Summary
I denne protokol, metoder til syntetisering og karakterisering multi-modal fase-change porphyrin dråber er skitseret.
Abstract
Faseskiftdråber er en klasse af ultralydkontrastmidler, der kan omdannes til ekkogene mikrobubbles in situ med anvendelse af tilstrækkelig akustisk energi. Dråber er mindre og mere stabile end deres mikrobobler kolleger. Traditionelle ultralydkontrastmidler kan dog ikke spores ud over akustiske feedbackmålinger, hvilket gør det vanskeligt at kvantificere kontrastmidlet biodistribution eller akkumulering ex vivo. Forskere kan være nødt til at stole på fluorescerende eller optisk absorberende følgesvend diagnostiske partikler til at udlede bio-distribution. Formålet med denne protokol er at detaljer trin til at skabe multi-modal fase-change porfyrin dråber ved hjælp af en kondenseringsmetode. Porfyrin er fluorescerende molekyler med forskellige absorbansbånd, der kan konjugeres på lipider og indarbejdes i dråber for at udvide dråbens alsidighed, hvilket muliggør mere robust biofordeling, samtidig med at akustiske egenskaber bevares. Syv formuleringer med varierende porfyrin-lipid og base lipid indhold blev foretaget for at undersøge microbubble og dråbe størrelse distributioner. Karakteriseringer, der er velegnede til porfyrinholdige strukturer, er også beskrevet i protokollen for at demonstrere deres analytiske alsidighed i løsningen. Dimensionering viste, at de post-kondenserede gennemsnitlige diametre var 1,72 til 2,38 gange mindre end prækursor populationer. Absorbanskarakterisering viste intakte samlinger havde en Q-band peak på 700 nm, mens forstyrrede prøver havde en absorbans peak på 671 nm. Fluorescens karakterisering viste intakt 30% porfyrin-lipid forsamlinger var fluorescerende slukkes (>97%), med fluorescens opsving opnået ved forstyrrelser. Akustisk fordampning viste, at porfyrindråber ikke var ekkogene ved lavere tryk og kunne omdannes til ekkogene mikrobubbles med tilstrækkeligt tryk. Disse karakteriseringer viser potentialet for porfyrindråber for at eliminere behovet for absorbans eller fluorescensbaserede ledsagende diagnostiske strategier til kvantificering af ultralydkontrastmidlet biodistribution til levering eller terapeutiske anvendelser in vivo eller ex vivo.
Introduction
Ultralydsscanning er en ikke-invasiv, ikke-iioniserende form for medicinsk billeddannelse, der udnytter akustiske bølger. Mens ultralydsscannere er mere bærbare og kan give realtidsbilleder, kan ultralydsscanning lide af lav kontrast, hvilket gør det vanskeligt for sonografer pålideligt at skelne mellem lignende ekkogene patologiske træk. For at modvirke denne begrænsning kan mikrobubbles injiceres i værten for at forbedre vaskulær kontrast. Mikrobubbles er mikron-størrelse gasfyldte kontrastmidler, der er meget ekkogen til akustiske bølger og kan give forbedret fartøj kontrast1,2. Skallerne og gaskernerne af mikrobobler kan skræddersys til forskellige applikationer, såsom billeddannelse, trombolyse, cellemembranpermeabilisering eller forbigående vaskulær åbning2.
En ulempe ved mikrobobler er deres korte cirkulation halveringsliv. For eksempel har klinisk tilgængelige perflutren lipidmikrosfærer kun en halveringstid på 1,3 minutter3. For lange billeddannelse sessioner, flere injektioner af mikrobobler er nødvendige. En anden ulempe ved mikrobobler er deres store diametre. Mens perflutren lipidmikrosfærer er omkring 1 til 3 μm i diameter, små nok til at cirkulere i vaskulatur, de er for store til at ekstravasere og passivt ophobes i væv af interesse, såsom tumorer4. En strategi for at overvinde disse begrænsninger er at kondensere gaskernemikrobubbles til mindre, flydende kernedråber5,6. Mens dråber ikke er ekkogene i deres flydende tilstand, kan de fordampes til mikrobubbles ved eksponering for ultralyd med tilstrækkeligt højt top negativt tryk og genvinde deres evne til at give kontrast. Dette gør det muligt for dråben at drage fordel af de mere gunstige farmakokinetik af en lille væskekerne, samtidig med at evnen til at give kontrast, når den er insoneret og uden at ændre den kemiske sammensætning4,7.
Decafluorobutane er en ideel perfluorcarbonforbindelse til faseskift mellem gasformige og flydende tilstande5,6,7. Decafluorobutane giver mulighed for kondensering af mikrobubbles i dråber med temperaturreduktion alene, mens mindre tætte perfluorcarboner kræver yderligere tryk5. Denne blide metode minimerer ødelæggelsen af bobler under kondens7,8,9. Da deres kerner er flydende, er dråber ikke-ekkogene og usynlige for ultralyd. Men med anvendelsen af tilstrækkelig akustisk eller termisk energi kan de flydende kerner fordampe tilbage til en gasformige tilstand, der genererer ekkogene mikrobubbles8. Denne fordampning giver mulighed for kontrol af, hvornår og hvor man skal generere mikrobobler.
Mens dråber er nyttige til passiv akkumulering, in situ fordampning, eller forbedre celle permeabilitet4, dråber (og deres fragmenter) kan ikke afbildes eller kvantificeres ex vivo. Derfor anvendes kvantificerbare følgesvend diagnostiske middel, såsom fluorescerende4,10,11, magnetiske partikler12, optisk absorberende midler13, som en analog til at måle dråbe levering til væv af interesse. For eksempel brugte Helfield et al. en co-injektion af fluorescerende nanoperler til histologibilledkvantificering af museorganer, da dråber ikke kunne påvises fluorescerende4. Ulempen ved ledsagende diagnostiske midler er den sporbare komponent kan handle uafhængigt af dråben afhængigt af dens individuelle farmakokinetiske profil.
Heldigvis kan skallen af mikrobobler og dråber tilpasses. For eksempel demonstrerede Huynh et al. ultralyd kontrastmidler med porfyrrin-lipid skaller, hvilket skaber multimodale mikrobubbles14. Porfyrin er en klasse af organiske forbindelser med en aromatisk makrocylic struktur14,15. De er optisk absorberende, fluorescerende, og kan være cheated til en bred vifte af metaller til strålebehandling, røntgennukleid-baseret billeddannelse, eller spormetal-baseret kvantificering14. Et eksempel på porfyrin er pyropheophorbid (Pyro). Ved at konjugatere Pyro på lipider, indarbejde Pyro-lipider i mikrobobler eller dråber tillader dem at blive afbildet og sporet gennem flere modaliteter: akustisk, fluorescerende, og gennem absorbans14. Dette multimodale kontrastmiddel kan bruges til at spore og kvantificere akkumulering. Dette kunne eliminere behovet for ledsagende diagnostiske midler, da den kvantificerbare komponent nu konjugeres på skallen, hvilket muliggør mere nøjagtig kvantificering af levering16.
Heri, en protokol til oprettelse af multi-modal fase-change porfyrin dråber er skitseret. Som ultralyd kontraster agenter kan bruges som en platform for lægemiddellevering til væv af interesse, såsom tumorer2,4, udvide deres detektering ud ultralyd kunne vise sig nyttigt for levering effektivitet kvantificering. Formålet med disse dråber er at give sporbare ultralyd kontrast agenter i stand til passiv ophobning in vivo, in situ fordampning og akustik, og med potentiale til at kvantificere bio-distribution eller ophobning fra ex vivo organer uden afhængighed af sekundære sensorer. Karakteriseringsmetoder er også skitseret for at fremvise porfyrindråber potentiale som bio-distribution sensorer. Virkningerne af Pyro-lipid-belastning i skallen (0% til 50% ved molarforhold) diskuteres også.
Protocol
1. Dehydrerede lipidfilm
- Beregn masserne af hver af de nødvendige skalkomponenter (se supplerende fil "Lipid Formula Sheet").
BEMÆRK: For denne protokol skalsammensætningen vil være: 10 molar % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-5000] ammoniumsalt (DSPE-PEG5K), x molar % pyropheophorbid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfocholin (Pyro-SPC) og (90 - x)molar % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DSPC). Mængden af Pyro-SPC vil blive varieret på tværs af 7 shell kompositioner (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Kontroller DSPE-PEG5K's molekylvægt på lagerflasken.- Skaler protokollen til enhver lipid volumen med et minimum volumen på 1 mL. Til denne protokol blev der anvendt et samlet lipidvolumen på 10 mL med en samlet lipidkoncentration på 1 mg pr. minut til alle formuleringer. Den hjælpende opløsning vil være: 10% propylenglycol, 10% glycerol og 80% fosfatbuffer saltvand (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (se trin 2.3 og "Lipid Formula Sheet").
BEMÆRK: Syntese protokol pyro-lipider er skitseret i supplerende fil "Andre protokoller og data" Trin S1 til S1.19, som blev ændret fra det arbejde, der udføres af Zheng et al.15.
- Skaler protokollen til enhver lipid volumen med et minimum volumen på 1 mL. Til denne protokol blev der anvendt et samlet lipidvolumen på 10 mL med en samlet lipidkoncentration på 1 mg pr. minut til alle formuleringer. Den hjælpende opløsning vil være: 10% propylenglycol, 10% glycerol og 80% fosfatbuffer saltvand (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (se trin 2.3 og "Lipid Formula Sheet").
- Baseret på de beregnede masser (se trin 1.1 og "Lipid Formula Sheet"), afveje hver af de ikke-Pyro-lipider og overføre til en tilstrækkelig størrelse borosilicate glas hætteglas med en skrue-on cap.
- Cap hætteglasset, mærke hætten og hætteglasset, og dække bunden og væggene i lipid hætteglasset med aluminiumsfolie. Dette hætteglas vil blive omtalt som "Lipid Vial" for resten af protokollen. Opbevar Lipid Vial i et køligt, tørt, mørkt område.
- Hvis formuleringen indeholder Pyro-SPC, opløses 10 mg Pyro-SPC tørfilm (se "Andre protokoller og data") i 1 mL kloroform. Vortex for 5 s, måle absorbans, og beregne den passende volumen til at tilføje til Lipid Vial.
FORSIGTIG: Kloroform er en sundhedsfare, irriterende og giftig. Brug en beskyttende kittel, øjenbeskyttelse, handsker, og undgå at indånde dampe.
BEMÆRK: Da Pyro-SPC er lysfølsom, skal du reducere lyset i arbejdsområdet, hvis det er muligt ved håndtering af Pyro-SPC. Hold Pyro-SPC forseglet og dækket, når den ikke er i brug.- På det ultraviolet-synlige spektrofotometer skal du indstille det til at måle absorbansen fra et bølgelængdeområde på 800 nm til 300 nm med intervaller på 0,5 nm og måle en baseline med 2000 μL ren methanol i et kompatibelt 1 cm stilængdekuvette.
FORSIGTIG: Methanol er en sundhedsfare, irriterende, giftig og brandfarlig. Brug en beskyttende kittel, øjenbeskyttelse, handsker, og undgå at indånde dampe. Hold dig væk fra gnister og varme. - Der tilsættes 2 μL af Pyro-SPC i kloroform i 2000 μL methanol og vortex i 30 s. Overfør det til en ren, kompatibel 1 cm cuvette, og mål absorbansen. Juster denne fortyndingsfaktor, hvis absorbanstoppen ved 667 nm ud af det ultraviolet synlige spektrofotometers absorbansområde.
BEMÆRK: Når du overfører kloroform eller methanol, skal du bruge en ren glassprøjte eller en rørspids med positiv forskydning i stedet for en mekanisk pipette for bedre nøjagtighed. - Gentag trin 1.4.2 to gange mere for at få tre gange for at få tre gange.
- Gennemsnitlig absorbans peak værdier på 667 nm og bruge følgende ligning til at beregne mængden af Pyro-SPC i chloroform er nødvendige for Lipid Vial14,15:
hvor V er den nødvendige mængde Pyro-SPC i chloroform, m er den krævede masse af Pyro-SPC (se trin 1.1 og "Lipid Formula Sheet"), M er den molekylvægt af Pyro-SPC ved 1040.317 g·mol-1, A er den gennemsnitlige absorbans ved 667 nm, d er fortyndingsfaktoren baseret på methanol og Pyro-SPC i chloroformvolumener (trin 1.4.2) L er cuvettestilængden ved 1 cm, og ε er 667 nm molardæmpningskoefficient for Pyro-SPC ved 45000 L·mol-1·cm-1.
BEMÆRK: Nævneren af ligningen er Beer-Lambert-loven, som relaterer koncentrationen af en analysand i opløsning til den målte optiske absorbans over en afstand. - Der tilsættes den beregnede mængde Pyro-SPC i kloroform fra forrige trin til Lipid-hætteglasset ved hjælp af en ren glassprøjte (Figur 1A) og hættesglasset og dæk derefter hætteglasset.
BEMÆRK: Figur 1 viser kun 30% Pyro-lipid formuleringen. - Hvis der er nogen Pyro-SPC tilbage i kloroform tilbage: I en røghætte skal du fjerne Pyro-SPC + chloroforme hætteglasset fra trin 1.4, hæld hætteglasset delvist til siden og kontinuerligt strømme nitrogengas så forsigtigt som muligt ind i Pyro-SPC/chloroforme hætteglasset. Drej hætteglasset for at tørre kloroformen ud ved hjælp af nitrogengasstrømmen og for jævnt at belægge Pyro-SPC'en på hætteglasets indvendige væg, mens det tørrer. Sørg for, at der ikke laves stænk, og at ingen af opløsningen falder ud.
- Når Pyro-SPC lipidfilmen fremstår tør og belagt på hætteglasets væg, skal du slukke for nitrogengasstrømmen. Hætteglasset, forsegle hætteglasset hals med voksfilm, og opbevar hætteglasset på -20 °C og i mørke.
- På det ultraviolet-synlige spektrofotometer skal du indstille det til at måle absorbansen fra et bølgelængdeområde på 800 nm til 300 nm med intervaller på 0,5 nm og måle en baseline med 2000 μL ren methanol i et kompatibelt 1 cm stilængdekuvette.
- Forbered en opløsning på 90% kloroform og 10% methanol (% v/v), og tilsæt 5 mL af det til Lipid Vial. Hætten Lipid Vial, og hvirvl forsigtigt for at homogenisere indholdet (Figur 1B).
BEMÆRK: Hvis formuleringen indeholder fosfatsyre lipider (såsom 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfat natriumsalt (DSPA)), tilsættes: 60% chloroform, 32% methanol og 8% dobbeltdeioniseret vand (% v/v/v) til Lipid Vial i stedet. Mere intens hvirvlende kan være nødvendigt at opløse lipid indhold. - I en røghætte, uncap Lipid Vial, delvist vippe Lipid Vial til sin side og løbende flyde nitrogen gas så forsigtigt som muligt ind i Lipid Vial. Roter Lipid Vial for at tørre opløsningen ud ved hjælp af nitrogengasstrømmen og belægge lipidfilmen jævnt på lipidglasets indvendige væg, mens den tørrer. Sørg for, at der ikke laves stænk, og at ingen af opløsningen falder ud.
- Når lipider synes tørre og belagt på de indvendige vægge af lipid hætteglasset (Figur 1C), slukke nitrogen gas flow, dække bunden og væggen i Lipid Hætteglasset med aluminiumsfolie, og dække den øverste åbning med aluminiumsfolie stak med et par huller med en nål til udluftning (Figur 1D).
- Mærk og læg det overdækkede Lipid Vial inde i en vakuumafsikkator, og lad lipiderne tørre yderligere i mindst 24 timer, men højst 72 timer.
BEMÆRK: Protokollen kan genoptages senere efter 24 til 72 timer.
2. Lipid Hydrering
- Fyld en bad sonicatormed vand og varme det til 70 °C. Tænd sonikering for at hjælpe med at blande vandet.
FORSIGTIG: Vand og soniker er ved høje temperaturer. Undgå at røre ved vandet og sonikeren. Brug øjenbeskyttelse, en beskyttende kittel og beskyttelseshandsker. - Når badet sonicator har nået 70 °C, fjerne Lipid Vial fra vakuumafsiccator. Reducer lyset i arbejdsområdet, hvis det er muligt.
- Klargør en hjælpeløsning på 10% propylenglycol, 10% glycerol, 80% PBS (% v/v/v) og tilsæt 10 mL af den til Lipid-hætteglasset (se trin 1.1.1 og "Lipid Formula Sheet").
BEMÆRK: Hvis du bruger en standard luftforskydningspipette, skal du være forsigtig ved håndtering af tyktflydende opløsningsmidler som propylenglycol og glycerol. Aspirere og dyk lydstyrken langsomt og vent på, at restmængden når bunden af pipettespidsen. Sørg for, at væsken ikke klæber til ydersiden af pipettespidsen, når der overføres mængder ved at bevæge sig langsomt. - Cap Lipid Vial, fjerne aluminium dække, og forsigtigt hvirvle hætteglasset i bad sonicator i 15 min, mens sonikering er på at opløse lipider. Sørg for, at Lipid Vials hals er over vandet. Kontroller lejlighedsvis, om hætteglasset er forsvarligt lukket.
- Lejlighedsvis skal du fjerne Lipid Vial fra vandbadet. Hold den kortvarigt frem i lyset for at kontrollere, om indholdet er helt opløst (figur 1E).
- Hvis Lipid Vial indholdet ikke homogeniseres, fjerne Lipid Vial fra bad sonicator. Fastgør hætten, hvirvl mere aggressivt, og returnere den til bad sonicator.
- Fjern Lipid Vial fra bad sonicator, og slukke bad sonicator. Tør Lipid Vial udvendigt med papirhåndklæder, og re-label Lipid Vial.
- Dæk Lipid Vial med aluminiumsfolie, og afkøle Lipid Vial ved stuetemperatur i et køligt, mørkt, tørt område i 10 minutter.
- Aliquot Lipid Vial indhold: omkring 2 mL af lipidopløsningen i 3 mL borosilicat glas klare serum hætteglas (7 mm indre mund diameter, 13 mm ydre mund diameter).
BEMÆRK: Nogle protokoller kan bruge 1,5 mL lipidopløsning i 3 mL-hætteglaset7. - Hætte serum hætteglas med lyophilization-stil grå chlorobutyl gummi propper (7 mm indre mund diameter, 13 mm ydre mund diameter) og fastgør gummi prop med afrivning aluminium sæler (13 mm ydre mund diameter) og en crimper (Figur 1F).
- Støvsug, degas og tryk igen lipidopløsningen i hvert af serumglassene4,5,7 ( Figur2).
BEMÆRK: Se "Andre protokoller og data" for at få vejledning i, hvordan du samler gasveksleren og flere detaljer.- Luk hver ventil mellem og med trykventil A og gasflaskeventil (figur 2). Tilslut serum hætteglas til de mangfoldige nåle, derefter åbne de tilsvarende Manifold Ventiler, derefter åbne Vakuumventil A og Vakuumventil B, og vakuum ved -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) i 5 minutter for at fjerne atmosfærisk luft. Væsken må IKKE støvsuges ud (se "Andre protokoller og data" Trin S3 til S3.1.5).
FORSIGTIG: Vakuumpumpen kan briste, hvis den håndteres forkert. Brug ikke vakuumpumpen sammen med organiske, sure eller grundlæggende kemikalier. - Når vakuumet stadig er tændt, skal du holde et serumglas (for at forhindre det i at svinge) og trykke hurtigt på det med en pen eller markør for at afgas. Hold trykke indtil ingen bobler form, og der er ingen bobler i hætteglasset. Lad IKKE nogen væske støvsuges ud. Sæt aflytningen på pause, hvis det er nødvendigt. Gentag for alle tilsluttede serum hætteglas. Efter afgasning af alle serum hætteglas, LUK vakuumventil A og vakuumventil B og SLUK for vakuumpumpen (se "Andre protokoller og data" Trin S3.2 til S3.2.3).
- Med serum hætteglasset stadig forbundet til nålen og med vakuumpumpen slukket, langsomt dreje gasflaskeventilen 1/16 til 1/8 (ca. 22,5 til 45 ° fuld omdrejning) mod uret til delvist at åbne, derefter åbne T-Handle Ventil, og langsomt dreje Air Regulator Valve med uret til 3 psi (20,7 kPa) gauge. Åbn derefter trykventil A og trykventil B (se "Andre protokoller og data" Trin S3.3 til S3.3.21).
FORSIGTIG: Den koffeinfri gasflaske er under tryk og kan eksplodere, hvis den opvarmes. Hold dig fra varme og slag. Decafluorobutane gas kan forårsage ilt forskydning og kvælning. Brug korrekt øjenbeskyttelse og håndtag i en røghætte. Hvis det håndteres forkert, er det muligt at støvsuge gasflasken, hvilket kan forårsage hurtig afpresning og implosion. Hvis du åbner gasflaskeventilen mere end 1/8 dreje, kan det beskadige luftregulatoren. - Efter 30 s tryk (måleren skal stadig læse 3 psi (20,7 kPa)), lukke alle manifold ventiler med serum hætteglas, afbryde serum hætteglas, kappe nålene, og LUK gasflaskeventilen.
- Aflast det bebyggede tryk ved delvist at åbne en enkelt manifoldventil, indtil Air Regulator gauge-nålen går til sin hvileposition. Luk derefter alt mellem og inklusive manifoldventilerne og T-håndtaget.
- Luk hver ventil mellem og med trykventil A og gasflaskeventil (figur 2). Tilslut serum hætteglas til de mangfoldige nåle, derefter åbne de tilsvarende Manifold Ventiler, derefter åbne Vakuumventil A og Vakuumventil B, og vakuum ved -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) i 5 minutter for at fjerne atmosfærisk luft. Væsken må IKKE støvsuges ud (se "Andre protokoller og data" Trin S3 til S3.1.5).
- Mærk serumglas og opbevar dem ved 4 °C og i mørke. Sørg for, at alle gasvekslerventiler er lukkede, og at vakuumpumpen slukkes bagefter.
BEMÆRK: Serumet skal være stabilt i op til 4 måneder i denne tilstand. På dette trin kan protokollen genoptages senere, højst efter 4 måneder.
3. Decafluorobutane hætteglas
- Med rene, tomme 3 mL borosiliatglas klare serum hætteglas (7 mm indre mund diameter, 13 mm ydre mund diameter), hætte dem med lyophilization-stil grå chlorobutyl gummi propper (7 mm indre mund diameter, 13 mm ydre mund diameter) og sikre gummi prop med afrivning aluminium sæler (13 mm ydre mund diameter) og en crimper4, 7,8.
- Følg trin 2.9.1 for at støvsuge den atmosfæriske luft (se "Andre protokoller og data" Trin S3.1 til S3.1.5).
- Spring afgasningen over, og følg trin 2.9.3 til 2.9.5 for at få vist hætteglasset igen (se "Andre protokoller og data" Trin S3.3 til S3.3.21).
- Mærk decafluorobutane hætteglass og opbevar dem ved 4 °C og i mørke. Sørg for, at alle gasvekslerventiler er lukkede, og at vakuumpumpen slukkes bagefter.
BEMÆRK: Der vil være behov for serumglas fyldt med decafluorobutangas til dråbekondensationen. De skal være stabile i op til 4 måneder i denne tilstand. På dette trin kan protokollen genoptages senere, højst efter 4 måneder.
4. Dråbedannelse
- En hydreret lipidopløsning fjernes i serumglasset (fra trin 2.10) fra køleskabet.
- Brug en decapper, fjern aluminiumsforseglingen på serumglasset og overfør 1 mL lipidopløsningen til et 1,85 mL borosilicatglasprøveglasglasglas (med en phenolskruehætte) ved at lade lipidopløsningen flyde ned ad den indvendige væg. Opret ikke bobler.
- Hvis der er en resterende lipidopløsning i serumglasset, skal du følge trin 2.9 til 2.10 for at afgas og presse serumglasset til opbevaring igen (se "Andre protokoller og data" Trin S3 til S3.3.21).
- Med 1,85 mL prøve hætteglas, forsigtigt flow i decafluorobutane gas ind i prøven hætteglas headspace ved hjælp af Gas Exchanger (se figur 2 for de specifikke ventil navne).
- Sørg for, at alle ventilerne på gasveksleren er korrekt lukket, og at pumpen er slukket.
FORSIGTIG: Hvis det gøres forkert, er det muligt at støvsuge gasflasken ud, hvilket forårsager hurtig dekompression og implosion. - Åbn en manifoldventil og ophed forsigtigt den tilsvarende nål fra manifolden.
FORSIGTIG: Skarpt objekt, undgå kontakt/piercing. - Åbn trykventil A og trykventil B og drej gasflaskeventilen 1/16 til 1/8 (ca. 22,5 til 45 ° fuld omdrejning) mod uret for at åbne delvist og derefter åbne T-Håndtagsventilen.
FORSIGTIG: Gasflaskeventilen må ikke åbnes mere end dette, da den kan forårsage skade på luftregulatoren. - Uddel prøveglasset med lipidopløsningen, og flyt den, så manifoldnålen er over væskeluftsgrænsefladen inde i hætteglasset. Hold hætteglasset der.
-
Drej langsomt luftregulatorventilen med uret, indtil luftregulatorens målern bevæger sig lidt fra sin hvileposition, og perfluorcarbongas forsigtigt strømmer ud af den mangfoldige nål. Lad perfluorcarbon gas forsigtigt strømme ind i hætteglasset headspace i 30 s. Opret ikke bobler. Juster luftregulatorventilen, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Væskeluftgrænsefladen skal forstyrres en smule af decafluorobutane-gasstrømmen. Da systemet nu er åbent, kan luftregulatormåleren ikke læse trykket korrekt. - Efter 30 s, omhyggeligt og hurtigt hætte af prøven hætteglas uden at flytte hætteglasset for meget.
- Luk gasflaskeventilen (med uret), T-håndtagsventilen, luftregulatorventilen (mod uret), trykventil A, trykventil B og manifoldventil.
- Skær forsigtigt nålen.
- Prøveglasset mærkes, og forsegl halsen med voksfilm, der går med uret (figur 3A og 3B).
BEMÆRK: Tal 3B til 3F viser kun 30% Pyro-lipid formulering.
- Sørg for, at alle ventilerne på gasveksleren er korrekt lukket, og at pumpen er slukket.
- Prøveglasset anbringes i mørke og ved 4 °C i mindst 10 min eller op til 24 timer.
BEMÆRK: På dette trin kan protokollen genoptages senere, højst 24 timer. - Placer ca. 100 g tøris (kuldioxid) i en isoleret beholder, og læg almindelig is i en anden isoleret beholder. Hent tilberedte decafluorobutane serum hætteglas, der er nævnt i trin 3, to 3,81 cm (1,5 tommer) 20-gauge nåle, en 1 mL plastsprøjte (unstick stemplet før brug), en 200 mL beholder, metal tonger, og et termometer (-20 til 100 °C).
BEMÆRK: Hvis der kun laver mikrobobler, er der ikke behov for isopropanol, tøris og is. - Prøveglasset anbringes sammen med lipidopløsningen i den mekaniske omrører, og omrør til 45 s (Figur 3C).
- Efter den mekaniske omrøring skal prøveglasset stå højre side op, afskærmet fra lys, og starte en 15 minutters nedtælling for at køle hætteglasset ned og vælge mikroboblerne8,17.
- Når nedtællingen på 15 min har nået 10 minutter (5 minutter tilbage på nedtællingen), fyldes en beholder med ca. 200 mL isopropanol, og den afkøles til -20 °C med tøris ved hjælp af metaltænger.
BEMÆRK: Måltemperaturen er -15 til -17 °C, men isopropanolen opvarmes under håndtering af mikroboblerne.
FORSIGTIG: Isopropanol er brandfarlig. Hold dig væk fra varme og gnister. Tøris kan forårsage hudskader. Håndter med tang. Brug handsker, øjenbeskyttelse og en beskyttende kittel.
- Når nedtællingen på 15 min har nået 10 minutter (5 minutter tilbage på nedtællingen), fyldes en beholder med ca. 200 mL isopropanol, og den afkøles til -20 °C med tøris ved hjælp af metaltænger.
- Når mikroboblerne er blevet størrelsesvalgt i 15 min, skal du kigge efter den størrelsesvalgte partition inde i prøveglasset (Figur 3D).
- Hold prøveglasset højre side-up, forsigtigt uncap prøven hætteglas, og trække omkring 0,7 mL af den nederste partition med en 1,5 tommer 20-gauge nål fastgjort til en 1 mL plast sprøjte. Kontroller, at ingen af de øverste partitioner trækkes tilbage. Svirp ikke sprøjten for at fjerne luftlommer.
- Sæt en anden 20-gauge nål i et decafluorobutane serum hætteglas (holde nålen nær toppen af serum hætteglas) for at udlufte og derefter indsætte nålen / sprøjten med størrelsen valgte mikrobubbles.
- Overfør langsomt de størrelsesvalgte mikrobobler. Vip hætteglasset og vinkel sprøjten for at lade væsken glide ned ad den indvendige væg af decafluorobutane serum hætteglasset.
- Når al den størrelsesvalgte mikrobobbleopløsning er overført, skal du fjerne nålen med sprøjten, men hold udluftningsnålen i for at lette undertrykket (Figur 3E).
- Hvis du kun laver størrelsesvalgte mikrobobler, skal du stoppe her. Hold udluftningsnålen i og nær toppen. Hold hætteglasset i mørke og ved stuetemperatur.
- Tilsæt små mængder tøris eller stuetemperatur isopropanol til isopropanol badet for at sikre, at badetemperaturen er mellem -15 og -17 °C.
- Med 20-gauge udluftningsnål indsat nær toppen af serum hætteglasset, placere serum hætteglasset i isopropanol badet, holde microbubble niveau under niveauet af isopropanol men hætteglasset hals over det, og periodisk hvirvle serum hætteglasset i 2 minutter at kondensere mikrobubbles.
BEMÆRK: Dette trin blev ændret fra det arbejde, der blev udført af Sheeran et al.6- Svirv ikke serumglasset kontinuerligt i isopropanolen, og lad ikke opløsningen fryse. Hvirvle i ca 5 s, og løft serum hætteglasset ud af isopropanol. Kontroller for iskernedannelse, og fortsæt hvirvlende i isopropanol. Hvis der er isdannelse, hvirvle serum hætteglasset i luften, indtil det spredes.
- Efter 2 minutters kondens fjernes serumglassglastet fra isopropanolbadet, og udluftningsnålen fjernes.
BEMÆRK: Mikroboblerne skulle have været kondenseret til dråber, som angivet ved ændringen i translucency (Figur 3E versus figur 3F for 30% Pyro-lipid formulering). - Tør serumglasset, mærk det, og læg det på almindelig is i en mørk, isoleret beholder, indtil den er klar til brug. Uåbnede (intakt aluminium tætning) dråber bør være stabil i denne tilstand i op til 6 timer, så længe den smeltede is bliver udskiftet efter behov.
- Når du er klar til brug, skal du fjerne aluminiumsforseglingen med decapperen. Hold dråber (selv åbne hætteglas) på is og i mørke, mens de ikke er i brug. Hold mikrobobler i mørke og ved stuetemperatur.
5. Morfologisk og optisk karakterisering
- Forbered 1% Triton ved: tilsætning af 5 mL Triton X-100 i 500 mL PBS (1x, pH 7.4) og rør med en magnetisk rørestang indtil homogen14.
BEMÆRK: Triton X-100 meget tyktflydende. Hvis du bruger en standard luftforskydningspipette, skal du være forsigtig ved håndtering. Aspirere og dyk lydstyrken langsomt og vent på, at restmængden når bunden af pipetten. Sørg for, at væsken ikke klæber til ydersiden af pipettespidsen, når der overføres mængder ved at bevæge sig langsomt. - Forbered dråber (trin 4). Hvis mikrobobler også karakteriseres, opsamles et lille volumen af de størrelsesvalgte mikrobobler før kondens (trin 4.9).
- Mikroboblerne eller dråberne på en coultertæller (CC) er i størrelse fra 0,2 til 6 μm for at opnå størrelsesfordelinger og koncentrationer (figur 4).
- Fyld en ren 20 mL cuvette med 10 mL CC elektrolyt, der blev filtreret gennem 0,2 μm pore polyethersulfone membranfilter. Mål det på CC med tre kørsler for at få en baseline.
- I samme CC elektrolyt tilsættes 5 μL mikrobubble- eller dråbeprøve og blandes forsigtigt.
BEMÆRK: Der kan tilsættes 2-20 μL prøve, afhængigt af hvor koncentreret prøven er. - Kør prøven på CC (3 runs), træk den gennemsnitlige grundlinje fra, og beregn størrelsesfordelingen og koncentrationen (tal pr. ML).
- Mål dråbeabsorberingen med UV-Vis-spektroskopi (Figur 5).
BEMÆRK: Figur 5 viser kun 30% Pyro-lipid formuleringen.- På UV-Vis-spektrofotometret skal absorbansmålingen indstilles til 800 nm til 300 nm bølgelængder med intervaller på 0,5 nm og muliggøre baselinekorrektion.
- Udfør en baselinemåling ved hjælp af en ren 1 cm kurvelængdekuvette fyldt med PBS. Sørg for, at lydstyrken er høj nok til at krydse spektroskopstrålens sti.
- Fortynd Pyro-lipiddråberne til PBS (anbefal 2 μL til 500 μL dråber i 2000 μL fortyndingsvand) og blandes ved pipettering.
BEMÆRK: HvirvLER IKKE, ellers vil samlingerne blive ødelagt. - Overfør de fortyndede dråber til en renset cuvette og mål absorbansen. Rediger fortyndingerne, hvis det er nødvendigt.
- Gentag trin 5.4.1 til 5.4.4, men brug 1 % Triton i stedet for PBS. Efter fortynding overføres prøven til et tætningsglas/udjævnet hætteglas og vortex i 30 s før måling.
- Mål fluorescensen af mikrobobler eller dråber (figur 6).
BEMÆRK: Figur 6 viser kun 30% Pyro-lipid formuleringen.- På fluorescensspektrofotometret skal excitationsbølgelængden indstilles til 410 nm, og emissionsbølgelængden varierer fra 600 til 750 nm med 1 nm stigninger.
- Mål fluorescensen af PBS fortyndingsstof for at få en baseline ved hjælp af et cuvette, der er kompatibelt med fluorescensspektrofotometeret.
- Pyro-lipidmikrobubbles eller dråber fortyndes til PBS (anbefaler 0,5 μL til 10 μL dråber i 2000 μL fortyndingsvand) og blandes ved pipettering.
BEMÆRK: HvirvLER IKKE, ellers vil samlingerne blive ødelagt. - Overfør den fortyndede prøve til det rensede, basisd cuvette og mål fluorescensen. Rediger fortyndingerne, hvis det er nødvendigt, og undgå signalmætning.
- Gentag trin 5.5.1 til 5.5.4, men brug 1% Triton i stedet for PBS. Efter fortynding i 1% Triton overføres den fortyndede prøve til et tætlukket/udjævnet hætteglas og vortex i 30 s før måling. Tilføj nok volumen til at sikre bobler genereret fra vortexing er over laservejen.
BEMÆRK: Prøvens fluorescenssignal i Triton vil være meget højere end i PBS på grund af fluorescens uudslukkende (figur 6).
6. Fordampningsbilleddannelse
- Fyld en passende størrelse vandtank med deioniseret vand og lad det hvile i 24 timer for at ekvilibrere gasserne i vandet med atmosfæren.
- Forbered dråber og holde på is og i mørke, indtil brug.
- Lav et flow phantom tube fra 2% agar som beskrevet af Pellow et al.18 Dyk fantomet ned i en vandtank opvarmet til 37 °C.
- Varm PBS op til 37 °C, og flow gennem fantomet.
- Med et præklinisk ultralydssystem og 21 MHz lineær arraytransducer (se Materialetabel) skal du justere visningen til flowfantomet, indstille den til B-tilstandsbilleddannelse, indstille outputtrykket og optage videoer eller billeder for at erhverve baselines ved hvert tryk.
- 20 μL af dråben fortyndes til 50 mL 37 °C PBS, og bland forsigtigt. Overfør opløsningen til en 30 mL plastsprøjte, og skub opløsningen gennem agarfantomet.
- Hold den samme justering som trin 6.5, øge outputtrykket, indtil fordampning er observeret (lyse pletter i fantomet, se figur 7).
BEMÆRK: Figur 7 viser 30% Pyro-lipid dråbeprøven. Denne kommercielt tilgængelige 21 MHz lineære array transducer er i stand til både billeddannelse og fordampning dråber.
Representative Results
Forkonterede, størrelsesvalgte mikrobubbleprøver (n = 3) og postkonterede dråbeprøver (n = 3) blev dimensioneret på en Coulter Counter (CC) med en 10 μm blænde. En begrænsning af 10 μm blænden er, at den ikke kan måle partikler mindre end 200 nm, hvilket kan skævvride middelstørrelsen og koncentrationen. Figur 4 viser størrelsesdataene for hver af Pyro-lipid-indholdsformuleringerne. Tabel 1 viser statistikker baseret på størrelsesdataene. Ved hjælp af et forhold mellem præ- og postkonterede middeldiametre viste resultaterne, at 0% Pyro-lipidformuleringen havde det mindste middeldiameterskift på 1,72 ± 0,02. 50% Pyro-lipid formuleringen havde den største gennemsnitlige diameter på 2,38 ± 0,08. 1% Pyro-lipiddråbeprøven havde den højeste observerede koncentration ved (2,71 ± 0,13) ×10 10 /mL, mens 40 % Pyro-lipiddråbeprøven havde den laveste observerede koncentration ved (7,36 ± 0,81) × 109 /mL. Dimensioneringsdata viste, at 10% Pyro-lipiddråbeprøven havde den mindste topdimeter ved 261 ± 13 nm, mens 50% Pyro-lipiddråbeprøven havde den største ved 390 ± 55 nm. Generelt, da Pyro-lipidindholdet steg, faldt koncentrationen, og middeldiameteren steg. Da de postkontiterede prøver er baseret på prækursormikrobubbleprøven, opstod tendensen for begge typer ultralydkontrastmidler. Efterhånden som Pyro-lipidindholdet steg, begyndte der at dannes en mikrobobble-subpopulation (med en topstørrelse på ca. 2000 μm). Denne sekundære top var ikke til stede i 0% Pyro-lipid mikrobubble prøve og mest synlige i 40% og 50% Pyro-lipid populationer.
Figur 5 viser repræsentative absorbansmålinger af 30 % Pyro-lipiddråbeprøven. Toppen af den intakte prøve i PBS var 700 nm, mens den forstyrrede prøve i Triton flyttede toppen til 671 nm. Dette viste, at de intakte samler har forskellige optiske egenskaber i forhold til de enkelte, usamlet lipid komponenter.
Figur 6A viser repræsentative fluorescensmålinger af den forkonterede mikrobubbleprøve, mens figur 6B viser postkontæteret dråbeprøve med 30 % Pyro-lipid. Den intakte prøve i PBS havde en fluorescens peak på 704 nm, mens den forstyrrede form havde et højdepunkt på 674 nm. Fratrækning af det forstyrrede område under kurven med det intakte område under kurven, og dividere forskellen med det forstyrrede område under kurven giver slukning effektivitet, som arbejder ud til at være 98,61% og 98,07% for 30% Pyro-lipid microbubble prøve og dråbe prøve, henholdsvis.
For at demonstrere dråber, der konverterede til mikrobobler, blev fortyndede dråber afbildet og fordampet i et 37 °C flow fantom med et ultralydssystem. Figur 7 viser repræsentative ultralydsbilleder af 30% Pyro-lipiddråbeprøven, der er afbildet ved forskellige tryk. Ved lavt tryk (Figur 7A) var der meget lidt signal, kun baggrundssignal fra luftbobler fast fra agarsyntesen. Dette skyldes, at dråber er ikke-ekkogene og ikke spreder ultralyd. Ved en lidt høj effekt blev der genereret et par mikrobobler (Figur 7B) som vist ved udseendet af lyse pletter. Efterhånden som trykket steg, blev der genereret flere mikrobobler (Figur 7C og 7D). Dette viste også, at dråberne ikke spontant vil fordampe ved 37 °C.
Figur 1: Billeder af trinene til at danne 30% Pyro-lipid-opløsningen. A) Lipid pulver plus Pyro-SPC i kloroform. B) Opløsningsløsning tilføjet. C) Lipid film tørret og belagt på indvendige væg af hætteglas. D) Lipid hætteglas indpakket i aluminiumsfolie (udvendig folie tapede til genbrug). E) Hydreret lipidopløsning. F) Lipidopløsning i serumglas. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Den 10-manifold gasveksler. De ventiler, der henvises til i protokollen, er mærket. Se supplerende fil "Andre protokoller og data" for at få vejledning i, hvordan du samler gasveksleren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: A) Lipidopløsningerne i de 7 formuleringer (0% til 50% Pyro-SPC) i prøveglas. Figur B til D viser billeder af de skridt, der er taget for at lave 30% Pyro-lipiddråber. B) 30 % Pyro-lipidopløsning i prøveglas. C) Post-agitation. D) 15 min størrelse valgt. E) Bundpartition overført til decafluorobutane hætteglas. D) Postkondensering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Coulter Counter (CC) dimensioneringsdata for de størrelsesvalgte mikrobubble- og dråbeprøver med forskelligt Indhold af Pyro-lipidskal (n = 3). De solide grønne linjer repræsenterer mikrobobler, og de stiplede cyanlinjer repræsenterer dråber. A) 0% Pyro-SPC. B) 1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D) 20% Pyro-SPC. E) 30% Pyro-SPC. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H) De samlede observerede koncentrationer af mikrobubble- og dråbeprøver fra CC baseret på Pyro-SPC-indholdet i skallen. Alle fejllinjer angiver standardafvigelse. Alle målinger blev udført ved hjælp af en 10 μm blænde, som har en størrelse på 200 nm til 6000 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative ultraviolet-synlige (UV-Vis) spektroskopiabsorberingsmålinger fra 300 til 800 nm af den postkonterede 30% Pyro-lipiddråbeprøve fortyndet i PBS og i 1% Triton. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentativ fluorescens emission fra 600 til 750 nm ophidset ved 410 nm. A) Størrelsesvalgt, forkonteret 30% Pyro-lipid mikrobubble prøve i PBS og i 1% Triton. B) Postkonteret 30% Pyro-lipiddråbeprøve i PBS og i 1% Triton. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Repræsentative ultralydsbilleder af et agarflowfantom på 37 °C taget med en præklinisk 21 MHz lineær arraytransducer i B-tilstand (se Materialetabel). Den venstre kolonne (Figur A, C, E, &G ) viser PBS-kontrolelementer. Den højre kolonne (Figur B, D, F,&H ) viser 20 μL postkonteret 30 % Pyro-lipiddråbeprøve fortyndet til 50 mL af 37 °C PBS. Hver række repræsenterer fritgående top negative tryk, som blev anslået ud fra det arbejde, som Sheeran et al.8 De gule trekanter angiver fokusdybde. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Metode | Agent | Pyro shell % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| CC | Bobler | Konc. [/mL] | (2.76 ± 0.28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1.91 ± 0.22) × 10^10 | (1.47 ± 0.05) × 10^10 | (8.47 ± 0.95) × 10^9 | (9.89 ± 0.15) × 10^9 |
| CC | Bobler | Peak [nm] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| CC | Bobler | Gennemsnitlig [nm] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| CC | Bobler | Median [nm] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| CC | Dråber | Konc. [/mL] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1.75 ± 0.18) × 10^10 | (1.72 ± 0.13) × 10^10 | (1.09 ± 0.01) × 10^10 | (7.36 ± 0.81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| CC | Dråber | Peak [nm] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| CC | Dråber | Gennemsnitlig [nm] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| CC | Dråber | Median [nm] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
Tabel 1: Dimensionering af datastatistikker for mikrobubble- og dråbeprøverne med forskelligt Pyro-SPC-indhold fra Coulter Counter (CC) (n = 3). Alle fejl angiver standardafvigelse.
Supplerende oplysninger - Lipid Formula Sheet: Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende oplysninger - Andre protokoller og data: Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Efter tilsætning af alle lipidkomponenterne sammen (trin 1.2 og 1.4.5, figur 1A) blev der tilsat en opløsning af chloroform og methanol (og vand, hvis fosfatidsyrelipider som DSPA er til stede) for at sikre, at Pyro-lipid- og ikke-Pyro-lipidkomponenterne blev fuldt homogeniseret (Trin 1.5, figur 1B). For at forhindre dannelsen af lipid vesikler med heterogen lipid sammensætning, blev de opløste lipider tørret og belagt på det indre af væggen af hætteglasset som en tynd film (Figur 1C). Belægningen (trin 1.6) gør også hydreringen (trin 2.1 til 2.4) lettere, da det øger overfladen af den tørrede film. Tørring (trin 1.6, figur 1C) og støvsugning (trin 1.8, figur 1D) blev udført for at sikre, at chloroformen og methanolen blev fuldstændig fordampet, da disse kemikalier kan forstyrre dannelsen af mikrobobler. Mens protokollen kan skaleres ned for at gøre lipid løsning mængder så lavt som 1 mL, større mængder kan reducere hætteglas-til-hætteglas variation. Selv om dette kan risikere at forringe Pyro-SPC,mens den ikke er i brug, var opbevaringstilstanden for lipidopløsningen (trin 2.9 til 2.10) beregnet til at reducere denne risiko. Afgasningstrinnet med gasveksleren (trin 2.9.2, figur 1F og figur 2)tjener til at fjerne så meget ilt som muligt for at forhindre oxidering. Det anbefales ikke at opbevare lipidopløsninger, der indeholder porfyrrin-lipider, mens atmosfæriske gasser stadig opløses i opløsningen (Figur 1E).
I trin 2.10 er lipidopløsningen i et serumglas med et trykhovedrum, svarende til, hvordan det klinisk godkendte ultralydkontrastmiddel perflutren lipidmikrosfærer sælges (svarende til figur 1F). Internt arbejde har vist, at stabile mikrobobler ikke kunne genereres via mekanisk agitation med tilstedeværelsen af Pyro-lipider, hvis hætten var et blødt materiale som gummiproppen. Lipidopløsningen blev derfor overført til et prøveglas med en ikke-gummi phenolhætte (trin 4.1 til 4.4, figur 3A og 3B). Når decafluorobutangassen blev strømmet ind i prøveglasset (trin 4.1 til 4.4), skulle tættere decafluorobutan fortrænge den atmosfæriske luft i prøveglasset. I øjeblikket er det uvist, hvorfor Pyro-lipider ikke er i stand til at danne mikrobobler med gummipropper. Uden Pyro-lipider kan stabile mikrobobler laves direkte i serumglassene med gummipropper4,7. Det anbefales således at bruge gasveksleren til at afgas og presse serumglasset igen og derefter omrøre selve serumglasset for ikke-Pyro-lipidformuleringer4,5,6,7 (se "Andre protokoller og data"). Fordelen ved at være i stand til mekanisk agitere i serum hætteglas er headspace kan presses og størrelse-udvælgelse kan gøres ved at vende serum hætteglasset på hovedet8. I denne protokol blev 0% Pyro-lipid-formuleringen overført til et prøveglas (trin 4.1 til 4.4) for at være i overensstemmelse med de formuleringer, der indeholdt Pyro-lipider. Derudover resulterer længere acyl lipid kædelængder i mere stabile dråber på grund af bedre van der Waals interaktioner19. Lipid shell sammensætning blev valgt baseret på, hvad der var kommercielt tilgængelige, 18-acyl kæde længde for alle lipid typer. DSPE-PEG5K blev indarbejdet i hele formuleringen (trin 1.1), da tilstedeværelsen af polyethylenglykolkæderne forhindrer sammensendelse af strukturer via frastødende steriske kræfter19. Under lipidhydrering blev badet sonicator badet indstillet til 70 °C (trin 2.1) så høj nok til fuldt ud at sprede 18-acyl kæde længde lipid film18. For længere acyl kædelængder, vil højere temperaturer være påkrævet.
Højere Pyro-lipidbelastning ville øge koncentrationen af optisk absorberende og fluorescerende komponenter, hvilket kan ønskes til visse applikationer, der drager fordel af maksimeret porfyrinbelastning. Men efterhånden som Pyro-lipidindholdet steg, faldt den observerbare dråbekoncentration, og diametererne steg (figur 4 og tabel 1). Dette illustrerer en afvejning mellem optisk fluorescens og absorbans egenskaber versus dråbe koncentration og diameter. Til forskere, der skal prioritere små diametre for in vivo ophobning gennem små utætte fartøjer, eller hvis en høj koncentration af dråber skal injiceres, stigende Pyro-lipid belastning kan ikke være værd at stigningen i dråbe dimeter eller fald i dråbe koncentration. Hvis høje dråbekoncentrationer og/eller små dråbediametre er altafgørende, bør lignende størrelse ledsagende diagnostiske midler overvejes i stedet for Pyro-lipider. Mens 1 % Pyro-lipiddråber ikke resulterede i et fald i koncentrationen eller forøgelsen af størrelsen, kan 1 % Pyro-lipidbelastning være for lav til, at den med rimelighed kan påvises fra vævsbaggrundslysstofrør. Imidlertid giver fleksibiliteten af porfyrrinmoiety flere muligheder for funktionalisering, som vil give alternative metoder til kvantificering, der er mere egnet til applikationer med lav koncentration. For eksempel kan Pyro-lipider være chelateret med kobber-64 for positon emission tomografi imaging og gamma tælle20, eller med palladium for spormetal kvantificering ved hjælp af massespektrometri, eller med mangan for magnetisk resonans imaging14.
Mens nogle eksperimenter kun kan kræve en lille mængde af dråbeopløsningen, er 1 mL af lipidopløsningen nødvendig for at fylde 1,85 mL prøveglasset. Goertz et al. viste, at ændringer i håndtering, headspace tryk, væske-til-gas-forhold, og selv hætteglasformen kan alle påvirke mikrobobble populationer17. Hætteglastemperatur under omrøring og størrelsesvalg kan også påvirke størrelsesfordelingen. Derfor er det vigtigt at være så konsekvent som muligt for de metoder, der er optimeret af slutbrugeren, når du laver dråber. Uåbnede dråber kan fryses (-20 °C) og optøs senere til fremtidig brug, men dette vil påvirke størrelsespopulationer.
Den agitationsprocedure, der aktiverer en lipidopløsning i mikrobubbles, producerer ikke en morfologisk homogen population (trin 4.6); snarere, prøven er fyldt med mikrobobler, multilamellar vesikler, liposomer, og micelles18,21,22. Mens mikrobobble størrelser spænder over mikron og nanometer rækkevidde, de andre strukturer er stort set under 800 nm 23. De anvendte dimensioneringsteknikker skelner ikke mellem disse forskellige strukturer, og de postkonditerede mikrobobbleprøver (trin 4.6, figur 3C) og de postkonterede dråbeprøver (trin 4.14, figur 3F),må antages som blandinger. Ultralyd-ufølsomme forsamlinger (multilamellar vesikler, liposomer, og micelles) er sandsynligvis bevaret post-kondens og vil ikke ændre størrelse, da de ikke har fase-foranderlige kerner. Da Coulter-tælleren ikke kan skelne mellem disse forskellige supramolekulære forsamlinger, bør forskydningen i befolkningsstørrelsen efter kondens fortolkes ud fra den antagelse, at en del af nanoskalastrukturerne er uomvendte og bidrager til den observerede befolkning i denne størrelsesregion. Derudover bidrager disse konstruktioner til de spektroskopiske og fluorescerende signaturer i disse prøver14. Fluorescens og absorbans signaturer af micelles, liposom / vesikler, og dråber er alle ens, herunder deres grad af fluorescens slukke14. Det er derfor vigtigt at overveje, at der er en blanding af samlinger i figur 3C til 3F, figur 4, pbs fortyndet prøve i figur 5og PBS fortyndet prøve i figur 6.
Efter størrelsesvalg og før kondens (trin 4.9) er det muligt at eliminere ikke-boblesamlinger ved at centrifugere mikrobobbleprøven for at adskille de flydende bobler fra de ikke-flydende samlinger som beskrevet af Feshitan et al.21 Graden af adskillelse kan styres ved at justere spinkraften og varigheden. Men eksperimenter med mikrobobble kondensering af sådanne størrelses isolerede prøver afslørede, at ved hjælp af de større prækursor mikrobobble populationer, der er valgt ved hjælp af størrelse isolation procedurer gav større dråber (se "Andre protokoller og data" Trin S5 for post-spundet boble og dråbestørrelse). Da en bestemt anvendelse af dråber produceret med denne protokol er en platform for passiv ekstravasation og akkumulering på grund af deres lille størrelse sammenlignet med mikrobubbles4,8, dråbepopulationer, der er så små som muligt, var ønsket. Således brugte denne protokol post-ophidsede mikrobubble prøver, der ikke var størrelsesisoleret via centrifugering, selvom det betød ultralyd-ufølsomme micelles, liposomer og vesikler var til stede i den endelige løsning. Dette indebærer, at kvantificeringsprocedurerne for biodistribution vil udlede signal for alle de injicerede strukturer og ikke kun er begrænset til dråberne. Da disse strukturer af samme størrelse sandsynligvis akkumuleres via en passiv mekanisme, der primært er dikteret af størrelse, er der dog ikke mistanke om, at dette bør ændre de vigtigste slutninger, der kan foretages, hvis denne platform skal udnyttes in vivo, selvom alle disse aspekter bør overvejes individuelt afhængigt af den sammenhæng, hvori platformen kan anvendes. Tests ved hjælp af eksperimentelle arme med og uden ultralyd kan udføres for at sikre, at det er de ultralydsfølsomme dråber, der er ansvarlige for eventuelle ændringer i biodistributionen, da kun perfluorcarbonkernesamlinger i opløsningen vil reagere på ultralyd.
Efter omrøring blev hætteglasset udhvilet i 15 minutter, og der blev observeret en skillevæg i hætteglasset (Figur 3C versus 3D). Størrelsesvalg via opdrift er en enkel metode til at eliminere de større strukturer /bobler fra en aktiveret mikrobobbleopløsning8,17. I dette tilfælde blev partikler med diametre på over 5 μm for det meste fjernet efter størrelsesvalg (figur 4). Omfanget af størrelsesvalg kan indstilles ved at kontrollere varigheden af størrelsesvalg17. Sheeran et al. har vist, at ikke størrelsesvalg kan resultere i genererede mikrobobler, der okkluderer vaskulatur8.
Perfluorcarboner har den fordel, at de er biologisk inert7. Mens decafluorobutanes kogepunkt er -1,7 °C, over kropstemperaturen, fordamper dråberne ikke umiddelbart, når de udsættes for 37 °C (Figur 7B). Da dråberne er metastabile ved 37 °C, er der behov for yderligere akustisk energi for at fordampe dråberne til mikrobubbles7,9. Poprosky et al. har demonstreret porfyrindråber kondenseret via tryk22. Dette er en levedygtig og endda vigtig metode, når du bruger mindre tætte perfluorcarboner, men højt tryk kan ødelægge nogle bobler i processen. Octafluoropropane (C3F8) har et kogepunkt på -36,7 °C, så både køling og tryk er nødvendig for dråbekondensering. Men den lettere perfluorcarbon fører til mindre stabile dråber. Dodecafluoropentane (C5F12) kan føre til mere stabile dråber med et kogepunkt på 28 °C. Det er dog en væske ved stuetemperatur og har brug for stærkere akustiske energier til at fordampe. Valget af den indeholdende gas af ultralydkontrastmidlet bør derfor overveje betingelserne for dets tilsigtede biologiske anvendelse ud over parametrene for dets fremstilling. I denne protokol blev isopropanolbadet til kondens indstillet til -15 til -17 °C (trin 4.7.1 og trin 4.13), mens andre protokoller anvendte -10 °C 5,6. Selv med en fælles decafluorobutan kerne, kondens temperatur kan variere afhængigt af begyndende sammensætning, samlede lipid koncentration, og lipid shell sammensætning. Hvis du bruger andre formuleringer, kan optimering være nødvendig for at sikre korrekt dråbekondensering uden at få opløsningen til at fryse.
Da dråberne er mindre og mere stabile end deres mikrobobbleprækursor7, kan de drage bedre fordel af passive akkumuleringsmekanismer for at ekstravasere i visse interessevæv, såsom den forbedrede permeabilitet og retentionseffekt af visse tumortyper4,24. Med fluorescerende, optisk absorberende og akustiske metoder til detektion14er det muligt at bruge en enkelt formulering til at kvantificere optagelse. Derudover kan denne platform bruges til at undersøge, om den akustiske fordampning af dråber kan forbedre leveret agentfraktion ud over passive niveauer16. For at kvantificere agentbiodistribution i væv og organer af interesse efter injektionen skal der sprøjtes en kendt mængde Pyro-lipiddråber ind i dyret, ultralyd kan eller ikke må påføres afhængigt af kontrolsættet, dyret skal ofres et forudbestemt tidspunkt, og organerne skal fjernes og vejes. Organerne skal homogeniseres, filtreres, fortyndes i overfladeaktivt (vaskemiddel) for at decellulisere vævet og kvantificeres med fluorescens eller UV-Vis spektroskopi for at opnå injicerede dosisprocenter pr. organmasse baseret på Pyro-signalerne. For trin 5.4.5 (figur 5) og trin 5.5.5 (figur 6) blev Triton X-100 overfladeaktivt (vaskemiddel) brugt til at forstyrre prøverne, da det ikke er fluorescerende ved 410 nm, og dets absorbansbølgelængder overlapper ikke Pyros.
Mikrobobler var ikke karakteriseret ved UV-Vis absorbans. Da UV-Vis spektroskopets laserkilde er parallel med detektoren, kan store bobler sprede lys væk fra detektoren, hvilket får dem til at fremstå mere optisk absorberende14. I modsætning til UV-Vis-spektrofotometret er/bør fluorescensspektrofotometerets detektor være/bør være vinkelret på laserkilden for at forhindre kilden i at forstyrre detektoren. UV-Vis blev anvendt til at kvantificere absorbansen af de intakte og forstyrrede dråbeprøver (trin 5.4, figur 5). 300 til 800 nm blev valgt som absorbans bølgelængder som de to vigtigste absorbans bands af pyro-lipid, Soret band (340 til 500 nm) og Q-båndet (640 til 730 nm), falder inden for dette interval14. Når den samles i en dråbe (eller andre supramolekulære strukturer), skiftes Q-båndstoppen af Pyro-lipid fra 671 nm til 700 nm (Figur 5). Når denne supramolecular struktur forstyrres af et overfladeaktivt middel som Triton, skifter toppen tilbage til 671 nm14,15. Baseret på dette skift er det muligt at fortælle, om Pyro-lipiderne er i samlet tilstand eller i en forstyrret tilstand. Forholdet mellem de to toppe kan bruges til at estimere samlingernes forfald over tid.
For fluorescensmålingerne (trin 5.5, figur 6) blev der valgt en excitationsbølgelængde på 410 nm, da den svarer til Soret-båndets top for usamlet Pyro-lipid14. En emission bølgelængde spænder fra 600 til 800 nm blev valgt som toppe af de intakte samlinger i PBS og forstyrrede Pyro-lipider i Triton er indeholdt inden for dette interval. Skiftet og stigningen i fluorescens (figur 6) mellem de intakte (704 nm i PBS) og forstyrrede (674 nm i Triton) prøver forekom på grund af struktur-induceret slukning. I den samlede form blev Pyro-lipidmolekylerne pakket tæt sammen, så genererede fotoner blev absorberet af nærliggende Pyro-lipidmolekyler. Dette er tydeligt i den intakte versus forstyrrede slukningseffektivitet. Det er således nødvendigt at fortynde prøver i overfladeaktivt (vaskemiddel) som 1% Triton X-100 for at lindre slukning og maksimere signalet til biodistribution kvantificering14.
For nemheds skyld blev den samme lineære ultralydstransducer brugt til både at fordampe og billedet (trin 6.5 og 6.7, figur 7). Denne ultralydtransducer (Tabel over materialer) var i stand til at nå det nødvendige højeste negative tryk, der var nødvendigt for at fordampe dråber8. Påfyldning af en tank med deioniseret vand fra en hane genererer gasser, der opløses i vandet (trin 6.1). For at minimere interferens fra de opløste gasser i vandet med fordampning og billeddannelse blev vandet udhvilet i 24 timer i tanken for at gøre det muligt for gasserne i vandet at ekvilibrere med atmosfæren (trin 6.1). Alternativt kan det deioniserede vand afgasses med en tilstrækkelig størrelse, tætningsbeholder, der er forbundet til et tilstrækkeligt kraftigt vakuum. Ultralydsbillederne viste, at mikroboblerne med succes blev kondenseret, da dråberne var observerbare / ikke-ekkogene ved lavt tryk (Figur 7B). Det var kun ved højere udgangstryk, at dråberne fordampede til observerbare, ekkogene mikrobubbles (Figur 7D, 7F, 7H). Mens den postkontæterede dråbeprøve indeholder miceller og liposomer / vesikler, er disse samlinger ikke-ekkogene, og kun dråber kan fordampe til ekkogene mikrobubbles. En PBS kontrol blev flød gennem fantomet til at etablere baseline billeder (Tal 7A, 7C, 7E, 7G). Da trykket steg i PBS, blev der ikke skabt nogen kontrast. Dette indikerede, at det høje tryk fra transduceren ikke kunne producere spontan kavitation i et vandbaseret medium alene, og dermed kunne al anden genereret kontrast tilskrives det anvendte ultralydskontrastmiddel. Hvis udgangstrykket er for højt, kan genererede mikrobobler ødelægges. Ved gradvist at øge trykket og observere den genererede kontrast, kan det optimale tryk findes8. Cirkulationen halveringstid af dråberne kan bestemmes på samme måde ved at fordampe dråberne er visse tidsintervaller og observere kontrasten genereret over tid7.
Sammenfattende blev multimodale faseskiftdråber med varierende Pyro-lipid-indhold skabt med kondensmetoden. Dimensionering viste, at der var en afvejning mellem Pyro-lipid lastning og microbubble / dråbe koncentration. Karakteriseringer viste, at der var forskelle i intakte og forstyrrede former i både absorbans og fluorescens. Ultralydsscanning viste, at dråber ikke var ekkogene ved 37 °C og kunne fordampes til ekkogene mikrobubbles ved tilstrækkeligt tryk. Karakteriseringer viste også potentialet for Pyro-lipiddråber til at erstatte ledsagende diagnostiske midler til dråbebiodistributions- eller akkumuleringstest. Fremtidigt arbejde vil undersøge in-solution fordampningstærskler, stabilitet i opløsning og in vivo-cirkulationsvarigheder hos nøgenmus.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Brandon Helfield for at hjælpe med at opbygge gasveksleren og Dr. Miffy Hok Yan Cheng for tekniske diskussioner. Forfatterne vil gerne takke følgende finansieringskilder: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute og Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M.
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
