Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Syntese og karakterisering av multimodale faseendring porfyrindråper

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/62665
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Princess Margaret Cancer Centre, 2Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 3Philips Healthcare

Summary

I denne protokollen er metoder for syntetisering og karakterisering av multimodale faseendringspofyrrindråper skissert.

Abstract

Faseendringsdråper er en klasse ultralydkontrastmidler som kan konverteres til ekkogene mikrobobler in situ med anvendelsen av tilstrekkelig akustisk energi. Dråper er mindre og mer stabile enn deres mikrobubble kolleger. Imidlertid er tradisjonelle ultralydkontrastmidler ikke sporbare utover akustiske tilbakemeldingsmålinger, noe som gjør kvantifisering av kontrastmiddel biodistribusjon eller akkumulering ex vivo vanskelig. Forskere kan måtte stole på fluorescerende eller optisk absorberende ledsagerdiagnostiske partikler for å utlede biofordeling. Formålet med denne protokollen er å detaljere trinn for å lage multimodale faseendring porfyrindråper ved hjelp av en kondensmetode. Porfyriner er fluorescerende molekyler med distinkte absorbansbånd som kan konjugeres på lipider og innlemmes i dråper for å utvide dråpe versatility, noe som muliggjør mer robust biofordeling samtidig som akustiske egenskaper beholdes. Syv formuleringer med varierende porfyrin-lipid og base lipidinnhold ble laget for å undersøke mikroboble- og dråpestørrelsesfordelinger. Karakteriseringer egnet til porfyrinholdige strukturer er også beskrevet i protokollen for å demonstrere deres analytiske allsidighet i løsningen. Størrelse viste at de postkondenserte gjennomsnittlige diameterene var 1,72 til 2,38 ganger mindre enn forløperpopulasjoner. Absorbanskarakterisering viste at intakte forsamlinger hadde en Q-båndtopp på 700 nm, mens forstyrrede prøver hadde en absorbanstopp på 671 nm. Fluorescenskarakterisering viste intakte 30% porfyrin-lipidenheter ble fluorescerende slokket (>97%), med fluorescens utvinning oppnådd ved forstyrrelser. Akustisk fordampning viste at porfyrindråper ikke var ekkogene ved lavere trykk og kunne omdannes til ekkogene mikrobobler med tilstrekkelig trykk. Disse karakteriseringene viser potensialet for porfyrindråper for å eliminere behovet for absorbans eller fluorescensbaserte ledsagerdiagnostiske strategier for å kvantifisere ultralydkontrastmiddel biodistribusjon for levering eller terapeutiske applikasjoner in vivo eller ex vivo.

Introduction

Ultralydavbildning er en ikke-invasiv, ikke-ioniserende form for medisinsk avbildning som benytter akustiske bølger. Mens ultralydskannere er mer bærbare og kan gi sanntidsbilder, kan ultralydavbildning lide av lav kontrast, noe som gjør det vanskelig for sonografer å skille mellom lignende ekkogene patologiske egenskaper på en pålitelig måte. For å motvirke denne begrensningen kan mikrobobler injiseres i verten for å forbedre vaskulær kontrast. Mikrobobler er mikronstore gassfylte kontrastmidler som er svært ekkogeniske for akustiske bølger og kan gi forbedret karkontrast1,2. Skjellene og gasskjernene i mikrobobler kan skreddersys for forskjellige bruksområder, for eksempel avbildning, trombolyse, cellemembranpermeabilisering eller forbigående vaskulær åpning2.

En ulempe med mikrobobler er deres korte sirkulasjon halveringstid. For eksempel har klinisk tilgjengelige perflutren lipidmikrosfærer bare en halveringstid på 1,3 minutter3. For lange bildebehandlingsøkter er det nødvendig med flere injeksjoner av mikrobobler. En annen ulempe med mikrobobler er deres store diametre. Mens perflutren lipidmikrosfærer er rundt 1 til 3 μm i diameter, små nok til å sirkulere i vaskulatur, er de for store til å ekstravasere og passivt akkumuleres i vev av interesse, for eksempel svulster4. En strategi for å overvinne disse begrensningene er å kondensere gasskjernemikroboblene til mindre, flytende kjernedråper5,6. Mens dråper ikke er ekkogeniske i flytende tilstand, kan de fordampes til mikrobobler ved eksponering for ultralyd med tilstrekkelig høyt topp negativt trykk, og gjenvinner deres evne til å gi kontrast. Dette gjør det mulig for dråpen å dra nytte av de gunstigere farmakokinetikken til en liten væskekjerne, samtidig som den beholder evnen til å gi kontrast når den er insonert og uten å endre kjemisksammensetning 4,7.

Decafluorobutane er en ideell perfluorkarbonforbindelse for faseforskyvning mellom gassformige og flytende tilstander5,6,7. Decafluorobutane tillater kondensering av mikrobobler i dråper med temperaturreduksjon alene, mens mindre tette perfluorkarboner krever ytterligere trykk5. Denne milde metoden minimerer ødeleggelse av bobler under kondens7,8,9. Ettersom kjernene deres er flytende, er dråper ikke-ekkogene og usynlige for ultralyd. Men med anvendelsen av tilstrekkelig akustisk eller termisk energi kan væskekjernene fordampe tilbake til en gassform, og generere ekkogene mikrobobler8. Denne fordampningen gir kontroll over når og hvor du skal generere mikrobobler.

Mens dråper er nyttige for passiv akkumulering, in situ fordampning eller forbedring av cellegjennomtrengelighet4, kan dråper (og deres fragmenter) ikke avbildes eller kvantifiseres ex vivo. Derfor brukes kvantifiserbart ledsagerdiagnostisk middel, for eksempel fluorescerende4,10,11, magnetiske partikler12, optisk absorberende midler13, som en analog for å måle dråpelevering til vev av interesse. For eksempel brukte Helfield et al. en co-injeksjon av fluorescerende nanoperler for histologibilde kvantifisering av museorganer, da dråper ikke kunne oppdages fluorescerende4. Ulempen med ledsagerdiagnostiske midler er at den sporbare komponenten kan virke uavhengig av dråpen, avhengig av den individuelle farmakokinetiske profilen.

Heldigvis kan skallet av mikrobobler og dråper tilpasses. For eksempel demonstrerte Huynh et al. ultralydkontrastmidler med porfyrin-lipidskall, og skapte multimodale mikrobobler14. Porfyriner er en klasse organiske forbindelser med en aromatisk makrosyklisk struktur14,15. De er optisk absorberende, fluorescerende og kan chelated til et bredt utvalg av metaller for strålebehandling, radinuklidbasert avbildning eller spor metallbasert kvantifisering14. Et eksempel på porfyrin er pyrofeophorbide (Pyro). Ved å mane Pyro på lipider, inkorporere Pyro-lipider i mikrobobler eller dråper, kan de avbildes og spores gjennom flere modaliteter: akustisk, fluorescerende og gjennom absorbans14. Dette multimodale kontrastmiddelet kan brukes til å spore og kvantifisere akkumulering. Dette kan eliminere behovet for ledsagerdiagnostiske midler ettersom den kvantifiserbare komponenten nå er konjugert på skallet, noe som muliggjør mer nøyaktig leveringskvartifisering16.

Heri er en protokoll for å lage multi-modale faseendring porfyrindråper skissert. Som ultralyd kontraster agenter kan brukes som en plattform for legemiddel levering til vev av interesse, for eksempel svulster2,4, utvide deres påvisbarhet utover ultralyd kan vise seg nyttig for levering effekt kvantifisering. Formålet med disse dråpene er å gi sporbare ultralydkontrastmidler som er i stand til passiv akkumulering in vivo, in situ fordampning og akustikk, og med potensial til å kvantifisere biofordeling eller akkumulering fra ex vivo organer uten avhengighet av sekundære sensorer. Karakteriseringsmetoder er også skissert for å vise frem porfyrindråpers potensial som biodistribusjonssensorer. Effektene av Pyro-lipid lasting i skallet (0% til 50% ved molarforhold) diskuteres også.

Protocol

1. Dehydrerte lipidfilmer

  1. Beregn massene av hver av skallkomponentene som trengs (se Tilleggsfil "Lipid Formula Sheet").
    MERK: For denne protokollen kan skallsammensetningen vil være: 10 molar % 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksy(polyetylenglykol)-5000] ammoniumsalt (DSPE-PEG5K), x molar % pyrofeophorbi konjugert 1-stearoyl-2-hydroksy-sn-glysero-3-fosfocholin (Pyro-SPC), og (90 - x) molar % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC). Mengden Pyro-SPC vil varieres på tvers av 7 skallsammensetninger (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Kontroller molekylvekten til DSPE-PEG5K på lagerflasken.
    1. Skaler protokollen til et hvilket som helst lipidvolum med et minimumsvolum på 1 ml. For denne protokollen ble et totalt lipidvolum på 10 ml med en total lipidkonsentrasjon på 1 mg per ml brukt til alle formuleringer. Den hjelpestoffløsningen vil være: 10% propylenglykol, 10% glyserol og 80% fosfatbuffer saltvann (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v / v / v) (se trinn 2.3 og "Lipid Formula Sheet").
      MERK: Synteseprotokollen til Pyro-lipider er skissert i tilleggsfilen "Andre protokoller og data" Trinn S1 til S1.19, som ble endret fra arbeidet utført av Zheng et al.15.
  2. Basert på de beregnede massene (se trinn 1.1 og "Lipid Formula Sheet"), vei ut hver av de ikke-Pyro-lipidene og overfør til et tilstrekkelig stort borosilikatglasshetteglass med en skruehett.
  3. Hette hetteglasset, merk hetten og hetteglasset, og dekk bunnen og veggene i lipidhette hetteglasset med aluminiumsfolie. Dette hetteglasset vil bli referert til som "Lipid hetteglass" for resten av protokollen. Oppbevar Lipid hetteglasset i et kjølig, tørt, mørkt område.
  4. Hvis formuleringen inneholder Pyro-SPC, oppløs 10 mg Pyro-SPC tørrfilm (se "Andre protokoller og data") i 1 ml kloroform. Virvel i 5 s, mål absorbansen og beregn riktig volum for å legge til Lipid hetteglasset.
    FORSIKTIG:Kloroform er en helsefare, irriterende og giftig. Bruk en beskyttende labjakke, øyebeskyttelse, hansker og unngå å puste røyk.
    MERK: Siden Pyro-SPC er lysfølsom, må du redusere lysene i arbeidsområdet hvis det er mulig ved håndtering av Pyro-SPC. Hold Pyro-SPC forseglet og tildekket når den ikke er i bruk.
    1. På det ultrafiolette spektrofotometeret setter du det til å måle absorbering fra et bølgelengdeområde på 800 nm til 300 nm med trinn på 0,5 nm, og måler en basislinje med 2000 μL ren metanol i en kompatibel 1 cm banelengde cuvette.
      FORSIKTIG:Metanol er en helsefare, irriterende, giftig og brannfarlig. Bruk en beskyttende labjakke, øyebeskyttelse, hansker og unngå å puste røyk. Holdes unna gnister og varme.
    2. Tilsett 2 μL pyro-spc i kloroform i 2000 μL metanol og virvel i 30 s. Overfør den til en ren, kompatibel 1 cm cuvette, og mål absorbansen. Juster denne fortynningsfaktoren hvis absorbanstoppen på 667 nm ut av det ultrafiolette synlige spektrofotometerets absorbansområde.
      MERK: Når du overfører kloroform eller metanol, bruk en ren glasssprøyte eller en pipette med positiv forskyvning i stedet for en mekanisk pipette for bedre nøyaktighet.
    3. Gjenta trinn 1.4.2 to ganger til for å få triplikatabsorberingsverdier.
    4. Gjennomsnittlig absorbans toppverdier på 667 nm og bruk følgende ligning for å beregne volumet av Pyro-SPC i kloroform som trengs for Lipid hetteglass14,15:
      Equation 1
      hvor V er volumet av Pyro-SPC i kloroform nødvendig, m er den nødvendige massen av Pyro-SPC (se trinn 1.1 og "Lipid Formula Sheet"), M er molekylvekten til Pyro-SPC ved 1040.317 g·mol-1, A er gjennomsnittlig absorbans ved 667 nm, d er fortynningsfaktoren basert på metanol og Pyro-SPC i kloroformvolumer (trinn 1.4.2), L er cuvette bane lengde på 1 cm, og ε er 667 nm molar demping koeffisient av Pyro-SPC ved 45000 L·mol-1·cm-1.
      MERK: Ligningens nevner er Beer-Lambert-loven, som relaterer konsentrasjonen av en analytt i oppløsning til den målte optiske absorbansen over en avstand.
    5. Tilsett det beregnede volumet av Pyro-SPC i kloroform fra forrige trinn til Lipid hetteglasset ved hjelp av en ren glasssprøyte (figur 1A) og hette og dekk hetteglasset.
      MERK: Figur 1 viser kun 30 % pyro-lipidformulering.
    6. Hvis det er noen Pyro-SPC i kloroform igjen: I en avtrekkshette løsner du Pyro-SPC + kloroform hetteglasset fra trinn 1.4, vipper delvis hetteglasset til siden og strømmer kontinuerlig nitrogengass så forsiktig som mulig inn i Pyro-SPC / kloroform hetteglasset. Roter hetteglasset for å tørke ut kloroformen ved hjelp av nitrogengassstrømmen og for jevnt å belegge Pyro-SPC på hetteglassets indre vegg når det tørker. Pass på at det ikke er gjort sprut, og at ingen av løsningene faller ut.
    7. Når Pyro-SPC lipidfilmen ser tørr og belagt på veggen av hetteglasset, slår du av nitrogengassstrømmen. Hette hetteglasset, forsegle hetteglasshalsen med voksfilm, og oppbevar hetteglasset ved -20 °C og i mørket.
  5. Forbered en løsning på 90% kloroform og 10% metanol (% v / v), og tilsett 5 ml av det til Lipid-hetteglasset. Cap Lipid hetteglasset, og virvle forsiktig for å homogenisere innholdet (Figur 1B).
    MERK: Hvis formuleringen inneholder fosfatidsyrelipider (som 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfat natriumsalt (DSPA)), tilsett: 60% kloroform, 32% metanol og 8% dobbeltdeionisert vann (% v / v / v) til Lipid vial i stedet. Mer intens virveling kan være nødvendig for å oppløse lipidinnholdet fullt ut.
  6. I en avtrekkshette løsner du Lipid-hetteglasset, vipper Lipid-hetteglasset delvis til siden og strømmer nitrogengass så forsiktig som mulig inn i Lipid-hetteglasset. Roter Lipid hetteglasset for å tørke ut løsningen ved hjelp av nitrogengassstrømmen og belegge lipidfilmen jevnt på den indre veggen av Lipid-hetteglasset når det tørker. Pass på at det ikke er gjort sprut, og at ingen av løsningene faller ut.
  7. Når lipidene ser tørre ut og belagt på de indre veggene i lipidhette hetteglasset (figur 1C), slår du av nitrogengassstrømmen, dekker bunnen og veggen av Lipid-hetteglasset med aluminiumsfolie, og dekker toppåpningen med aluminiumsfolie stikket med noen hull med en nål for ventilasjon (Figur 1D).
  8. Merk og plasser det dekkede Lipid hetteglasset inne i en vakuumdesiccator og la lipidene tørke ytterligere i minst 24 timer, men ikke mer enn 72 timer.
    MERK: Protokollen kan gjenopptas senere, etter 24 til 72 timer.

2. Lipidhydrering

  1. Fyll en badesonatormed vann og varm den til 70 °C. Slå på sonikeringen for å blande vannet.
    FORSIKTIG:Vannet og lydskriveren er ved høye temperaturer. Unngå å berøre vannet og lyddemperen. Bruk vernebriller, en beskyttende labfrakk og vernehansker.
  2. Når badekarets soniker har nådd 70 °C, fjerner du Lipid hetteglasset fra vakuumdesiccatoren. Reduser lysene i arbeidsområdet hvis det er mulig.
  3. Forbered en hjelpeløsning på 10% propylenglykol, 10% glyserol, 80% PBS (% v / v / v) og legg til 10 ml av det til Lipid-hetteglasset (se trinn 1.1.1 og "Lipid Formula Sheet").
    MERK: Hvis du bruker en standard luftforskyvningspipette, må du være forsiktig når du håndterer viskøse løsningsmidler som propylenglykol og glyserol. Aspirer og dypp volumet sakte og vent til restvolumet når bunnen av pipettespissen. Pass på at væsken ikke klamrer seg til utsiden av pipettespissen når du overfører volumer ved å bevege deg sakte.
  4. Cap Lipid hetteglasset, fjern aluminiumsdekselet, og virvle forsiktig hetteglasset i badekarets soniker i 15 minutter mens sonikeringen er på for å oppløse lipidene. Pass på at Lipid hetteglassets nakke er over vannet. Kontroller av og til om hetteglasshetten er ordentlig lukket.
    1. Fjern av og til Lipid hetteglasset fra vannbadet. Hold den kort fast i lyset for å kontrollere om innholdet er fullstendig oppløst (figur 1E).
    2. Hvis Lipid hetteglassinnholdet ikke homogeniseres, fjern Lipid hetteglasset fra badekarets soniker. Fest hetten, virvle mer aggressivt, og returner den til badesonatoren.
  5. Fjern Lipid hetteglasset fra badekarets soniker, og slå av badekarets soniker. Tørk Lipid hetteglassets eksteriør med papirhåndklær, og merk Lipid hetteglasset på nytt.
  6. Dekk Lipid hetteglasset med aluminiumsfolie, og avkjøl Lipid hetteglasset ved romtemperatur i et kjølig, mørkt, tørt område i 10 minutter.
  7. Aliquot Lipid hetteglassinnholdet: ca 2 ml lipidoppløsning i 3 ml borosilikatglass klare serumflasker (7 mm indre munndiameter, 13 mm ytre munndiameter).
    MERK: Noen protokoller kan bruke 1,5 ml lipidoppløsning i hetteglasset 3 ml7.
  8. Hette serum hetteglassene med lyofilisering-stil grå klorobutyl gummipropper (7 mm indre munndiameter, 13 mm ytre munndiameter) og fest gummiproppen med avrivning aluminiumstetninger (13 mm ytre munndiameter) og en krymper (Figur 1F).
  9. Støvsug, degas og trykk lipidoppløsningen på nytt i hvert av serum hetteglassene4,5,7 ( figur2).
    MERK: Se "Andre protokoller og data" for instruksjoner om hvordan du monterer gassveksleren og flere detaljer.
    1. Lukk hver ventil mellom og inkludert trykkventil A og gassflaskeventil (figur 2). Koble serum hetteglassene til manifoldnålene, åpne deretter de tilsvarende manifoldventilene, åpne deretter vakuumventil A og vakuumventil B, og støvsug ved -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) i 5 minutter for å fjerne atmosfærisk luft. IKKE støvsug ut noe av væsken (se "Andre protokoller og data" Trinn S3 til S3.1.5).
      FORSIKTIG:Vakuumpumpen kan eksplodere hvis den håndteres feil. Ikke bruk vakuumpumpen sammen med organiske, sure eller grunnleggende kjemikalier.
    2. Mens vakuumet fortsatt er på, holder du et serum hetteglass (for å forhindre at det svinger) og banker det raskt med en penn eller markør for å degas. Fortsett å tappe til det ikke dannes bobler, og det er ingen bobler i hetteglasset. IKKE la væske støvsuges ut. Stans trykking midlertidig om nødvendig. Gjenta for alle tilkoblede serum hetteglass. Etter avgassing av alle serum hetteglass, LUKK Vakuumventil A og Vakuumventil B og SLÅ AV vakuumpumpen (se "Andre protokoller og data" Trinn S3.2 til S3.2.3).
    3. Når serumhette hetteglasset fortsatt er koblet til kanylen og vakuumpumpen er slått av, dreier du langsomt gassflaskeventilen 1/16 til 1/8 (ca. 22,5 til 45 ° full omdreining) mot klokken for å åpne den delvis, og deretter åpner du T-håndtaksventilen og vrir luftregulatorventilen sakte til 3 psi (20,7 kPa) måler. Åpne deretter trykkventil A og trykkventil B (se "Andre protokoller og data" Trinn S3.3 til S3.3.21).
      FORSIKTIG:Decafluorobutane gassflasken er under trykk og kan eksplodere ved oppvarming. Hold deg unna varme og støt. Dekafluorobutangass kan forårsake oksygenforskyvning og kvelning. Bruk riktig øyebeskyttelse og håndtak i en avtrekkshette. Hvis det håndteres feil, er det mulig å støvsuge gassflasken, noe som kan føre til rask avtrykk og implosjon. Åpning av gassflaskeventilen mer enn 1/8 omdreining kan skade luftregulatoren.
    4. Etter 30 s trykk (måleren skal fortsatt lese 3 psi (20,7 kPa)), lukk alle manifoldventiler med serumflasker, koble fra serumflaskene, hylse nålene og LUKK gassflaskeventilen.
    5. Avlast det oppbygde trykket ved delvis å åpne en enkelt manifoldventil til nålen for luftregulatormåleren går til hvilestilling. Lukk deretter alt mellom og inkludert Manifold-ventilene og T-Håndtaket.
  10. Merk serum hetteglass og oppbevar dem ved 4 °C og i mørket. Kontroller at alle gassvekslerventiler er lukket og at vakuumpumpen slås av etterpå.
    MERK: Serumet skal være stabilt i opptil 4 måneder i denne tilstanden. På dette trinnet kan protokollen gjenopptas senere, etter maksimalt 4 måneder.

3. Decafluorobutane hetteglass

  1. Med rene, tomme 3 ml borosilikatglass klare serumflasker (7 mm indre munndiameter, 13 mm ytre munndiameter), hette dem med lyofiliseringsstil grå klorobutylgummipropper (7 mm indre munndiameter, 13 mm ytre munndiameter) og fest gummiproppen med tåreavbrudd aluminiumstetninger (13 mm ytre munndiameter) og en crimper4, 7,8.
  2. Følg trinn 2.9.1 for å støvsuge den atmosfæriske luften (se "Andre protokoller og data" Trinn S3.1 til S3.1.5).
  3. Hopp over avgassingen og følg trinn 2.9.3 til 2.9.5 for å trykke hetteglasset på nytt (se "Andre protokoller og data" trinn S3.3 til S3.3.21).
  4. Merk decafluorobutane hetteglassene og oppbevar dem ved 4 °C og i mørket. Kontroller at alle gassvekslerventiler er lukket og at vakuumpumpen slås av etterpå.
    MERK: Serum hetteglass fylt med decafluorobutane gass vil være nødvendig for dråpekondensering. De skal være stabile i opptil 4 måneder i denne tilstanden. På dette trinnet kan protokollen gjenopptas senere, etter maksimalt 4 måneder.

4. Dråpedannelse

  1. Fjern en hydrert lipidoppløsning i serum hetteglasset (fra trinn 2.10) fra kjøleskapet.
  2. Bruk en decapper, fjern aluminiumstetningen på serumhetteglasset og overfør 1 ml lipidoppløsning til et 1,85 ml borosilikatglassprøve hetteglass (med fenolisk skruehett) ved å la lipidoppløsningen strømme ned i innerveggen. Ikke lag bobler.
    1. Hvis det er noen gjenværende lipidløsning i serum hetteglasset, følg trinn 2.9 til 2.10 for å degas og trykk på serum hetteglasset for lagring (se "Andre protokoller og data" Trinn S3 til S3.3.21).
  3. Med 1,85 ml prøvehette hetteglass strømmer forsiktig i decafluorobutane-gass inn i prøvehetterommet ved hjelp av gassveksleren (se figur 2 for de spesifikke ventilnavnene).
    1. Kontroller at alle ventilene på gassveksleren er ordentlig lukket og at pumpen er slått av.
      FORSIKTIG:Hvis det gjøres feil, er det mulig å støvsuge ut gassflasken og forårsake rask dekompresjon og implosjon.
    2. Åpne en manifoldventil og avvarm forsiktig den tilsvarende nålen fra manifolden.
      FORSIKTIG:Skarpt objekt, unngå kontakt/piercing.
    3. Åpne trykkventil A og trykkventil B og vri gassflaskeventilen 1/16 til 1/8 (ca. 22,5 til 45 ° full omdreining) mot klokken for delvis å åpne og deretter åpne T-håndtaksventilen.
      FORSIKTIG:Gassflaskeventilen må ikke åpnes mer enn dette, da den kan forårsake skade på luftregulatoren.
    4. Løsne prøvehette hetteglasset med lipidoppløsningen og flytt det slik at Manifold-nålen er over væskeluftgrensesnittet inne i hetteglasset. Hold hetteglasset der.
    5. Drei luftregulatorventilen langsomt med klokken til luftregulatormålernålen beveger seg litt fra hvileposisjonen og perfluorkarbongassen strømmer forsiktig ut av manifoldnålen. La perfluorkarbongassen forsiktig strømme inn i hetteglassets hoderom i 30 s. Ikke lag bobler. Juster luftregulatorventilen om nødvendig.
      MERK: Væske-luft-grensesnittet skal være litt forstyrret av decafluorobutane gassstrømmen. Siden systemet nå er åpent, kan ikke luftregulatormåleren lese trykket riktig.
    6. Etter 30 s, forsiktig og raskt cap prøve hetteglasset uten å flytte hetteglasset for mye.
    7. Lukk gassflaskeventilen (med klokken), T-håndtaksventilen, luftregulatorventilen (mot klokken), trykkventil A, trykkventil B og manifoldventil.
    8. Forsiktig kappe nålen.
    9. Merk prøvedelet og forsegle nakken med voksfilm som går med urviseren (Figur 3A og 3B).
      MERK: Tallene 3B til 3F viser bare 30% Pyro-lipidformulering.
  4. Oppbevar hetteglasset i mørket og ved 4 °C i minst 10 minutter eller opptil 24 timer.
    MERK: På dette trinnet kan protokollen gjenopptas senere, maksimalt 24 timer.
  5. Legg ca. 100 g tørris (karbondioksid) i en isolert beholder og legg vanlig is i en annen isolert beholder. Hent tilberedte decafluorobutane serum hetteglass som er nevnt i trinn 3, to 3,81 cm (1,5 tommer) 20-gauge nåler, en 1 ml plastsprøyte (løsne stempelet før bruk), en 200 ml beholder, metalltangen og et termometer (-20 til 100 °C).
    MERK: Hvis du bare lager mikrobobler, er det ikke behov for isopropanol, tørris og is.
  6. Plasser prøvehetten med lipidoppløsningen i den mekaniske agitatoren og rør i 45 s (figur 3C).
  7. Etter den mekaniske agitasjonen, stå prøve hetteglasset høyre side opp, skjermet fra lys, og start en 15 min nedtelling for å kjøle ned hetteglasset og størrelse-velge mikrobubbles8,17.
    1. Når nedtellingen på 15 minutter har nådd 10 minutter (5 minutter igjen av nedtellingen), fyll en beholder med ca. 200 ml isopropanol og avkjøl den til -20 °C med tørris ved hjelp av metalltangen.
      MERK: Måltemperaturen er -15 til -17 °C, men isopropanolen varmes opp under håndtering av mikroboblene.
      FORSIKTIG:Isopropanol er brannfarlig. Holdes unna varme og gnister. Tørris kan forårsake hudskader. Håndter med tang. Bruk hansker, øyebeskyttelse og en beskyttende labfrakk.
  8. Etter at mikroboblene har vært størrelsesvalgt i 15 minutter, se etter den størrelsesvalgte partisjonen inne i prøve hetteglasset (Figur 3D).
  9. Hold prøvehette hetteglasset rett side opp, fjern forsiktig prøvehette hetteglasset og trekk ca. 0,7 ml av bunnpartisjonen med en 1,5 tommers 20-gauge nål festet til en 1 ml plastsprøyte. Kontroller at ingen av den øverste partisjonen er trukket tilbake. Ikke flikk sprøyten for å fjerne luftlommer.
  10. Sett inn en annen 20-gauge nål i et decafluorobutane serum hetteglass (hold nålen nær toppen av serum hetteglasset) for å ventilere og deretter sette inn nålen / sprøyten med de størrelsesvalgte mikrobubbles.
  11. Overfør de størrelsesvalgte mikroboblene langsomt. Vipp hetteglasset og vinkle sprøyten slik at væsken glir ned i den indre veggen på hetteglasset med dekafluorobutane serum.
  12. Når all den størrelsesvalgte mikrobobleløsningen er overført, fjerner du kanylen med sprøyten, men holder luftekanylen inne for å lindre negativt trykk (figur 3E).
    1. Hvis du bare lager størrelsesvalgte mikrobobler, stopp her. Hold luftekanylen i og nær toppen. Oppbevar hetteglasset i mørket og ved romtemperatur.
  13. Tilsett små mengder tørris eller romtemperatur isopropanol i isopropanolbadet for å sikre at badetemperaturen er mellom -15 og -17 °C.
  14. Med den 20-gauge ventilasjonsnålen satt inn nær toppen av serumhette hetteglasset, plasser serumhettekjøttet i isopropanolbadet, hold mikrobubble-nivået under isopropanolnivået, men hetteglasshalsen over det, og virvle serumhettebåndet periodisk i 2 minutter for å kondensere mikroboblene.
    MERK: Dette trinnet ble endret fra arbeidet utført av Sheeran et al.6
    1. Ikke virvle serum hetteglasset kontinuerlig i isopropanol og ikke la løsningen fryse. Virvle i ca 5 s, og løft serum hetteglasset ut av isopropanol. Se etter iskjernedannelse, og fortsett å virvle i isopropanol. Hvis det er isdannelse, virvler du serum hetteglasset i luften til det sprer seg.
  15. Etter 2-minutters kondens, fjern serum hetteglasset fra isopropanolbadet og fjern ventilasjonsnålen.
    MERK: Mikroboblene skal ha blitt kondensert til dråper, som indikert ved endringen i gjennomskinnelighet (figur 3E versus figur 3F for 30 % Pyro-lipidformulering).
  16. Tørk av serum hetteglasset, merk det og legg det på vanlig is i en mørk, isolert beholder til det er klart til bruk. Uåpnede (intakt aluminiumsforsegling) dråper skal være stabile i denne tilstanden i opptil 6 timer så lenge smeltet is blir erstattet etter behov.
  17. Når den er klar til bruk, fjern aluminiumstetningen med decapperen. Hold dråper (til og med åpne hetteglass) på is og i mørke mens de ikke er i bruk. Hold mikrobobler i mørke og ved romtemperatur.

5. Morfologisk og optisk karakterisering

  1. Forbered 1% Triton ved å: tilsett 5 ml Triton X-100 i 500 ml PBS (1x, pH 7.4) og rør med en magnetisk rørestang til homogen14.
    MERK: Triton X-100 veldig viskøs. Hvis du bruker en standard luftforskyvningspipette, må du være forsiktig ved håndtering. Aspirer og dypp volumet sakte og vent til restvolumet når bunnen av pipetten. Pass på at væsken ikke klamrer seg til utsiden av pipettespissen når du overfører volumer ved å bevege deg sakte.
  2. Klargjør dråper (trinn 4). Hvis mikrobobler også karakteriseres, samler du et lite volum av de størrelsesvalgte mikroboblene før kondens (trinn 4.9).
  3. Endre størrelsen på mikroboblene eller dråpene på en Coulter Counter (CC) fra 0,2 til 6 μm for å oppnå størrelsesfordelinger og konsentrasjoner (figur 4).
    1. Fyll en ren 20 ml cuvette med 10 ml CC elektrolytt som ble filtrert gjennom 0,2 μm porepolyetersulfonmembranfilter. Mål den på kopien med tre kjøringer for å få en grunnlinje.
    2. I samme CC-elektrolytt tilsetter du 5 μL mikrobubble- eller dråpeprøve og blander forsiktig.
      MERK: 2 til 20 μL prøve kan tilsetts avhengig av hvor konsentrert prøven er.
    3. Kjør prøven på CC (3 runs), trekk fra den gjennomsnittlige grunnlinjen, og beregn størrelsesfordelingen og konsentrasjonen (antall per ml).
  4. Mål dråpeabsorberingen med UV-Vis spektroskopi (figur 5).
    MERK: Figur 5 viser kun 30 % pyro-lipidformulering.
    1. På UV-Vis-spektrofotometeret stiller du inn absorbansmålingen som 800 nm til 300 nm bølgelengder med trinn på 0,5 nm og muliggjør korreksjon av grunnlinjen.
    2. Bruk en ren 1 cm banelengde cuvette fylt med PBS, utfør en grunnlinjemåling. Kontroller at volumet er høyt nok til å krysse spektroskopstrålebanen.
    3. Fortynn Pyro-lipiddråpene i PBS (anbefal 2 μL til 500 μL dråper i 2000 μL fortynningsmiddel) og bland ved pipettering.
      MERK: IKKE virvel ellers vil samlingene bli ødelagt.
    4. Overfør de fortynnede dråpene til en rengjort cuvette og mål absorbansen. Endre fortynning om nødvendig.
    5. Gjenta trinn 5.4.1 til 5.4.4, men bruk 1% Triton i stedet for PBS. Etter fortynning, overfør prøven til et forseglet/ avkortet hetteglass og virvel i 30 s før måling.
  5. Mål fluorescensen til mikrobobler eller dråper (Figur 6).
    MERK: Figur 6 viser kun 30 % pyro-lipidformulering.
    1. På fluorescensspektrofotometeret setter du eksitasjonsbølgelengden som 410 nm og utslippsbølgelengden varierer fra 600 til 750 nm med 1 nm trinn.
    2. Mål fluorescensen til PBS-fortynningsmiddelet for å få en basislinje ved hjelp av en cuvette som er kompatibel med fluorescensspektrofotometeret.
    3. Fortynn Pyro-lipidmikrobobler eller dråper i PBS (anbefaler 0,5 μL til 10 μL dråper i 2000 μL fortynningsmiddel) og bland ved pipettering.
      MERK: IKKE virvel ellers vil samlingene bli ødelagt.
    4. Overfør den fortynnede prøven til den rensede, grunnlinjede cuvette og mål fluorescensen. Endre fortynningene om nødvendig og unngå signalmetning.
    5. Gjenta trinn 5.5.1 til 5.5.4, men bruk 1% Triton i stedet for PBS. Etter fortynning i 1% Triton, overfør den fortynnede prøven til et forseglet / avkortet hetteglass og virvel i 30 s før måling. Legg til nok volum for å sikre at bobler generert fra virveling er over laserbanen.
      MERK: Fluorescenssignalet til prøven i Triton vil være mye høyere enn i PBS på grunn av fluorescens unquenching (Figur 6).

6. Fordampningsavbildning

  1. Fyll en vanntank i riktig størrelse med deionisert vann og la den hvile i 24 timer for å likevekte gassene i vannet med atmosfæren.
  2. Forbered dråper og hold på is og i mørke til bruk.
  3. Lag et strømningsfantomrør fra 2% agar som beskrevet av Pellow et al.18 Senk fantomet ned i en vanntank oppvarmet til 37 °C.
  4. Varm opp PBS til 37 °C og strømning gjennom fantomet.
  5. Med et preklinisk ultralydsystem og 21 MHz lineær array-svinger (se Materialfortegnelse), juster visningen til strømningsfantomet, sett den til B-modusavbildning, angi utgangstrykk og ta opp videoer eller bilder for å skaffe grunnlinjer ved hvert trykk.
  6. Fortynn 20 μL av dråpen i 50 ml 37 °C PBS og bland forsiktig. Overfør løsningen til en 30 ml plastsprøyte og skyv løsningen gjennom agarfantomet.
  7. Hold samme justering som trinn 6.5, øk utgangstrykket til fordampning observeres (lyse flekker i fantomet, se figur 7).
    MERK: Figur 7 viser 30 % Pyro-lipiddråpeprøve. Denne kommersielt tilgjengelige 21 MHz lineære array-svingeren er i stand til både bildebehandling og fordamping av dråper.

Representative Results

Forhåndskondenserte, størrelsesvalgte mikrobubbleprøver (n = 3) og postkondenserte dråpeprøver (n = 3) ble dimensjonert på en Coulter Counter (CC) med en blenderåpning på 10 μm. En begrensning på 10 μm blenderåpningen er at den ikke kan måle partikler mindre enn 200 nm, noe som kan forvå gjennomsnittsstørrelsen og konsentrasjonen. Figur 4 viser størrelsesdataene for hver av Pyro-lipidinnholdsformuleringene. Tabell 1 viser statistikk basert på størrelsesdataene. Ved hjelp av et forhold mellom pre- og postkondenserte gjennomsnittlige diametre viste resultatene at 0% Pyro-lipidformuleringen hadde det minste gjennomsnittlige diameterskiftet på 1,72 ± 0,02. Den 50% Pyro-lipidformuleringen hadde størst gjennomsnittlig diameter på 2,38 ± 0,08. Den 1% Pyro-lipiddråpeprøven hadde den høyeste observerte konsentrasjonen ved (2,71 ± 0,13) ×10 10 /ml mens den 40% Pyro-lipiddråpeprøven hadde lavest observert konsentrasjon ved (7,36 ± 0,81) × 109 /ml. Størrelsesdata viste at 10% Pyro-lipiddråpeprøve hadde den minste toppdimeteret på 261 ± 13 nm, mens 50% Pyro-lipiddråpeprøve hadde den største på 390 ± 55 nm. Generelt, etter hvert som Pyro-lipidinnholdet økte, ble konsentrasjonen redusert og gjennomsnittsdiameteren økte. Ettersom de postkondenserte prøvene er basert på forløperens mikrobubble-prøve, oppstod trenden for begge typer ultralydkontrastmidler. Etter hvert som Pyro-lipidinnholdet økte, begynte en mikrobubble subpopulation (med en toppstørrelse på ca. 2000 μm) å danne seg. Denne sekundære toppen var ikke til stede i 0% Pyro-lipid mikrobubble prøve og mest tydelig i 40% og 50% Pyro-lipid populasjoner.

Figur 5 viser representative absorbansmålinger av den 30 % Pyro-lipiddråpeprøven. Toppen av den intakte prøven i PBS var 700 nm, mens den forstyrrede prøven i Triton flyttet toppen til 671 nm. Dette viste at de intakte monteringene har forskjellige optiske egenskaper sammenlignet med de enkelte, umonterte lipidkomponentene.

Figur 6A viser representative fluorescensmålinger av den forhåndskondenserte mikrobubble-prøven, mens figur 6B viser postkondensert dråpeprøve med 30 % pyro-lipid. Den intakte prøven i PBS hadde en fluorescenstopp på 704 nm, mens den forstyrrede formen hadde en topp på 674 nm. Å trekke det forstyrrede området under kurven med det intakte området under kurven, og å dele forskjellen med det forstyrrede området under kurven, gir slukkeeffektiviteten, som fungerer til henholdsvis 98,61% og 98,07% for henholdsvis den 30% Pyro-lipid mikrobubble prøve- og dråpeprøven.

For å demonstrere dråper som konverterte til mikrobobler, ble fortynnede dråper avbildet og fordampet i et 37 °C strømningsfantom med et ultralydsystem. Figur 7 viser representative ultralydbilder av den 30 % Pyro-lipiddråpeprøven som er avbildet ved forskjellige trykk. Ved lavt trykk (figur 7A) var det svært lite signal, bare bakgrunnssignal fra luftbobler som satt fast fra agarsyntesen. Dette er fordi dråper er ikke-ekkogeniske og ikke sprer ultralyd. Ved litt høy effekt ble det generert noen mikrobobler (figur 7B) som vist ved utseendet av lyse flekker. Etter hvert som trykket økte, ble det generert flere mikrobobler (figur 7C og 7D). Dette viste også at dråpene ikke spontant vil fordampe ved 37 °C.

Figure 1
Figur 1: Bilder av trinnene for å danne den 30% Pyro-lipidløsningen. A) Lipidpulver pluss Pyro-SPC i kloroform. B) Oppløsningsløsning lagt til. C) Lipidfilm tørket og belagt på innvendig vegg av hetteglass. D) Lipid hetteglass innpakket i aluminiumsfolie (utvendig folie teipet for gjenbruk). E) Hydrert lipidoppløsning. F) Lipidoppløsning i serum hetteglass. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Gassveksleren med ti manifolder. Ventilene det refereres til i protokollen er merket. Se Tilleggsfil "Andre protokoller og data" for instruksjoner om hvordan du monterer gassveksleren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: A) Lipidløsningene til de 7 formuleringene (0% til 50% Pyro-SPC) i prøve hetteglass. Figur B til D viser bilder av trinnene som er tatt for å lage 30% Pyro-lipiddråper. B) 30 % Pyro-lipidoppløsning i et hetteglass med prøve. C) Etter agitasjon. D) 15 min størrelse valgt. E) Bunnpartisjon overført til decafluorobutane hetteglass. D) Etterkondensering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Coulter Counter (CC) størrelsesdata for de størrelsesvalgte mikrobubble- og dråpeprøvene med forskjellig Pyro-lipidskallinnhold (n = 3). De heldekkende grønne linjene representerer mikrobobler, og de prikkede cyan linjene representerer slippverktøy. A) 0% Pyro-SPC. B) 1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D) 20% Pyro-SPC. E) 30% Pyro-SPC. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H) De totale observerte konsentrasjonene av mikroboble- og dråpeprøver fra CC basert på Pyro-SPC-innhold i skallet. Alle feilfelt angir standardavvik. Alle målinger ble utført ved hjelp av en 10 μm blenderåpning som har et størrelsesområde på 200 nm til 6000 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative ultrafiolett-synlige (UV-Vis) spektroskopiabsorberingsmålinger fra 300 til 800 nm av den postkondenserte 30% Pyro-lipiddråpeprøven fortynnet i PBS og i 1% Triton. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representativt fluorescensutslipp fra 600 til 750 nm spent på 410 nm. A) Størrelsesvalgt, forhåndskondensert 30% Pyro-lipid mikrobubble prøve i PBS og i 1% Triton. B) Postkondensert 30% Pyro-lipiddråpeprøve i PBS og i 1% Triton. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representative ultralydbilder av et 37 °C agarstrømningsfantom tatt med en preklinisk 21 MHz lineær array-svinger i B-modus (se Materialtabell). Den venstre kolonnen (Figur A, C, Eog G) viser PBS-kontroller. Høyre kolonne (Figur B, D, F, & H) viser 20 μL postkondenserte 30 % Pyro-lipiddråpeprøve fortynnet til 50 ml 37 °C PBS. Hver rad representerer frittfelts topp negativt trykk, som ble estimert ut fra arbeidet utført av Sheeran et al.8 De gule trekantene indikerer fokusdybde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Metode Agent Pyro skall % 0 1 10 20 30 40 50
CC Bobler Kons. [/ml] (2,76 ± 0,28) × 10^10 (3,04 ± 0,15) × 10^10 (2,02 ± 0,11) × 10^10 (1,91 ± 0,22) × 10^10 (1,47 ± 0,05) × 10^10 (8,47 ± 0,95) × 10^9 (9,89 ± 0,15) × 10^9
CC Bobler Topp [nm] 329 ± 6 297 ± 15 305 ± 21 273 ± 14 310 ± 40 266 ± 33 393 ± 89
CC Bobler Gjennomsnitt [nm] 609 ± 2 603 ± 15 635 ± 6 690 ± 8 812 ± 1 935 ± 22 950 ± 55
CC Bobler Median [nm] 450 ± 6 421 ± 6 414 ± 6 432 ± 5 490 ± 2 596 ± 37 695 ± 41
CC Dråper Kons. [/ml] (2,18 ± 0,07) × 10^10 (2,71 ± 0,13) × 10^10 (1,75 ± 0,18) × 10^10 (1,72 ± 0,13) × 10^10 (1,09 ± 0,01) × 10^10 (7,36 ± 0,81) × 10^9 (7,38 ± 0,28) × 10^9
CC Dråper Topp [nm] 292 ± 0 297 ± 17 261 ± 13 280 ± 9 268 ± 17 287 ± 38 390 ± 55
CC Dråper Gjennomsnitt [nm] 353 ± 5 350 ± 5 347 ± 1 347 ± 4 397 ± 1 399 ± 6 400 ± 7
CC Dråper Median [nm] 318 ± 4 318 ± 4 310 ± 1 315 ± 2 340 ± 0 367 ± 5 370 ± 9

Tabell 1: Størrelsesdatastatistikk for mikrobubble- og dråpeprøvene med forskjellig Pyro-SPC-innhold fra Coulter Counter (CC) (n = 3). Alle feil indikerer standardavvik.

Tilleggsinformasjon - Lipid Formelark: Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsinformasjon - Andre protokoller og data: Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Etter å ha tilsatt alle lipidkomponentene sammen (trinn 1.2 og 1.4.5, figur 1A), ble det tilsatt en løsning av kloroform og metanol (og vann hvis fosfatidsyrelipider som DSPA er til stede) ble tilsatt for å sikre at Pyro-lipid- og ikke-Pyro lipidkomponenter ble fullstendig homogenisert (Trinn 1.5, figur 1B). For å forhindre dannelse av lipid vesicles med heterogen lipidsammensetning ble de oppløste lipidene tørket og belagt på innsiden av hetteglassets vegg som en tynn film (Figur 1C). Belegget (trinn 1.6) gjør også hydreringen (trinn 2.1 til 2.4) enklere da det øker overflatearealet til den tørkede filmen. Tørkingen (trinn 1.6, figur 1C) og støvsugingen (trinn 1.8, figur 1D) ble gjort for å sikre at kloroform og metanol ble fullstendig fordampet da disse kjemikaliene kan forstyrre dannelsen av mikrobobler. Selv om protokollen kan skaleres ned for å gjøre lipidløsningsvolumene så lave som 1 ml, kan større volumer redusere variasjonen mellom hetteglass og hetteglass. Selv om dette kan medføre risiko for å forringe Pyro-SPC mens den ikke er i bruk, var lagringstilstanden til lipidløsningen (trinn 2.9 til 2.10) ment å redusere denne risikoen. Avgassingstrinnet med gassveksleren (trinn 2.9.2, figur 1F og figur 2) tjener til å eliminere så mye oksygen som mulig for å forhindre oksidasjon. Det anbefales ikke å lagre lipidløsninger som inneholder porfyrin-lipider mens atmosfæriske gasser fortsatt er oppløst i løsningen (Figur 1E).

I trinn 2.10 er lipidoppløsningen i et serumhette hetteglass med et trykksatt hoderom, på samme måte som det klinisk godkjente ultralydkontrastmiddelet perflutren lipidmikrosfærer selges (ligner figur 1F). Internt arbeid har vist at stabile mikrobobler ikke kunne genereres via mekanisk agitasjon med tilstedeværelse av Pyro-lipider hvis hetten var et mykt materiale som gummiproppen. Derfor ble lipidoppløsningen overført til et prøvehette hetteglass med en ikke-gummi fenolhette (trinn 4.1 til 4.4, figur 3A og 3B). Når dekafluorobutanegassen ble strømmet inn i prøvehette hetteglasset (trinn 4.1 til 4.4), bør denser decafluorobutane fortrenge den atmosfæriske luften i prøvehetterommet. For tiden er det ukjent hvorfor Pyro-lipider ikke klarer å danne mikrobubbles med gummipropper. Uten Pyro-lipider kan stabile mikrobubbles gjøres direkte i serum hetteglassene med gummipropper4,7. Dermed anbefales det å bruke gassveksleren til å degas og trykke serumhetteskjemaet på nytt og deretter agitere selve serumhetteskjemaet for ikke-Pyro-lipidformuleringer4,5,6,7 (se "Andre protokoller og data"). Fordelen med å kunne lufte mekanisk i serum hetteglass er hoderommet kan trykksatt og størrelsesvalg kan gjøres ved å invertere serum hetteglasset opp-ned8. I denne protokollen ble 0% Pyro-lipidformuleringen overført til et prøvehette hetteglass (trinn 4.1 til 4.4) for å være i samsvar med formuleringene som inneholdt Pyro-lipider. I tillegg resulterer lengre acyl lipidkjedelengder i mer stabile dråper på grunn av bedre van der Waals-interaksjoner19. Lipidskallsammensetningen ble valgt basert på det som var kommersielt tilgjengelig, 18-acylkjedelengde for alle lipidtyper. DSPE-PEG5K ble innlemmet i all formuleringen (trinn 1.1) da tilstedeværelsen av polyetylenglykolkjedene forhindrer koalescens av strukturer via frastøtende steriske krefter19. Under lipidhydrering ble badesonatorbadet satt til 70 °C (trinn 2.1) så høyt nok til å spre lipidfilmen18med 18 acylkjedelengde fullstendig. For lengre acylkjedelengder vil det være nødvendig med høyere temperaturer.

Høyere Pyro-lipid lasting vil øke konsentrasjonen av optisk absorberende og fluorescerende komponenter, noe som kan være ønskelig for visse applikasjoner som drar nytte av maksimert porfyrin lasting. Men etter hvert som Pyro-lipidinnholdet økte, ble den observerbare dråpekonsentrasjonen redusert og diameterene økte (Figur 4 og Tabell 1). Dette illustrerer en avveining mellom optisk fluorescens og absorbansegenskaper kontra dråpekonsentrasjon og diameter. For forskere som må prioritere små diametre for in vivo akkumulering gjennom små lekkende kar, eller hvis en høy konsentrasjon av dråper må injiseres, kan det hende at økende Pyro-lipidbelastning ikke er verdt økningen i dråpedimeter eller reduksjon i dråpekonsentrasjon. Hvis høye dråpekonsentrasjoner og/eller små dråpediametre er avgjørende, bør tilsvarende store ledsagerdiagnostiske midler vurderes i stedet for Pyro-lipider. Mens 1% Pyro-lipiddråper ikke resulterte i en reduksjon i konsentrasjon eller økning i størrelse, kan 1% Pyro-lipid lasting være for lav til å være rimelig påviselig fra vevsbakgrunn fluorescerende. Fleksibiliteten til porfyrinmoiety gir imidlertid flere alternativer for funksjonalisering som vil gi alternative kvantifiseringsmidler som er mer egnet for bruksområder med lav konsentrasjon. For eksempel kan Pyro-lipider chelated med kobber-64 for positon utslipp tomografi avbildning og gamma teller20, eller med palladium for trace-metal kvantifisering ved hjelp av massespektrometri, eller med mangan for magnetisk resonansavbildning14.

Mens noen eksperimenter kanskje bare krever et lite volum av dråpeløsningen, er det nødvendig med 1 ml lipidoppløsning for å fylle hetteglasset med 1,85 ml prøve. Goertz et al. demonstrerte at endringer i håndtering, hoderomstrykk, væske-til-gass-forhold og til og med hetteglassformen kan påvirke mikrobobblepopulasjoner17. Hetteglasstemperatur under agitasjon og størrelsesvalg kan også påvirke størrelsesfordelingen. Derfor, for metodene optimalisert av sluttbrukeren, er det viktig å være så konsistent som mulig når du lager dråper. Uåpnede dråper kan fryses (-20 °C) og tines senere for fremtidig bruk, men dette vil påvirke størrelsespopulasjonene.

Agitasjonsprosedyren som aktiverer en lipidløsning i mikrobobler, produserer ikke en morfologisk homogen befolkning (trinn 4.6); I stedet er prøven fylt med mikrobobler, multilamellar vesicles, liposomer og micelles18,21,22. Mens mikrobubble størrelser spenner over mikron og nanometer rekkevidde, de andre strukturene er i stor grad under 800 nm 23. Størrelsesteknikkene som brukes skiller ikke mellom disse ulike strukturene, og dermed må de post-agitated mikrobubble-prøvene (trinn 4.6, figur 3C) og de postkondenserte dråpeprøvene (trinn 4.14, figur 3F) antas som blandinger. Ultralyd-ufølsomme forsamlinger (multilamellar vesikler, liposomer og micelles) er sannsynligvis bevart etter kondens og vil ikke endre størrelse da de ikke har faseforanderlige kjerner. Siden Coulter Counter ikke kan skille mellom disse forskjellige supramolecular-samlingene, bør endringen i populasjonsstørrelse etter kondens tolkes med antagelsen om at en del av nanoskalastrukturene er uomtvistelige og bidrar til den observerte befolkningen i den størrelsesregionen. I tillegg bidrar disse strukturene til spektroskopiske og fluorescerende signaturer av disse prøvene14. Fluorescens- og absorbanssignaturene til micelles, liposom / vesicles og dråper er alle like, inkludert deres grad av fluorescensslukking14. Dermed er det viktig å vurdere at det er en blanding av samlinger i figur 3C til 3F, figur 4, PBS fortynnet prøve i figur 5, og PBS fortynnet prøve i figur 6.

Etter størrelsesvalg og før kondens (trinn 4.9) er det mulig å eliminere ikke-bobleenheter ved å sentrifugere mikrobubble-prøven for å skille bøyeboblene fra de ikke-oppdriftsenhetene som beskrevet av Feshitan et al.21 Graden av separasjon kan kontrolleres ved å justere spinnkraften og varigheten. Eksperimenter med mikroboblekondensering av slike størrelsesisolerte prøver viste imidlertid at bruk av de større forløpermikrobubblepopulasjonene som velges ved hjelp av størrelsesisolasjonsprosedyrer, ga større dråper (se "Andre protokoller og data" Trinn S5 for etterspunnet boble- og dråpestørrelse). Siden en tiltenkt anvendelse av dråper produsert med denne protokollen er en plattform for passiv ekstravasasjon og akkumulering på grunn av deres lille størrelse sammenlignet med mikrobobler4,8, var dråpepopulasjoner som er så små som mulig ønsket. Dermed brukte denne protokollen post-agitated mikrobubble prøver som ikke var størrelsesisolert via sentrifugering, selv om det betydde ultralyd-ufølsomme micelles, liposomer og vesikler var til stede i den endelige løsningen. Dette innebærer at kvantifiseringsprosedyrer for biodistribusjon vil utlede signal for alle injiserte strukturer og ikke bare er begrenset til dråpene. Men siden disse lignende størrelse strukturer mest sannsynlig akkumuleres via en passiv mekanisme som primært dikteres av størrelse, er det ikke mistenkt at dette bør endre de viktigste slutningene som kan gjøres hvis denne plattformen skal brukes i vivo, selv om alle disse aspektene bør vurderes individuelt avhengig av konteksten der plattformen kan brukes. Tester ved hjelp av eksperimentelle armer med og uten ultralyd kan utføres for å sikre at det er ultralydfølsomme dråper som er ansvarlige for eventuelle endringer i biofordeling, da bare perfluorkarbonkjerneenhetene i løsningen vil reagere på ultralyd.

Etter agitasjon ble hetteglasset hvilt i 15 minutter og en partisjon ble observert i hetteglasset (Figur 3C versus 3D). Størrelsesvalg via oppdrift er en enkel metode for å eliminere de større strukturene / boblene fra en aktivert mikrobubble-løsning8,17. I dette tilfellet ble partikler med diameter større enn 5 μm for det meste fjernet etter størrelsesvalg (figur 4). Omfanget av størrelsesvalg kan justeres ved å kontrollere varigheten til størrelsesvalget17. Sheeran et al. har vist at ikke størrelsesvalg kan resultere i genererte mikrobobler som okkluderer vaskulatur8.

Perfluorkarboner har fordelen av å være biologisk inert7. Mens dekafluorobutanes kokepunkt er -1,7 °C, over kroppstemperaturen, fordampes ikke dråpene umiddelbart når de utsettes for 37 °C (figur 7B). Siden dråpene er metastabile ved 37 °C, er det nødvendig med ekstra akustisk energi for å fordampe dråpene til mikrobobler7,9. Poprosky et al. har vist porfyrindråper kondensert via trykk22. Dette er en levedyktig og til og med viktig metode når du bruker mindre tette perfluorkarboner, men høyt trykk kan ødelegge noen bobler i prosessen. Octafluoropropane (C3F8) har et kokepunkt på -36,7 °C, så både kjøling og trykksetting er nødvendig for dråpekondensering. Imidlertid fører det lettere perfluorkarbonet til mindre stabile dråper. Dodecafluoropentane (C5F12) kan føre til mer stabile dråper med et kokepunkt på 28 °C. Det er imidlertid en væske ved romtemperatur og trenger sterkere akustiske energier for å fordampe. Dermed bør valg av den inneholdende gassen til ultralydkontrastmiddelet vurdere betingelsene for den tiltenkte biologiske anvendelsen i tillegg til parametrene for fabrikasjonen. I denne protokollen ble isopropanolbadet for kondens satt til -15 til -17 °C (trinn 4.7.1 og trinn 4.13) mens andre protokoller brukte -10 °C 5,6. Selv med en vanlig dekafluorobutankjerne kan kondenstemperaturen variere avhengig av hjelpestoffsammensetning, total lipidkonsentrasjon og lipidskallsammensetning. Hvis du bruker andre formuleringer, kan det være nødvendig med optimalisering for å sikre riktig dråpekondensering uten at løsningen fryser.

Ettersom dråpene er mindre og mer stabile enn deres mikrobubble forløper7, kan de dra bedre nytte av passive akkumuleringsmekanismer for å ekstravasere inn i visse vev av interesse, for eksempel forbedret permeabilitet og oppbevaringseffekt av visse tumortyper4,24. Med fluorescerende, optisk absorberende og akustiske metoder fordeteksjon 14, er det mulig å bruke en enkelt formulering for å kvantifisere opptaket. I tillegg kan denne plattformen brukes til å undersøke om akustisk fordampning av dråper kan forbedre levert agentfraksjon utover passive nivåer16. For å kvantifisere agent biofordeling i vev og organer av interesse etter injeksjon, bør en kjent mengde Pyro-lipiddråper injiseres i dyret, ultralyd kan eller ikke kan påføres avhengig av kontrollsettet, dyret skal ofres et forhåndsspesifisert tidspunkt, og organene skal fjernes og veies. Organene skal homogeniseres, filtreres, fortynnes i overflateaktivt middel (vaskemiddel) for å decellularisere vevet, og kvantifiseres med fluorescens eller UV-Vis spektroskopi for å oppnå injiserte doseprosenter per organmasse basert på Pyro-signalene. For trinn 5.4.5 (figur 5) og trinn 5.5.5 (figur 6), ble Triton X-100 overflateaktivt middel (vaskemiddel) brukt til å forstyrre prøvene, da det ikke er fluorescerende ved 410 nm og absorberende bølgelengder ikke overlapper med Pyros.

Mikrobobler var ikke preget av UV-Vis absorbans. Siden UV-Vis-spektroskopets laserkilde er parallell med detektoren, kan store bobler spre lys bort fra detektoren, slik at de ser mer optisk absorberendeut 14. I motsetning til UV-Vis-spektrofotometeret, er fluorescensspektrofotometerets detektor / bør være vinkelrett på laserkilden for å forhindre at kilden forstyrrer detektoren. UV-Vis ble brukt til å kvantifisere absorbansen av de intakte og forstyrrede dråpeprøvene (trinn 5.4, figur 5). 300 til 800 nm ble valgt som absorbansbølgelengder som de to viktigste absorbansbåndene til pyro-lipid, Soret-båndet (340 til 500 nm) og Q-båndet (640 til 730 nm), faller innenfor dette området14. Når den monteres i en dråpe (eller andre supramolekulære strukturer), er Q-båndtoppen til Pyro-lipid rødforskyvning fra 671 nm til 700 nm (Figur 5). Når denne supramolecular strukturen er forstyrret av et overflateaktivt middel som Triton, skifter toppen tilbake til 671 nm14,15. Basert på dette skiftet er det mulig å fortelle om Pyro-lipidene er i en samlet tilstand eller i forstyrret tilstand. Forholdet mellom de to toppene kan brukes til å estimere forfallet av samlingene over tid.

For fluorescensmålingene (trinn 5.5, figur 6), ble en eksitasjonsbølgelengde på 410 nm valgt da den tilsvarer Soret-båndtoppen for umontert Pyro-lipid14. Et utslippsbølgelengdeområde fra 600 til 800 nm ble valgt som toppene til de intakte samlingene i PBS og forstyrrede Pyro-lipider i Triton finnes innenfor dette området. Skiftet og økningen i fluorescens (figur 6) mellom intakte (704 nm i PBS) og forstyrrede (674 nm i Triton) prøver oppstod på grunn av strukturindusert slukking. I den samlede formen ble Pyro-lipidmolekylene pakket tett sammen slik at genererte fotoner ble absorbert av nærliggende Pyro-lipidmolekyler. Dette er tydelig i intakt versus forstyrret slukkeeffektivitet. Dermed er det nødvendig å fortynne prøver i overflateaktivt middel (vaskemiddel) som 1% Triton X-100 for å lindre slukking og maksimere signalet for biodistribusjon kvantifisering14.

For enkelhets skyld ble den samme lineære array ultralydtransduseren brukt til både å fordampe og bilde (Trinn 6.5 og 6.7, figur 7). Denne ultralydtransduseren (Materialfortegnelse) var i stand til å nå de nødvendige topp negative trykkene som trengs for å fordampe dråper8. Fylling av en tank med deionisert vann fra en kran genererer gasser som blir oppløst i vannet (trinn 6.1). For å minimere forstyrrelser fra oppløste gasser i vannet med fordampning og avbildning, ble vannet hvilt i 24 timer i tanken slik at gassene i vannet kunne likevekte med atmosfæren (trinn 6.1). Alternativt kan det avioniserte vannet avgasses med en tilstrekkelig stor, forseglet beholder koblet til et tilstrekkelig kraftig vakuum. Ultralydbildene viste at mikroboblene ble kondensert da dråpene ikke var observerbare/ikke-ekkogene ved lavt trykk (figur 7B). Det var bare ved høyere utgangstrykk at dråpene fordampet til observerbare, ekkogene mikrobobler (Figur 7D, 7F, 7H). Mens den postkondenserte dråpeprøven inneholder micelles og liposomer/vesicles, er disse samlingene ikke-ekkogene, og bare dråper kan fordampe til ekkogene mikrobobler. En PBS-kontroll ble strømmet gjennom fantomet for å opprette grunnlinjebilder (figur 7A, 7C, 7E, 7G). Etter hvert som trykket økte i PBS, ble det ikke generert noen kontrast. Dette indikerte at høytrykket fra svingeren ikke kunne produsere spontan kavitasjon i et vannbasert medium alene, og dermed kunne all annen generert kontrast tilskrives ultralydkontrastmiddelet som brukes. Hvis utgangstrykket er for høyt, kan genererte mikrobobler ødelegges. Ved å øke trykket trinnvis og observere den genererte kontrasten, kan det optimale trykket bli funnet8. Sirkulasjonens halveringstid for dråpene kan bestemmes på en lignende måte ved å fordampe dråpene er visse tidsintervaller og observere kontrasten generert over tid7.

Oppsummert ble multimodale faseendringsdråper med varierende Pyro-lipidinnhold opprettet med kondensmetoden. Størrelse viste at det var en avveining mellom Pyro-lipidlasting og mikroboble-/dråpekonsentrasjon. Karakteriseringer viste at det var forskjeller i intakte og forstyrrede former i både absorbans og fluorescens. Ultralydavbildning viste at dråper ikke var ekkogene ved 37 °C og fordampet til ekkogene mikrobobler ved tilstrekkelig trykk. Karakteriseringer viste også potensialet for Pyro-lipiddråper til å erstatte ledsagerdiagnostiske midler for dråpebiodistribusjon eller akkumuleringstester. Fremtidig arbeid vil undersøke fordampningsterskler i løsningen, stabilitet i løsningen og in vivo-sirkulasjonsvarigheter hos nakne mus.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Dr. Brandon Helfield for å ha bidratt til å bygge gassveksleren og Dr. Miffy Hok Yan Cheng for tekniske diskusjoner. Forfatterne vil takke følgende finansieringskilder: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute og Princess Margaret Cancer Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 880220 Also known as "DSPE-PEG5K"
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 855775 Also known as "DSPC"
Aluminum Foil Any brand
Aluminum Seals, Tear-Off VWR 16171-840 Standard Aluminum, 13 mm outer diameter
Bath Sonicator Any brand Capable of  sonicating and heating up to 70 °C,
Bio-Stor Screw Cap Vials National Scientific BS20NABP Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring
Borosilicate glass clear serum vials VWR 16171-285 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter
Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap VWR 66011-020 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size
Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap Any brand Sizes will depend on desired volumes
Chloroform  Any brand
Coulter Counter Elctrolyte Diluent Any brand Compatible with Coulter Counter
Decafluorobutane (C4F10) FluoroMed 355-25-9
Deionized Water Any brand
Dry Ice (Carbon Dioxide) Any brand
Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer Any brand Capable of temperature control
E-Z Crimper, 13 mm Wheaton W225302 13 mm Standard Aluminum Seals
E-Z Decapper, 13 mm Wheaton W225352 13 mm Standard Aluminum Seals
Fluorescent Spectrophotometer Any brand Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source
Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette Any brand Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are  optical windows 
Gas Exchanger Made in-house Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions.
Glass syringes Any brand Sizes will depend on desired volumes
GLWR Custom Aperture Tube 10 um Beckman Coulter B42812 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e
Glycerol Any brand
Insulated Styrofaom containers with lids Any brand
Isopropanol Any brand
Lyophilization-Style Rubber Stoppers VWR 71000-060 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl
Membrane Diaphram Vacuum Pump Sartorius Stedim 16694-1-60-06 Adjustable pressure
Metal Tongs Any brand
Methanol Any brand
MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer VisualSonics 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging.
MultiSizer 4e Beckman Coulter Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm
Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 567-0010 Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times
Needles, Conventional BD 305176 20 gauge, 1.5 inch length
Nitrogen Gas Any brand Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source.
Parafilm Any brand Called "wax film" in the protocol.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Any brand 1X, 7.4 pH
Pipette Any brand Sizes will depend on desired volumes
Pipette Tips Any brand Sizes will depend on desired volumes
Plastic Syringes Any brand 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections
Polyethersulfone (PES) Membrane Filter Any brand 0.2 µm pore size
Propylene Glycol Any brand
Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine Made in-house Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis.
Thermometer Any brand (-20 to 100 °C)
Triton X-100 Any brand Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol"
Ultrapure Water Any brand Type 1 Purity
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Any brand Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length Any brand Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm
Vacuum Desiccator Any brand
Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform VisualSonics Pre-clinical ultrasound imaging system
Vialmix Bristol-Myers-Squibb Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s.
Vortex Mixer Any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
  2. Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
  3. Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
  4. Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
  5. Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
  6. Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
  7. Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
  8. Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
  9. Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
  10. Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
  11. Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
  12. Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
  13. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  14. Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
  15. Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
  16. Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
  17. Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
  18. Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
  19. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
  20. Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
  21. Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
  22. Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
  23. Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
  24. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).

Tags

Medisin utgave 176 ultralydkontrastmidler mikrobobler størrelsesvalg kondensering faseendringsdråper perfluorkarbon fordampning porfyrin
Syntese og karakterisering av multimodale faseendring porfyrindråper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J.,… More

Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J., Sheeran, P. S., Zheng, G. Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets. J. Vis. Exp. (176), e62665, doi:10.3791/62665 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter