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Developmental Biology

Modèles 2D et 3D à base de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de modèles de développement néocortical basés sur des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) 2D et 3D, ainsi que des méthodologies complémentaires permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du cilium primaire (PC).

Abstract

Les cils primaires (PC) sont des organites dynamiques non mobiles à base de microtubules qui dépassent de la surface de la plupart des cellules de mammifères. Ils émergent du centriole plus ancien pendant la phase G1/G0 du cycle cellulaire, tandis qu’ils se désassemblent lorsque les cellules rentrent dans le cycle cellulaire à la limite de phase G2/M. Ils fonctionnent comme des hubs de signaux, en détectant et en transduisant des signaux extracellulaires cruciaux pour de nombreux processus cellulaires. Comme pour la plupart des types de cellules, il a été démontré que toutes les cellules souches et progénitrices neurales néocorticales (NSPC) hébergent un PC leur permettant de détecter et de transduire des signaux spécifiques nécessaires au développement cortical cérébral normal. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour générer et caractériser des modèles cellulaires bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D) à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) afin de disséquer davantage l’implication du PC au cours du développement néocortical. En particulier, nous présentons des protocoles pour étudier la biogenèse et la fonction du PC dans les NSPC dérivés de rosettes neurales 2D, y compris la transduction de la voie Sonic Hedgehog (SHH). Pour tirer parti de l’organisation tridimensionnelle (3D) des organoïdes cérébraux, nous décrivons une méthode simple d’imagerie 3D d’organoïdes cérébraux in toto immunocolorés. Après nettoyage optique, l’acquisition rapide d’organoïdes entiers permet la détection des centrosomes et du PC sur les progéniteurs néocorticaux et les neurones de l’organoïde entier. Enfin, nous détaillons la procédure d’immunocoloration et de nettoyage des sections organoïdes épaisses flottantes en préservant un degré significatif d’informations spatiales 3D et en permettant l’acquisition à haute résolution nécessaire à l’analyse qualitative et quantitative détaillée de la biogenèse et de la fonction des PC.

Introduction

Les cils primaires (PC) sont des organites à base de microtubules qui détectent et transduisent une pléthore de signaux chimiques et mécaniques de l’environnement extracellulaire. En particulier, le PC est l’organite central pour la transduction de la voie de signalisation du hérisson chez les vertébrés1,2. Alors que la plupart des cellules neurales ont longtemps été montrées abritant un PC, la contribution de cet organite dans la formation du système nerveux central a longtemps été sous-évaluée. Des études sur le développement néocortical ont conduit à la découverte de multiples cellules souches neurales et progénitrices (NSPC), toutes abritant un PC, dont l’emplacement a été proposé comme crucial pour la détermination du devenir du progéniteur3,4,5,6,7. La PC s’est avérée cruciale pour les mécanismes cellulaires nécessaires au développement cortical cérébral normal, y compris l’expansion et l’engagement des NSPC8,9,10,11,12 ainsi que la polarité apicobasale de l’échafaudage glial radial soutenant la migration neuronale13. De plus, les PC sont nécessaires lors de la migration tangentielle des interneurones vers la plaque corticale14,15. Enfin, un rôle pour le PC a été proposé dans l’établissement des connexions synaptiques des neurones dans le cortex cérébral16,17. Dans l’ensemble, ces résultats plaident en faveur d’un rôle crucial de la PC aux étapes majeures du développement cortical cérébral18,19 et soulèvent la nécessité d’étudier leur implication dans les mécanismes pathologiques sous-jacents aux anomalies du développement cortical cérébral.

Des études récentes ont largement amélioré notre compréhension des différences cellulaires et moléculaires importantes entre le développement cortical dans les modèles humains et animaux, soulignant la nécessité de développer des systèmes modèles humains. De ce point de vue, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSEh) représentent une approche prometteuse pour étudier la pathogenèse de la maladie dans un contexte génétique et cellulaire pertinent. Les modèles cellulaires bidimensionnels adhérents (2D) ou les rosettes neurales contiennent des NSPC similaires à ceux observés dans le cortex cérébral en développement, qui s’organisent en structures en forme de rosette montrant une polarité apicobasale correcte20,21,22. De plus, le système de culture tridimensionnelle (3D) permet la génération d’organoïdes dorsaux du cerveau antérieur qui récapitulent de nombreuses caractéristiques du développement cortical cérébral humain23,24,25,26. Ces deux approches complémentaires de modélisation cellulaire offrent des perspectives passionnantes pour disséquer l’implication du PC au cours du développement normal et pathologique du cortex cérébral.

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de rosettes neurales et de NSPC dérivés ainsi que d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal. Nous fournissons également des protocoles détaillés pour analyser la biogenèse et la fonction du PC présent sur les NSPC en testant la transduction de la voie Sonic Hedgehog et en analysant la dynamique des molécules cruciales impliquées dans cette voie. Pour tirer parti de l’organisation 3D des organoïdes cérébraux, nous avons également mis en place une méthode simple et économique d’imagerie 3D d’organoïdes cérébraux in toto immunocolorés permettant l’acquisition rapide, grâce à un microscope à feuille de lumière, de l’organoïde entier, avec une haute résolution permettant de visualiser pc sur tous les types de progéniteurs néocorticaux et de neurones de l’organoïde entier. Enfin, nous avons adapté l’immunohistochimie sur des sections flottantes de 150 μm avec un nettoyage et une acquisition ultérieurs à l’aide d’un microscope confocal à balayage résonant permettant l’acquisition d’images à haute résolution, ce qui est nécessaire pour l’analyse détaillée de la biogenèse et de la fonction du PC. Plus précisément, le logiciel d’imagerie 3D permet la reconstruction 3D du PC avec une analyse ultérieure des paramètres morphologiques, y compris la longueur, le nombre et l’orientation du PC, ainsi que la mesure de l’intensité du signal des composants ciliaires le long de l’axoneme.

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Protocol

1. Génération de modèles cellulaires 2D hIPS de développement néocortical

  1. Formation de rosette neurale
    1. Commencez par les cultures hIPSC abritant de grandes colonies régulières, présentant moins de 10% de différenciation et pas plus de 80% de confluence.
    2. Rincez les hIPSC avec 2 mL de PBS.
    3. Ajouter 2 mL de milieu d’induction NSPC complété par l’inhibiteur de Rock (NIM + 10 μM de Y-27632).
    4. Disséquez manuellement chaque colonie hIPSC d’un plat de 35 mm à l’aide d’une aiguille pour couper chaque colonie avec précision dans les directions horizontale et verticale afin de créer un motif de damier divisant chaque colonie en grappes égales.
    5. Détachez la colonie à l’aide d’un grattoir à cellules et transférez-les sur un plat ultra-faible de 35 mm.
    6. Laissez-les flotter pendant la nuit (ON) dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2, afin qu’ils puissent former des corps embryoïdes (EB).
      REMARQUE: Les corps embryoïdes (EB) sont définis comme des amas de sphéroïdes flottants ou des agrégats de csegh.
    7. Transférer les EB dans des boîtes de 35 mm revêtues de poly-L-ornithine/laminine (PO/lam) dans des boîtes de 2 mL NIM + 10 μM de Y-27632.
    8. Rafraîchissement quotidien du milieu d’induction NSPC (NIM sans Y-27632) jusqu’à la formation de rosettes neurales qui prend environ 12 à 14 jours. Vérifiez au microscope.
      REMARQUE: Après cette étape, les rosettes neurales peuvent être étendues, différenciées et traitées pour une analyse immunocolorante ou dissociées pour obtenir des cellules souches et progénitrices neurales isolées (NSPC).
  2. Expansion de la rosette neurale et différenciation précoce
    1. Coupez les rosettes neurales en forme de grille avec une aiguille et délogez les grappes à l’aide d’un grattoir cellulaire.
    2. Transférer les rosettes dans une plaque de 4 puits contenant un couvercle en verre revêtu de PO / lam (4-5 rosettes / puits) dans 0,5 mL de support de maintenance NSPC (NMM).
    3. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
    4. Actualisez NMM tous les deux jours jusqu’au jour 20.
    5. À partir du jour 20, la culture de rosettes neurales dans 0,5 mL de cytokine a épuisé le NMM pour permettre la différenciation. Rafraîchissez le milieu tous les 2-3 jours.
    6. Au jour 30 et au jour 40 (10 ou 20 jours de différenciation), fixez les rosettes avec 0,5 mL de PFA à 4%, 20 min, RT.
  3. Biogenèse du PC et analyse fonctionnelle sur des CSNP isolés
    1. Dissociation des PNJ
      1. Coupez les rosettes neurales de l’étape 1.1.8 selon un motif en forme de grille avec une aiguille et délogez les grappes à l’aide d’un grattoir cellulaire. Transférer les cellules dans des plats de 35 mm revêtus de PO/lam dans 2 mL de NMM et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
      2. Actualisez NMM tous les deux jours jusqu’à la confluence (environ 5 à 7 jours).
      3. Après avoir gratté les grandes cellules claires entourant les rosettes neurales, cueillez-les manuellement et transférez-les sur des plats frais de 35 mm enduits de PO / lam pour enrichir les NSPC et épuiser les types de cellules non neurales.
      4. Après un ou deux passages manuels (répétez l’étape 1.3.1.3 si nécessaire) nécessaires pour enlever tous les types de cellules contaminantes, retirer le milieu et rincer avec du PBS.
      5. Ajouter 300 μL de trypsine à 0,05 % et incuber pendant 5 min à 37 °C jusqu’à ce que la plupart des cellules se détachent.
      6. Ajouter 2 mL du milieu contenant 10% de FBS (DMEM + 10% DE FBS) pour inactiver la trypsine. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Pipettez doucement la suspension cellulaire de haut en bas trois fois pour briser les amas de cellules.
      7. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
      8. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le NMN.
      9. Ensemencez les NSPC dissociés sous forme de cellules simples (1 x 105 cellules/cm2) dans du NMM sur des plats enduits de PO/lam et incubez-les dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
      10. Développez les NSPC dans NMM en changeant de support tous les deux jours.
        REMARQUE: Les NSPC sont ensemencés à haute densité pour éviter la différenciation.
    2. Analyse de la biogenèse PC
      1. Les semences dissocient les NSPC à 100 000 cellules/cm2 et les incubent dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 dans le NMM pendant 2 jours.
      2. Aspirer le milieu et affamer les NSPC dans un milieu appauvri en cytokines (milieu de famine NSPC, tableau supplémentaire 1) pendant 48 h.
      3. Fixez les NSPC avec 4% de PFA pendant 20 minutes à RT.
      4. Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min à TA avant l’immunocoloration.
    3. Analyse de la fonction PC: voie de signalisation SHH
      1. Les semences ont dissocié les NSPC à 100 000 cellules/cm2 sur des lames de chambre à 8 puits revêtues de PO/lam (300 μL) ou des plats T25 (5 mL) et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 dans le NMM pendant 2 jours.
      2. Affamer les NSPC dans un milieu de famine NSPC (300 μL par puits de glissière de chambre à 8 puits et 5 mL dans une fiole de T25) pendant 48 h.
      3. Pour induire la voie SHH, incuber les NSPC avec le milieu de famine complété par du SHH recombinant (100 ng / mL) ou SAG (500 nM); (150 μL par puits d’une lame de chambre de 8 puits et 2 mL en fiole T25) pendant 24 h.
      4. Fixer les NSPC cultivés sur des lames de chambre à 8 puits dans 250 μL de PFA à 4 % par puits pendant 20 min à TA et les laver deux fois avec 250 μL de PBS pendant 5 min à RT avant l’analyse immunocolorante.
      5. Retirez le milieu et lavez les NSPC cultivés dans des plats T25 avec du PBS.
      6. Ajouter 500 μL de trypsine à 0,05 % et incuber pendant 5 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.
      7. Ajouter 2 mL de milieu contenant 10% de FBS (DMEM + 10% FBS) pour inactiver la trypsine et recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL.
      8. Centrifugez à 300 x g pendant 5 min et aspirez soigneusement le surnageant pour obtenir des pastilles NSPC qui peuvent être cryoconservées à -80 °C avant l’extraction de l’ARN et l’analyse RT-PCR.

2. Génération d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal

  1. Culture unicellulaire de csisptiques
    1. Commencez par les cultures hIPSC abritant de grandes colonies régulières présentant moins de 10% de différenciation et qui ont été adoptées presque une fois. Assurez-vous que les cellules ne sont pas confluentes à plus de 80%.
    2. Laver les colonies avec 2 mL de PBS.
    3. Ajouter 500 μL de réactif de dissociation cellulaire douce (GCDR) et incuber pendant 5 à 7 min à 37 °C.
    4. Aspirer le GCDR et ajouter 2 mL de milieu mTeRS1 complété par 5 μM de Y-27632.
    5. Pipettez doucement les cellules de haut en bas 10 fois pour dissocier toutes les colonies en cellules uniques.
    6. Transférer les cellules sur des plats enduits de vitronectine et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2.
      REMARQUE: Effectuer au moins 1 passage des hSIC à l’aide de GCDR avant l’expérience de différenciation pour adapter les hIPSC aux conditions de culture unicellulaire.
  2. Au jour 0, permettre aux cSEh de former des corps embryonnaires dans un milieu EB contenant une faible concentration de FGF2 et une concentration élevée d’inhibiteur de roche nécessaire à la survie du hIPSC. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Laver les colonies avec 2 mL de PBS.
    2. Ajouter 500 μL de réactif de dissociation cellulaire douce (GCDR) et incuber pendant 5 à 7 min à 37 °C.
    3. Aspirer le GCDR et ajouter 1 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632; Utilisez une pipette de 1 mL pour détacher doucement les cellules et les transférer dans un tube conique de 15 mL.
    4. Rincer à nouveau avec 2 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632, transférer les cellules restantes dans le tube conique de 15 mL. Ajouter immédiatement 3 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632 au tube conique et homogénéiser doucement la solution à l’aide d’une pipette de 5 mL.
    5. Centrifuger les cellules dissociées à 100 x g pendant 5 min.
    6. Aspirer doucement le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 6 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632.
    7. Centrifuger les cellules à 100 x g pendant 5 min.
    8. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632. Utilisez une pipette de 1 mL pour dissocier doucement les cellules en une suspension à cellule unique.
    9. Immédiatement après avoir réutilisé les cellules, diluez-les et comptez-les.
    10. Diluer le volume approprié de la suspension cellulaire (contenant 900 000 cellules) dans 30 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632 et 4 ng/mL de bFGF et mélanger doucement la solution.
    11. Plaque 9 000 cellules/puits dans une plaque 96U à fixation ultra-basse (300 μL/puits). Pour éviter de perturber la formation d’EB, incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2 jusqu’au jour 3 sans changement de milieu.
  3. Induction neuronale (inhibition SMAD double)
    1. Le jour 3, assurez-vous que les EB mesurent entre 300 et 400 μm et affichent des bordures régulières. Si les deux critères sont atteints, remplacer la moitié du milieu (150 μL) par un milieu d’induction-1 contenant des inhibiteurs de Dual SMAD, ce qui entraîne un éclaircissement du contour des EB du jour 6 au jour 7 indiquant une différenciation neuroectodermique (tableau supplémentaire 2).
    2. Le jour 4, remplacer les 3/4 du milieu (225 μL) par un milieu d’induction-1.
    3. Jour 6 et Jour 8 : Rafraîchissez la moitié du milieu d’induction-1 (150 μL).
  4. Intégration d’organoïdes dans la matrice de la membrane basale (Jour 10)
    1. Le jour 10, intégrez les EB dans la matrice de membrane basale (BMM) à facteur de croissance réduit.
      REMARQUE: À partir de cette étape, utilisez toujours des ciseaux stériles pour couper l’ouverture des embouts de la pipette afin d’éviter d’endommager les organoïdes par pipetage répété.
    2. Premier transfert d’environ 15-17 organoïdes dans des tubes coniques. Laissez les EB se déposer et retirez le milieu. Ajouter 50 μL de milieu d’induction-2 et les transférer dans un tube de microcentrifugation contenant 100 μL de BMM.
    3. Étalez le mélange matrice-EB sur le centre d’un puits d’une plaque à fixation ultra-basse et séparez les EB pour éviter qu’ils ne fusionnent.
    4. Laisser le BMM se solidifier dans l’incubateur à 37 °C pendant 45 min.
    5. Ajouter 3 mL du milieu d’induction-2 dans chaque puits et placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
      REMARQUE: Assurez-vous que cette procédure est effectuée le plus rapidement possible car BMM se solidifie à température ambiante.
  5. Culture stationnaire d’organoïdes incorporés dans la matrice de la membrane basale
    1. Jour 12, 14: Rafraîchir le milieu d’induction-2.
    2. Jour 16: Rafraîchir le milieu d’induction 2 et vérifier au microscope l’expansion des boucles neuroépithéliales.
  6. Dissociation et culture de la matrice de membrane basale sur un agitateur orbital
    1. Le jour 17, dissociez les organoïdes du BMM en pipetant de haut en bas 10 fois avec une pipette de 5 mL et transférez-les dans un milieu de différenciation-1 (sans vitamine A). Incuber sur un agitateur orbital à 80 tr/min dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 pour améliorer l’absorption nutritionnelle.
      REMARQUE: Utilisez un incubateur différent pour la culture stationnaire et la culture sur un agitateur orbital pour éviter toute vibration préjudiciable à la croissance des cellules hIPS adhérentes.
    2. Jour 19: Actualiser la différenciation moyen-1.
    3. Jour 21: Changer le milieu de différenciation-1 en milieu de différenciation-2 (avec la vitamine A).
    4. Du jour 23 au jour 35: Rafraîchissez le milieu avec la différenciation moyen-2 tous les 2-3 jours.
    5. Du jour 35 au jour 70: Actualisez la différenciation moyen-2 avec 1% de BMM et rafraîchissez tous les 2-3 jours.
    6. Recueillir les organoïdes après 28, 42 et 70 +/- 2 jours de différenciation et les fixer pendant la nuit à 4 °C, dans 5 mL 4 % de PFA sur un tube conique de 15 mL.
    7. Pour une analyse immunologique ultérieure in toto ou flottante, les organoïdes sont ensuite rincés deux fois dans du PBS et conservés à 4 °C dans du PBS + 0,05 % d’azoture de sodium.
    8. Pour l’analyse immunocolorante sur des sections congelées, immerger 4 % d’organoïdes fixes PFA dans 10 mL 30 % de saccharose à +4 °C ON (ou jusqu’à ce que les organoïdes coulent). Intégrez-les dans une matrice d’intégration congelée et stockez-les à -80 °C jusqu’à la cryosection.

3. Immunomarquage in toto , nettoyage et acquisition par feuille de lumière des organoïdes du cerveau antérieur dorsal

  1. Fixation
    1. Recueillir les organoïdes dans des plaques à 6 puits, retirer le milieu et les fixer avec 2 mL de PFA à 4 %, à 4 °C, pendant la nuit.
    2. Effectuer trois lavages dans 2 mL de PBS à température ambiante.
    3. Transférer les organoïdes dans des tubes de 2 mL et conserver à 4 °C dans 2 mL de PBS + 0,05 % d’azoture de sodium.
  2. Perméabilisation
    1. Incuber des organoïdes dans 1 mL de PBS contenant 0,2% de Triton X100 à RT pendant 1 h. Faites-le deux fois.
    2. Incuber dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Triton X100 et 20 % de DMSO, à 37 °C, pendant la nuit.
    3. Incuber dans 1 mL de PBS contenant 0,1 % de Tween20, 0,1 % de Triton X100, 0,1 % de désoxycholate, 0,1 % de NP40 et 20 % de DMSO, à 37 °C, pendant la nuit.
    4. Incuber dans 1 mL de PBS contenant 0,2% de Triton-X100, à RT, pendant 1 h. Faites-le deux fois.
  3. Blocage et immunoétiquetage
    1. Bloquer dans 1 mL de solution bloquante (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Sérum d’âne, 10% DMSO), à 37 °C, ON.
    2. Incuber avec des anticorps primaires dilués dans 250 μL de PBS, 0,2 % de Tween20, 0,1 μg/mL d’héparine, 5 % de DMSO et 3 % de sérum d’âne, à 37 °C, pendant 2 jours.
    3. Laver dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Tween20 et 0,1 μg/mL d’héparine, pendant 1 h, à 37 °C. Faites-le quatre fois.
    4. Laver dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Tween20 et 0,1 μg/mL d’héparine, pendant la nuit, à 37 °C.
    5. Incuber avec des anticorps secondaires dilués dans 250 μL de PBS contenant 0,2 % de Tween 20, 0,1 μg/mL d’héparine et 3 % de sérum d’âne, à 37 °C, pendant 2 jours.
    6. Laver dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Tween 20 et 0,1 μg/mL d’héparine, pendant 1 h, sur une roue, à RT. Faites-le quatre fois.
    7. Laver dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Tween 20 et 0,1 μg/mL d’héparine, pendant la nuit, sur une roue, à TA.
    8. Laver dans 1 mL de PBS, pendant 24 h, à RT.
    9. Stocker à +4 °C dans 1 mL de PBS et 0,05 % d’azoture de sodium jusqu’à élimination.
  4. Clairière en TDE (2,2′ -Thiodiéthanol)
    1. Incuber les organoïdes dans 1 mL de TDE à 30% (3 mL de TDE + 7 mL de PBS), pendant 24 h, à RT.
    2. Incuber dans 1 mL de TDE à 60% (6 mL de TDE + 4 mL de PBS), pendant 24 h, à RT.
    3. Incuber dans 1 mL de 80% de TDE (8 mL de TDE + 2 mL de PBS), pendant 24 h, à RT.
  5. Intégration d’organoïdes avant l’acquisition de feuilles lumineuses
    REMARQUE: Utilisez un système sur mesure; fabriqué avec une seringue de 1 mL avec la pointe coupée avec un scalpel.
    1. Préparer 100 mL d’agarose à faible fusion à 4 % dans une solution de TDE à 60 % et aliquote dans des tubes de 2 mL. Conserver à +4 °C.
    2. Avant l’incorporation organoïde, préchauffer un tube contenant 1,5 mL d’agarose à faible fusion à 4 % dans 60 % de TDE au bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il se liquéfie.
    3. Pendant ce temps, préparez un système de moulage sur mesure fabriqué à partir d’une seringue de 1 mL dont l’extrémité est coupée à l’aide d’un scalpel.
    4. Pompez dans la seringue 600 μL de la solution de gel à l’aide du piston.
    5. Positionnez l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette agrandie dont l’ouverture a été coupée à l’aide de ciseaux stériles.
    6. Remplissez la seringue avec 400 μL de solution de gel afin que l’échantillon soit positionné dans le tiers inférieur de la seringue.
    7. Laisser le gel polymériser et conserver dans une solution de TDE à 80 % à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à l’acquisition.
    8. Pour l’acquisition de feuilles de lumière, utilisez un objectif 20x immergé dans une solution de TDE à 80% ajoutée dans la chambre d’échantillonnage pour permettre un ajustement précis à l’indice de réfraction de la méthode de nettoyage.
    9. Insérez la seringue contenant l’organoïde incorporé à l’agarose dans le plus grand porte-échantillon conçu pour accueillir une seringue de 1 mL dont le piston peut être actionné pour positionner l’organoïde devant l’objectif.
      REMARQUE: L’acquisition d’une feuille de lumière d’un organoïde entier prend environ 5 à 10 minutes.

4. Immunocoloration et élimination des sections flottantes des organoïdes du cerveau antérieur dorsal

  1. Fixation, incorporation d’agarose et sectionnement des organoïdes
    1. Recueillir les organoïdes après 28, 42 et 70 +/- 2 jours de différenciation dans une plaque à 6 puits et fixer pendant la nuit à 4 °C dans 2 mL de PFA à 4 %.
    2. Rincer deux fois dans 2 mL de PBS et conserver à 4 °C dans 2 mL de PBS + 0,05 % d’azoture de sodium.
    3. Incorporer les organoïdes fixes dans 4% d’agarose à faible fusion dans un moule d’encastrement en plastique (7 x 7 mm). Retirez soigneusement le bloc d’agarose du moule en plastique et collez-le à l’étage vibratome.
    4. Couper les organoïdes incorporés à l’aide d’un vibratome pour obtenir des sections flottantes de 150 μm transférées dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 500 μL de PBS à l’aide d’un pinceau pour éviter d’endommager les sections.
      REMARQUE: L’agarose à faible fusion est recommandée car sa température de fusion n’est que d’environ 60 ° C. Préparer l’agarose à faible teneur en fusion à 4 % dans une solution de PBS et laisser refroidir juste au-dessus de 37 °C au bain-marie avant l’incorporation d’organoïdes.
  2. Perméabilisation, blocage et immunocoloration
    1. Incuber les sections dans 500 μL de PBS contenant 0,3% de Triton X100, à RT, sous agitation, pendant 20 min. Faites-le trois fois.
    2. Incuber les sections dans 500 μL de PBS contenant 0,3% de Triton X100 et 5% de lait écrémé, à TA, sous agitation, pendant 2 h.
    3. Incuber les sections dans 250 μL de solution d’anticorps primaires (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% de lait non gras), sous agitation, à +4 °C, pendant la nuit.
    4. Laver les sections dans 500 μL de PBS, à RT, sous agitation, pendant 20 min. Faites-le quatre fois.
    5. Incuber les sections dans 250 μL de solution d’anticorps secondaires (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% de lait écrémé), à TA, sous agitation, pendant 2 h.
    6. Laver les sections dans 500 μL de PBS, à RT, sous agitation, pendant 20 min. Faites-le quatre fois.
    7. Stocker les sections dans 500 μL de PBS, à +4° C jusqu’à ce qu’elles soient dégagées.
  3. Clairière en TDE (2,2′ -Thiodiéthanol)
    1. Incuber les sections dans 500 μL de 30% et 60% de TDE pendant 1 h chacune à RT, puis dans 500 μL de 80% TDE pendant la nuit, à RT.
    2. Conserver les sections nettoyées dans 500 μL de TDE à 80 % jusqu’à l’acquisition à +4 °C.
  4. Montage de sections flottantes avant l’acquisition avec un balayage confocal résonant
    1. Montez une section flottante dans une chambre scellée permettant de maintenir l’échantillon en solution TDE à 80% et conçue pour s’adapter sur un étage XY motorisé de microscopes confocaux.
    2. Mettez un couvercle rond dans le système de chambre.
    3. Transférez soigneusement la section immunocolorée nettoyée à l’aide d’un pinceau.
    4. Remplissez la chambre avec une solution de TDE à 80%.
    5. Ajoutez deux couvercles standard plus un deuxième couvercle rond et un joint en silicone.
    6. Vissez l’anneau de vissage de la chambre pour sceller parfaitement le système.

5. Feuille de lumière et analyse confocale à balayage résonant

  1. Traitez les acquisitions de feuilles lumineuses et de balayage résonant à l’aide d’un logiciel qui permet la visualisation et l’analyse 3D de l’ensemble de l’échantillon immunocoloré.
    REMARQUE: Un tel logiciel permet d’ouvrir rapidement d’énormes données pour créer facilement des instantanés et des animations. Il permet de déplacer l’échantillon dans différentes orientations et de générer des vues 2D grâce à un outil de slicer 2D dans différentes orientations, XY et YZ par exemple.
  2. Pour la détection automatique des centrosomes et des cils primaires, utilisez un assistant ponctuel permettant de quantifier leur nombre dans des conditions pathologiques ou de contrôle.
  3. Pour la reconstruction 3D du PC permettant une mesure précise de leur longueur, utilisez un assistant de filament pour fixer manuellement le point de départ du PC et le logiciel utilise le signal de fluorescence pour reconstruire le PC avec précision.

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Representative Results

Modèles cellulaires hIPS 2D pour étudier la biogenèse et la fonction du cilium primaire
Le protocole détaillé ici a été adapté d’études publiées précédemment20,21,22. Ce protocole permet la génération de structures de rosettes neurales qui contiennent des progéniteurs néocorticaux et des neurones similaires à ceux observés dans le néocortex en développement. Une validation détaillée peut être effectuée par une analyse immunocolorante conventionnelle à l’aide de fabricants spécifiques3. Par exemple, les progéniteurs apicals (AP) doivent être doublement colorés avec SOX2 et PAX6, les progéniteurs intermédiaires (IP) sont révélés par la coloration TBR2 / EOMES et les neurones néocorticaux précoces sont révélés par la coloration CTIP2 (Figure 1A-C). De telles structures neuronales en forme de rosette modélisent la migration nucléaire intercinétique (INM) de l’AP qui peut être visualisée par immunocoloration avec des anticorps élevés contre la phospho-vimentine, qui colore les noyaux mitotiques et le TPX2 qui tache le fuseau mitotique. Ces marqueurs permettent donc d’analyser plusieurs caractéristiques de l’AP, dont l’INM avec division cellulaire à avoir lieu apicalement autour de la lumière centrale (Figure 1D,D'), ainsi que le mode de division déterminé en mesurant l’angle entre le plan de division et la surface apicale. Enfin, la ciliogenèse peut être analysée par immunocoloration avec des anticorps élevés contre le PCNT, qui colore le corps basal du PC, et l’ARL13B qui colore l’axoneme. Sur de telles structures de rosaces, les PC s’étendent du pôle apical des AP dans la lumière centrale de chaque région semblable à un ventricule (Figure 1E,E'), alors qu’ils dépassent également des neurones CTIP2+ (Figure 1E'').

La dissociation de ces structures de rosace permet d’obtenir des NSPC isolés cultivés sur des plaques de culture revêtues de poly-L-ornithine/laminine dans des NMM à haute densité pour permettre le maintien d’une population stable et extensible de NSPC pendant au moins 15 passages sans accumuler d’anomalies caryotype21,27. Pour analyser la biogenèse des PC, les NSPC dissociés sont cultivés jusqu’à la confluence et affamés pendant 48 heures. Les analyses d’immunocoloration utilisant des anticorps élevés contre les marqueurs PC montrent que ces NSPC hébergent pc (Figure 2A). En combinant deux outils open source complémentaires, Ilastik, un outil d’analyse d’images basé sur l’apprentissage automatique utile pour la segmentation PC28 et CiliaQ, un plugin Fiji/ImageJ29, qui permettent la reconstruction 3D de PC à partir de piles d’images confocales 3D, plusieurs paramètres structurels peuvent être facilement évalués, y compris le nombre de PC et leur longueur.

La fonction PC des NSPC peut également être évaluée en testant la transduction de la voie de signalisation Hedgehog. Pour évaluer la transduction de la voie de signalisation SHH, les NSPC sont affamés pendant 48 h et traités avec de la SHH recombinante (rSHH) ou un agoniste lissé (SAG) pendant 24 h. À l’aide d’anticorps élevés contre GPR161, SMO et GLI2, l’analyse immunofluorescente (IF) permet de tester le trafic de ces principaux acteurs de signalisation SHH le long du PC, le GPR161 sortant normalement du PC tandis que le GLI2 et le SMO s’accumulent dans le PC en réponse à l’activation de la voie SHH (Figure 2C-D). L’analyse des piles d’images confocales 3D à l’aide des outils CiliaQ permet de quantifier la sortie GPR161 du PC ainsi que l’accumulation de GLI2 et de SMO dans le PC après l’activation de la voie SHH (Figure 2F-G). De plus, l’analyse RT-PCR semi-quantitative sur l’ARNm extrait des NSPC traités par rSHH ou SAG montre l’induction de deux gènes cibles SHH, GLI1 et PTCH1, attestant de la transduction normale de la signalisation SHH dans les NSPC dérivés des hIPSC de contrôle (Figure 2B).

Dans l’ensemble, les modèles cellulaires 2D de développement du cerveau antérieur dorsal reproduisent clairement plusieurs aspects du développement normal du cortex cérébral et représentent des outils prometteurs pour disséquer les mécanismes associés à la PC sous-jacents aux anomalies du développement néocortical en utilisant le contrôle par rapport aux HCSH des patients hébergeant des mutations dans les gènes responsables des anomalies du développement humain du cortex cérébral.

Modèles cellulaires 3D hIPS pour étudier l’implication du cil primaire au cours du développement néocortical
Le protocole décrit ici (Figure 3A) a été adapté des protocoles précédemment publiés23,24,25,26,30 et testé avec succès sur cinq lignes hIPSC de contrôle distinctes. Il permet la génération d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal dérivés du sPICSC qui augmentent en taille au fil du temps tout en formant de grandes boucles neuroépithéliales (Figure 3B). L’analyse d’immunomarquage soit sur des cryosections organoïdes (cryostat, 20 μm), des sections flottantes (vibratome, 150 μm), soit in toto, peut être effectuée pour les contrôles de qualité. Au jour 28 ± 2, les organoïdes sont constitués de boucles neuroépithéliales stratifiées co-exprimant le marqueur progéniteur neural SOX2 et le marqueur dorsal du cerveau antérieur PAX6, attestant de l’identité du cerveau antérieur dorsal. Au jour 42 ± 2 (6 semaines de différenciation), ces boucles devraient présenter une organisation stratifiée plus complexe. De la surface apicale à la surface basale de ces structures en boucle, une région de type zone ventriculaire (VZ) avec des progéniteurs gliaux radiaux apicaux (aRG) SOX2/PAX6 positifs peut être délimitée ainsi qu’une région de type zone sous-ventriculaire (SVZ) avec des progéniteurs intermédiaires (IP) positifs TBR2 et une région de type plaque corticale (CP) contenant des neurones néocorticaux précoces CTIP2 positifs (Figure 3C, E). La polarité moléculaire apicale de l’aRG peut être évaluée par l’enrichissement apical à la surface ventriculaire de ZO-1 et N-CADH (Figure 4A, Vidéo 1). Les propriétés de division du progéniteur aRG peuvent être évaluées à l’aide de marqueurs TP2X et P-VIM pour analyser l’INM qui conduit normalement à l’alignement des noyaux mitotiques aRG à la surface ventriculaire des boucles corticales (Figure 4B, Vidéo 2). Un tel immunomarquage permet également de mesurer l’angle de division pour évaluer le mode de division symétrique par rapport au mode de division asymétrique de l’aRG. Des progéniteurs P-Vim positifs peuvent également être observés dans la région de type SVZ, abritant un processus basal unique s’étendant jusqu’à la surface basale rappelant la glie radiale externe (oRG ou glie radiale basale, Figure 4C, Vidéo 2). Bien qu’ils soient absents des organoïdes du jour 42, les neurones de naissance tardive positifs SATB2 doivent être détectés à partir du jour 70 (10 semaines de différenciation) (Figure 3D, F), attestant du moment in vivo de la différenciation neuronale néocorticale.

Des expériences d’immunomarquage utilisant les marqueurs du corps basal (gamma tubuline) et de l’axoneme (ARL13B) permettent de visualiser le PC sur des cryosections de 20 μm (Figure 3G,H). Pour tirer parti de l’organisation 3D des organoïdes du cerveau antérieur dorsal, une immunocoloration complète peut être effectuée. L’acquisition par feuille de lumière de tels organoïdes immunocolorés et éliminés in toto permet la détection des centrosomes et du PC sur tous les types de NSPC ainsi que sur les neurones néocorticaux (Vidéo 3). En outre, pour effectuer des analyses plus précises de la biogenèse PC, une analyse immunohistochimique sur des sections épaisses flottantes librement (150 μm) d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal peut être effectuée. Après le nettoyage, de telles sections peuvent être acquises à l’aide d’un objectif d’huile 40x (NA 1.3) ou 63x (NA 1.4) d’un microscope laser confocal à lumière blanche résonnante inversée, permettant d’améliorer la résolution tout en préservant l’information spatiale 3D des organoïdes. Un tel microscope confocal à balayage laser permet l’acquisition rapide de sections épaisses, avec une excitation et une détection précises et flexibles sans aucune interférence (vidéo 4). Plusieurs paramètres structurels du PC peuvent être évalués, y compris le numéro, la longueur et l’orientation du PC, à l’aide d’un logiciel d’imagerie 3D. Des outils open source dédiés et disponibles gratuitement, tels qu’Ilastik28, un outil d’analyse d’images basé sur l’apprentissage automatique, ainsi que le progiciel CiliaQ sur Fiji / ImageJ29 sont très utiles pour la segmentation automatique des PC permettant une analyse qualitative et quantitative ultérieure de la biogenèse et de la fonction des PC dans des conditions de contrôle par rapport à des conditions pathologiques.

Figure 1
Figure 1 : Génération et caractérisation de rosettes neurales 2D. Caractérisation immunohistochimique des structures de rosettes neurales à l’aide des anticorps (A) SOX2 et PAX6 pour détecter l’AP, (B) TBR2/EOMES pour révéler l’IP et (C) CTIP2 pour colorer les neurones néocorticaux précoces. Les AP proliférantes sont détectées avec des anticorps phospho-vimentine et TPX2 et sont situées à la surface apicale (D,D'). Les PC sont révélés par une double immunocoloration avec des anticorps PCNT et ARL13B. Les PC s’étendent de chaque AP à la lumière centrale de chaque rosette, tandis qu’ils sont également détectés sur IP et les neurones précoces (E,E',E''). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les NSPC isolés dérivés de rosettes neurales 2D hébergent un PC fonctionnel. La dissociation des rosettes neurales 2D donne lieu à des NSPC isolés hébergeant du PC après la famine pendant 48 h, comme l’ont révélé l’immunocoloration ARL13B et PCNT (A). Les NSPC hébergent une PC fonctionnelle, comme l’a révélé la quantification RT-PCR de deux gènes cibles SHH GLI1 et PTCH1 après la famine pendant 48 h et l’activation ultérieure de la voie par traitement par SHH recombinant (rSHH) pendant 24 h. Les données d’expression GLI1 et PTCH1 ont été réalisées en trois exemplaires et normalisées en données d’expression d’ACTB. Les données ont été analysées avec la méthode 2−ΔΔCt et présentées comme expression relative ± SEM (test de Mann Whitney) (B). Analyse IF sur des NSPC affamés avec (D) ou sans traitement (C) rSHH pour tester la dynamique de deux acteurs cruciaux de la voie de signalisation SHH, GLI2 et GPR161, qui s’accumulent ou sortent respectivement du PC après l’activation de la voie SHH. En combinant les outils Ilastik et CiliaQ pour l’analyse des images confocales, l’intensité du signal GPR161 (F) et GLI2 (G) dans le PC a été comparée dans les NSPC traités par +/- rSHH. La coloration ARL13B a été utilisée pour la segmentation du PC et, comme prévu, la longueur du PC était inchangée dans les NSPC traités par +/- rSHH (E). Les données sont résumées dans des diagrammes en boîte et à moustaches (valeurs moyennes ± SEM). p < 0,0001 (test de Mann Whitney). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Génération et caractérisation des organoïdes dorsaux du cerveau antérieur. (A) Aperçu schématique du protocole de génération d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal. (B) Images représentatives en champ lumineux d’organoïdes aux jours 1, 3, 7, 24 et 42 de différenciation. Images confocales de cryosections de 20 μm d’organoïdes aux jours 42 (C) et 70 (D) après immunocoloration avec des anticorps SOX2, TBR2 et CTIP2 délimitant, respectivement, la zone ventriculaire (VZ), la zone sous-ventriculaire (SVZ) contenant TBR2 positif IP et la région préplaque (CP) contenant des neurones néocorticaux précoces CTIP2 positifs. Images confocales de cryosections de 20 μm d’organoïdes aux jours 42 (E) et 70 (F) après immunocoloration avec des anticorps PAX6, CTIP2 et SATB2 montrant l’apparition de neurones tardifs POSITIFS SATB2 au jour 70. Images confocales de cryosections de 20 μm d’un organoïde au jour 42 après immunocoloration avec des anticorps ARL13B et PCNT révélant PC au pôle apical des progéniteurs gliaux radiaux (G) alors qu’ils sont également présents sur les neurones positifs CTIP2 (H). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Imagerie 3D d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal. (A) Acquisition d’une feuille de lumière d’un organoïde du cerveau antérieur dorsal entier (Jour 42) coloré avec des anticorps PAX6, N-CADH et CTIP2 montrant les multiples boucles neuroépithéliales avec des progéniteurs gliaux radiaux positifs PAX6 présentant une polarité apicobasale correcte révélée par l’accumulation de N-Cadhérine à leur côté apical et de neurones néocorticaux précoces CTIP2 positifs délimitant une région semblable à une plaque. (B) Acquisition par feuille légère d’un organoïde du cerveau antérieur dorsal entier (Jour 42) coloré avec des anticorps TPX2, P-Vim et CTIP2 illustrant la migration nucléaire intercinétique des progéniteurs gliaux radiaux ventriculaires. (C) Zoom sur l’acquisition de la feuille lumineuse d’un organoïde du cerveau antérieur dorsal entier (Jour 42) coloré avec des anticorps TPX2 et P-Vim montrant un progéniteur prolongeant un processus basal unique et localisé dans la zone sous-ventriculaire, rappelant un progéniteur glial radial externe. (D) Acquisition par scanner résonant d’une section de 150 μm d’un organoïde dorsal du cerveau antérieur (Jour 42) coloré avec des anticorps PCNT et ARL13B montrant pc dans les NSPC et les neurones néocorticaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Génération et caractérisation de modèles cellulaires 2D et 3D hIPS du développement du cerveau antérieur dorsal pour disséquer l’implication du PC dans la physiopathologie des anomalies corticales cérébrales. Les cellules hIPS sont autorisées à former des corps embryonnaires (EB) en plaques de culture à faible adhérence, puis sont incubées dans un milieu d’induction contenant deux inhibiteurs du SMAD pour induire une différenciation neuroectodermique. L’adhésion des EB dans les boîtes revêtues de PO / lam permet la génération de structures de rosettes neurales 2D, tandis que la culture flottante libre des EB avec intégration ultérieure dans BMM permet la génération d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal. Le retrait des facteurs mitogéniques du milieu de rosette neurale adhérent favorise l’apparition de la neurogenèse qui peut être testée par analyse IF. La dissociation des rosettes neurales adhérentes permet la génération de cultures NSPC isolées utiles pour la biogenèse PC et l’analyse fonctionnelle. Les organoïdes du cerveau antérieur dorsal sont collectés après 4, 6 ou 10 semaines de différenciation et fixés pour une analyse immunocolorante ultérieure soit in toto, sur des sections de 150 μm d’épaisseur, soit sur des cryosections de 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Acquisition par feuille de lumière d’un organoïde du cerveau antérieur dorsal entier (Jour 42) immunocoloré avec des anticorps PAX6, CTIP2 et NCADH. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Acquisition par feuille de lumière d’un organoïde du cerveau antérieur dorsal entier (Jour 42) immunocoloré avec des anticorps TPX2, P-VIM et CTIP2. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Acquisition par feuille de lumière d’un organoïde du cerveau antérieur dorsal entier (Jour 42) immunocoloré avec des anticorps PCNT et ARL13B. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 4 : Acquisition confocale par balayage résonant d’une section de 150 μm d’un organoïde du cerveau antérieur dorsal (Jour 42) immunocoloré avec des anticorps ARL13B et PCNT. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

DOSSIERS SUPPLÉMENTAIRES: Veuillez cliquer ici pour télécharger les tableaux.

Tableau supplémentaire 1 : Recette des milieux utilisés pour la génération de rosettes neurales 2D et de NSPC.

Tableau supplémentaire 2 : Recette des milieux utilisés pour la génération d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal.

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Discussion

Les PC sont maintenant considérés comme des organites clés régulant les étapes cruciales du développement cortical cérébral normal18,19,31, y compris l’expansion et l’engagement des NSPC8,9,10,11,12 ainsi que la migration neuronale13,14 et la synaptogenèse16,17 . En plus de l’analyse dans des modèles animaux ou des tissus cérébraux fœtaux humains, la génération de modèles de développement néocortical basés sur des hIPSC dérivés de patients très innovants et pertinents est essentielle pour disséquer le rôle de la PC au cours du développement cortical cérébral normal et pathologique.

Le protocole de modélisation 2D basé sur hIPSC détaillé ici a été adapté de trois publications majeures20,21,22. La différenciation neuroépithéliale est induite par une double inhibition SMAD à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules des voies activine/nodale (SB-431542) et BMP (LDN-193189)2. Les cellules sont organisées en structures en forme de rosette contenant des NSPC ainsi que des neurones néocorticaux de couche profonde après 20 jours de différenciation. En outre, ces structures en forme de rosette montrent une polarité apicobasale correcte, une migration nucléaire intercinétique des progéniteurs apicals ainsi qu’une extension PC de tous les NSPC et neurones. Après dissociation de ces structures de rosaces, on obtient une population homogène et stable de progéniteurs corticaux21. Lorsqu’ils sont cultivés jusqu’à la confluence et affamés pendant 48 h, ces progéniteurs corticaux hébergent un PC pour lequel la morphologie, le nombre et la longueur peuvent être facilement analysés en combinant le paquet de plugins Ilastik28 et CiliaQ28,29 sur Fiji / ImageJ. En outre, en utilisant des cytokines pour induire la voie de signalisation SHH, la fonction PC peut également être utilisée par IF pour tester la dynamique des acteurs cruciaux de la voie de signalisation le long du PC tels que GLI2, SMO et GPR161. En outre, les tests RT-PCR semi-quantitatifs permettent de tester l’induction de l’expression du gène cible SHH, y compris GLI1 et PTCH1, en réponse à l’activation de la voie SHH. D’autres voies de signalisation dépendant de la fonction PC doivent également être testées, y compris les voies WNT et IGF2,32,33. Pour conclure sur cette approche de modélisation 2D, qui reproduit clairement plusieurs aspects du développement normal du cortex cérébral, elle représente un outil utile et pertinent pour tester la biogenèse et la fonction du PC dans des conditions normales par rapport à des conditions pathologiques et devrait contribuer à mieux comprendre l’implication du PC au cours du développement néocortical.

Complémentaires aux approches de modélisation 2D basées sur hIPSC, les organoïdes du cerveau antérieur dorsal offrent des opportunités sans précédent d’étudier le développement cérébral normal et pathologique in vitro car ils récapitulent de nombreuses caractéristiques et caractéristiques du cortex cérébral humain en développement précoce. Deux principaux types de protocoles sont actuellement utilisés : les méthodes intrinsèques et les méthodes guidées. Le protocole intrinsèque développé par Lancaster et ses collègues23 repose sur la capacité intrinsèque des IPSC à s’auto-organiser avec un minimum de facteurs externes et donne naissance à des organoïdes cérébraux contenant des rudiments de régions cérébrales distinctes offrant une occasion unique de modéliser les interactions entre différentes régions du cerveau. Cependant, la grande variabilité et l’hétérogénéité inhérentes à une telle stratégie de modélisation présentent des défis importants en matière de reproductibilité. Les protocoles de différenciation organoïde guidée permettent la génération d’organoïdes spécifiques à une région du cerveau avec une hétérogénéité minimale24,25,26. Cette approche nous a permis de générer avec succès des organoïdes du cerveau antérieur dorsal avec des structures semblables à des ventricules qui récapitulent les principaux processus du développement cortical cérébral humain précoce. Le premier problème critique est de commencer par des cultures hIPSC de haute qualité abritant de grandes colonies régulières présentant une différenciation inférieure à 10% et qui ont été passées presque une fois en monocouche pour adapter les hIC aux conditions de culture unicellulaire. En effet, pour limiter l’hétérogénéité organoïde, l’un des défis majeurs en terrain, la formation d’EB de taille homogène est un préalable qui implique la nécessité de dissocier les colonies hIPSC en suspension unicellulaire permettant l’ensemencement à la densité cellulaire définie. Une autre étape critique est l’inclusion des EB BMM, nécessaire pour soutenir la structure 3D et l’expansion neuroépithéliale. Nous avons favorisé l’inclusion en groupe d’une quinzaine d’organoïdes par rapport à l’inclusion individuelle même si elle implique une étape supplémentaire, la dissociation BMM. Il a été démontré que la dissociation du BMM avant la culture par agitation réduit la variabilité à l’intérieur et entre les lots organoïdes, ce qui se traduit par une reproductibilité plus élevée34. En outre, il permet de se débarrasser des processus cellulaires s’étendant dans le BMM qui ne sont pas préjudiciables pour les étapes de différenciation suivantes, mais qui rendent difficile l’observation des organoïdes pour l’inspection de la qualité lors des étapes ultérieures de la procédure. Pour améliorer l’absorption nutritionnelle et l’échange d’oxygène, nous avons comparé la maturation organoïde sur des agitateurs orbitaux et des bioréacteurs en rotation qui ont conduit à des résultats similaires. Nous avons donc choisi l’option agitateur orbital, car elle permet de réduire considérablement les volumes moyens et donc le coût total des expériences. Il est important de noter que vous utilisez un incubateur différent pour la culture stationnaire et agitée sur un agitateur orbital afin d’éviter toute vibration préjudiciable à la croissance adhérente du hIPSC. Nous avons appliqué avec succès ce protocole sur cinq lignes hIPSC de contrôle distinctes35 qui donnent lieu à des résultats homogènes assurant la robustesse de cette procédure.

La caractérisation de tels organoïdes peut être réalisée à l’aide de plusieurs méthodes. Pour préserver l’information spatiale 3D au sein des organoïdes, nous avons mis en place un protocole permettant l’immunocoloration et l’élimination complètes des organoïdes entiers avec acquisition ultérieure de feuilles lumineuses. Différentes méthodes de nettoyage ont émergé avec efficacité en fonction de l’origine et de l’épaisseur de l’échantillon36,37. Ici, nous avons mis en place une méthode de nettoyage simple, rapide et rentable qui repose sur le TDE (2,2'-thiodiéthanol), un dérivé du glycol précédemment utilisé pour éliminer les organoïdes cérébraux et intestinaux de souris38,39. L’acquisition d’organoïdes immunocolorés et éliminés a été réalisée sur un microscope à feuille de lumière à l’aide d’un objectif 20x immergé dans 80% de TDE. Par rapport à d’autres méthodes d’acquisition d’imagerie 3D, la microscopie à feuille de lumière présente un intérêt pour plusieurs raisons: acquisition rapide, bonne pénétration et photoblanchiment réduit. L’optimisation de l’étape de perméabilisation permet d’atteindre une pénétration efficace et homogène des anticorps permettant de visualiser les corps basaux et les axonèmes du PC s’étendant à partir de tous les types de cellules progénitrices et neuronales de l’organoïde entier. De plus, l’acquisition de sections flottantes de 150 μm d’épaisseur à l’aide d’un microscope confocal à balayage résonant inversé avec des objectifs d’huile 40x (NA 1.3) ou 63x (NA 1.4) permet de gagner davantage en résolution, tout en préservant un degré significatif d’informations spatiales 3D et en permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du PC.

La combinaison de tels modèles cellulaires 2D et 3D et d’une analyse d’imagerie 3D (Figure 5) sur des cSH générés soit par la reprogrammation de cellules de patients ciliopathiques, soit par l’utilisation de la technologie CRISPR/CAS9 pour éditer spécifiquement des gènes centrosomaux ou ciliaires devrait permettre des progrès significatifs dans la compréhension de la contribution du PC au cours du développement normal et pathologique du cortex cérébral. Il est important de noter que la technologie d’édition du génome permet également de sauver spécifiquement les mutations des patients afin d’obtenir des HCSH de contrôle isogénique afin de surmonter l’hétérogénéité génétique qui remet en question la détection des mécanismes de la maladie. De plus, les approches génomiques unicellulaires sont maintenant largement utilisées dans tout le domaine et représentent des approches pertinentes et complémentaires de l’analyse immunocolorante. Ainsi, malgré certaines limitations et difficultés inhérentes à toutes les technologies émergentes, et qui sont largement abordées, ces modèles 2D et 3D basés sur hIPSC et les méthodes de caractérisation que nous avons présentées ici offrent des outils puissants et pertinents pour disséquer l’implication du PC dans les mécanismes pathologiques sous-jacents aux anomalies néocorticales du développement humain.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR) à S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) et N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 et ANR-19-CE16-0002-01). LB est soutenu par l’ANR dans le cadre du programme Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) et la Fondation Bettencourt Schueller (programme MD-PhD). L’Institut Imagine est soutenu par un financement public de l’ANR dans le cadre du programme Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01, projets CrossLab) et dans le cadre du deuxième programme Investissements d’Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

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References

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Biologie du développement numéro 181 cil primaire cellules souches pluripotentes induites par l’homme hIPSC cellules souches neurales et progénitrices développement cortical cérébral humain rosettes neurales organoïdes du cerveau antérieur dorsal modèles 2D et 3D basés sur hIPSC du développement néocortical organoïdes cérébraux hérisson sonique immunocoloration à monture entière clairage optique microscope à feuille de lumière
Modèles 2D et 3D à base de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical
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Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

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