Summary
Neste protocolo, são traçados métodos para sintetizar e caracterizar gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase.
Abstract
As gotículas de mudança de fase são uma classe de agentes de contraste de ultrassom que podem se converter em microbolhas ecogênicas in situ com a aplicação de energia acústica suficiente. As gotículas são menores e mais estáveis do que suas contrapartes de microbolhas. No entanto, os agentes tradicionais de contraste de ultrassom não são rastreáveis além das medidas de feedback acústico, o que dificulta a quantificação da bio-distribuição ou acúmulo de agentes de contraste. Os pesquisadores podem ter que contar com partículas de diagnóstico companheiro fluorescente ou opticamente absorventes para inferir a bio-distribuição. O objetivo deste protocolo é detalhar etapas para a criação de gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase usando um método de condensação. Porfirinas são moléculas fluorescentes com faixas de absorção distintas que podem ser conjugadas em lipídios e incorporadas em gotículas para ampliar a versatilidade de gotículas, permitindo uma bio-distribuição mais robusta, mantendo propriedades acústicas. Sete formulações com diferentes conteúdos de porfirina-lipídica e lipídio base foram feitas para investigar distribuições de microbolhas e tamanho de gotícula. Caracterizações adequadas às estruturas contendo porphyrin também são descritas no protocolo para demonstrar sua versatilidade analítica em solução. O dimensionamento mostrou que os diâmetros médios pós-condensados foram 1,72 a 2,38 vezes menores do que as populações precursoras. A caracterização da absorvência mostrou que os conjuntos intactos tinham um pico de banda Q de 700 nm, enquanto as amostras interrompidas tinham um pico de absorção de 671 nm. A caracterização da fluorescência mostrou que os conjuntos de porfirina-lipídico foram extintos fluorescentemente (>97%), com recuperação de fluorescência alcançada após a interrupção. A vaporização acústica mostrou que as gotículas de porfirina não eram ecogênicas a pressões mais baixas e podiam ser convertidas em microbolhas ecogênicas com pressões suficientes. Essas caracterizações mostram o potencial de gotículas porfiliais para eliminar a necessidade de absorção ou estratégias de diagnóstico companheiro baseadas em fluorescência para quantificar a bio-distribuição de agentes de contraste de ultrassom para aplicações de entrega ou terapêutica in vivo ou ex vivo.
Introduction
A imagem de ultrassom é uma forma não invasiva, não ionizante de imagens médicas que utiliza ondas acústicas. Embora os scanners de ultrassom sejam mais portáteis e possam fornecer imagens em tempo real, a imagem de ultrassom pode sofrer de baixo contraste, tornando difícil para os sonografistas distinguir de forma confiável características patológicas ecogênicas. Para neutralizar essa limitação, microbolhas podem ser injetadas no hospedeiro para melhorar o contraste vascular. Microbolhas são agentes de contraste do tamanho de micron que são altamente ecogênicos às ondas acústicas e podem fornecer contraste aprimorado do vaso1,2. As conchas e núcleos de gás de microbolhas podem ser adaptados para diferentes aplicações, como imagem, trombiolise, permeabilização da membrana celular ou abertura vascular transitória2.
Uma desvantagem dos microbolhas é sua meia-vida de curta circulação. Por exemplo, microesferas lipídicas perflutrenas clinicamente disponíveis têm apenas uma meia-vida de 1,3 minutos3. Para longas sessões de imagem, são necessárias múltiplas injeções de microbolhas. Outra desvantagem dos microbolhas são seus grandes diâmetros. Enquanto as microesferas lipídicas perflutren têm cerca de 1 a 3 μm de diâmetro, pequenas o suficiente para circular em vasculatura, elas são muito grandes para extravasar e se acumulam passivamente em tecidos de interesse, como tumores4. Uma estratégia para superar essas limitações é condensar as microbolhas do núcleo de gás em gotículas menores e líquidas5,6. Embora as gotículas não sejam ecogênicas em seu estado líquido, elas podem ser vaporizadas em microbolhas após a exposição ao ultrassom com pressão negativa de pico suficientemente alta, recuperando sua capacidade de fornecer contraste. Isso permite que a gotícula aproveite a farmacocinética mais favorável de um pequeno núcleo líquido, mantendo a capacidade de proporcionar contraste quando inssonado e sem alterar a composição química4,7.
O decafluorobutano é um composto perfluorocarbono ideal para a mudança de fase entre estados gasosos e líquidos5,6,7. O decafluorobutano permite a condensação de microbolhas em gotículas apenas com redução de temperatura, enquanto perfluorocarbonos menos densos requerem pressurização adicional5. Este método suave minimiza a destruição de bolhas durante a condensação7,8,9. Como seus núcleos são líquidos, gotículas não são ecogênicas e invisíveis ao ultrassom. No entanto, com a aplicação de energia acústica ou térmica suficiente, os núcleos líquidos podem vaporizar de volta em um estado gasoso, gerando microbolhas ecogênicas8. Essa vaporização permite o controle de quando e onde gerar microbolhas.
Embora as gotículas sejam úteis para acumulação passiva, vaporização in situ ou melhoria da permeabilidade celular4,gotículas (e seus fragmentos) não podem ser imagens ou ex vivoquantificadas . Portanto, o agente de diagnóstico companheiro quantificável, como fluorescente4,10,11, partículas magnéticas12, agentes opticamente absorventes13, são utilizados como um análogo para medir a entrega de gotículas a tecidos de interesse. Por exemplo, Helfield et al. usaram uma co-injeção de nano-contas fluorescentes para quantificação de imagem histologia de órgãos do rato, pois gotículas não podiam ser detectadas fluorescentemente4. A desvantagem dos agentes diagnósticos companheiros é que o componente rastreável pode agir independentemente da gotícula, dependendo do seu perfil farmacocinético individual.
Felizmente, a casca de microbolhas e gotículas pode ser personalizada. Por exemplo, Huynh et al. demonstraram agentes de contraste de ultrassom com conchas porphyrin-lipídicas, criando microbolhas multimodais14. Porfirinas são uma classe de compostos orgânicos com uma estrutura macrocílica aromática14,15. Eles são opticamente absorventes, fluorescentes, e podem ser quelados a uma grande variedade de metais para radioterapia, imagens baseadas em radionuclídeos ou quantificação baseada em metal de rastreamento14. Um exemplo de porfirina é o piropheophorbida (Pyro). Ao conjugar Pyro em lipídios, incorporar piro-lipídios em microbolhas ou gotículas permitem que sejam imagens e rastreadas através de múltiplas modalidades: acústica, fluorescente e através da absorvância14. Este agente de contraste multimodal poderia ser usado para rastrear e quantificar o acúmulo. Isso poderia eliminar a necessidade de agentes de diagnóstico companheiros, uma vez que o componente quantificável é agora conjugado na concha, permitindo uma quantificação de entrega mais precisa16.
Aqui, um protocolo para a criação de gotículas de porfirina multimodal de mudança de fase é delineado. Como os agentes de contrastes de ultrassom podem ser usados como plataforma para o fornecimento de medicamentos a tecidos de interesse, como tumores2,4, estender sua detectabilidade além do ultrassom pode ser útil para quantificação da eficácia do parto. O objetivo dessas gotículas é fornecer agentes de contraste de ultrassom rastreáveis capazes de acumulação passiva in vivo, in situ vaporização e acústica, e com o potencial de quantificar a bio distribuição ou acúmulo de órgãos ex vivo sem a dependência de sensores secundários. Métodos de caracterização também são delineados para mostrar o potencial das gotículas de porfirina como sensores de bio-distribuição. Os efeitos do carregamento piro-lipídide na casca (0% a 50% pela razão molar) também são discutidos.
Protocol
1. Filmes lipídesid desidratados
- Calcule as massas de cada um dos componentes da concha necessários (ver Arquivo Suplementar "Folha de Fórmula Lipídica").
NOTA: Para este protocolo, a composição da casca será: 10 molar % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamina-N-[metoxi (polietileno glicol)-5000] sal de amônio (DSPE-PEG5K), x molar % pyropheophopho Conjugado 1-estearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfocholina (Pyro-SPC), e (90 - x) molar % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholina (DSPC). A quantidade de Pyro-SPC será variada em 7 composições de conchas (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Verifique o peso molecular do DSPE-PEG5K na garrafa de estoque.- Dimensione o protocolo para qualquer volume lipíduo com um volume mínimo de 1 mL. Para este protocolo, foi utilizado um volume lipídeto total de 10 mL com concentração lipídica total de 1 mg por mL para todas as formulações. A solução excipiente será: 10% propilenoglicol, 10% glicerol e 80% salina tampão fosfato (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (ver Passo 2.3 e "Folha de Fórmula Lipídica").
NOTA: O protocolo de síntese de piro-lipídios está descrito no Arquivo Suplementar "Outros Protocolos e Dados" Etapas S1 a S1.19, que foi modificado a partir do trabalho feito por Zheng et al.15.
- Dimensione o protocolo para qualquer volume lipíduo com um volume mínimo de 1 mL. Para este protocolo, foi utilizado um volume lipídeto total de 10 mL com concentração lipídica total de 1 mg por mL para todas as formulações. A solução excipiente será: 10% propilenoglicol, 10% glicerol e 80% salina tampão fosfato (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (ver Passo 2.3 e "Folha de Fórmula Lipídica").
- Com base nas massas calculadas (ver Passo 1.1 e "Folha de Fórmula Lipídica"), pese cada um dos lipídios não-Piro-lipídios e transfira para um frasco de vidro borossilicato de tamanho suficiente com uma tampa de parafuso.
- Cubra o frasco, rotule a tampa e o frasco, e cubra a parte inferior e as paredes do frasco lipídado com papel alumínio. Este frasco será referido como o "Frasco Lipídedo" para o resto do protocolo. Armazene o Frasco Lipídua em uma área fria, seca e escura.
- Se a formulação contiver Pyro-SPC, dissolva 10 mg de filme seco Pyro-SPC (ver "Outros Protocolos e Dados") em 1 mL de clorofórmio. Vórtice para 5 s, meça a absorvância e calcule o volume apropriado para adicionar ao frasco lipídedo.
ATENÇÃO: O clorofórmio é um risco para a saúde, irritante e tóxico. Use um jaleco protetor, proteção dos olhos, luvas e evite respirar fumaça.
NOTA: Como o Pyro-SPC é sensível à luz, reduza as luzes na área de trabalho, se possível, ao manusear o Pyro-SPC. Mantenha o Pyro-SPC lacrado e coberto quando não estiver em uso.- No espectrofotômetro ultravioleta-visível, defina-o para medir a absorvência de uma faixa de comprimento de onda de 800 nm a 300 nm com incrementos de 0,5 nm, e meça uma linha de base com 2000 μL de metanol puro em um cuvette de comprimento de caminho compatível de 1 cm.
ATENÇÃO: O metanol é um risco para a saúde, irritante, tóxico e inflamável. Use um jaleco protetor, proteção dos olhos, luvas e evite respirar fumaça. Fique longe de faíscas e calor. - Adicione 2 μL do Pyro-SPC em clorofórmio em 2000 μL de metanol, e vórtice para 30 s. Transfira-o para um cuvette limpo e compatível de 1 cm e meça a absorvância. Ajuste este fator de diluição se o pico de absorção a 667 nm da faixa de absortômetro do espectrofotômetro ultravioleta visível.
NOTA: Sempre que transferir clorofórmio ou metanol, use uma seringa de vidro limpa ou uma pipeta de deslocamento positivo em vez de uma pipeta mecânica para melhor precisão. - Repita o passo 1.4.2 mais duas vezes para obter valores de absorção triplicado.
- Média dos valores máximos de absorção em 667 nm e use a seguinte equação para calcular o volume de Pyro-SPC em clorofórmio necessário para o Frasco lipídeco14,15:
onde V é o volume de Pyro-SPC em clorofórmio necessário, m é a massa necessária de Pyro-SPC (ver Passo 1.1 e "Folha de Fórmula Lipídica"), M é o peso molecular de Pyro-SPC em 1040.317 g·mol-1, A é a absorvância média em 667 nm, d é o fator de diluição baseado no metanol e Pyro-SPC em volumes de clorofórmio (Passo 1.4.2), L é o comprimento do caminho cuvette em 1 cm, e ε é 667 nm molar coeficiente de atenuação de Pyro-SPC em 45000 L·mol-1·cm-1.
NOTA: O denominador da equação é a Lei Beer-Lambert, que relaciona a concentração de um analito em solução à absorvância óptica medida à distância. - Adicione o volume calculado de Pyro-SPC em clorofórmio da etapa anterior ao frasco lipídedo usando uma seringa de vidro limpa(Figura 1A) e, em seguida, tampar e cobrir o frasco.
NOTA: A Figura 1 só mostra a formulação piro-lipídica de 30%. - Se houver algum Pyro-SPC em clorofórmio restante: Em um capô de fumaça, descap o frasco pyro-SPC + clorofórmio da Etapa 1.4, incline parcialmente o frasco para o lado e flua continuamente gás nitrogênio o mais suavemente possível no frasco pyro-SPC/clorofórmio. Gire o frasco para secar o clorofórmio usando o fluxo de gás nitrogênio e para revestir uniformemente o Pyro-SPC na parede interna do frasco à medida que seca. Certifique-se de que nenhum respingo seja feito e nenhuma solução caia.
- Uma vez que o filme lipídico Pyro-SPC apareça seco e revestido na parede do frasco, desligue o fluxo de gás nitrogênio. Tampe o frasco, sele o frasco com filme de cera e armazene o frasco a -20 °C e no escuro.
- No espectrofotômetro ultravioleta-visível, defina-o para medir a absorvência de uma faixa de comprimento de onda de 800 nm a 300 nm com incrementos de 0,5 nm, e meça uma linha de base com 2000 μL de metanol puro em um cuvette de comprimento de caminho compatível de 1 cm.
- Prepare uma solução de 90% clorofórmio e 10% de metanol (% v/v), e adicione 5 mL dele ao frasco lipídeco. Tampa o frasco lipídepo e gire suavemente para homogeneizar o conteúdo(Figura 1B).
NOTA: Se a formulação contiver lipídios ácido fosfídicos (como 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-fosfato de sal de sódio (DSPA)), adicione: 60% clorofórmio, 32% de metanol e 8% de água duplamente desionizada (% v/v/v) ao frasco lipídico. Um rodífalo mais intenso pode ser necessário para dissolver totalmente o conteúdo lipídudo. - Em um capô de fumaça, desprestaça o frasco lipídico, incline parcialmente o frasco lipídico para o lado e flua continuamente gás nitrogênio o mais suavemente possível no frasco lipídico. Gire o frasco lipídico para secar a solução usando o fluxo de gás nitrogênio e revestir uniformemente o filme lipídico na parede interna do frasco lipídico à medida que seca. Certifique-se de que nenhum respingo seja feito e nenhuma solução caia.
- Uma vez que os lipídios pareçam secos e revestidos nas paredes internas do frasco lipídico(Figura 1C),desligue o fluxo de gás nitrogênio, cubra o fundo e a parede do Frasco Lipídio com papel alumínio, e cubra a abertura superior com papel alumínio cutucado com alguns furos com uma agulha para ventilação(Figura 1D).
- Rotule e coloque o frasco lipídico coberto dentro de um desiccador de vácuo e deixe os lipídios secarem ainda mais por pelo menos 24 horas, mas não mais do que 72 h.
NOTA: O protocolo pode ser retomado mais tarde, depois das 24 às 72 horas.
2. Hidratação Lipídica
- Encha um sonicator de banho com água e aqueça-o a 70 °C. Ligue a sônica para ajudar a misturar a água.
ATENÇÃO: A água e o sonicator estão em altas temperaturas. Evite tocar na água e no sonicator. Use proteção ocular, um jaleco protetor e luvas de proteção. - Uma vez que o sonicator de banho tenha atingido 70 °C, remova o frasco lipídico do desiccador de vácuo. Reduza as luzes na área de trabalho, se possível.
- Prepare uma solução excipiente de 10% de propilenoglicol, 10% glicerol, 80% PBS (% v/v/v) e adicione 10 mL dele ao Frasco Lipídedo (ver Passo 1.1.1 e "Folha de Fórmula Lipídica").
NOTA: Se usar uma pipeta padrão de deslocamento de ar, tenha cuidado ao manusear solventes viscosos como propilenoglicol e glicerol. Aspire e mergulhe o volume lentamente e espere que o volume residual chegue ao fundo da ponta da pipeta. Certifique-se de que o líquido não se agarra ao lado de fora da ponta da pipeta ao transferir volumes movendo-se lentamente. - Cubra o frasco lipídico, remova a tampa de alumínio e gire suavemente o frasco no sônico de banho por 15 minutos enquanto a sônica está sobre dissolver os lipídios. Certifique-se de que o pescoço do Lipid Vial está acima da água. Verifique ocasionalmente se a tampa do frasco está fechada com segurança.
- Ocasionalmente, remova o frasco lipídedo do banho de água. Segure-o brevemente à luz para verificar se o conteúdo está totalmente dissolvido(Figura 1E).
- Se o conteúdo do frasco lipídico não estiver homogeneizando, remova o frasco lipídico do sônico de banho. Segure a tampa, gire mais agressivamente e devolva-a ao sônico de banho.
- Retire o frasco lipídico do sônico de banho e desligue o sonicador do banho. Seque o exterior do Frasco Lipída com toalhas de papel e re-rotule o frasco lipídeco.
- Cubra o frasco lipídeco com papel alumínio e esfrie o frasco lipídeco à temperatura ambiente em uma área fria, escura e seca por 10 minutos.
- Aliquot o conteúdo do frasco lipídeco: cerca de 2 mL da solução lipídica em frascos de soro transparente de vidro 3 mL (7 mm de diâmetro interno da boca, 13 mm de diâmetro externo da boca).
NOTA: Alguns protocolos podem usar 1,5 mL de solução lipídica no frasco de 3 mL7. - Tampe os frascos de soro com rolha de borracha de clorobutil cinza estilo liofilização (diâmetro da boca interna de 7 mm, diâmetro externo da boca de 13 mm) e fixe a rolha de borracha com vedações de alumínio rasgadas (13 mm de diâmetro externo da boca) e um crimper(Figura 1F).
- Aspirar, degas e represslar a solução lipídica em cada um dos frascos de soro4,5,7 (Figura 2).
NOTA: Consulte "Outros Protocolos e Dados" para obter instruções sobre como montar o Trocador de Gás e mais detalhes.- Feche todas as válvulas entre e incluindo válvula de pressão A e válvula de cilindro de gás(Figura 2). Conecte os frascos de soro às agulhas do coletor, depois abra as válvulas de coletor correspondentes, depois abra a válvula de vácuo A e a válvula de vácuo B e aspire a -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) por 5 minutos para remover o ar atmosférico. NÃO aspire nenhum líquido (consulte "Outros Protocolos e Dados" Passos S3 para S3.1.5).
ATENÇÃO: A bomba de vácuo pode estourar se manuseada incorretamente. Não utilize a bomba de vácuo com produtos químicos orgânicos, ácidos ou básicos. - Com o vácuo ainda ligado, segure um frasco de soro (para evitar que ele balance) e toque-o rapidamente com uma caneta ou marcador para degas. Continue tocando até que não se forme bolhas e não haja bolhas no frasco. NÃO deixe nenhum líquido ser aspirado. Pausar tocando se necessário. Repita para todos os frascos de soro conectados. Depois de desgasear todos os frascos de soro, FECHE a válvula de vácuo A e a válvula de vácuo B e desligue a bomba de vácuo (consulte "Outros protocolos e dados" passos S3.2 para S3.2.3).
- Com o frasco de soro ainda conectado à agulha e com a bomba de vácuo desligada, gire lentamente a válvula do cilindro de gás 1/16 a 1/8 (cerca de 22,5 a 45° de revolução completa) no sentido anti-horário para abrir parcialmente, depois abra a válvula t-handle e gire lentamente a válvula reguladora de ar no sentido horário para 3 psi (20,7 kPa). Em seguida, abra a válvula de pressão A e a válvula de pressão B (consulte "Outros protocolos e dados" passos S3.3 para S3.3.21).
ATENÇÃO: O cilindro de gás decafluorobutano está sob pressão e pode explodir se aquecido. Mantenha-se longe do calor e do impacto. O gás decafluorobutano pode causar deslocamento de oxigênio e sufocamento. Use proteção ocular adequada e manuseie em um capô de fumaça. Se manuseado incorretamente, é possível aspirar o cilindro de gás, o que pode causar rápida despressurização e implosão. Abrir a válvula do cilindro de gás mais de 1/8 pode danificar o regulador de ar. - Após 30 s de pressurização (medidor ainda deve ler 3 psi (20,7 kPa)), feche todas as válvulas de coletor com frascos de soro, desconecte os frascos de soro, baia as agulhas e FECHE a válvula do cilindro de gás.
- Alivie a pressão acumulada abrindo parcialmente uma única válvula de coletor até que a agulha do medidor do regulador de ar vá para sua posição de repouso. Em seguida, feche tudo entre e incluindo as válvulas manes e o T-Handle.
- Feche todas as válvulas entre e incluindo válvula de pressão A e válvula de cilindro de gás(Figura 2). Conecte os frascos de soro às agulhas do coletor, depois abra as válvulas de coletor correspondentes, depois abra a válvula de vácuo A e a válvula de vácuo B e aspire a -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) por 5 minutos para remover o ar atmosférico. NÃO aspire nenhum líquido (consulte "Outros Protocolos e Dados" Passos S3 para S3.1.5).
- Rotule os frascos de soro e armazene-os a 4 °C e no escuro. Certifique-se de que todas as válvulas do Trocador de Gás estejam fechadas e a bomba de vácuo seja desligada depois.
NOTA: O soro deve ficar estável por até 4 meses neste estado. Nesta etapa, o protocolo pode ser retomado mais tarde, após 4 meses no máximo.
3. Frascos de decafluorobutano
- Com frascos de soro limpos e vazios de 3 mL borosilicato (7 mm de diâmetro interno da boca, 13 mm de diâmetro externo da boca), tampa-os com rolha de borracha de clorobutil cinza estilo liofilização (7 mm de diâmetro interno da boca, 13 mm de diâmetro da boca) e fixar a rolha de borracha com vedações de alumínio rasgadas (13 mm de diâmetro da boca exterior) e um4, 4, 7,8.
- Siga o Passo 2.9.1 para aspirar o ar atmosférico (consulte "Outros Protocolos e Dados" Passos S3.1 para S3.1.5).
- Pule a desgassagem e siga as Etapas 2.9.3 para 2.9.5 para repressurizar o frasco (ver "Outros Protocolos e Dados" Passos S3.3 para S3.3.21).
- Rotule os frascos de decafluorobutano e armazene-os a 4 °C e no escuro. Certifique-se de que todas as válvulas do Trocador de Gás estejam fechadas e a bomba de vácuo seja desligada depois.
NOTA: Serão necessários frascos de soro cheios de gás decafluorobutano para a condensação da gotícula. Eles devem estar estáveis por até 4 meses neste estado. Nesta etapa, o protocolo pode ser retomado mais tarde, após 4 meses no máximo.
4. Formação de gotículas
- Remova uma solução lipídica hidratada no frasco de soro (a partir da etapa 2.10) da geladeira.
- Usando um decapper, remova o selo de alumínio no frasco de soro e transfira 1 mL da solução lipídica para um frasco de amostra de vidro borossilicato de 1,85 mL (com uma tampa de parafuso fenólica) deixando a solução lipídica fluir pela parede interna. Não crie bolhas.
- Se houver alguma solução lipídica restante no frasco de soro, siga as etapas 2.9 a 2.10 para desgas e represslize o frasco de soro para armazenamento (consulte "Outros Protocolos e Dados" Passos S3 para S3.3.21).
- Com o frasco de amostra de 1,85 mL, flua suavemente em gás decafluorobutano no headspace de frasco de amostra usando o Trocador de Gás (ver Figura 2 para os nomes específicos da válvula).
- Certifique-se de que todas as válvulas do Trocador de Gás estejam devidamente fechadas e que a bomba esteja desligada.
ATENÇÃO: Se feito incorretamente, é possível aspirar o cilindro de gás causando descompressão rápida e implosão. - Abra uma válvula coletora e desemplha cuidadosamente a agulha correspondente do coletor.
ATENÇÃO: Objeto afiado, evite contato/perfuração. - Abra a válvula de pressão A e a válvula de pressão B e gire a válvula do cilindro de gás 1/16 a 1/8 (cerca de 22,5 a 45° de revolução completa) no sentido anti-horário para abrir parcialmente e, em seguida, abrir a válvula t-handle.
ATENÇÃO: Não abra mais a válvula do cilindro de gás, pois pode causar danos ao regulador de ar. - Despreeça o frasco de amostra com a solução lipídica e mova-a para que a agulha do Coletor esteja acima da interface líquido-ar dentro do frasco. Segure o frasco lá.
-
Gire lentamente a válvula reguladora de ar no sentido horário até que a agulha do medidor do regulador de ar se mova ligeiramente de sua posição de descanso e o gás perfluorocarboneto esteja fluindo suavemente para fora da agulha do coletor. Deixe o gás perfluorocarbono fluir suavemente para o espaço de cabeça do frasco por 30 s. Não crie bolhas. Ajuste a válvula reguladora de ar, se necessário.
NOTA: A interface líquido-ar deve ser ligeiramente perturbada pelo fluxo de gás decafluorobutano. Como o sistema está agora aberto, o medidor do regulador aéreo não pode ler corretamente a pressão. - Depois dos 30, tampa cuidadosamente e rapidamente o frasco de amostra sem mover muito o frasco.
- Feche a válvula do cilindro de gás (no sentido horário), a válvula t-handle, válvula reguladora de ar (no sentido anti-horário), válvula de pressão A, válvula de pressão B e válvula de coletor.
- Cuidadosamente emagressa a agulha.
- Rotule o frasco de amostra e sele o pescoço com filme de cera indo no sentido horário (Figura 3A e 3B).
NOTA: As figuras de 3B a 3F só mostram a formulação piro-lipídica de 30%.
- Certifique-se de que todas as válvulas do Trocador de Gás estejam devidamente fechadas e que a bomba esteja desligada.
- Armazene o frasco de amostra no escuro e a 4 °C por pelo menos 10 min ou até 24h.
NOTA: Nesta etapa, o protocolo pode ser retomado mais tarde, 24 horas no máximo. - Coloque cerca de 100 g de gelo seco (dióxido de carbono) em um recipiente isolado e coloque gelo regular em outro recipiente isolado. Recuperar frascos de soro de decafluorobutano preparados mencionados na etapa 3, duas agulhas de calibre 20 de 3,81 cm (1,5 polegada), uma seringa de plástico de 1 mL (desaderar o êmbolo antes do uso), um recipiente de 200 mL, pinças metálicas e um termômetro (-20 a 100 °C).
NOTA: Se apenas fazer microbolhas, então não há necessidade de isopropanol, gelo seco e gelo. - Coloque o frasco de amostra com a solução lipídica no agitador mecânico e agitar para 45 s(Figura 3C).
- Após a agitação mecânica, levante o frasco de amostra para a direita, protegido da luz, e inicie uma contagem regressiva de 15 minutos para esfriar o frasco e selecione o tamanho das microbolhas8,17.
- Quando a contagem regressiva de 15 minutos chegar a 10 minutos (5 minutos restantes na contagem regressiva), encha um recipiente com cerca de 200 mL de isopropanol e esfrie-o a -20 °C com gelo seco usando pinças metálicas.
NOTA: A temperatura-alvo é de -15 a -17 °C, mas o isopropanol aquecerá enquanto manuseia as microbolhas.
ATENÇÃO: A isopropanol é inflamável. Mantenha-se longe do calor e faíscas. Gelo seco pode causar danos na pele. Manuseie com pinças. Use luvas, proteção ocular e um jaleco de proteção.
- Quando a contagem regressiva de 15 minutos chegar a 10 minutos (5 minutos restantes na contagem regressiva), encha um recipiente com cerca de 200 mL de isopropanol e esfrie-o a -20 °C com gelo seco usando pinças metálicas.
- Depois que os microcompletos tiverem sido selecionados por 15 minutos, procure a partição selecionada pelo tamanho dentro do frasco de amostra(Figura 3D).
- Mantendo o frasco de amostra para cima, despreze cuidadosamente o frasco de amostra e retire cerca de 0,7 mL da partição inferior com uma agulha de calibre 20 de 1,5 polegadas presa a uma seringa de plástico de 1 mL. Certifique-se de que nenhuma parte superior seja retirada. Não aperte a seringa para remover os bolsões de ar.
- Insira uma agulha diferente de 20 bitolas em um frasco de soro decafluorobutano (mantendo a agulha perto do topo do frasco de soro) para ventilar e, em seguida, inserir a agulha/seringa com as microbolhas selecionadas de tamanho.
- Transfira lentamente os microcompletos selecionados pelo tamanho. Incline o frasco e anule a seringa para deixar o líquido deslizar pela parede interna do frasco de soro de decafluorobutano.
- Uma vez transferida toda a solução de microbolhas selecionada pelo tamanho, remova a agulha com a seringa, mas mantenha a agulha de ventilação para aliviar a pressão negativa(Figura 3E).
- Se estiver fazendo apenas microbolhas selecionadas pelo tamanho, pare aqui. Mantenha a agulha de ventilação dentro e perto do topo. Mantenha o frasco no escuro e à temperatura ambiente.
- Adicione pequenas quantidades de gelo seco ou isopropanol de temperatura ambiente ao banho de isopropanol para garantir que a temperatura do banho esteja entre -15 a -17 °C.
- Com a agulha de ventilação de 20 bitolas inserida perto da parte superior do frasco de soro, coloque o frasco de soro no banho isopropanol, mantendo o nível de microbolhas abaixo do nível do isopropanol, mas o pescoço de frasco acima dele, e redemoinho intermitente do frasco de soro por 2 minutos para condensar as microbolhas.
NOTA: Esta etapa foi modificada a partir do trabalho feito por Sheeran et al.6- Não gire o frasco de soro continuamente no isopropanol e não deixe a solução congelar. Gire por cerca de 5 s, e levante o frasco de soro para fora do isopropanol. Verifique se há nucleação de gelo, e retome o giro em isopropanol. Se houver formação de gelo, gire o frasco de soro no ar até que se dissipe.
- Após a condensação de 2 minutos, remova o frasco de soro do banho isopropanol e remova a agulha de ventilação.
NOTA: Os microbolhas devem ter sido condensados em gotículas, conforme indicado pela mudança na translucência (Figura 3E versus Figura 3F para a formulação piro-lipídica de 30%. - Limpe o frasco de soro, rotule-o e coloque-o em gelo normal em um recipiente escuro e isolado até estar pronto para uso. As gotículas não abertas (vedação de alumínio intacto) devem ser estáveis neste estado por até 6 h, desde que o gelo derretido seja substituído conforme necessário.
- Quando estiver pronto para usar, remova o selo de alumínio com o descafeinado. Mantenha gotículas (até mesmo frascos abertos) no gelo e no escuro enquanto não estiver em uso. Mantenha microbolhas no escuro e à temperatura ambiente.
5. Caracterização morfológica e óptica
- Prepare 1% Triton por: adicionando 5 mL de Triton X-100 em 500 mL de PBS (1x, pH 7.4) e mexa com uma barra de agitação magnética até14homogêneos .
NOTA: Tritão X-100 muito viscoso. Se estiver usando uma pipeta padrão de deslocamento de ar, tenha cuidado ao manusear. Aspire e mergulhe o volume lentamente e espere que o volume residual chegue ao fundo da pipeta. Certifique-se de que o líquido não se agarra ao lado de fora da ponta da pipeta ao transferir volumes movendo-se lentamente. - Prepare gotículas (Passo 4). Se as microbolhas também estiverem sendo caracterizadas, colete um pequeno volume das microbolhas selecionadas antes da condensação (Passo 4.9).
- Dimensione os microcompletos ou gotículas em um Contador coulter (CC) de 0,2 a 6 μm para obter distribuições e concentrações de tamanho(Figura 4).
- Encha uma cuvette limpa de 20 mL com 10 mL de eletrólito CC filtrado através de 0,2 μm de filtro de membrana polietroésulfone poro. Meça-o no CC com três corridas para obter uma linha de base.
- No mesmo eletrólito CC, adicione 5 μL de microbolhas ou amostra de gotícula e misture suavemente.
NOTA: 2 a 20 μL de amostra podem ser adicionados dependendo da concentração da amostra. - Execute a amostra no CC (3 runs), subtraia a linha de base média e calcule a distribuição e concentração de tamanho (número por mL).
- Meça a absorvância de gotícula com espectroscopia UV-Vis(Figura 5).
NOTA: A Figura 5 só mostra a formulação piro-lipídica de 30%.- No espectrofotômetro UV-Vis, defina a medição de absorvência como comprimentos de onda de 800 nm a 300 nm com incrementos de 0,5 nm e habilite a correção da linha de base.
- Usando uma cuvette de 1 cm de comprimento limpa cheia de PBS, realize uma medição de linha de base. Certifique-se de que o volume é alto o suficiente para interceptar o caminho do feixe de espectroscópio.
- Diluir as gotículas piro-lipídicas em PBS (recomendo 2 μL a 500 μL de gotículas em 2000 μL de diluente) e misture por pipetação.
NOTA: NÃO vórtice ou então os conjuntos serão destruídos. - Transfira as gotículas diluídas em uma cuvette limpa e meça a absorvância. Altere as diluições, se necessário.
- Repetia passos 5.4.1 a 5.4.4, mas use triton 1% em vez de PBS. Após a diluição, transfira a amostra para um frasco vedado/tampado e vórtice por 30 s antes de medir.
- Meça a fluorescência de microbolhas ou gotículas(Figura 6).
NOTA: A Figura 6 só mostra a formulação piro-lipídica de 30%.- No espectrofotômetro da fluorescência, defina o comprimento de onda de excitação como 410 nm e o comprimento de onda de emissão varia de 600 a 750 nm com incrementos de 1 nm.
- Meça a fluorescência do diluente PBS para obter uma linha de base usando um cuvette compatível com o espectrofotômetro fluorescência.
- Diluir as microbolhas ou gotículas piro-lipídicas em PBS (recomendar 0,5 μL a 10 μL de gotículas em 2000 μL de diluente) e misturar por pipetação.
NOTA: NÃO vórtice ou então os conjuntos serão destruídos. - Transfira a amostra diluída para o cuvette limpo e de base e meça a fluorescência. Altere as diluições se necessário e evite a saturação do sinal.
- Repetia passos 5.5.1 a 5.5.4, mas use Triton 1% em vez de PBS. Depois de diluir em 1% Tritão, transfira a amostra diluída para um frasco vedado/tampado e vórtice por 30 s antes de medir. Adicione volume suficiente para garantir que as bolhas geradas a partir do vórtice estejam acima do caminho do laser.
NOTA: O sinal de fluorescência da amostra em Tritão será muito maior do que na PBS devido à fluorescência unquenching(Figura 6).
6. Imagem de vaporização
- Encha um reservatório de água de tamanho apropriado com água desionizada e deixe descansar por 24 horas para equilibrar os gases na água com a atmosfera.
- Prepare gotículas e mantenha no gelo e no escuro até usar.
- Faça um tubo fantasma de fluxo de 2% de ágar como descrito por Pellow et al.18 Submergir o fantasma em um tanque de água aquecido a 37 °C.
- Aqueça o PBS a 37 °C e flua pelo fantasma.
- Com um sistema de ultrassom pré-clínico e transdutor de matriz linear de 21 MHz (ver Tabela de Materiais),alinhe a visão do fantasma de fluxo, defina-a para a imagem do modo B, defina as pressões de saída e capture vídeos ou imagens para adquirir linhas de base a cada pressão.
- Diluir 20 μL da gotícula em 50 mL de 37 °C PBS e misture suavemente. Transfira a solução para uma seringa de plástico de 30 mL e empurre a solução através do fantasma do ágar.
- Mantendo o mesmo alinhamento do Passo 6.5, aumente as pressões de saída até que a vaporização seja observada (manchas brilhantes no fantasma, ver Figura 7).
NOTA: A Figura 7 mostra a amostra de gotícula piro-lipídica de 30%. Este transdutor de matriz linear de 21 MHz disponível comercialmente é capaz de imagens e gotículas vaporizantes.
Representative Results
Amostras de microbolhas pré-condensadas e selecionadas em tamanho(n = 3) e amostras de gotículas pós-condensadas(n = 3) foram dimensionadas em um Contador coulter (CC) com abertura de 10 μm. Uma limitação da abertura de 10 μm é que não pode medir partículas menores que 200 nm, o que pode influenciar o tamanho médio e a concentração. A Figura 4 mostra os dados de dimensionamento para cada uma das formulações de conteúdo piro-lipída. A Tabela 1 apresenta estatísticas com base nos dados de dimensionamento. Utilizando uma razão de diâmetros médios pré e pós-condensados, os resultados mostraram que a formulação piro-lipídica de 0% teve a menor mudança média de diâmetro em 1,72 ± 0,02. A formulação piro-lipídica de 50% apresentou o maior diâmetro médio em 2,38 ± 0,08. A amostra de gotícula piro-lipídica de 1% apresentou a maior concentração observada em (2,71 ± 0,13) × 1010 /mL, enquanto a amostra de gotícula piro-lipídica de 40% apresentou a menor concentração observada em (7,36 ± 0,81) × 109 /mL. Os dados de dimensionamento mostraram que a amostra de gotícula piro-lipídica de 10% tinha o menor diômetro de pico em 261 ± 13 nm, enquanto a amostra de gotícula piro-lipídica de 50% tinha a maior em 390 ± 55 nm. Geralmente, à medida que o teor piro-lipídide aumentava, a concentração diminuiu e o diâmetro médio aumentou. Como as amostras pós-condensadas são baseadas na amostra precursora de microbolhas, a tendência ocorreu para ambos os tipos de agentes de contraste de ultrassom. À medida que o teor piro-lipídide aumentava, uma subpopulação de microbolhas (com um tamanho de pico de aproximadamente 2000 μm) começou a se formar. Este pico secundário não estava presente na amostra de microbolhas piro-lipídicas de 0% e mais aparente nas populações de 40% e 50% de piro-lipídios.
A Figura 5 mostra medidas representativas de absorvência da amostra de gotícula piro-lipídica de 30%. O pico da amostra intacta na PBS foi de 700 nm, enquanto a amostra interrompida em Triton mudou o pico para 671 nm. Isso mostrou que as montagens intactas têm propriedades ópticas diferentes em comparação com os componentes lipídudos individuais e desmontados.
A Figura 6A mostra medidas representativas de fluorescência da amostra de microbolhas pré-condensadas, enquanto a Figura 6B mostra amostra de gotícula pós-condensada com 30% de piro-lipídio. A amostra intacta na PBS teve um pico de fluorescência de 704 nm, enquanto a forma interrompida teve um pico de 674 nm. Subtrair a área rompida sob a curva com a área intacta sob a curva, e dividir a diferença pela área interrompida sob a curva dá a eficiência de saciamento, que resulta em 98,61% e 98,07% para a amostra de microbolça piro-lipídica de 30%, respectivamente.
Para demonstrar gotículas convertendo-se em microbolhas, gotículas diluídas foram imagens e vaporizadas em um fantasma de fluxo de 37 °C com um sistema de ultrassom. A Figura 7 mostra imagens representativas de ultrassom da amostra de gotícula piro-lipídica de 30% imagemdas em diferentes pressões. Em baixas pressões(Figura 7A), havia muito pouco sinal, apenas sinal de fundo de bolhas de ar presos a partir da síntese de ágar. Isso ocorre porque as gotículas não são ecogênicas e não espalham ultrassom. Em uma potência ligeiramente alta, foram gerados alguns microbolhas (Figura 7B), como mostrado pelo aparecimento de manchas brilhantes. À medida que a pressão aumentava, mais microbolhas foram geradas(Figura 7C e 7D). Isso também demonstrou que as gotículas não vaporizarão espontaneamente a 37 °C.
Figura 1: Imagens dos passos para formar a solução 30% piro-lipídica. A) Pó lipídico mais Pyro-SPC em clorofórmio. B) Solução de dissolução adicionada. C) Filme lipídido seco e revestido na parede interna do frasco. D) Frasco lipídeco embrulhado em papel alumínio (papel alumínio exterior colado para reutilização). E) Solução lipídica hidratada. F) Solução lipídica em frasco de soro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O trocador de gás de 10 coletores. As válvulas referenciadas no protocolo são rotuladas. Consulte arquivo suplementar "Outros Protocolos e Dados" para obter instruções sobre como montar o Trocador de Gás. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A) As soluções lipídicas das 7 formulações (0% a 50% Pyro-SPC) em frascos de amostra. As figuras B a D mostram imagens das medidas tomadas para fazer gotículas piro-lipídicas de 30%. B) solução piro-lipídica de 30% em frasco de amostra. C) Pós-agitação. D) tamanho 15 min selecionado. E) Partição inferior transferida para frasco de decafluorobutano. D) Pós-condensação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coulter Counter (CC) dimensionamento de dados das amostras de microbolhas e gotículas selecionadas com diferentes teor de casca piro-lipídica(n = 3). As linhas verdes sólidas representam microbolhas e as linhas de ciano pontilhadas representam gotículas. A) 0% Pyro-SPC. B) 1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D) 20% Pyro-SPC. E) 30% Pyro-SPC. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H) As concentrações totais observadas de amostras de microbolhas e gotículas do CC com base no conteúdo Pyro-SPC no shell. Todas as barras de erro indicam desvio padrão. Todas as medições foram realizadas utilizando-se uma abertura de 10 μm que tem uma faixa de tamanho de 200 nm a 6000 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Medições de absorvância de espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis) representativas de 300 a 800 nm da amostra de gotícula piro-lipídica pós-condensada diluída em PBS e em 1% Triton. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Emissão representativa de fluorescência de 600 a 750 nm animado a 410 nm. A) Amostra de microbolhas piro-lipídica selecionada em 30% em PBS e em 1% triton. B) Amostra de gotícula piro-lipídica pós-condensada de 30% na PBS e em 1% tritão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imagens representativas de ultrassom de um fantasma de fluxo de ágar de 37 °C tiradas com um transdutor de matriz linear pré-clínico de 21 MHz no modo B (ver Tabela de Materiais). A coluna esquerda (Figuras A, C, E,& G) mostra os controles pbs. A coluna direita (Figuras B, D, F,& H) mostra 20 μL de amostra de gotícula piro-lipídica pós-condensada diluída em 50 mL de 37 °C PBS. Cada linha representa pressões negativas de pico de campo livre, que foram estimadas a partir do trabalho feito por Sheeran et al.8 Os triângulos amarelos indicam profundidade de foco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Método | Agente | Pyro Shell % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| CC | Bolhas | Conc. [/mL] | (2,76 ± 0,28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1.91 ± 0.22) × 10^10 | (1,47 ± 0,05) × 10^10 | (8.47 ± 0,95) × 10^9 | (9.89 ± 0,15) × 10^9 |
| CC | Bolhas | Pico [nm] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| CC | Bolhas | Média [nm] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| CC | Bolhas | Mediana [nm] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| CC | Gotículas | Conc. [/mL] | (2.18 ± 0,07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1,75 ± 0,18) × 10^10 | (1,72 ± 0,13) × 10^10 | (1.09 ± 0,01) × 10^10 | (7.36 ± 0,81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| CC | Gotículas | Pico [nm] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| CC | Gotículas | Média [nm] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| CC | Gotículas | Mediana [nm] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
Tabela 1: Dimensionamento das estatísticas de dados das amostras de microbolhas e gotículas com diferentes conteúdos Pyro-SPC do Coulter Counter (CC) (n = 3). Todos os erros indicam desvio padrão.
Informações Complementares - Folha de Fórmula Lipídica: Clique aqui para baixar este Arquivo.
Informações Complementares - Outros Protocolos e Dados: Clique aqui para baixar este Arquivo.
Discussion
Depois de adicionar todos os componentes lipídicos juntos (etapas 1.2 e 1.4.5, Figura 1A), uma solução de clorofórmio e metanol (e água se lipídios ácido fosfádico como dSPA estão presentes) foi adicionado para garantir que os componentes piro-lipídicos e não-Piro lipídios fossem totalmente homogeneizados (Passo 1.5, Figura 1B). Para evitar a formação de vesículas lipídicas com composição lipídica heterogênea, os lipídios dissolvidos foram secos e revestidos no interior da parede do frasco como uma película fina(Figura 1C). O revestimento (Passo 1.6) também facilita a hidratação (Passo 2.1 a 2.4) à medida que aumenta a área superficial do filme seco. A secagem (Passo 1.6, Figura 1C) e o aspirador (Passo 1.8, Figura 1D) foram feitos para garantir que o clorofórmio e o metanol fossem totalmente evaporados, pois esses produtos químicos podem interromper a formação de microbolhas. Embora o protocolo possa ser reduzido para tornar os volumes de solução lipídica tão baixos quanto 1 mL, volumes maiores podem reduzir a variação do frasco para o frasco. Embora isso possa correr o risco de degradar o Pyro-SPC enquanto não estiver em uso, a condição de armazenamento da solução lipídica (Passo 2.9 a 2.10) foi destinada a reduzir esse risco. O passo de desgaseamento com o trocador de gás (Passo 2.9.2, Figura 1F e Figura 2) serve para eliminar o máximo de oxigênio possível para evitar a oxidação. Não é recomendado armazenar soluções lipídicas contendo porfirina-lipídios enquanto os gases atmosféricos ainda são dissolvidos na solução(Figura 1E).
Na etapa 2.10, a solução lipídica está em um frasco de soro com um headspace pressurizado, semelhante à forma como as microesferas lipídicas do agente de contraste de ultrassom clinicamente aprovadas são vendidas (semelhante à Figura 1F). O trabalho interno mostrou que microbolhas estáveis não poderiam ser geradas através de agitação mecânica com a presença de Piro-lipídios se a tampa fosse um material macio como a rolha de borracha. Assim, a solução lipídica foi transferida para um frasco de amostra com tampa fenólica não-borracha (Passos 4.1 a 4.4, Figura 3A e 3B). Quando o gás decafluorobutano foi fluído para o frasco de amostra (Passos 4.1 a 4.4), o decafluorobutano mais denso deve deslocar o ar atmosférico no espaço de cabeça do frasco amostral. Atualmente, não se sabe por que os piro-lipídios são incapazes de formar microbolhas com rolhas de borracha. Sem piro-lipídios, microbolhas estáveis podem ser feitas diretamente nos frascos de soro com rolhas de borracha4,7. Assim, recomenda-se utilizar o Trocador de Gás para degas e repressurizar o frasco de soro e, em seguida, agitar o próprio frasco de soro para formulações não-piro-lipídicas4,5,6,7 (ver "Outros Protocolos e Dados"). A vantagem de ser capaz de agitar mecanicamente em frasco de soro é que o headspace pode ser pressurizado e a seleção de tamanho pode ser feita invertendo o frasco de soro de cabeça para baixo8. Neste protocolo, a formulação piro-lipídica de 0% foi transferida para um frasco de amostra (Passos 4.1 a 4.4) para ser consistente com as formulações que continham piro-lipídios. Além disso, maiores comprimentos da cadeia lipídica de acilho resultam em gotículas mais estáveis devido a melhores interações van der Waals19. A composição da casca lipídica foi escolhida com base no que estava comercialmente disponível, comprimento da cadeia de 18 acimais para todos os tipos lipídicos. O DSPE-PEG5K foi incorporado em toda a formulação (Passo 1.1) como a presença das cadeias de polietileno glicol impede a coalescência das estruturas através de forças estéricas repulsivas19. Durante a hidratação lipídica, o banho de sonicator de banho foi definido para 70 °C (Passo 2.1) tão alto o suficiente para dispersar totalmente o filme lipídico de 18 acyl de comprimento da cadeia18. Para maiores comprimentos da cadeia de aciis, serão necessárias temperaturas mais altas.
Um carregamento mais alto de piro-lipídios aumentaria a concentração de componentes de absorção óptica e fluorescing, que podem ser desejados para certas aplicações que se beneficiam do carregamento maximizado de porfirina. No entanto, à medida que o teor piro-lipídide aumentou, a concentração de gotículas observáveis diminuiu e os diâmetros aumentaram(Figura 4 e Tabela 1). Isso ilustra uma troca entre fluorescência óptica e propriedades de absorção versus concentração de gotículas e diâmetro. Para pesquisadores que devem priorizar pequenos diâmetros para o acúmulo in vivo através de pequenos vasos com vazamento ou se uma alta concentração de gotículas precisa ser injetada, o aumento do carregamento piro-lipídico pode não valer o aumento do diômetro gotícula ou diminuição na concentração de gotículas. Se altas concentrações de gotículas e/ou pequenos diâmetros de gotículas forem primordiais, agentes de diagnóstico companheiro de tamanho semelhante devem ser considerados em vez de piro-lipídios. Embora 1% das gotículas piro-lipídicas não resultem em uma diminuição na concentração ou aumento de tamanho, 1% o carregamento piro-lipídide pode ser muito baixo para ser razoavelmente detectável a partir do fundo do tecido fluorescentemente. No entanto, a flexibilidade da porfirina moiety fornece múltiplas opções de funcionalização que darão meios alternativos de quantificação mais adequados para aplicações de baixa concentração. Por exemplo, piro-lipídios podem ser quelados com cobre-64 para tomografia de emissão de positon e contagem gama20, ou com paládio para quantificação de trace-metal usando espectrometria de massa, ou com manganês para ressonância magnética14.
Enquanto alguns experimentos podem exigir apenas um pequeno volume da solução de gotícula, 1 mL da solução lipídica é necessário para preencher o frasco de amostra de 1,85 mL. Goertz et al. demonstraram que mudanças no manuseio, pressão do headspace, relação líquido-gás e até mesmo a forma do frasco podem afetar as populações de microbolhas17. A temperatura do frasco durante a agitação e a seleção de tamanho também podem influenciar a distribuição de tamanho. Portanto, para os métodos otimizados pelo usuário final, é fundamental ser o mais consistente possível ao fazer gotículas. Gotículas não abertas podem ser congeladas (-20 °C) e descongeladas mais tarde para uso futuro, mas isso afetará as populações de tamanho.
O procedimento de agitação que ativa uma solução lipídica em microbolhas não produz uma população morfologicamente homogênea (Passo 4.6); em vez disso, a amostra é preenchida com microbolhas, vesículas multilamellar, lipossomos e micelas18,21,22. Enquanto os tamanhos de microbolhas abrangem a faixa de míces e nanômetros, as outras estruturas estão em grande parte abaixo de 800 nm 23. As técnicas de dimensionamento utilizadas não distinguem entre essas várias estruturas e, portanto, as amostras de microbolhas pós-agitadas (Etapa 4.6, Figura 3C) e as amostras de gotículas pós-condensadas (Passo 4.14, Figura 3F) devem ser assumidas como misturas. Os conjuntos insensíveis de ultrassom (vesículas multilamellar, lipossomos e micelas) são provavelmente conservados pós-condensação e não mudarão de tamanho, pois não têm núcleos mutáveis de fase. Uma vez que o Contador Coulter não pode distinguir entre esses diferentes conjuntos supramoleculares, a mudança no tamanho populacional após a condensação deve ser interpretada com a suposição de que alguma proporção das estruturas nanoescala são inconversíveis e contribuem para a população observada nessa região de tamanho. Além disso, essas estruturas contribuem para as assinaturas espectroscópicas e fluorescentes dessas amostras14. As assinaturas de fluorescência e absorvência de micelas, liposomos/vesículas e gotículas são todas semelhantes, incluindo seu grau de fluorescência saciando14. Assim, é importante considerar que há uma mistura de montagens nas Figuras 3C a 3F, Figura 4, a amostra diluída do PBS na Figura 5e a amostra diluída do PBS na Figura 6.
Após a seleção de tamanho e antes da condensação (Etapa 4.9), é possível eliminar os conjuntos não-bolhas centrifugando a amostra de microbolhas para separar as bolhas flutuantes dos conjuntos não flutuantes, conforme descrito por Feshitan et al.21 O grau de separação pode ser controlado ajustando a força e duração do spin. No entanto, experimentos de condensação de microbolhas de amostras isoladas de tamanho revelaram que o uso das populações precursoras de microbolhas que são selecionadas usando procedimentos de isolamento de tamanho rendeu gotículas maiores (ver "Outros Protocolos e Dados" Passo S5 para dimensionamento de bolhas pós-giradas e gotículas). Uma vez que uma aplicação pretendida de gotículas produzidas com este protocolo é uma plataforma para extravasão passiva e acúmulo devido ao seu pequeno tamanho em comparação com microbolhas4,8, populações de gotículas que são tão pequenas quanto possível foram desejadas. Assim, este protocolo utilizou amostras de microbolhas pós-agitadas que não foram isoladas via centrifugação, mesmo que isso significasse micelas insensíveis de ultrassom, lipossomos e vesículas estavam presentes na solução final. Isso implica que os procedimentos de quantificação para a biosco distribuição derivarão sinal para todas as estruturas injetadas e não se limitarão apenas às gotículas. No entanto, uma vez que essas estruturas de tamanho semelhante provavelmente se acumulam através de um mecanismo passivo que é ditado principalmente pelo tamanho, não se suspeita que isso deve mudar as principais inferências que podem ser feitas se essa plataforma for utilizada in vivo,embora todos esses aspectos devem ser considerados individualmente dependendo do contexto em que a plataforma possa ser utilizada. Testes utilizando braços experimentais com e sem ultrassom podem ser realizados para garantir que sejam as gotículas sensíveis ao ultrassom que são responsáveis por quaisquer alterações na biosco distribuição, pois apenas os conjuntos do núcleo de perfluorocarbono na solução responderão ao ultrassom.
Após agitação, o frasco ficou descansado por 15 minutos e observou-se uma partição no frasco (Figura 3C versus 3D). A seleção de tamanho via flutuação é um método simples de eliminar as estruturas/bolhas maiores de uma solução de microbolhas ativada8,17. Neste caso, partículas com diâmetros superiores a 5 μm foram removidas principalmente após a seleção de tamanho(Figura 4). A extensão da seleção de tamanho pode ser ajustada controlando a duração da seleção de tamanho17. Sheeran et al. mostraram que a não seleção de tamanho pode resultar em microbolhas geradas que ocluem a vasculatura8.
Perfluorocarbonos têm a vantagem de serem biologicamente inertes7. Enquanto o ponto de ebulição da decafluorobutana é de -1,7 °C, acima da temperatura corporal, as gotículas não vaporizam imediatamente quando expostas a 37 °C (Figura 7B). Como as gotículas são metaeveis a 37 °C, é necessária energia acústica adicional para vaporizar as gotículas para microbolhas7,9. Poprosky et al. demonstraram gotículas de porfirina condensadas via pressurização22. Este é um método viável e até essencial ao usar perfluorocarbonos menos densos, mas altas pressões podem destruir algumas bolhas no processo. Octafluoropropano (C3F8) tem um ponto de ebulição de -36,7 °C, de modo que tanto o resfriamento quanto a pressurização são necessários para a condensação de gotículas. No entanto, o perfluorocarbono mais leve leva a gotículas menos estáveis. Dodecafluoropentane (C5F12) pode levar a gotículas mais estáveis com um ponto de ebulição de 28 °C. No entanto, é um líquido à temperatura ambiente e precisará de energias acústicas mais fortes para vaporizar. Assim, a escolha do gás contendo do agente de contraste do ultrassom deve considerar as condições de sua aplicação biológica pretendida, além dos parâmetros de sua fabricação. Neste protocolo, o banho de isopropanol para condensação foi definido de -15 a -17 °C (Etapa 4.7.1 e Passo 4.13), enquanto outros protocolos utilizados -10 °C 5,6. Mesmo com um núcleo de decafluorobutano comum, a temperatura de condensação pode variar dependendo da composição excipiente, concentração lipídica total e composição da casca lipídica. Se usar outras formulações, a otimização pode ser necessária para garantir a condensação adequada da gotícula sem fazer com que a solução congele.
Como as gotículas são menores e mais estáveis do que seu precursor de microbolhas7,elas podem aproveitar melhor os mecanismos de acumulação passiva para extravasar em certos tecidos de interesse, como o efeito de permeabilidade e retenção aprimorado de certos tipos de tumor4,24. Com métodos fluorescentes, opticamente absorventes e acústicos de detecção14,é possível usar uma única formulação para quantificar a absorção. Além disso, esta plataforma pode ser usada para investigar se a vaporização acústica de gotículas pode melhorar a fração de agente entregue além dosníveis passivos 16. Para quantificar a bio-distribuição do agente em tecidos e órgãos de interesse após a injeção, uma quantidade conhecida de gotículas piro-lipídicas deve ser injetada no animal, o ultrassom pode ou não ser aplicado dependendo do conjunto de controle, o animal deve ser sacrificado um ponto de tempo pré-especificado, e os órgãos devem ser removidos e pesados. Os órgãos devem ser homogeneizados, filtrados, diluídos em surfactante (detergente) para descelularizar o tecido, e quantificados com fluorescência ou espectroscopia UV-Vis para obter percentuais de dose injetada por massa de órgão com base nos sinais de Pyro. Para o passo 5.4.5 (Figura 5) e Passo 5.5.5(Figura 6),Triton X-100 surfactante (detergente) foi usado para interromper as amostras, pois não é fluorescente a 410 nm e seus comprimentos de onda de absorvância não se sobrepõem aos de Pyro.
Os microbolhas não foram caracterizados com absorvência UV-Vis. Como a fonte laser do espectroscópio UV-Vis é paralela ao detector, qualquer grande bolha poderia dispersar a luz para longe do detector, fazendo com que pareçam mais absorventes opticamente14. Ao contrário do espectrofotômetro UV-Vis, o detector de espectrofotômetro de fluorescência é/deve ser perpendicular à fonte laser para evitar que a fonte interfira no detector. UV-Vis foi utilizado para quantificar a absorvância das amostras de gotículas intactas e interrompidas (Passo 5.4, Figura 5). 300 a 800 nm foi escolhido como os comprimentos de onda de absorção como as duas principais bandas de absorção de piro-lipídio, a banda Soret (340 a 500 nm) e a banda Q (640 a 730 nm), caindo dentro desta faixa14. Quando montado em uma gotícula (ou outras estruturas supramoleculares), o pico da banda Q de Piro-lipída é recotado de 671 nm para 700 nm(Figura 5). Quando esta estrutura supramolecular é interrompida por um surfactante como Tritão, o pico muda de volta para 671 nm14,15. Com base nesta mudança, é possível dizer se os Piro-lipídios estão em um estado montado ou em um estado interrompido. A proporção dos dois picos pode ser usada para estimar a decadência das assembleias ao longo do tempo.
Para as medidas de fluorescência (Passo 5.5, Figura 6), foi escolhido um comprimento de onda de excitação de 410 nm, pois corresponde ao pico da banda Soret para piro-lipídio não remontado14. Um comprimento de onda de emissão de 600 a 800 nm foi selecionado à medida que os picos dos conjuntos intactos na PBS e piro-lipídios interrompidos em Tritão estão contidos dentro desta faixa. A mudança e o aumento da fluorescência(Figura 6) entre as amostras intactas (704 nm em PBS) e interrompidas (674 nm em Tritão) ocorreram devido à extinção induzida pela estrutura. Na forma montada, as moléculas piro-lipídicas foram embaladas de perto para que os fótons gerados fossem absorvidos por moléculas piro-lipídicas próximas. Isso é evidente na eficiência de sacieçação intacta versus interrompida. Assim, é necessário diluir amostras em surfactante (detergente) como 1% Triton X-100 para aliviar a sacieciação e maximizar o sinal para quantificação de bio-distribuição14.
Para simplificar, o mesmo transdutor de ultrassom de matriz linear foi usado tanto para vaporizar quanto para imagem (Etapas 6.5 e 6.7, Figura 7). Este transdutor de ultrassom (Tabela de Materiais) foi capaz de atingir o pico de pressões negativas necessárias para vaporizar gotículas8. Encher um tanque com água deionizada de uma torneira gera gases que se dissolvem na água (Passo 6.1). Para minimizar a interferência dos gases dissolvidos na água com vaporização e imagem, a água ficou descansada por 24 h no tanque para permitir que os gases na água se equilibrem com a atmosfera (Passo 6.1). Alternativamente, a água deionizada pode ser desgaseada com um recipiente vedado suficientemente dimensionado conectado a um vácuo suficientemente poderoso. As imagens de ultrassom demonstraram que os microbolhas foram condensados com sucesso, pois as gotículas eram inobserváveis/não ecogênicas a baixas pressões(Figura 7B). Foi apenas em pressões de saída mais altas que as gotículas vaporizaram em microbolhas observáveis e ecogênicas(Figura 7D, 7F, 7H). Embora a amostra de gotícula pós-condensada contenha micelas e lipossóculos/vesículas, esses conjuntos são não ecogênicos e apenas gotículas podem vaporizar em microbolhas ecogênicas. Um controle PBS foi fluído através do fantasma para estabelecer imagens de linha de base (Figuras 7A, 7C, 7E, 7G). À medida que a pressão aumentava na PBS, não foi gerado contraste. Isso indicou que as altas pressões do transdutor não poderiam produzir cavitação espontânea apenas em um meio à base de água, e, portanto, todos os outros contrastes gerados poderiam ser atribuídos ao agente de contraste de ultrassom empregado. Se a pressão de saída for muito alta, microcompletos gerados podem ser destruídos. Aumentando gradualmente a pressão e observando o contraste gerado, a pressão ideal pode ser encontrada8. A meia-vida de circulação das gotículas pode ser determinada de forma semelhante, vaporizando as gotículas são certos intervalos de tempo e observando o contraste gerado ao longo do tempo7.
Em resumo, gotículas multimodal de mudança de fase com conteúdo piro-lipídicos variado foram criadas com o método de condensação. O dimensionamento mostrou que houve uma troca entre o carregamento piro-lipídeca e a concentração de microbolhas/gotículas. Caracterizações mostraram que havia diferenças nas formas intactas e interrompidas tanto na absorção quanto na fluorescência. As imagens de ultrassom mostraram que as gotículas não eram ecogênicas a 37 °C e eram vaporizáveis em microbolhas ecogênicas a pressões suficientes. Caracterizações também mostraram o potencial de gotículas piro-lipídicas para substituir agentes de diagnóstico companheiro para testes de bio-distribuição ou acumulação de gotículas. O trabalho futuro investigará limiares de vaporização na solução, estabilidade na solução e durações de circulação in vivo em camundongos nus.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Brandon Helfield por ajudar a construir o trocador de gás e o Dr. Miffy Hok Yan Cheng por discussões técnicas. Os autores gostariam de agradecer às seguintes fontes de financiamento: Ontário Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute e Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
