Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

बहु-मॉडल चरण-परिवर्तन पोर्फिरिन बूंदों का संश्लेषण और लक्षण वर्णन

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/62665
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Princess Margaret Cancer Centre, 2Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 3Philips Healthcare

Summary

इस प्रोटोकॉल में, बहु-मॉडल चरण-परिवर्तन पोर्फिरिन बूंदों को संश्लेषित करने और विशेषता के तरीकों को रेखांकित किया गया है।

Abstract

चरण-परिवर्तन बूंदें अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों का एक वर्ग है जो पर्याप्त ध्वनिक ऊर्जा के अनुप्रयोग के साथ सीटू में इकोजेनिक माइक्रोबबल में परिवर्तित हो सकती है। बूंदें अपने माइक्रोबबल समकक्षों की तुलना में छोटी और अधिक स्थिर होती हैं। हालांकि, पारंपरिक अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट ध्वनिक प्रतिक्रिया माप से परे ट्रैक करने योग्य नहीं हैं, जो कंट्रास्ट एजेंट जैव-वितरण या संचय पूर्व वीवो को मुश्किल बनाता है। शोधकर्ताओं को जैव वितरण का अनुमान लगाने के लिए फ्लोरोसेंट या ऑप्टिकली शोषक साथी नैदानिक कणों पर निर्भर रहना पड़ सकता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक संघनन विधि का उपयोग करके बहु-मॉडल चरण-परिवर्तन पोर्फिरिन बूंदों को बनाने के लिए विस्तृत कदम उठाना है। पोर्फिरिन अलग-अलग अवशोषण बैंड वाले फ्लोरोसेंट अणु हैं जिन्हें लिपिड पर संयुग्मित किया जा सकता है और बूंदों की बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करने के लिए बूंदों में शामिल किया जा सकता है, ध्वनिक गुणों को बनाए रखते हुए अधिक मजबूत जैव-वितरण को सक्षम करता है। माइक्रोबबल और बूंद आकार वितरण की जांच करने के लिए अलग-अलग पोर्फिरिन-लिपिड और बेस लिपिड सामग्री के साथ सात फॉर्मूलेशन किए गए थे। पोर्फिरिन युक्त संरचनाओं के अनुकूल लक्षण ों को प्रोटोकॉल में उनके विश्लेषणात्मक बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करने के लिए भी वर्णित किया गया है। आकार घटाने से पता चला है कि बाद गाढ़ा मतलब व्यास १.७२ से २.३८ बार अग्रदूत आबादी से छोटे थे । अवशोषण लक्षण वर्णन से पता चला बरकरार विधानसभाओं में ७०० एनएम का क्यू-बैंड पीक था जबकि बाधित नमूनों में ६७१ एनएम पर एक अवशोषण शिखर था । फ्लोरेसेंस लक्षण वर्णन बरकरार दिखाया 30% पोर्फिरिन-लिपिड विधानसभाओं फ्लोरोसेंटी शमन (>97%), फ्लोरेसेंस वसूली के साथ व्यवधान पर प्राप्त किया गया । ध्वनिक वाष्पीकरण से पता चला है कि पोर्फिरिन की बूंदें कम दबावों पर गैर-इकोजेनिक थीं और पर्याप्त दबावों के साथ इकोजेनिक माइक्रोबबल में परिवर्तित की जा सकती हैं। ये लक्षण पोर्फिरिन बूंदों की क्षमता को दिखाते हैं ताकि वे वीवो या पूर्व वीवोमें डिलीवरी या चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट जैव-वितरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए अवशोषण या फ्लोरेसेंस-आधारित साथी नैदानिक रणनीतियों की आवश्यकता को समाप्त कर सकें।

Introduction

अल्ट्रासाउंड इमेजिंग चिकित्सा इमेजिंग का एक गैर-आक्रामक, गैर-आयनीकरण रूप है जो ध्वनिक तरंगों का उपयोग करता है। जबकि अल्ट्रासाउंड स्कैनर अधिक पोर्टेबल हैं और वास्तविक समय की छवियां प्रदान कर सकते हैं, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग कम विपरीत से पीड़ित हो सकते हैं, जिससे सोनोग्राफरों के लिए इसी तरह इकोजेनिक रोग सुविधाओं को मज़बूती से अलग करना मुश्किल हो जाता है। इस सीमा का प्रतिकार करने के लिए, संवहनी विपरीत में सुधार करने के लिए मेजबान में माइक्रोबबल इंजेक्शन किया जा सकता है। माइक्रोबबल्स माइक्रोन आकार के गैस से भरे कंट्रास्ट एजेंट होते हैं जो ध्वनिक तरंगों के लिए अत्यधिक इकोजेनिक होते हैं और1,2उन्नत पोत विपरीत प्रदान कर सकते हैं। माइक्रोबबल्स के गोले और गैस कोर को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए सिलवाया जा सकता है, जैसे इमेजिंग, थ्रोम्बोलिसिस, सेल झिल्ली पारमेबिलाइजेशन, या क्षणिक संवहनी उद्घाटन2।

माइक्रोबबल्स की एक खामी उनके छोटे परिसंचरण आधा जीवन है । उदाहरण के लिए, चिकित्सकीय रूप से उपलब्ध परफ्लुट्रेन लिपिड माइक्रोस्फीयर में केवल 1.3 मिनट3का आधा जीवन होता है। लंबे इमेजिंग सत्रों के लिए, माइक्रोबबल्स के कई इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। माइक्रोबबल्स की एक और खामी उनके बड़े व्यास हैं। जबकि परफ्लुट्रेन लिपिड माइक्रोस्फीयर व्यास में लगभग 1 से 3 माइक्रोन हैं, वेक्यूलेचर में प्रसारित करने के लिए काफी छोटे हैं, वे बहुत बड़े हैं और निष्क्रिय रूप से रुचि के ऊतकों में जमा होते हैं, जैसे कि ट्यूमर4। इन सीमाओं को दूर करने के लिए एक रणनीति गैस-कोर माइक्रोबबल्स को छोटे, तरल-कोर बूंदों5,6में गाढ़ा करना है। जबकि बूंदें उनके तरल राज्य में इकोजेनिक नहीं हैं, उन्हें पर्याप्त रूप से उच्च चोटी नकारात्मक दबाव के साथ अल्ट्रासाउंड के संपर्क में आने पर माइक्रोबबल्स में वाष्पित किया जा सकता है, जो इसके विपरीत प्रदान करने की उनकी क्षमता को फिर से प्राप्त कर सकता है। यह बूंद को एक छोटे तरल-कोर के अधिक अनुकूल फार्माकोकिनेटिक्स का लाभ उठाने की अनुमति देता है, जबकि रासायनिक संरचना4,7को बदलने के बिना और विपरीत प्रदान करने की क्षमता को बनाए रखता है।

डेसफ्लोरोबुटेन गैसीय और तरल राज्यों के बीच चरण-स्थानांतरण के लिए एक आदर्श परफ्लोरोकार्बन यौगिकहै 5,6,7। डेफ्लोरोबुटेन अकेले तापमान में कमी के साथ बूंदों में माइक्रोबबल के संघनन के लिए अनुमति देता है, जबकि कम घने परफ्लोरोकार्बन को अतिरिक्त दबाव5की आवश्यकता होती है। यह सौम्य विधि संघनन केदौरानबुलबुले के विनाश को कम करती है ,8,9. चूंकि उनके कोर तरल हैं, बूंदें गैर-इकोजेनिक और अल्ट्रासाउंड के लिए अदृश्य हैं। हालांकि, पर्याप्त ध्वनिक या थर्मल ऊर्जा के आवेदन के साथ, तरल कोर एक गैसीय राज्य में वापस वाष्पित हो सकते हैं, इकोजेनिक माइक्रोबबल्स8उत्पन्न कर सकते हैं। यह वाष्पीकरण माइक्रोबबल्स को कब और कहां उत्पन्न करना है, इसके नियंत्रण के लिए अनुमति देता है।

जबकि बूंदें निष्क्रिय संचय के लिए उपयोगी होती हैं, सीटू वाष्पीकरण में, या सेल पारमेबिलिटी में सुधार4,बूंदों (और उनके टुकड़े) को छवि या मात्रात्मक पूर्व वीवोनहीं किया जा सकता है। इसलिए, फ्लोरोसेंट4,10, 11,चुंबकीय कण 12, ऑप्टिकली शोषक एजेंट13जैसे मात्रात्मक साथी नैदानिक एजेंट का उपयोग ब्याज के ऊतकों को बूंद वितरण गेज करने के लिए एक एनालॉग के रूप में कियाजाताहै। उदाहरण के लिए, हेलफील्ड एट अल ने माउस अंगों के हिस्टोरोलॉजी छवि क्वांटिफिकेशन के लिए फ्लोरोसेंट नैनो-मोतियों के सह-इंजेक्शन का उपयोग किया क्योंकि बूंदों का फ्लोरोसेंट रूप से4का पता नहीं लगाया जा सकता था। साथी नैदानिक एजेंटों का नुकसान ट्रैक करने योग्य घटक अपने व्यक्तिगत फार्माकोकाइनेटिक प्रोफ़ाइल के आधार पर बूंद से स्वतंत्र रूप से कार्य कर सकता है।

सौभाग्य से, माइक्रोबबल्स और बूंदों के खोल को अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ह्यूयन्ह एट अल ने पोर्फिरिन-लिपिड गोले के साथ अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों का प्रदर्शन किया, जो मल्टी-मॉडल माइक्रोबबल्स14बनाते हैं। पोर्फिरिन्स एक ऐसा वर्ग है जो14,15सुगंधित मैक्रोसाइलिक संरचना के साथ कार्बनिक यौगिकों का एक वर्ग है । वे ऑप्टिकल रूप से शोषक, फ्लोरोसेंट होते हैं, और रेडियोथेरेपी, रेडियोन्यूक्लाइड-आधारित इमेजिंग, या धातु आधारित क्वांटिफिकेशन14का पता लगाने के लिए धातुओं की एक विस्तृत विविधता के लिए चेलेटेड किया जा सकता है। पोर्फिरिन का एक उदाहरण पायोफियोफोराइड (पायरो) है। लिपिड पर पायरो को संयोजित करके, माइक्रोबबल्स या बूंदों में पायरो-लिपिड को शामिल करने से उन्हें कई तौर-तरीकों के माध्यम से चित्रित और ट्रैक करने की अनुमति होती है: ध्वनिक रूप से, फ्लोरोसेंटली, और अवशोषण14के माध्यम से। इस मल्टी-मॉडल कंट्रास्ट एजेंट का उपयोग संचय को ट्रैक करने और निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह साथी नैदानिक एजेंटों की आवश्यकता को समाप्त कर सकता है क्योंकि मात्रात्मक घटक अब खोल पर संयुग्मित है, जिससे अधिक सटीक वितरण मात्रा16को सक्षम किया जा सकता है।

इसके साथ ही, मल्टी-मॉडल चरण-परिवर्तन पोर्फिरिन बूंदों को बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल रेखांकित किया गया है। चूंकि अल्ट्रासाउंड विरोधाभासों एजेंटों को ब्याज के ऊतकों में दवा वितरण के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि ट्यूमर2,4,अल्ट्रासाउंड से परे उनकी पता लगाने की क्षमता का विस्तार डिलीवरी प्रभावकारिता मात्राकरण के लिए उपयोगी साबित हो सकता है। इन बूंदों का उद्देश्य वीवो मेंनिष्क्रिय संचय में सक्षम ट्रैक करने योग्य अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट प्रदान करना है, सीटू वाष्पीकरण और ध्वनिकी में, और माध्यमिक सेंसरों पर निर्भरता के बिना पूर्व वीवो अंगों से जैव-वितरण या संचय की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता के साथ। बायो-डिस्ट्रीब्यूशन सेंसर के रूप में पोर्फिरिन बूंदों की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए लक्षण वर्णन विधियों को भी रेखांकित किया गया है। खोल में पायरो-लिपिड लोडिंग के प्रभाव (मोलर अनुपात से 0% से 50%) पर भी चर्चा की जाती है।

Protocol

1. निर्जलित लिपिड फिल्में

  1. आवश्यक प्रत्येक खोल घटकों की जनता की गणना करें (पूरक फ़ाइल "लिपिड फॉर्मूला शीट" देखें)।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, खोल संरचना होगी: 10 मोलर% 1,2-डिटेरोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोथेलेनमाइन-एन-[मेथॉक्सी (पॉलीथीन ग्लाइकोल) -5000] अमोनियम नमक (डीएसपीई-पेग5के), एक्स मोलर% पाइरोफेरोफोरिडी 1-स्टेरॉयल-2-हाइड्रोक्सी-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (पायरो-एसपीसी), और (९०-x) मोलर% 1,2-डिस्टेरोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीएसपीसी) । पायरो-एससीसी की मात्रा 7 खोल रचनाओं(x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50) में भिन्न होगी। स्टॉक बोतल पर DSPE-PEG5K के आणविक वजन की जांच करें।
    1. 1 एमएल की न्यूनतम मात्रा के साथ किसी भी लिपिड वॉल्यूम के लिए प्रोटोकॉल स्केल करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, सभी योगों के लिए 1 मिलीग्राम प्रति मिलीग्राम की कुल लिपिड एकाग्रता के साथ 10 एमएल की कुल लिपिड मात्रा का उपयोग किया गया था। एक्जिलिएंट सॉल्यूशन होगा: 10% प्रोपलीन ग्लाइकोल, 10% ग्लाइस्रोल, और 80% फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस, 1X, 7.4 पीएच) (% v/v/v) (चरण 2.3 और "लिपिड फॉर्मूला शीट" देखें)।
      नोट: पायरो-लिपिड का संश्लेषण प्रोटोकॉल पूरक फ़ाइल "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" चरण S1 से S1.19 में उल्लिखित है, जिसे झेंग एट अल15द्वारा किए गए कार्य से संशोधित किया गया था।
  2. गणना की गई जनता के आधार पर ("चरण 1.1 और "लिपिड फॉर्मूला शीट" देखें), प्रत्येक गैर-पायरो-लिपिड का वजन करें और एक स्क्रू-ऑन कैप के साथ पर्याप्त आकार के बोरोसिलिकेट ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें।
  3. शीशी कैप, टोपी और शीशी लेबल, और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपिड शीशी के नीचे और दीवारों को कवर। इस शीशी को बाकी प्रोटोकॉल के लिए "लिपिड शीशी" के रूप में संदर्भित किया जाएगा। लिपिड शीशी को ठंडे, सूखे, अंधेरे क्षेत्र में स्टोर करें।
  4. यदि सूत्रीकरण में पायरो-एसपीसी शामिल हैं, तो क्लोरोफॉर्म के 1 एमएल में 10 मिलीग्राम पायरो-एसपीसी ड्राई फिल्म (देखें "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा") को भंग करें। 5 एस के लिए भंवर, अवशोषण को मापने, और लिपिड शीशी में जोड़ने के लिए उचित मात्रा की गणना करें।
    सावधानी:क्लोरोफॉर्म एक स्वास्थ्य के लिए खतरा, अड़चन और विषाक्त है। एक सुरक्षात्मक प्रयोगशाला कोट, आंखों की सुरक्षा, दस्ताने पहनें, और सांस लेने के धुएं से बचें।
    नोट: के रूप में Pyro-SPC प्रकाश संवेदनशील है, काम कर रहे क्षेत्र में रोशनी को कम यदि संभव हो तो जब संभव हो तो Pyro-SPC संभाल । उपयोग में नहीं होने पर पायरो-एससीसी को सील और कवर रखें।
    1. पराबैंगनी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर, इसे 0.5 एनएम वेतन वृद्धि के साथ 800 एनएम से 300 एनएम की तरंगदैर्ध्य सीमा से अवशोषित करने के लिए सेट करें, और संगत 1 सेमी पथ लंबाई क्यूवेट में शुद्ध मेथनॉल के 2000 μL के साथ एक बेसलाइन को मापें।
      सावधानी:मेथनॉल एक स्वास्थ्य खतरा, अड़चन, विषाक्त और ज्वलनशील है। एक सुरक्षात्मक प्रयोगशाला कोट, आंखों की सुरक्षा, दस्ताने पहनें, और सांस लेने के धुएं से बचें। चिंगारियों और गर्मी से दूर रहें।
    2. मेथनॉल के 2000 माइक्रोन में क्लोरोफॉर्म में पायरो-एससीसी के 2 माइक्रोन जोड़ें, और 30 एस के लिए भंवर। इसे एक साफ, संगत 1 सेमी क्यूवेट में स्थानांतरित करें, और अवशोषण को मापें। पराबैंगनी-दृश्य स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के अवशोषण रेंज से बाहर 667 एनएम पर अवशोषण पीक यदि इस कमजोर पड़ने वाले कारक को समायोजित करें।
      नोट: जब भी क्लोरोफॉर्म या मेथनॉल स्थानांतरित करें, तो बेहतर सटीकता के लिए यांत्रिक पिपेट के बजाय एक साफ ग्लास सिरिंज या सकारात्मक-विस्थापन पिपेट का उपयोग करें।
    3. ट्रिप्लिकेट अवशोषण मूल्यों को प्राप्त करने के लिए चरण 1.4.2 दो बार दोहराएं।
    4. 667 एनएम पर अवशोषित पीक मूल्यों का औसत और लिपिड शीशी14, 15के लिए आवश्यक क्लोरोफॉर्म में पायरो-एससीपी की मात्रा की गणना करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें :
      Equation 1
      जहां वी क्लोरोफॉर्म में पायरो-एससीसी की मात्रा की आवश्यकता है, एम पायरो-स्पीसी (चरण 1.1 और "लिपिड फॉर्मूला शीट" देखें) का आवश्यक द्रव्यमान है, एम 1040.317 g·मोल -1 पर पायरो-एससीसी का आणविक वजन है, ए 667 एनएम पर औसत अवशोषण है, डी क्लोरीनफॉर्म वॉल्यूम (स्टेप 1.4.2) में मेथनॉल और पायरो-स्कीप पर आधारित कमजोर पड़ने वाला कारक है (स्टेप 1.4.2), एल 1 सेमी पर क्यूवेट पथ की लंबाई है, और ε 45000 एल-मोल -1 -सेमी-1 पर पायरो-स्पीसीका667एनएम मोलर एटटेन्यूटेशन गुणांक है।
      नोट: समीकरण के भाजक बियर-लैम्बर्ट कानून है, जो एक दूरी पर मापा ऑप्टिकल अवशोषण के समाधान में एक विश्लेषण की एकाग्रता से संबंधित है ।
    5. एक साफ ग्लास सिरिंज(चित्रा 1A)का उपयोग करके लिपिड शीशी के लिए पिछले कदम से क्लोरोफॉर्म में Pyro-SPC की गणना की मात्रा जोड़ें और फिर टोपी और शीशी को कवर ।
      नोट: चित्रा 1 केवल 30% पायरो-लिपिड निर्माण से पता चलता है।
    6. यदि क्लोरोफॉर्म शेष में कोई पायरो-एससीसी है: एक धुएं हुड में, चरण 1.4 से पायरो-एससीपी + क्लोरोफॉर्म शीशी को अनकैप करें, आंशिक रूप से शीशी को अपनी तरफ झुकाएं और लगातार नाइट्रोजन गैस को पायरो-एससीसी/क्लोरोफॉर्म शीशी में जितना संभव हो सके प्रवाहित करें। नाइट्रोजन गैस प्रवाह का उपयोग करके क्लोरोफॉर्म को सुखाने के लिए शीशी को घुमाएं और शीशी की आंतरिक दीवार पर पायरो-एसपीसी को समान रूप से कोट करें क्योंकि यह सूख जाता है। सुनिश्चित करें कि कोई बौछार नहीं की जाती है और कोई भी समाधान बाहर नहीं आता है।
    7. एक बार Pyro-SPC लिपिड फिल्म सूखी और शीशी की दीवार पर लेपित दिखाई देता है, नाइट्रोजन गैस प्रवाह बंद कर देते हैं । शीशी को कैप करें, शीशी की गर्दन को मोम फिल्म से सील करें, और शीशी को -20 डिग्री सेल्सियस और अंधेरे में स्टोर करें।
  5. 90% क्लोरोफॉर्म और 10% मेथनॉल (% v/v) का घोल तैयार करें और इसमें से 5 एमएल लिपिड शीशी में डालें। लिपिड शीशी को कैप करें, और सामग्री(चित्रा 1B)को समरूप बनाने के लिए धीरे-धीरे घूमता है।
    नोट: यदि सूत्रीकरण में फॉस्फेटिक एसिड लिपिड (जैसे 1,2-डिस्टेरोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फेट सोडियम नमक (डीएसपीए)), तो जोड़ें: 60% क्लोरोफॉर्म, 32% मेथनॉल, और 8% डबल-डिशनाइज्ड पानी (% v/v/v) इसके बजाय लिपिड वियल। लिपिड सामग्री को पूरी तरह से भंग करने के लिए अधिक तीव्र घूमता आवश्यक हो सकता है।
  6. एक धूम हुड में, लिपिड शीशी को अनकैप करें, आंशिक रूप से लिपिड शीशी को अपनी तरफ झुकाएं और लिपिड शीशी में जितना संभव हो उतना धीरे-धीरे नाइट्रोजन गैस प्रवाहित करें। लिपिड शीशी को घुमाएं नाइट्रोजन गैस प्रवाह का उपयोग करके समाधान को सुखाने के लिए और लिपिड शीशी की आंतरिक दीवार पर लिपिड फिल्म को समान रूप से कोट करें क्योंकि यह सूख जाता है। सुनिश्चित करें कि कोई बौछार नहीं की जाती है और कोई भी समाधान बाहर नहीं आता है।
  7. एक बार लिपिड सूखी दिखाई देते हैं और लिपिड शीशी(चित्रा 1C)की आंतरिक दीवारों पर लेपित, नाइट्रोजन गैस प्रवाह बंद कर देते हैं, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपिड शीशी के नीचे और दीवार को कवर करते हैं, और एल्यूमीनियम के साथ शीर्ष खोलने को कवर करते हैं जो वेंटिंग(चित्रा 1D)के लिए सुई के साथ कुछ छेद के साथ पोक किया जाता है।
  8. लेबल और एक वैक्यूम desiccator के अंदर कवर लिपिड शीशी जगह है और लिपिड को कम से कम 24 घंटे के लिए आगे सूखने की अनुमति देते हैं लेकिन 72 घंटे से अधिक नहीं।
    नोट: प्रोटोकॉल बाद में फिर से शुरू किया जा सकता है, 24 से ७२ घंटे के बाद ।

2. लिपिड हाइड्रेशन

  1. एक नहाते हुए सोनिकेटर को पानी से भरें और इसे 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। पानी मिलाने में मदद करने के लिए सोनीशन चालू करें।
    सावधानी:पानी और सोनिकेटर उच्च तापमान पर हैं। पानी और सोनिकेटर को छूने से बचें। आंखों की सुरक्षा, एक सुरक्षात्मक प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें।
  2. एक बार बाथ सोनिकेटर 70 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया है, तो वैक्यूम डेसिकेटर से लिपिड शीशी को हटा दें। संभव हो तो कार्य क्षेत्र में रोशनी को कम करें।
  3. 10% प्रोपलीन ग्लाइकोल, 10% ग्लाइसरोल, 80% पीबीएस (% v/v/v) का एक अनुभवी समाधान तैयार करें और लिपिड शीशी में इसका 10 एमएल जोड़ें (चरण 1.1.1 और "लिपिड फॉर्मूला शीट")।
    नोट: यदि एक मानक वायु-विस्थापन पिपेट का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रोपलीन ग्लाइकोल और ग्लिसरोल जैसे चिपचिपा सॉल्वैंट्स को संभालते समय देखभाल का उपयोग करें। एस्पिरेट और वॉल्यूम को धीरे-धीरे डुबकी दें और अवशिष्ट मात्रा को पिपेट टिप के नीचे तक पहुंचने की प्रतीक्षा करें। सुनिश्चित करें कि तरल धीरे-धीरे आगे बढ़ते हुए वॉल्यूम स्थानांतरित करते समय पिपेट टिप के बाहर से चिपक नहीं जाता है।
  4. लिपिड शीशी कैप करें, एल्यूमीनियम कवर को हटा दें, और धीरे-धीरे स्नान सोनिकेटर में शीशी को 15 मिनट के लिए घुमाएं जबकि सोनीशन लिपिड को भंग करने पर है। सुनिश्चित करें कि लिपिड शीशी की गर्दन पानी से ऊपर है। कभी-कभी जांचें कि शीशी टोपी सुरक्षित रूप से बंद है या नहीं।
    1. कभी-कभी, लिपिड शीशी को पानी स्नान से हटा दें। संक्षेप में यह जांचने के लिए प्रकाश में पकड़ें कि क्या सामग्री पूरी तरह से भंग हो गई है(चित्रा 1E)।
    2. लिपिड शीशी की सामग्री समरूप नहीं है तो लिपिड शीशी को बाथ सोनिकेटर से हटा दें। टोपी को सुरक्षित करें, अधिक आक्रामक रूप से घुमाएं, और इसे स्नान सोनिकेटर में वापस करें।
  5. बाथ सोनिकेटर से लिपिड शीशी निकालें, और बाथ सोनिकेटर को बंद कर दें। लिपिड शीशी बाहरी को पेपर टॉवेल से सुखा लें, और लिपिड शीशी को फिर से लेबल करें।
  6. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपिड शीशी को कवर करें, और 10 मिनट के लिए एक शांत, अंधेरे, शुष्क क्षेत्र में कमरे के तापमान पर लिपिड शीशी को ठंडा करें।
  7. लिपिड शीशी सामग्री को अलीकोट करें: 3 एमएल बोरोसिलिकेट ग्लास स्पष्ट सीरम शीशियों (7 मिमी आंतरिक मुंह व्यास, 13 मिमी बाहरी मुंह व्यास) में लिपिड समाधान के बारे में 2 मिलीलीटर।
    नोट: कुछ प्रोटोकॉल 3 एमएल शीशी7में लिपिड समाधान के 1.5 एमएल का उपयोग कर सकते हैं।
  8. लियोफिलाइजेशन-स्टाइल ग्रे क्लोरोबुटिल रबर डाट (7 मिमी आंतरिक मुंह व्यास, 13 मिमी बाहरी मुंह व्यास) के साथ सीरम शीशियों को कैप करें और रबर डाट को आंसू-बंद एल्यूमीनियम जवानों (13 मिमी बाहरी मुंह व्यास) और एक क्रिम्पर(चित्रा 1F)के साथ सुरक्षित करें।
  9. वैक्यूम, डेगास, और सीरम शीशियों में से प्रत्येक में लिपिड समाधान फिर से दबाव4,5, 7 (चित्रा 2)।
    नोट: गैस एक्सचेंजर और अधिक विवरणों को इकट्ठा करने के निर्देशों के लिए "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" का उल्लेख करें।
    1. दबाव वाल्व ए और गैस सिलेंडर वाल्व(चित्रा 2)के बीच और सहित हर वाल्व बंद करें। सीरम की शीशियों को कई गुना सुइयों से कनेक्ट करें, फिर संबंधित कई गुना वाल्व खोलें, फिर वैक्यूम वाल्व ए और वैक्यूम वाल्व बी खोलें, और वायुमंडलीय हवा को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए -90 केपीए (-13 साई, -900 mbar) पर वैक्यूम करें। किसी भी तरल को वैक्यूम न करें (S3.1.5 के लिए "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" चरण S3 देखें)।
      सावधानी:वैक्यूम पंप फट अगर गलत तरीके से संभाला जा सकता है । कार्बनिक, अम्लीय, या बुनियादी रसायनों के साथ वैक्यूम पंप का उपयोग न करें।
    2. वैक्यूम के साथ अभी भी, सीरम शीशी (इसे झूलने से रोकने के लिए) पकड़ें और इसे पेन या मार्कर से डेगास के साथ तेजी से टैप करें। जब तक कोई बुलबुले नहीं बन जाते तब तक टैप करते रहें और शीशी में कोई बुलबुले नहीं हैं। किसी भी तरल को खाली न होने दें। यदि आवश्यक हो तो टैपिंग को रोकें। सभी जुड़े सीरम शीशियों के लिए दोहराएं। सभी सीरम शीशियों को डीगैस करने के बाद, वैक्यूम वाल्व ए और वैक्यूम वाल्व बी बंद करें और वैक्यूम पंप को बंद कर दें (देखें "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" चरण S3.2 S3.2.3) ।
    3. सीरम शीशी के साथ अभी भी सुई से जुड़ा हुआ है और वैक्यूम पंप बंद के साथ, धीरे-धीरे गैस सिलेंडर वाल्व 1/16 से 1/8 (पूर्ण क्रांति के बारे में 22.5 से 45 डिग्री) को आंशिक रूप से खोलने के लिए, फिर टी-हैंडल वाल्व खोलें, और धीरे-धीरे एयर रेगुलेटर वाल्ववार को 3 पीएसआई (20.7 kPa) गेज में बदल दें। फिर, ओपन प्रेशर वाल्व ए और प्रेशर वाल्व बी (देखें "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" चरण S3.3 से S3.3.21) ।
      सावधानी:डेकाफ्लोरोबुटेन गैस सिलेंडर दबाव में है और गर्म होने पर विस्फोट हो सकता है। गर्मी और प्रभाव से रास्ता रखें। डेकाफ्लोरोबुटेन गैस ऑक्सीजन विस्थापन और घुटन का कारण बन सकती है। उचित आंखों की सुरक्षा पहनें और एक धुएं हुड में संभालें। यदि गलत तरीके से संभाला जाता है, तो गैस सिलेंडर को वैक्यूम करना संभव है, जो तेजी से डी-दबाव और विविधता पैदा कर सकता है। 1/8 टर्न से ज्यादा गैस सिलेंडर का वाल्व खोलने से एयर रेगुलेटर को नुकसान हो सकता है।
    4. दबाव के 30 एस के बाद (गेज अभी भी 3 साई (20.7 kPa)) पढ़ना चाहिए), सीरम शीशियों के साथ सभी कई गुना वाल्व बंद, सीरम शीशियों डिस्कनेक्ट, सुइयों म्यान, और गैस सिलेंडर वाल्व बंद करो।
    5. एयर रेगुलेटर गेज सुई अपनी आराम की स्थिति में चला जाता है जब तक आंशिक रूप से एक कई गुना वाल्व खोलने के द्वारा निर्मित दबाव से छुटकारा । फिर कई गुना वाल्व और टी-हैंडल के बीच और सहित सब कुछ बंद करें।
  10. सीरम की शीशियों को लेबल करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर और अंधेरे में स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि सभी गैस एक्सचेंजर वाल्व बंद हैं और वैक्यूम पंप बाद में बंद कर दिया गया है।
    नोट: सीरम इस राज्य में 4 महीने तक स्थिर होना चाहिए। इस कदम पर, प्रोटोकॉल बाद में फिर से शुरू किया जा सकता है, 4 महीने के बाद सबसे कम।

3. डेकाफ्लोरोबुटेन शीशियां

  1. साफ, खाली 3 एमएल बोरोसिलिकेट ग्लास स्पष्ट सीरम शीशियों (7 मिमी आंतरिक मुंह व्यास, 13 मिमी बाहरी मुंह व्यास), उन्हें लियोफिलाइजेशन-स्टाइल ग्रे क्लोरोब्यूटिल रबर डाट (7 मिमी आंतरिक मुंह व्यास, 13 मिमी बाहरी मुंह व्यास) के साथ कैप करें और आंसू-बंद एल्यूमीनियम सील (13 मिमी बाहरी मुंह व्यास) और एक4,एक 7,8.
  2. वायुमंडलीय हवा को वैक्यूम करने के लिए चरण 2.9.1 का पालन करें (देखें "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" चरण S3.1 से S3.1.5) ।
  3. डगैसिंग को छोड़ें और शीशी पर फिर से दबाव बनने के लिए चरण 2.9.3 से 2.9.5 का पालन करें (देखें "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" चरण S3.3 से S3.3.21)।
  4. डेकाफ्लोरोबुटेन शीशियों को लेबल करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस और अंधेरे में स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि सभी गैस एक्सचेंजर वाल्व बंद हैं और वैक्यूम पंप बाद में बंद कर दिया गया है।
    नोट: ड्रॉपलेट संघनन के लिए डेकाफ्लोरोबुटेन गैस से भरी सीरम शीशियों की आवश्यकता होगी। उन्हें इस राज्य में 4 महीने तक स्थिर रहना चाहिए। इस कदम पर, प्रोटोकॉल बाद में फिर से शुरू किया जा सकता है, 4 महीने के बाद सबसे कम।

4. बूंद गठन

  1. फ्रिज से सीरम शीशी (चरण 2.10 से) में एक हाइड्रेटेड लिपिड समाधान निकालें।
  2. एक डिकैपर का उपयोग करके, सीरम शीशी पर एल्यूमीनियम सील को हटा दें और लिपिड समाधान के 1.85 एमएल बोरोसिलिकेट ग्लास नमूना शीशी (फेनोलिक स्क्रू कैप के साथ) में लिपिड समाधान को आंतरिक दीवार के नीचे प्रवाहित करके स्थानांतरित करें। बुलबुले न बनाएं।
    1. यदि सीरम शीशी में कोई शेष लिपिड समाधान है, तो डेगास के लिए चरण 2.9 से 2.10 का पालन करें और भंडारण के लिए सीरम शीशी को फिर से दबाव डालें (देखें "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" चरण S3 से S3.3.21)।
  3. 1.85 एमएल नमूना शीशी के साथ, गैस एक्सचेंजर का उपयोग करके नमूना शीशी हेडस्पेस में डेकाफ्लोरोबुटेन गैस में धीरे-धीरे प्रवाहित करें (विशिष्ट वाल्व नामों के लिए चित्रा 2 देखें)।
    1. सुनिश्चित करें कि गैस एक्सचेंजर पर सभी वाल्व ठीक से बंद हैं और पंप बंद कर दिया गया है।
      सावधानी:यदि गलत तरीके से किया जाता है, तो गैस सिलेंडर को वैक्यूम करना संभव है जिससे तेजी से डिकंप्रेशन और विविधता होती है।
    2. एक कई गुना वाल्व खोलें और ध्यान से कई गुना से संबंधित सुई को अनशिएट करें।
      सावधानी-तेज वस्तु, संपर्क/भेदी से बचें।
    3. ओपन प्रेशर वाल्व ए और प्रेशर वाल्व बी और गैस सिलेंडर वाल्व 1/16 से 1/8 (पूर्ण क्रांति के लगभग 22.5 से 45 डिग्री) को आंशिक रूप से खोलने और फिर टी-हैंडल वाल्व खोलने के लिए काउंटरक्लॉकवाइज चालू करें।
      सावधानी-गैस सिलेंडर वाल्व को इससे अधिक न खोलें क्योंकि इससे वायु नियामक को नुकसान हो सकता है।
    4. लिपिड समाधान के साथ नमूना शीशी को अनकैप करें और इसे स्थानांतरित करें ताकि कई गुना सुई शीशी के अंदर तरल-वायु इंटरफेस से ऊपर हो। वहां शीशी धारण करें।
    5. धीरे-धीरे एयर रेगुलेटर वाल्व को दक्षिणावर्त तब तक चालू करें जब तक कि वायु नियामक गेज सुई अपने आराम की स्थिति से थोड़ा आगे नहीं बढ़ता है और परफ्लोरोकार्बन गैस धीरे-धीरे कई गुना सुई से बाहर बह रही है। परफ्लोरोकार्बन गैस को धीरे-धीरे 30 एस के लिए शीशी हेडस्पेस में प्रवाहित करें। बुलबुले न बनाएं। यदि आवश्यक हो तो एयर रेगुलेटर वाल्व को समायोजित करें।
      नोट: लिक्विड-एयर इंटरफेस को डेकाफ्लोरोबुटेन गैस प्रवाह से थोड़ा बेफिक्र होना चाहिए। चूंकि अभी सिस्टम खुला है, इसलिए एयर रेगुलेटर गेज प्रेशर को ठीक से नहीं पढ़ सकता ।
    6. 30 एस के बाद, ध्यान से और जल्दी से शीशी बहुत ज्यादा ले जाने के बिना नमूना शीशी टोपी ।
    7. गैस सिलेंडर वाल्व (दक्षिणावर्त), टी-हैंडल वाल्व, एयर रेगुलेटर वाल्व (काउंटरक्लॉथवाइज), प्रेशर वाल्व ए, प्रेशर वाल्व बी और कई गुना वाल्व बंद करें।
    8. ध्यान से सुई म्यान।
    9. नमूना शीशी लेबल और मोम फिल्म के साथ गर्दन सील दक्षिणावर्त जा रहा है(चित्रा 3A और 3B)।
      नोट: आंकड़े 3B से 3F केवल 30% पायरो-लिपिड निर्माण दिखाते हैं।
  4. नमूना शीशी को अंधेरे में और कम से कम 10 मिनट या 24 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: इस कदम पर, प्रोटोकॉल बाद में फिर से शुरू किया जा सकता है, सबसे कम 24 घंटे ।
  5. एक अछूता कंटेनर में लगभग 100 ग्राम सूखी बर्फ (कार्बन डाइऑक्साइड) रखें और नियमित रूप से बर्फ को दूसरे अछूता कंटेनर में रखें। चरण 3, दो 3.81 सेमी (1.5 इंच) 20 गेज सुई, एक 1 एमएल प्लास्टिक सिरिंज (उपयोग से पहले गिरने वाली अनस्टिक), 200 मिलीएल कंटेनर, धातु चिमटे, और एक थर्मामीटर (-20 से 100 डिग्री सेल्सियस) में उल्लिखित डेकाफ्लोरोबुटेन सीरम शीशियों को पुनः प्राप्त करें।
    नोट: यदि केवल माइक्रोबबल बना रहे हैं, तो आइसोप्रोपैनॉल, सूखी बर्फ और बर्फ की कोई आवश्यकता नहीं है।
  6. यांत्रिक आंदोलनकारी में लिपिड समाधान के साथ नमूना शीशी रखें और 45 एस(चित्रा 3C)के लिए आंदोलन करें।
  7. यांत्रिक आंदोलन के बाद, नमूना शीशी दाईं ओर खड़े हो जाओ, प्रकाश से परिरक्षित, और शीशी को ठंडा करने के लिए 15 मिनट की उलटी गिनती शुरू करें और आकार-माइक्रोबबल्स8,17का चयन करें।
    1. जब 15 मिनट की उलटी गिनती 10 मिनट (उलटी गिनती पर छोड़ी गई 5 मिनट) तक पहुंच गई है, तो एक कंटेनर को लगभग 200 एमएल आइसोप्रोपेनॉल से भरें और धातु चिमटे का उपयोग करके सूखी बर्फ के साथ -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
      नोट: लक्ष्य तापमान -15 से -17 डिग्री सेल्सियस है, लेकिन माइक्रोबबल्स को संभालने के दौरान आइसोप्रोपैनॉल गर्म हो जाएगा।
      सावधानी:आइसोप्रोपेनॉल ज्वलनशील है। गर्मी और चिंगारियों से दूर रहें। सूखी बर्फ त्वचा को नुकसान पहुंचा सकती है। चिमटे के साथ संभाल। दस्ताने, आंखों की सुरक्षा, और एक सुरक्षात्मक प्रयोगशाला कोट पहनें।
  8. माइक्रोबबल्स को 15 मिनट के लिए आकार-चयनित किए जाने के बाद, नमूना शीशी(चित्रा 3 डी)के अंदर आकार-चयनित विभाजन की तलाश करें।
  9. नमूना शीशी को दाईं ओर रखते हुए, ध्यान से नमूना शीशी को अनकैप करें, और 1.5 इंच 20-गेज सुई के साथ नीचे विभाजन के लगभग 0.7 एमएल को वापस लें जो 1 एमएल प्लास्टिक सिरिंज से जुड़ा हुआ है। सुनिश्चित करें कि शीर्ष विभाजन में से कोई भी वापस नहीं लिया गया है। हवा की जेब हटाने के लिए सिरिंज को फ्लिक न करें।
  10. वेंट करने के लिए एक डेकाफ्लोरोबुटेन सीरम शीशी (सीरम शीशी के शीर्ष के पास सुई रखते हुए) में एक अलग 20 गेज सुई डालें और फिर आकार-चयनित माइक्रोबबल्स के साथ सुई/सिरिंज डालें।
  11. धीरे-धीरे आकार-चयनित माइक्रोबबल्स को स्थानांतरित करें। शीशी झुकाएं और सिरिंज को कोण दें ताकि तरल को डेकाफ्लोरोबुटेन सीरम शीशी की आंतरिक दीवार के नीचे स्लाइड किया जा सके।
  12. एक बार सभी आकार का चयन माइक्रोबबल समाधान स्थानांतरित कर दिया गया है, सिरिंज के साथ सुई को हटा दें, लेकिन नकारात्मक दबाव(चित्रा 3E)को राहत देने के लिए निकालने सुई में रखें ।
    1. यदि केवल आकार-चयनित माइक्रोबबल बनाते हैं, तो यहां रुकें। वेंटिंग सुई को शीर्ष में और उसके पास रखें। शीशी को अंधेरे में और कमरे के तापमान पर रखें।
  13. स्नान का तापमान -15 से -17 डिग्री सेल्सियस के बीच है यह सुनिश्चित करने के लिए आइसोप्रोपैनॉल स्नान में सूखी बर्फ या कमरे के तापमान आइसोप्रोपैनॉल की थोड़ी मात्रा जोड़ें।
  14. सीरम शीशी के शीर्ष के पास डाली गई 20 गेज वेंटिंग सुई के साथ, आइसोप्रोपैनॉल स्नान में सीरम शीशी रखें, आइसोप्रोपेनॉल के स्तर से नीचे माइक्रोबबल स्तर रखते हुए, लेकिन इसके ऊपर शीशी गर्दन, और रुक-रुककर माइक्रोबबल्स को गाढ़ा करने के लिए 2 मिनट तक सीरम शीशी को घूमता है।
    नोट: यह कदम शीरन एट अल द्वारा किए गए काम से संशोधित किया गया था ।6
    1. आइसोप्रोपैनॉल में लगातार सीरम शीशी को चक्कर न लगाने दें और समाधान को फ्रीज न होने दें। लगभग 5 एस के लिए घूमता है, और सीरम शीशी को आइसोप्रोपैनॉल से बाहर उठाएं। बर्फ नाभिक की जांच करें, और आइसोप्रोपैनॉल में घूमता फिर से शुरू करें। यदि बर्फ का निर्माण होता है, तो सीरम शीशी को हवा में तब तक घूमता है जब तक कि यह नष्ट न हो जाए।
  15. 2 मिनट के संघनन के बाद आइसोप्रोपेनॉल बाथ से सीरम शीशी निकाल लें और वेंटिंग सुई को हटा दें।
    नोट: माइक्रोबबल्स को बूंदों में गाढ़ा किया जाना चाहिए था, जैसा कि पारलौकीता में परिवर्तन(चित्रा 3E बनाम चित्रा 3F 30% पायरो-लिपिड फॉर्मूलेशन के लिए) से संकेत मिलता है।
  16. सीरम शीशी को पोंछें, इसे लेबल करें, और उपयोग के लिए तैयार होने तक इसे एक अंधेरे, अछूता कंटेनर में नियमित बर्फ पर रखें। जब तक पिघली हुई बर्फ को आवश्यकतानुसार बदल दिया जाता है, तब तक इस राज्य में 6 घंटे तक की बूंदों को स्थिर होना चाहिए।
  17. उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, डिकैपर के साथ एल्यूमीनियम सील हटा दें। बूंदों (यहां तक कि खुली शीशियों) को बर्फ पर और अंधेरे में रखें, जबकि उपयोग में नहीं। माइक्रोबबल्स को अंधेरे में और कमरे के तापमान पर रखें।

5. रूपात्मक और ऑप्टिकल लक्षण वर्णन

  1. द्वारा 1% ट्राइटन तैयार करें: ट्राइटन एक्स-100 के 5 एमएल को पीबीएस (1x, पीएच 7.4) के 500 मिलील में जोड़ना और समरूप14तक चुंबकीय हलचल बार के साथ हलचल करना।
    नोट: ट्राइटन एक्स-100 बहुत चिपचिपा। यदि एक मानक वायु-विस्थापन पिपेट का उपयोग कर रहे हैं, तो हैंडलिंग करते समय देखभाल का उपयोग करें। धीरे-धीरे वॉल्यूम को एस्पिरेट और डुबकी दें और अवशिष्ट मात्रा को पिपेट के नीचे तक पहुंचने की प्रतीक्षा करें। सुनिश्चित करें कि तरल धीरे-धीरे आगे बढ़ते हुए वॉल्यूम स्थानांतरित करते समय पिपेट टिप के बाहर से चिपक नहीं जाता है।
  2. बूंदों (चरण 4) तैयार करें। यदि माइक्रोबबल्स की भी विशेषता हो रही है, तो संघनन (चरण 4.9) से पहले आकार-चयनित माइक्रोबबल्स की एक छोटी मात्रा एकत्र करें।
  3. आकार-वितरण और सांद्रता(चित्रा 4)प्राप्त करने के लिए कूल्टर काउंटर (सीसी) पर माइक्रोबबल्स या बूंदों को 0.2 से 6 माइक्रोन मीटर तक आकार दें।
    1. सीसी इलेक्ट्रोलाइट के 10 एमएल के साथ एक साफ 20 एमएल क्यूवेट भरें जिसे 0.2 माइक्रोन पोर पॉलीएथर्सल्फोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। एक बेसलाइन पाने के लिए तीन रन के साथ सीसी पर इसे मापें ।
    2. एक ही सीसी इलेक्ट्रोलाइट में, माइक्रोबबल या बूंद के नमूने के 5 माइक्रोल जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाएं।
      नोट: नमूना के 2 से 20 μL कैसे केंद्रित नमूना है पर निर्भर करता है जोड़ा जा सकता है ।
    3. सीसी (3 रन) पर नमूना चलाएं, औसत बेसलाइन को घटाएं, और आकार वितरण और एकाग्रता (संख्या प्रति एमएल) की गणना करें।
  4. यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी(चित्रा 5)के साथ बूंद अवशोषण को मापें।
    नोट: चित्रा 5 केवल 30% पायरो-लिपिड निर्माण से पता चलता है।
    1. यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर, अवशोषण माप को 0.5 एनएम वेतन वृद्धि के साथ 800 एनएम से 300 एनएम तरंगदैर्ध्य के रूप में सेट करें और बेसलाइन सुधार को सक्षम करें।
    2. पीबीएस से भरे एक साफ 1 सेमी पथ लंबाई क्यूवेट का उपयोग करना, एक आधारभूत माप करें। सुनिश्चित करें कि स्पेक्ट्रोस्कोप बीम पथ को काटने के लिए मात्रा काफी अधिक है।
    3. पीबीएस में पायरो-लिपिड बूंदों को पतला करें (2000 माइक्रोन में बूंदों के 2 माइक्रोन से 2 माइक्रोन की सलाह दें) और पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
      नोट: भंवर मत करो वरना विधानसभाओं को नष्ट कर दिया जाएगा।
    4. पतला बूंदों को एक साफ क्यूवेट में स्थानांतरित करें और अवशोषण को मापें। यदि आवश्यक हो तो कमजोर पड़ने को बदलें।
    5. चरण 5.4.1 से 5.4.4 तक दोहराएं लेकिन पीबीएस के बजाय 1% ट्राइटन का उपयोग करें। कमजोर पड़ने के बाद, मापने से पहले 30 एस के लिए एक सीलेबल/कैप्ड शीशी और भंवर में नमूना स्थानांतरित करें।
  5. माइक्रोबबल्स या बूंदों(चित्रा 6)के फ्लोरेसेंस को मापें।
    नोट: चित्रा 6 केवल 30% पायरो-लिपिड निर्माण से पता चलता है।
    1. फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर, एक्सट्रवेंशन वेवलेंथ को 410 एनएम के रूप में सेट करें और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 1 एनएम वेतन वृद्धि के साथ 600 से 750 एनएम तक हो।
    2. फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ संगत है कि एक कुवेट का उपयोग कर एक आधार रेखा प्राप्त करने के लिए पीबीएस मंद की फ्लोरेसेस को मापने।
    3. पीबीएस में पायरो-लिपिड माइक्रोबबल्स या बूंदों को पतला करें (2000 में बूंदों के 0.5 माइक्रोन से 10 माइक्रोन की सिफारिश करें) और पिपटिंग द्वारा मिलाएं।
      नोट: भंवर मत करो वरना विधानसभाओं को नष्ट कर दिया जाएगा।
    4. पतला नमूना को साफ, बेस्राल क्यूवेट में स्थानांतरित करें और फ्लोरेसेंस को मापें। यदि आवश्यक हो तो कमजोर पड़ने को बदलें और संकेत संतृप्ति से बचें।
    5. स्टेप्स 5.5.1 से 5.5.4 तक दोहराएं लेकिन पीबीएस के बजाय 1% ट्राइटन का उपयोग करें। 1% ट्राइटन में पतला करने के बाद, मापने से पहले 30 एस के लिए एक सीलन/कैप्ड शीशी और भंवर में पतला नमूना स्थानांतरित करें। भंवर से उत्पन्न बुलबुले लेजर पथ से ऊपर हैं सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त मात्रा जोड़ें।
      नोट: ट्राइटन में नमूने का फ्लोरेसेंस सिग्नल फ्लोरेसेंस अनकांपिंग(चित्रा 6)के कारण पीबीएस की तुलना में बहुत अधिक होगा।

6. वाष्पीकरण इमेजिंग

  1. एक उचित आकार के पानी की टंकी को डिएकोनाइज्ड पानी से भरें और इसे वायुमंडल के साथ पानी में गैसों को बराबर करने के लिए 24 घंटे तक आराम करने दें।
  2. बूंदों को तैयार करें और उपयोग तक बर्फ और अंधेरे में रखें।
  3. पेलो एट अल द्वारा वर्णित 2% एगर से एक प्रवाह प्रेत ट्यूब बनाएं।18 प्रेत को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी की टंकी में डूबे।
  4. पीबीएस को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और प्रेत के माध्यम से प्रवाहित करें।
  5. एक पूर्व नैदानिक अल्ट्रासाउंड प्रणाली और 21 मेगाहर्ट्ज रैखिक सरणी ट्रांसड्यूसर (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ, प्रवाह प्रेत के दृश्य को संरेखित करें, इसे बी-मोड इमेजिंग में सेट करें, आउटपुट दबाव सेट करें, और प्रत्येक दबाव पर बेसलाइन प्राप्त करने के लिए वीडियो या छवियों को कैप्चर करें।
  6. बूंद के 20 माइक्रोन को 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के 50 एमएल में पतला करें और धीरे-धीरे मिलाएं। समाधान को 30 एमएल प्लास्टिक सिरिंज में स्थानांतरित करें और समाधान को आगर प्रेत के माध्यम से धक्का दें।
  7. चरण 6.5 के समान संरेखण को ध्यान में रखते हुए, वाष्पीकरण देखे जाने तक आउटपुट दबाव बढ़ाएं (प्रेत में उज्ज्वल धब्बे, चित्रा 7देखें)।
    नोट: चित्रा 7 30% पायरो-लिपिड बूंद नमूना दिखाता है । यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 21 मेगाहर्ट्ज रैखिक सरणी ट्रांसड्यूसर इमेजिंग और वाष्पीकरण बूंदों दोनों में सक्षम है।

Representative Results

पूर्व-संघनित, आकार-चयनित माइक्रोबबल नमूने(एन = 3) और बाद-संघनित बूंद नमूने(एन = 3) को 10 माइक्रोन एपर्चर के साथ कूल्टर काउंटर (सीसी) पर आकार दिया गया था। 10 माइक्रोन अपर्चर की एक सीमा यह है कि यह 200 एनएम से छोटे कणों को माप नहीं सकता है, जो मतलब आकार और एकाग्रता को पूर्वाग्रह कर सकता है। चित्रा 4 पायरो-लिपिड सामग्री योगों में से प्रत्येक के लिए आकार देने का डेटा दिखाता है। तालिका 1 आकार देने वाले आंकड़ों के आधार पर आंकड़े दिखाता है। पूर्व और बाद गाढ़ा मतलब व्यास के अनुपात का उपयोग करना, परिणामों से पता चला है कि 0% Pyro-लिपिड निर्माण १.७२ ± ०.०२ पर सबसे छोटा मतलब व्यास बदलाव था । 50% पायरो-लिपिड फॉर्मूलेशन में 2.38 ± 0.08 पर सबसे बड़ा मतलब व्यास था। 1% पायरो-लिपिड बूंद नमूने में सबसे अधिक मनाया गया एकाग्रता (२.७१ ± ०.१३) ×१० १०/एमएल जबकि ४०% पायरो-लिपिड ड्रॉपलेट नमूने में सबसे कम मनाया एकाग्रता थी (७.३६ ± ०.८१) × १०९/mL । आकार घटाने के आंकड़ों से पता चला 10% Pyro-लिपिड बूंद नमूना २६१ ± 13 एनएम पर सबसे छोटा पीक डिमीटर था, जबकि ५०% Pyro-लिपिड बूंद नमूना ३९० ± ५५ एनएम में सबसे बड़ा था । आम तौर पर, जैसे-जैसे पायरो-लिपिड सामग्री बढ़ी, एकाग्रता में कमी आई और मतलब व्यास बढ़ गया। चूंकि बाद के संघनित नमूने अग्रदूत माइक्रोबबल नमूने पर आधारित होते हैं, इसलिए प्रवृत्ति दोनों प्रकार के अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों के लिए हुई। जैसे-जैसे पाइरो-लिपिड सामग्री बढ़ी, एक माइक्रोबबल सब पॉपुलेशन (लगभग 2000 माइक्रोन पर पीक आकार के साथ) का निर्माण शुरू हो गया। यह माध्यमिक चोटी 0% पायरो-लिपिड माइक्रोबबल नमूने में मौजूद नहीं थी और 40% और 50% पायरो-लिपिड आबादी में सबसे स्पष्ट थी।

चित्रा 5 30% पायरो-लिपिड बूंदी नमूने के प्रतिनिधि अवशोषण माप से पता चलता है। पीबीएस में बरकरार सैंपल की पीक 700 एनएम रही जबकि ट्राइटन में बाधित सैंपल ने चोटी को 671 एनएम पर शिफ्ट कर दिया। इससे पता चला कि अक्षुण्ण असेंबल में व्यक्तिगत, असेंबल लिपिड घटकों की तुलना में अलग-अलग ऑप्टिकल गुण होते हैं।

चित्रा 6A पूर्व-संघनित माइक्रोबबल नमूने के प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस माप दिखाता है जबकि चित्रा 6B 30% पायरो-लिपिड के साथ बाद-गाढ़ा बूंदी नमूना दिखाता है। पीबीएस में बरकरार सैंपल में फ्लोरेसेंस पीक 704 एनएम पर था जबकि बाधित फॉर्म में 674 एनएम पर पीक था। वक्र के तहत बरकरार क्षेत्र के साथ वक्र के तहत बाधित क्षेत्र को घटाना, और वक्र के तहत बाधित क्षेत्र द्वारा अंतर को विभाजित करना शमन दक्षता देता है, जो क्रमशः 30% पायरो-लिपिड माइक्रोबबल और नमूना बूंद नमूने के लिए 98.61% और 98.07% होता है।

माइक्रोबबल्स में परिवर्तित बूंदों को प्रदर्शित करने के लिए, अल्ट्रासाउंड प्रणाली के साथ 37 डिग्री सेल्सियस प्रवाह प्रेत में पतला बूंदों को चित्रित और वाष्पित किया गया था। चित्रा 7 विभिन्न दबावों पर इमेज्ड 30% पायरो-लिपिड बूंद नमूने के प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवियों को दिखाता है। कम दबाव(चित्रा 7A)पर, वहां बहुत कम संकेत था, हवा के बुलबुले से केवल पृष्ठभूमि संकेत आगर संश्लेषण से अटक गया । इसका कारण यह है कि बूंदें गैर-इकोजेनिक हैं और अल्ट्रासाउंड नहीं करती हैं। थोड़ी उच्च शक्ति पर, उज्ज्वल धब्बे की उपस्थिति से दिखाए गए कुछ माइक्रोबबल(चित्रा 7B)उत्पन्न हुए थे। जैसे-जैसे दबाव बढ़ता गया, अधिक माइक्रोबबल्स उत्पन्न होते गए(चित्रा 7सी और 7D)। इससे यह भी पता चला कि बूंदें अनायास 37 डिग्री सेल्सियस पर वाष्पित नहीं होंगी।

Figure 1
चित्रा 1:30% पायरो-लिपिड समाधान बनाने के लिए चरणों की छवियां। A)क्लोरोफॉर्म में लिपिड पाउडर प्लस पायरो-स्पीसी। B)भंग समाधान जोड़ा गया । ग)लिपिड फिल्म सूख गई और शीशी की आंतरिक दीवार पर लेपित । घ)लिपिड शीशी एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे (बाहरी पन्नी पुन: उपयोग के लिए टेप) । ई)हाइड्रेटेड लिपिड समाधान। एफ)सीरम शीशी में लिपिड समाधान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:10-कई गुना गैस एक्सचेंजर। प्रोटोकॉल में संदर्भित वाल्व लेबल किए गए हैं। गैस एक्सचेंजर को इकट्ठा करने के बारे में निर्देशों के लिए पूरक फ़ाइल "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: ए) नमूना शीशियों में 7 फॉर्मूलों (0% से 50% पायरो-एससीपी) के लिपिड समाधान। आंकड़े बी से डी 30% पायरो-लिपिड बूंदों को बनाने के लिए उठाए गए कदमों की छवियां दिखाते हैं । B)एक नमूना शीशी में 30% पायरो-लिपिड समाधान। C)आंदोलन के बाद । घ)15 मिनट आकार-चयनित। ई)नीचे विभाजन decafluorobutane शीशी को हस्तांतरित किया । घ)संघनन के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:कूल्टर काउंटर (सीसी) विभिन्न पायरो-लिपिड शेल सामग्री(एन = 3) के साथ आकार-चयनित माइक्रोबबल और बूंद के नमूनों के डेटा को आकार देना। ठोस हरी रेखाएं माइक्रोबबल्स का प्रतिनिधित्व करती हैं और बिंदीदार सियान लाइनें बूंदों का प्रतिनिधित्व करती हैं। A)0% पायरो-एससीसी। B)1% पायरो-एससीसी। C)10% पायरो-एससीसी। घ)20% पायरो-एससीसी। ई)30% पायरो-एससीसी। एफ)40% पायरो-एससीसी। जी)50% पायरो-एससीसी। ज)खोल में पायरो-एससीसी सामग्री के आधार पर सीसी से माइक्रोबबल और बूंद नमूनों की कुल देखी गई सांद्रता । सभी त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है। सभी माप 10 माइक्रोन अपर्चर का उपयोग करके किए गए थे जिसमें 200 एनएम से 6000 एनएम तक की आकार सीमा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:प्रतिनिधि पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विस) स्पेक्ट्रोस्कोपी अवशोषण माप 300 से 800 एनएम के बाद गाढ़ा 30% पायरो-लिपिड बूंद नमूना पीबीएस में पतला और 1% ट्राइटन में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6-410 एनएम पर 600 से 750 एनएम तक प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस उत्सर्जन। A)आकार-चयनित, पीबीएस में पूर्व-संघनित 30% पायरो-लिपिड माइक्रोबबल नमूना और 1% ट्राइटन में। B)पीबीएस में 30% पायरो-लिपिड बूंद नमूना और 1% ट्राइटन में बाद गाढ़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:बी-मोड में प्री-क्लीनिकल 21 मेगाहर्ट्ज रैखिक सरणी ट्रांसड्यूसर (सामग्रियों की तालिका देखें) के साथ लिए गए 37 डिग्री सेल्सियस एगर फ्लो फैंटम की प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवियां। बायां कॉलम(आंकड़े ए, सी, ईऔर जी)पीबीएस नियंत्रण दिखाता है। सही कॉलम(आंकड़े बी, डी, एफ,और एच)37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के 50 मिलील में पतला पोस्ट-कंडेंसेड 30% पायरो-लिपिड ड्रॉपलेट नमूना के 20 माइक्रोन दिखाता है। प्रत्येक पंक्ति मुक्त क्षेत्र पीक नकारात्मक दबाव है, जो शीरन एट अल द्वारा किए गए काम से अनुमानित किया गया का प्रतिनिधित्व करता है ।8 पीले त्रिकोण ध्यान गहराई से संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पद्धति एजेंट पायरो शेल % 0 1 10 20 30 40 50
प्रतिलिपि बुलबुले कॉन. [/एमएल] (2.76 ± 0.28) × 10 ^10 (3.04 ± 0.15) × 10 ^10 (2.02 ± 0.11) × 10 ^10 (1.91 ± 0.22) × 10 ^10 (1.47 ± 0.05) × 10 ^10 (8.47 ± 0.95) × 10 ^9 (9.89 ± 0.15) × 10 ^9
प्रतिलिपि बुलबुले पीक [एनएम] 329 ± 6 297 ± 15 305 ± 21 273 ± 14 310 ± 40 266 ± 33 393 ± 89
प्रतिलिपि बुलबुले मतलब [एनएम] 609 ± 2 603 ± 15 635 ± 6 690 ± 8 812 ± 1 935 ± 22 950 ± 55
प्रतिलिपि बुलबुले मीडियन [एनएम] 450 ± 6 421 ± 6 414 ± 6 432 ± 5 490 ± 2 596 ± 37 695 ± 41
प्रतिलिपि बूदें कॉन. [/एमएल] (2.18 ± 0.07) × 10 ^10 (2.71 ± 0.13) × 10 ^10 (1.75 ± 0.18) × 10 ^10 (1.72 ± 0.13) × 10 ^10 (1.09 ± 0.01) × 10 ^10 (7.36 ± 0.81) × 10 ^9 (7.38 ± 0.28) × 10 ^9
प्रतिलिपि बूदें पीक [एनएम] 292 ± 0 297 ± 17 261 ± 13 280 ± 9 268 ± 17 287 ± 38 390 ± 55
प्रतिलिपि बूदें मतलब [एनएम] 353 ± 5 350 ± 5 347 ± 1 347 ± 4 397 ± 1 399 ± 6 400 ± 7
प्रतिलिपि बूदें मीडियन [एनएम] 318 ± 4 318 ± 4 310 ± 1 315 ± 2 340 ± 0 367 ± 5 370 ± 9

तालिका 1: कूल्टर काउंटर (सीसी)(एन = 3) से विभिन्न पायरो-एससीसी सामग्री के साथ माइक्रोबबल और बूंद के नमूनों के डेटा आंकड़े आकार घटाना। सभी त्रुटियां मानक विचलन का संकेत देती हैं।

अनुपूरक सूचना - लिपिड फॉर्मूला शीट: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक सूचना - अन्य प्रोटोकॉल और डेटा: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

सभी लिपिड घटकों को एक साथ जोड़ने के बाद (चरण 1.2 और 1.4.5, चित्रा 1 ए),क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल का एक समाधान (और पानी यदि डीएसपीए जैसे फॉस्फाटिड एसिड लिपिड मौजूद हैं) को यह सुनिश्चित करने के लिए जोड़ा गया था कि पायरो-लिपिड और गैर-पायरो लिपिड घटक पूरी तरह से समरूप थे (चरण 1.5, चित्रा 1B)। विषम लिपिड संरचना के साथ लिपिड वेसिकल्स के गठन को रोकने के लिए, भंग लिपिड को एक पतली फिल्म(चित्रा 1C)के रूप में शीशी की दीवार के इंटीरियर पर सुखा दिया गया था और लेपित किया गया था। कोटिंग (चरण 1.6) हाइड्रेशन (चरण 2.1 से 2.4) को भी आसान बनाता है क्योंकि यह सूखे फिल्म के सतह क्षेत्र को बढ़ाता है। सुखाने (चरण 1.6, चित्रा 1C)और वैक्यूमिंग (चरण 1.8, चित्रा 1D)को सुनिश्चित करने के लिए किया गया था ताकि क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल को पूरी तरह से सुखाया जा सके क्योंकि ये रसायन माइक्रोबबल के गठन को बाधित कर सकते हैं। जबकि प्रोटोकॉल को लिपिड समाधान की मात्रा को 1 एमएल जितना कम बनाने के लिए बढ़ाया जा सकता है, बड़ी मात्रा में शीशी-से-शीशी भिन्नता को कम किया जा सकता है। हालांकि यह उपयोग में नहीं रहते हुए पायरो-SPC अपमानजनक का खतरा चला सकता है, लिपिड समाधान (चरण 2.9 से 2.10) की भंडारण स्थिति उस जोखिम को कम करने के लिए थी। गैस एक्सचेंजर (चरण 2.9.2, चित्रा 1F और चित्रा 2)के साथ डीगैसिंग चरण ऑक्सीकरण को रोकने के लिए जितना संभव हो उतना ऑक्सीजन को खत्म करने का काम करता है। पोर्फिरिन-लिपिड युक्त लिपिड समाधानों को संग्रहीत करने की सिफारिश नहीं की जाती है जबकि वायुमंडलीय गैसें अभी भी समाधान(चित्रा 1E)में भंग हो जाती हैं।

चरण 2.10 में, लिपिड समाधान एक दबाव वाले हेडस्पेस के साथ सीरम शीशी में है, इसी तरह चिकित्सकीय रूप से अनुमोदित अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट परफ्लुट्रेन लिपिड माइक्रोस्फीयर बेचे जाते हैं (चित्र 1एफके समान)। आंतरिक कार्य से पता चला है कि यदि टोपी रबर डाट की तरह एक नरम सामग्री थी तो पायरो-लिपिड की उपस्थिति के साथ यांत्रिक आंदोलन के माध्यम से स्थिर माइक्रोबबल उत्पन्न नहीं किए जा सकते थे। इसलिए, लिपिड समाधान को गैर-रबर फेनोलिक कैप (चरण 4.1 से 4.4, चित्रा 3 ए और 3B)के साथ एक नमूना शीशी में स्थानांतरित कर दिया गया था। जब डेकाफ्लोरोबुटेन गैस को नमूना शीशी (चरण 4.1 से 4.4) में प्रवाहित किया गया था, तो डेंजर डेकाफ्लोरोबुटेन को नमूने शीशी हेडस्पेस में वायुमंडलीय हवा को विस्थापित करना चाहिए। वर्तमान में, यह अज्ञात है कि पायरो-लिपिड रबर डाट के साथ माइक्रोबबल बनाने में असमर्थ क्यों हैं। कोई पायरो-लिपिड के साथ, स्थिर माइक्रोबबल सीधे सीरम शीशियों में रबर डाट4,7के साथ बनाया जा सकता है। इस प्रकार, गैस एक्सचेंजर का उपयोग करके सीरम शीशी को फिर से दबाव बनाने और सीरम शीशी पर फिर से दबाव बनने की सिफारिश की जाती है, फिर सीरम शीशी को गैर-पायरो-लिपिड फॉर्मूलेशन4,5,6,7 (देखें "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" के लिए आंदोलन करते हैं)। सीरम शीशी में यांत्रिक रूप से उत्तेजित करने में सक्षम होने का लाभ हेडस्पेस पर दबाव बनाया जा सकता है और सीरम शीशी को उल्टा करके आकार-चयन किया जा सकता है8। इस प्रोटोकॉल में, 0% पायरो-लिपिड फॉर्मूलेशन को एक नमूना शीशी (चरण 4.1 से 4.4) में स्थानांतरित कर दिया गया था ताकि पायरो-लिपिड शामिल फॉर्मूलेशन के अनुरूप हो। इसके अतिरिक्त, लंबे समय तक एसील लिपिड चेन लंबाई बेहतर वैन डेर वाल्स इंटरैक्शन19के कारण अधिक स्थिर बूंदों में परिणाम देती है। लिपिड शेल संरचना को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध था, सभी लिपिड प्रकारों के लिए 18-एसील चेन लंबाई के आधार पर चुना गया था। DSPE-PEG5K को सभी फॉर्मूलेशन (चरण 1.1) में शामिल किया गया था क्योंकि पॉलीथीन ग्लाइकोल चेन की उपस्थिति प्रतिकारक स्टेक बलों19के माध्यम से संरचनाओं के संयोजन को रोकती है। लिपिड हाइड्रेशन के दौरान, बाथ सोनिकेटर बाथ को 18-एसील चेन लेंथ लिपिड फिल्म 18 को पूरी तरह से तितर-बितर करने के लिए काफी उच्च के रूप में 70 डिग्री सेल्सियस (चरण2.1)के लिए सेट किया गया था। अब एसील चेन लंबाई के लिए, उच्च तापमान की आवश्यकता होगी।

उच्च पायरो-लिपिड लोडिंग ऑप्टिकल रूप से अवशोषित और फ्लोरेसेपिंग घटकों की एकाग्रता में वृद्धि करेगी, जो कुछ अनुप्रयोगों के लिए वांछित हो सकता है जो अधिकतम पोर्फिरिन लोडिंग से लाभान्वित होते हैं। हालांकि, जैसे-जैसे पायरो-लिपिड सामग्री बढ़ी, नमूदार बूंद एकाग्रता में कमी आई और व्यास बढ़ गए(चित्र 4 और तालिका 1)। यह ऑप्टिकल फ्लोरेसेंस और अवशोषण गुणों बनाम बूंद एकाग्रता और व्यास के बीच एक व्यापार-बंद दिखाता है। शोधकर्ताओं के लिए है कि छोटे टपका हुआ जहाजों के माध्यम से वीवो संचय में के लिए छोटे व्यास को प्राथमिकता चाहिए या यदि बूंदों की एक उच्च एकाग्रता इंजेक्शन की जरूरत है, बढ़ती Pyro-लिपिड लोडिंग बूंदी डिमीटर में वृद्धि या बूंद एकाग्रता में कमी के लायक नहीं हो सकता है । यदि उच्च बूंद सांद्रता और/या छोटी बूंद व्यास सर्वोपरि हैं, तो इसी तरह के आकार के साथी नैदानिक एजेंटों पर पायरो-लिपिड के बजाय विचार किया जाना चाहिए । जबकि 1% पायरो-लिपिड बूंदों के परिणामस्वरूप एकाग्रता में कमी या आकार में वृद्धि नहीं हुई, 1% पायरो-लिपिड लोडिंग ऊतक पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंटी से यथोचित रूप से पता लगाने योग्य होने के लिए बहुत कम हो सकती है। हालांकि, पोर्फिरिन मोइज़िटी का लचीलापन कार्यात्मकता के लिए कई विकल्प प्रदान करता है जो कम एकाग्रता वाले अनुप्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त मात्राकरण के वैकल्पिक साधन प्रदान करेगा। उदाहरण के लिए, पायरो-लिपिड को पोसिटन उत्सर्जन टोमोग्राफी इमेजिंग और गामा गिनती20के लिए तांबे-64 के साथ या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके ट्रेस-मेटल क्वांटिफिकेशन के लिए पैलेडियम के साथ या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग14के लिए मैंगनीज के साथ किया जा सकता है।

जबकि कुछ प्रयोगों के लिए केवल बूंद समाधान की एक छोटी मात्रा की आवश्यकता हो सकती है, 1.85 एमएल नमूना शीशी को भरने के लिए लिपिड समाधान के 1 एमएल की आवश्यकता होती है। Goertz एट अल का प्रदर्शन किया है कि हैंडलिंग, हेडस्पेस दबाव, तरल से गैस अनुपात में परिवर्तन, और यहां तक कि शीशी आकार सभी माइक्रोबबल आबादी को प्रभावित कर सकते हैं17। आंदोलन और आकार-चयन के दौरान शीशी का तापमान आकार वितरण को भी प्रभावित कर सकता है। इसलिए, अंतिम उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित तरीकों के लिए, बूंदों को बनाते समय जितना संभव हो उतना सुसंगत होना महत्वपूर्ण है। बिना खोली बूंदों को फ्रीज किया जा सकता है (-20 डिग्री सेल्सियस) और भविष्य के उपयोग के लिए बाद में गल सकता है लेकिन यह आकार की आबादी को प्रभावित करेगा।

आंदोलन प्रक्रिया जो माइक्रोबबल्स में लिपिड समाधान को सक्रिय करती है, एक रूपात्मक सजातीय आबादी (चरण 4.6) का उत्पादन नहीं करती है; बल्कि, नमूना माइक्रोबबल्स, मल्टीलैमलर वेसिकल्स, लिपोसोम्स, और मिसेल्स18, 21,22से भरा हुआ है । जबकि माइक्रोबबल आकार माइक्रोन और नैनोमीटर रेंज का विस्तार करते हैं, अन्य संरचनाएं काफी हद तक 800 एनएम 23से नीचे हैं। उपयोग की जाने वाली आकार तकनीकें इन विभिन्न संरचनाओं के बीच अंतर नहीं करती हैं, और इस प्रकार उत्तेजित माइक्रोबबल नमूने (चरण 4.6, चित्रा 3 सी)और बाद में संघनित बूंद नमूने (चरण 4.14, चित्रा 3F)को मिश्रण के रूप में माना जाना चाहिए। अल्ट्रासाउंड-असंवेदनशील विधानसभाओं (मल्टीलैमलर वेसिकल्स, लिपोसोम्स और मिसेल्स) की संभावना संघनन के बाद संरक्षित है और आकार में परिवर्तन नहीं होगा क्योंकि उनके पास चरण-परिवर्तनीय कोर नहीं हैं। चूंकि कल्टर काउंटर इन विभिन्न सुप्रामोलेक्यूलर विधानसभाओं के बीच अंतर नहीं कर सकता है, इसलिए संघनन के बाद जनसंख्या आकार में बदलाव की व्याख्या इस धारणा के साथ की जानी चाहिए कि नैनोस्केल संरचनाओं का कुछ अनुपात अचरज है और उस आकार के क्षेत्र में देखी गई आबादी में योगदान देता है। इसके अतिरिक्त, ये संरचनाएं इन नमूनों के स्पेक्ट्रोस्कोपिक और फ्लोरोसेंट हस्ताक्षरों में योगदान देती हैं14। मिकेल, लिपोसोम/वेसिकल्स और बूंदों के फ्लोरेसेंस और अवशोषण हस्ताक्षर सभी समान हैं, जिनमें फ्लोरेसेंस की उनकी डिग्री14को बुझाने की है । इस प्रकार, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि आंकड़े 3C से 3F में विधानसभाओं का मिश्रण है, चित्रा 4,पीबीएस पतला नमूना चित्रा 5में, और पीबीएस चित्रा 6में नमूना पतला ।

आकार-चयन और संघनन से पहले और संघनन (चरण 4.9) से पहले, गैर-उछाल वाले बुलबुले को गैर-प्रसन्न करने वाली विधानसभाओं से अलग करने के लिए माइक्रोबबल नमूने को अपकेंद्री करके गैर-बुलबुले विधानसभाओं को खत्म करना संभव है जैसा कि फेशिटन एट अल द्वारा वर्णित है।21 सेपरेशन की डिग्री को स्पिन बल और अवधि को समायोजित करके नियंत्रित किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के आकार-अलग नमूनों के माइक्रोबबल संघनन के प्रयोगों से पता चला है कि आकार अलगाव प्रक्रियाओं का उपयोग करके चुने गए बड़े अग्रदूत माइक्रोबबल आबादी का उपयोग करके बड़ी बूंदें मिलीं (पोस्ट-काता बुलबुला और बूंद आकार के लिए "अन्य प्रोटोकॉल और डेटा" चरण S5 देखें)। चूंकि इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पादित बूंदों का एक इच्छित आवेदन माइक्रोबबल4, 8कीतुलना में उनके छोटे आकार के कारण निष्क्रिय अपव्यवहार और संचय के लिए एक मंच है, इसलिए बूंदआबादीजो यथासंभव छोटी है वांछित थी। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल ने उत्तेजित माइक्रोबबल नमूनों का उपयोग किया जो अपकेंद्रित्र के माध्यम से आकार-अलग नहीं थे, भले ही इसका मतलब अल्ट्रासाउंड-असंवेदनशील माइकेल, लिपोसोम्स और वेसिकल्स अंतिम समाधान में मौजूद थे। इसका मतलब यह है कि जैव वितरण के लिए मात्राकरण प्रक्रियाओं इंजेक्शन संरचनाओं के सभी के लिए संकेत प्राप्त होगा और सिर्फ बूंदों तक ही सीमित नहीं हैं । हालांकि, चूंकि ये इसी तरह के आकार की संरचनाएं मुख्य रूप से आकार से तय होने वाले निष्क्रिय तंत्र के माध्यम से जमा होती हैं, इसलिए यह संदेह नहीं है कि यदि इस मंच का उपयोग वीवो मेंकिया जाना है तो इसे मुख्य निष्कर्ष ों को बदलना चाहिए, हालांकि इन सभी पहलुओं पर व्यक्तिगत रूप से विचार किया जाना चाहिए जिस संदर्भ में मंच का उपयोग किया जा सकता है। अल्ट्रासाउंड के साथ और बिना प्रयोगात्मक हथियारों का उपयोग करके परीक्षण यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि यह अल्ट्रासाउंड-संवेदनशील बूंदें हैं जो जैव-वितरण में किसी भी परिवर्तन के लिए जिम्मेदार हैं, क्योंकि समाधान में केवल परफ्लोरोकार्बन कोर असेंबली अल्ट्रासाउंड का जवाब देगी।

आंदोलन के बाद, शीशी को 15 मिनट के लिए विश्राम दिया गया और शीशी(चित्रा 3सी बनाम 3 डी)में एक विभाजन देखा गया। उछाल के माध्यम से आकार-चयन एक सक्रिय माइक्रोबबल समाधान8,17से बड़ी संरचनाओं/बुलबुले को नष्ट करने का एक सरल तरीका है। इस मामले में, 5 माइक्रोन से अधिक व्यास वाले कणों को ज्यादातर आकार-चयन(चित्र 4) केबाद हटा दिया गया था। आकार-चयन की सीमा को आकार-चयन17की अवधि को नियंत्रित करके ट्यून किया जा सकता है। शीरन एट अल ने दिखाया है कि आकार-चयन नहीं करने से उत्पन्न माइक्रोबबल्स हो सकते हैं जो वाक्यूल्चर 8 को ऑक्सीलेडकरतेहैं।

परफ्लोरोकार्बन्स को जैविक रूप से निष्क्रिय होने का लाभ होता है7. जबकि डेकाफ्लोरोबुटेन का उबलते बिंदु -1.7 डिग्री सेल्सियस है, शरीर के तापमान से ऊपर, बूंदों को 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 7B)के संपर्क में आने पर तुरंत वाष्पित नहीं किया जाता है। चूंकि बूंदें 37 डिग्री सेल्सियस पर मेटा-स्थिर होती हैं, इसलिए बूंदों को माइक्रोबबल्स7,9में वाष्पित करने के लिए अतिरिक्त ध्वनिक ऊर्जा की आवश्यकता होती है। पॉप्रोस्की एट अल ने दबाव22के माध्यम से संघनित पोर्फिरिन बूंदों का प्रदर्शन किया है। यह कम घने परफ्लोरोकार्बन का उपयोग करते समय एक व्यवहार्य और यहां तक कि आवश्यक विधि है लेकिन उच्च दबाव इस प्रक्रिया में कुछ बुलबुले को नष्ट कर सकता है। ऑक्टाफ्लोरोप्रोपेन (सी3एफ8)में -36.7 डिग्री सेल्सियस का उबलता बिंदु होता है, इसलिए बूंद संघनन के लिए ठंडा और दबाव दोनों की आवश्यकता होती है। हालांकि, हल्का परफ्लोरोकार्बन कम स्थिर बूंदों की ओर जाता है। डोडेकैफ्लोरोपेनटेन (सी5एफ12) 28डिग्री सेल्सियस के उबलते बिंदु के साथ अधिक स्थिर बूंदों का कारण बन सकता है। हालांकि, यह कमरे के तापमान पर एक तरल है और वाष्पीकरण के लिए मजबूत ध्वनिक ऊर्जा की आवश्यकता होगी। इस प्रकार, अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट की युक्त गैस के विकल्प को अपने निर्माण के मापदंडों के अलावा अपने इच्छित जैविक आवेदन की स्थितियों पर विचार करना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, संघनन के लिए आइसोप्रोपैनॉल स्नान -15 से -17 डिग्री सेल्सियस (चरण 4.7.1 और चरण 4.13) के लिए निर्धारित किया गया था, जबकि अन्य प्रोटोकॉल का उपयोग -10 डिग्री सेल्सियस 5,6। यहां तक कि एक आम डेकाफ्लोरोबुटेन कोर के साथ, संघनन तापमान एक्सपिएपिएंट संरचना, कुल लिपिड एकाग्रता और लिपिड शेल संरचना के आधार पर भिन्न हो सकता है। यदि अन्य योगों का उपयोग कर रहे हैं, तो समाधान को फ्रीज किए बिना उचित बूंद संघनन सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

चूंकि बूंदें अपने माइक्रोबबल अग्रदूत 7 की तुलना में छोटी और अधिक स्थिर होती हैं , इसलिए वे कुछ ट्यूमर प्रकार 4 ,24जैसे कुछ ऊतकों में बहिष्ती होने के लिए निष्क्रिय संचय तंत्र का बेहतर लाभ उठा सकती हैं । फ्लोरोसेंट, ऑप्टिकली शोषक, और पता लगाने के ध्वनिक तरीकों केसाथ,तेज की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक ही सूत्रीकरण का उपयोग करना संभव है। इसके अतिरिक्त, इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि क्या बूंदों का ध्वनिक वाष्पीकरण निष्क्रिय स्तर16से परे वितरित एजेंट अंश में सुधार कर सकता है। इंजेक्शन के बाद ऊतकों और ब्याज के अंगों में एजेंट जैव वितरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पायरो-लिपिड बूंदों की एक ज्ञात मात्रा जानवर में इंजेक्ट की जानी चाहिए, नियंत्रण सेट के आधार पर अल्ट्रासाउंड लागू किया जा सकता है या नहीं लगाया जा सकता है, जानवर को पूर्व-निर्दिष्ट समय-बिंदु का त्याग किया जाना चाहिए, और अंगों को हटाया जाना चाहिए और तौला जाना चाहिए। अंगों को ऊतक को डीसेलुलराइज करने के लिए सर्फेक्टेंट (डिटर्जेंट) में समरूप, फ़िल्टर किया जाना चाहिए, और पायरो संकेतों के आधार पर प्रति अंग द्रव्यमान इंजेक्शन खुराक प्रतिशत प्राप्त करने के लिए फ्लोरेसेंस या यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए। चरण 5.4.5(चित्रा 5)और चरण 5.5.5(चित्रा 6),ट्राइटन एक्स-100 सर्फेक्टेंट (डिटर्जेंट) का उपयोग नमूनों को बाधित करने के लिए किया गया था क्योंकि यह 410 एनएम पर गैर-फ्लोरोसेंट है और इसकी अवशोषण तरंगदैर्ध्य पायरो के साथ ओवरलैप नहीं होता है।

माइक्रोबबल्स को यूवी-विस अवशोषण के साथ विशेषता नहीं थी। चूंकि यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोप का लेजर स्रोत डिटेक्टर के समानांतर है, इसलिए कोई भी बड़े बुलबुले डिटेक्टर से प्रकाश को तितर-बितर कर सकते हैं, जिससे वे अधिक ऑप्टिकली शोषक14दिखाई देते हैं। यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के विपरीत, फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का डिटेक्टर है/डिटेक्टर के साथ हस्तक्षेप करने से स्रोत को रोकने के लिए लेजर स्रोत के लिए लंबवत होना चाहिए । यूवी-विस का उपयोग अक्षुण्ण और बाधित बूंद नमूनों (चरण 5.4, चित्र 5)के अवशोषण को निर्धारित करने के लिए किया गया था। 300 से 800 एनएम को सोरो-लिपिड के दो मुख्य अवशोषण बैंड, सोरेट बैंड (340 से 500 एनएम) और क्यू-बैंड (640 से 730 एनएम) के रूप में अवशोषण तरंगदैर्ध्य के रूप में चुना गया था, जो इस सीमा14के भीतर आते हैं। जब एक बूंद (या अन्य सुप्रामोलेकुलर संरचनाओं) में इकट्ठा होता है, तो पायरो-लिपिड की क्यू-बैंड चोटी को लाल-671 एनएम से 700 एनएम(चित्रा 5)में स्थानांतरित कर दिया जाता है। जब इस सुप्रामोलेक्यूलर संरचना को ट्राइटन जैसे सर्फेक्टेंट द्वारा बाधित किया जाता है, तो चोटी 671 एनएम14, 15में वापस आजातीहै। इस बदलाव के आधार पर यह बताना संभव है कि पायरो-लिपिड इकट्ठे अवस्था में हैं या बाधित अवस्था में । समय के साथ विधानसभाओं के क्षय का अनुमान लगाने के लिए दो चोटियों के अनुपात का उपयोग किया जा सकता है।

फ्लोरेसेंस मापन (चरण 5.5, चित्र 6)के लिए 410 एनएम की एक उत्तेजन तरंगदैर्ध्य को चुना गया था क्योंकि यह असेंबल किए गए पायरो-लिपिड14के लिए सोरेट बैंड पीक से मेल खाती है। 600 से 800 एनएम तक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य सीमा को पीबीएस में अक्षुण्ण विधानसभाओं की चोटियों के रूप में चुना गया था और ट्राइटन में बाधित पायरो-लिपिड इस सीमा के भीतर निहित हैं। फ्लोरेसेंस में बदलाव और वृद्धि(चित्रा 6)बरकरार (पीबीएस में 704 एनएम) और बाधित (ट्राइटन में 674 एनएम) नमूने संरचना-प्रेरित शमन के कारण हुए। इकट्ठे रूप में, पायरो-लिपिड अणुओं को एक साथ बारीकी से पैक किया गया था ताकि उत्पन्न फोटॉन पास के पायरो-लिपिड अणुओं द्वारा अवशोषित हो गए। यह अक्षुण्ण बनाम बाधित शमन दक्षता में स्पष्ट है । इस प्रकार, 1% ट्राइटन एक्स-100 जैसे सर्फेक्टेंट (डिटर्जेंट) में नमूनों को पतला करना आवश्यक है ताकि बुझाने और जैव-वितरण क्वांटिफिकेशन14के लिए सिग्नल को अधिकतम किया जा सके।

सादगी के लिए, एक ही रैखिक सरणी अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर का उपयोग वाष्पीकरण और छवि दोनों (चरण 6.5 और 6.7, चित्र 7)दोनों के लिए किया गया था। यह अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर (सामग्री की तालिका) बूंदों को वाष्पित करने के लिए आवश्यक चरम नकारात्मक दबावों तक पहुंचने में सक्षम था8। एक नल से deionized पानी के साथ एक टैंक भरने गैसों कि पानी में भंग हो उत्पन्न करता है (चरण ६.१) । वाष्पीकरण और इमेजिंग के साथ पानी में घुलित गैसों से हस्तक्षेप को कम करने के लिए, पानी को टैंक में 24 घंटे के लिए विश्राम दिया गया था ताकि पानी में गैसों को वायुमंडल (चरण 6.1) के साथ बराबरी करने की अनुमति दी जा सके। वैकल्पिक रूप से, डिएकाइज्ड पानी को पर्याप्त आकार के, सील करने योग्य कंटेनर के साथ डेगास किया जा सकता है जो पर्याप्त रूप से शक्तिशाली वैक्यूम से जुड़ा हुआ है। अल्ट्रासाउंड छवियों का प्रदर्शन माइक्रोबबल सफलतापूर्वक गाढ़ा के रूप में बूंदों अप्राप्य थे/ यह केवल उच्च उत्पादन दबाव पर था कि बूंदों को नमूदार, इकोजेनिक माइक्रोबबल्स(चित्रा 7D,7F, 7H)में वाष्पित किया गया था। जबकि बाद गाढ़ा बूंद नमूने में मिसेल और लिपोसोम/वेसिकल्स होते हैं, ये असेंबली गैर-इकोजेनिक होती हैं और केवल बूंदें इकोजेनिक माइक्रोबबल्स में वाष्पीकरण कर सकती हैं । बेसलाइन इमेज(आंकड़े 7A, 7C, 7E, 7G) स्थापितकरने के लिए प्रेत के माध्यम से एक पीबीएस नियंत्रण प्रवाहित किया गया था। जैसे-जैसे पीबीएस में दबाव बढ़ा, कोई कंट्रास्ट उत्पन्न नहीं हुआ। यह संकेत दिया है कि ट्रांसड्यूसर से उच्च दबाव अकेले पानी आधारित माध्यम में सहज कैविटेशन का उत्पादन नहीं कर सकता है, और इस प्रकार अन्य सभी उत्पन्न विपरीत अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंट को नियोजित किया जा सकता है। यदि आउटपुट दबाव बहुत अधिक है, तो उत्पन्न माइक्रोबबल नष्ट हो सकते हैं। दबाव को बढ़ाने और उत्पन्न विपरीत को देखकर, इष्टतम दबाव8पाया जा सकता है। बूंदों के आधे जीवन का परिसंचरण बूंदों को वाष्पित करके इसी तरह से निर्धारित किया जा सकता है और समय7के साथ उत्पन्न विपरीत को देख रहे हैं।

संक्षेप में, अलग-अलग पायरो-लिपिड सामग्री के साथ बहु-मॉडल चरण-परिवर्तन बूंदों को संघनन विधि के साथ बनाया गया था। आकार देने से पता चला है कि पायरो-लिपिड लोडिंग और माइक्रोबबल/बूंद एकाग्रता के बीच एक व्यापार बंद था । लक्षण वर्णन से पता चला है कि अवशोषण और फ्लोरेसेंस दोनों में अक्षुण्ण और बाधित रूपों में अंतर थे। अल्ट्रासाउंड इमेजिंग से पता चला कि बूंदें ३७ डिग्री सेल्सियस पर गैर-इकोजेनिक थीं और पर्याप्त दबावों पर इकोजेनिक माइक्रोबबल्स में वैप्रिजनल थीं । लक्षण ों ने पायरो-लिपिड बूंदों के लिए बूंदों जैव-वितरण या संचय परीक्षणों के लिए साथी नैदानिक एजेंटों को बदलने की क्षमता भी दिखाई। भविष्य का काम इन-सॉल्यूशन वाष्पीकरण थ्रेसहोल्ड, इन-सॉल्यूशन स्थिरता और नग्न चूहों में वीवो परिसंचरण अवधि की जांच करेगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक तकनीकी चर्चाओं के लिए गैस एक्सचेंजर और डॉ मिफी होक यान चेंग के निर्माण में मदद करने के लिए डॉ ब्रैंडन हेलफील्ड का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । लेखकों को निम्नलिखित धन स्रोतों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं: ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति, स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों, टेरी फॉक्स अनुसंधान संस्थान, और राजकुमारी मार्गरेट कैंसर फाउंडेशन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 880220 Also known as "DSPE-PEG5K"
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 855775 Also known as "DSPC"
Aluminum Foil Any brand
Aluminum Seals, Tear-Off VWR 16171-840 Standard Aluminum, 13 mm outer diameter
Bath Sonicator Any brand Capable of  sonicating and heating up to 70 °C,
Bio-Stor Screw Cap Vials National Scientific BS20NABP Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring
Borosilicate glass clear serum vials VWR 16171-285 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter
Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap VWR 66011-020 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size
Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap Any brand Sizes will depend on desired volumes
Chloroform  Any brand
Coulter Counter Elctrolyte Diluent Any brand Compatible with Coulter Counter
Decafluorobutane (C4F10) FluoroMed 355-25-9
Deionized Water Any brand
Dry Ice (Carbon Dioxide) Any brand
Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer Any brand Capable of temperature control
E-Z Crimper, 13 mm Wheaton W225302 13 mm Standard Aluminum Seals
E-Z Decapper, 13 mm Wheaton W225352 13 mm Standard Aluminum Seals
Fluorescent Spectrophotometer Any brand Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source
Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette Any brand Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are  optical windows 
Gas Exchanger Made in-house Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions.
Glass syringes Any brand Sizes will depend on desired volumes
GLWR Custom Aperture Tube 10 um Beckman Coulter B42812 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e
Glycerol Any brand
Insulated Styrofaom containers with lids Any brand
Isopropanol Any brand
Lyophilization-Style Rubber Stoppers VWR 71000-060 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl
Membrane Diaphram Vacuum Pump Sartorius Stedim 16694-1-60-06 Adjustable pressure
Metal Tongs Any brand
Methanol Any brand
MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer VisualSonics 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging.
MultiSizer 4e Beckman Coulter Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm
Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 567-0010 Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times
Needles, Conventional BD 305176 20 gauge, 1.5 inch length
Nitrogen Gas Any brand Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source.
Parafilm Any brand Called "wax film" in the protocol.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Any brand 1X, 7.4 pH
Pipette Any brand Sizes will depend on desired volumes
Pipette Tips Any brand Sizes will depend on desired volumes
Plastic Syringes Any brand 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections
Polyethersulfone (PES) Membrane Filter Any brand 0.2 µm pore size
Propylene Glycol Any brand
Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine Made in-house Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis.
Thermometer Any brand (-20 to 100 °C)
Triton X-100 Any brand Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol"
Ultrapure Water Any brand Type 1 Purity
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Any brand Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length Any brand Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm
Vacuum Desiccator Any brand
Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform VisualSonics Pre-clinical ultrasound imaging system
Vialmix Bristol-Myers-Squibb Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s.
Vortex Mixer Any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
  2. Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
  3. Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
  4. Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
  5. Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
  6. Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
  7. Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
  8. Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
  9. Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
  10. Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
  11. Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
  12. Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
  13. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  14. Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
  15. Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
  16. Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
  17. Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
  18. Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
  19. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
  20. Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
  21. Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
  22. Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
  23. Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
  24. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).

Tags

मेडिसिन इश्यू 176 अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट्स माइक्रोबबल्स साइज सेलेक्शन कंडेनसेशन फेज-चेंज ड्रॉपलेट्स परफ्लोरोकार्बन वाष्पीकरण पोर्फिरिन
बहु-मॉडल चरण-परिवर्तन पोर्फिरिन बूंदों का संश्लेषण और लक्षण वर्णन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J.,… More

Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J., Sheeran, P. S., Zheng, G. Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets. J. Vis. Exp. (176), e62665, doi:10.3791/62665 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter