Summary
여기에서, 우리는 유전자 조작된 마우스 모델 유래 종양 에서 생체내에서 배아 치사되는 유전자 녹아웃을 수행하기 위한 프로토콜을 제시하고, 이어서 녹아웃이 종양 성장, 증식, 생존, 이동, 침윤 및 시험 관내 및 생체내에서 전사체에 미치는 영향을 평가한다.
Abstract
인간 암의 핵심 단백질을 정확하게 표적으로 삼는 신약 개발은 암 치료제를 근본적으로 변화시키고 있습니다. 그러나 이러한 약물을 사용하기 전에 표적 단백질이 특정 암 유형에서 치료 표적으로 검증되어야합니다. 이 검증은 종종 암의 유전자 조작 마우스 (GEM) 모델에서 후보 치료 표적을 코딩하는 유전자를 녹아웃하고 이것이 종양 성장에 어떤 영향을 미치는지 결정함으로써 수행됩니다. 불행히도, 기존의 녹아웃에서의 배아 치사율과 조건부 녹아웃에서의 모자이크주의와 같은 기술적 인 문제는 종종이 접근법을 제한합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, GEM 모델에서 생성된 악성 말초 신경 시스 종양(MPNSTs)의 단기 배양에 관심 있는 플록싱된 배아 치사 유전자를 절제하기 위한 접근법이 개발되었다.
이 논문은 적절한 유전자형을 갖는 마우스 모델을 확립하고, 이들 동물로부터 단기 종양 배양을 도출한 다음, Cre 재조합효소 및 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 플록싱된 배아 치사 유전자를 제거하는 방법을 기술한다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 아데노바이러스로 형질도입된 세포의 정제 및 유전자 절제가 세포 증식, 생존력, 전사체 및 동위원소 동종이식편 성장에 미치는 영향의 정량화를 상세화한 다음, 상세히 설명한다. 이러한 방법론은 시험관내 및 생체내에서 치료 표적을 확인하고 검증하기 위한 효과적이고 일반화 가능한 접근법을 제공한다. 이러한 접근법은 또한 감소된 시험관내 성장 아티팩트를 갖는 저통과 종양 유래 세포의 재생 가능한 공급원을 제공한다. 이를 통해 표적 유전자의 생물학적 역할은 분비물에 의해 매개되는 이동, 침윤, 전이 및 세포간 통신과 같은 다양한 생물학적 과정에서 연구될 수 있게 한다.
Introduction
지난 이십 년 전에 인간 암의 치료는 DNA를 손상시키거나 DNA 합성을 억제함으로써 빠르게 증식하는 세포 집단을 광범위하게 표적으로 삼는 방사선 요법 및 화학 요법제에 크게 의존했습니다. 이러한 접근법은 암세포 성장을 억제했지만, 장내 상피 세포 및 모낭 세포와 같은 정상적인 빠르게 증식하는 세포 유형에도 해로운 부작용이있었습니다. 최근에, 암 치료는 개별 환자의 신 생물의 성장에 매우 중요한 신호 전달 경로 내에서 단백질을 정확하게 표적화하는 화학 요법제를 활용하기 시작했습니다. 일반적으로 "정밀 의학"이라고하는이 접근법은 모노클로날 항체 및 소형 분자 억제제의 끊임없이 확장되는 레퍼토리의 개발로 이어졌습니다. 이들 제제는 종양 세포 증식 및 생존을 효과적으로 억제하면서 종래의 화학요법제 및 방사선요법으로 보이는 정상 세포 유형에 대한 해로운 부작용을 회피한다. 인간 암의 치료에 사용되는 모노클로날 항체는 가장 일반적으로 표적 세포 표면 분자, 예컨대 성장 인자 수용체 1 (예를 들어, 막-스패닝 수용체 티로신 키나제의 큰 패밀리) 및 면역 반응 조절제2 (예를 들어, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1, 프로그램된 사멸-리간드1)를 표적으로 한다. 소분자 억제제는 세포내 표면 단백질 또는 세포내 위치하는 신호전달 단백질 중 하나를 억제할 수 있다3. 그러나, 이러한 새로운 치료제를 효과적으로 채용하기 위해서는, 특정 암이 후보 치료제에 의해 표적화되고 있는 분자에 의존한다는 것이 확립되어야 한다.
이러한 새로운 치료제는 더 집중된 효과를 가지고 있지만, 그들 중 다수는 여전히 하나 이상의 단백질의 작용을 억제한다. 또한, 다양한 효과 및 특이성을 갖는 다수의 제제가 종종 특정 단백질을 표적화하기 위해 이용가능하다. 결과적으로, 전임상 조사 동안, 후보 단백질을 치료 표적으로 검증하기 위해 유전자 절제와 같은 추가적인 접근법을 사용하는 것이 현명하다. 단백질을 치료 표적으로서 검증하는데 특히 유용한 접근법 중 하나는 관심있는 특정 암 유형을 개발하는 유전자 조작된 동물 모델에서 후보 단백질을 코딩하는 유전자를 절제하는 것이다. 이 접근법은 널 돌연변이 (자연 돌연변이, 유전자 조작 된 널 돌연변이 [ "녹아웃"), 또는 유전자 트랩에 의해 도입 된 널 돌연변이)를 가진 마우스가 이용 가능하고 마우스가 성인기까지 생존 할 수있는 경우 상대적으로 간단 할 수 있습니다. 불행히도, 이러한 기준을 충족하는 null 돌연변이를 가진 마우스는 종종 사용할 수 없으며, 일반적으로 null 돌연변이가 배아 적으로 또는 출생 후 삶의 첫날에 사망을 초래하기 때문입니다. 이러한 상황에서, 관심있는 종양 유형을 개발하기 쉬운 마우스는 대신 관심있는 유전자의 주요 세그먼트가 loxP 부위 ( "floxed")에 의해 측면 인 마우스로 교차 될 수 있으며, 이는 Cre 재조합 효소를 발현하는 이식 유전자를 종양 세포 내로 도입함으로써 유전자가 절제되도록 허용한다 (조건부 녹아웃). 이 방법은 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, Cre 구동기가 종양에서 발현되지만 종래의 녹아웃에서 사망을 초래한 세포 유형에서는 발현되지 않는 경우, 이러한 접근법은 잠재적으로 후보 치료 표적을 검증할 수 있다. 둘째, 후보 단백질을 코딩하는 유전자를 종양 세포에서 절제하지만 종양-관련 섬유아세포 또는 면역 세포와 같은 다른 종양내 요소에서는 검출하지 못하도록, 조사자는 치료 표적의 세포-자율 및 비-세포-자율 효과를 구별할 수 있게 한다. 마지막으로, 타목시펜-유도성 Cre 구동기(CreERT2)는 조사자가 종양 발달의 여러 단계에서 관심있는 유전자를 삭제하고 후보 치료제가 효과적일 가능성이 가장 높은 창을 정의할 수 있게 한다.
불행히도, GEM 모델에서 발생하는 종양에서 조건부 녹아웃의 사용을 제한 할 수있는 기술적 인 문제도 있습니다. 예를 들어, 종양 세포에서 발현되고 생명에 필수적인 정상 세포에서 유전자 결실을 피하는 Cre 구동기는 이용가능하지 않을 수 있다. 과소 평가 될 수있는 또 다른 문제는 Cre 및 CreERT2 드라이버가 종종 마우스에서 플록스 된 대립 유전자를 가변적으로 절제하여 GEM 암에서 null 돌연변이에 대한 모자이크증을 초래한다는 것입니다. 이것이 발생하면, 표적화된 유전자가 절제되지 않은 종양 세포는 계속해서 빠르게 증식할 것이고, 절제된 대립유전자로 종양 세포를 과성장시킬 것이다. Cre 구동선에서의 모자이크주의는 표적화된 혈통에서의 비유비쿼터스 Cre 발현으로 인해 그리고 Cre 발현4와 무관하게 개별 세포에서의 실패한 재조합에 의해 발생할 수 있다. 이것은 셀 유형에 의존하는 Cre 드라이버의 알려진 현상이며 실험 설계 및 데이터 해석 중에 고려해야합니다. 모자이시즘은 녹아웃의 효과를 가릴 수 있으며 관심있는 유전자가 종양 세포 증식 및 / 또는 생존에 필수적이지 않으므로 유효한 치료 표적이 아니라는 잘못된 결론을 내릴 수 있습니다.
이러한 문제 중 몇몇은 수용체 티로신 키나제 erbB4가 MPNST 세포5에서 잠재적인 치료 표적인지 여부를 결정하기 위해 시도된 이전 연구에서 직면되었다. 이들 연구에서, 마우스는 슈완 세포 특이적 미엘린 단백질의 조절하에 뉴레귤린-1 (NRG1) 이형아교세포 성장 인자-β3 (GGFβ3)를 코딩하는 전이유전자를 발현하는 것을 프로모터제로 사용하였다 (P0-GGFβ3 마우스). P0-GGFβ3 마우스는 상염색체 우성 종양 감수성 증후군 신경섬유종증 유형 1(NF1)6을 갖는 환자에서 보이는 신경섬유종 병인 및 신경섬유종-MPNST 진행의 과정을 되풀이하는 과정을 통해 MPNST가 되도록 진행하는 다발성 신경섬유종을 개발한다. Trp53 널 돌연변이를 갖는 마우스에 교차시, 생성된 P0-GGFβ3; Trp53+/- 마우스는 cis-Nf1+/-에서 볼 수 있는 바와 같이 MPNSTs de novo를 개발하고; Trp53+/- 마우스.
이러한 MPNST는 세계 보건기구 (WHO) 등급 II에서 인간7에서 볼 수있는 WHO 등급 IV 병변으로의 진행을 재조정합니다. P0-GGFβ3 마우스에서, MPNSTs는 삼차 신경 (58 %) 및 척추 등쪽 신경 뿌리 (68 %)에서 기존의 플렉시 폼 신경 섬유종 내에서 발생한다7; P0-GGFβ3에서 발생하는 MPNSTs; Trp53+/- 마우스는 매우 유사한 분포를 갖는다. 인간에서 MPNST는 좌골 신경에서 가장 흔하게 발생하며 상완 신경총, 척추 신경 뿌리, 미주, 대퇴골, 정측, 천골 신경총, 포플라이트 폐쇄기 및 후부 경골 및 척골 신경이 뒤 따른다 8. 이러한 GEM 모델에서의 이러한 종양 분포는 인간에서 보이는 것과는 다소 다르다. 그러나, P0-GGFβ3 및P0-GGFβ3에서 발생하는 MPNSTs; Trp53+/- 마우스는 조직학적으로 인간 MPNST와 동일하고, 인간 MPNST에서 보이는 많은 동일한 돌연변이를 가지고 있으며, NF1 환자에서 보이는 신경섬유종-MPNST 진행의 과정을 재분석한다. P0-GGFβ3 또는 P0-GGFβ3의 생성; Erbb4-/-였던 Trp53+/- 마우스는 두 개의 Erbb4 널 대립유전자를 가진 마우스가 심장 결함9에 이차적인 배아 10.5일째에 utero에서 죽기 때문에 실현가능하지 않았다. 심장 특이적 Erbb4 전이유전자 (α-미오신 중쇄 (MHC)-Erbb4)를 도입함으로써 심장에서 Erbb4 발현을 구출하는 것은 생존 가능한 Erbb4-/- 마우스 10을 초래하기 때문에, 복잡한P0-GGFβ3을 갖는 마우스의 생성; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- 유전자형을 시도하였다.
그러나, 교미는 예상된 멘델 비율에서 마우스를 생성하지 않았고, 이는 원하는 유전자형이 해롭다는 것을 나타낸다. 따라서, P0-GGFβ3의 생성; Floxed Erbb4 대립유전자11 및 CreERT2 드라이버를 갖는 Trp53+/- 마우스는 이들 마우스에서 발생하는 MPNST에서 Erbb4의 결실을 허용하도록 시도되었다. 이 동물들에서, 손상되지 않은 Erbb4 대립 유전자를 가진 수많은 종양 세포가 여전히 존재했다 (모자이크증). 관찰 된 모자이크주의는 비효율적 인 타목시펜 전달로 인해 조직 내 재결합 효율의 차이가 발생할 수 있습니다. 자발적인 보상 메커니즘의 가능성은 Erbb4 발현에 대한 요구 사항을 우회함으로써 타목시펜 매개 재조합에서 모자이크주의에 더 기여할 수 있습니다. Trp53의 손실로 인해 종양 세포는 데이터의 해석을 혼란스럽게 할 수있는 추가적인 자발적인 "허용적"돌연변이에 취약해질 수 있습니다. Erbb4-온전한 MPNST 세포가 다른 종양 세포에서 Erbb4를 절제하는 결과를 가릴 가능성이 높아 보였기 때문에이 접근법은 포기되었습니다.
이러한 장애물은 Cre 재조합효소 및 eGFP를 발현하는 아데노바이러스를 사용하는 매우 초기 통과 MPNST 세포에서 Erbb4를 절제하기 위한 방법론의 개발로 이어졌다. 이들 세포는 FACS를 사용하여 감염되지 않은 세포로부터 분리될 수 있으며, 이는 절제된 Erbb4 유전자에 대한 모자이크주의를 현저하게 감소시킨다. 이하에는, 이를 달성하기 위해 사용된 방법들이 시험관내 및 생체내에서 유전자 절제의 효과를 평가하기 위해 사용된 방법들과 함께, 설명된다. 다음 프로토콜은 생체내 동종이식편 종양 성장 평가 전에 생체외 절제에 대해 관심있는 배아 치사 유전자의 플록스 대립유전자를 운반하는 종양을 생산하는 종양 보유 마우스를 생산하는 방법의 예이다. 여기에는 Erbb4 절제가 동위원소 동종이식편에서의 종양 세포 증식, 생존 및 시험관내 및 증식, 생존 및 혈관신생에 미치는 영향을 분석하기 위해 사용되는 접근법에 대한 설명이 포함된다.
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Protocol
생쥐와 함께 절차를 수행하기 전에 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 검토하고 승인해야합니다. 이 원고에 설명 된 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 MUSC의 제도적 동물 관리 지침에 따라 적절하게 훈련 된 인력에 의해 수행되었습니다.
1. Erbb4 flox 대립유전자에 대해 동형접합성 MPNST를 개발하는 마우스의 생성
- P0-GGFβ3의 F1 생성을 생성하고; Trp53+/-; Erbb4fl/+ P0-GGFβ3을 교미하여 동물; Trp53+/- 마우스7과 Erbb4fl/fl 마우스11. Punnett 사각형 (그림 1)을 사용하여 원하는 P0-GGFβ3으로 충분한 수컷 및 암컷 F1 새끼가 생성되도록하기 위해 번식 계획을 안내하십시오. Trp53+/-; Erbb4fl/+ 유전자형.
- 유전자형 F1 자손은 IACUC 가이드라인에 따라 수집된 꼬리 스닙으로부터 게놈 DNA를 단리한 다음, 앞서 기술한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 P0-GGFβ3 전이유전자 12, Trp53 야생형(+) 및 널(-) 대립유전자 7, 및 Erbb4 flox 및 Erbb4 야생 형 대립유전자13을 검출한다.
- jacks-lab.mit.edu/protocols 에 자세히 설명된 방법을 사용하여 꼬리 DNA를 분리합니다.
- PCR 반응 믹스를 25 ng DNA, 0.25 nM dNTPs, 0.02 U/μL Taq, 0.5 μM의 각 프라이머 및 1x PCR 버퍼와 혼합한다. 단일 95°C 인큐베이션(게놈 DNA를 용융시키고 Taq를 활성화시키기 위해)으로 PCR 반응을 1분 동안 수행하고, 이어서 94°C, 10초의 35 PCR 사이클(melting); 55°C, 30초(어닐링); 72°C, 40초(연장)에 이어 5분 동안 단일 72°C(연장)가 이어졌다. 1.2-1.5% 아가로스 겔 상에서 실행될 준비가 될 때까지 반응물을 4°C에서 보관한다.
참고: 어닐링 온도는 사용된 PCR 버퍼 시스템에 따라 다릅니다. 적절한 어닐링 온도를 결정하기 위해 어닐링 온도 구배를 수행하는 것이 좋습니다.
- P0-GGFβ3의 F2 생성을 생성하고; Trp53+/-; Erbb4fl/fl 동물을 적절한 F1 자손과 짝짓기에 의해 (P0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) 서로 함께.
참고: 그림 1 은 원하는 유전자형을 가진 F2 자손의 예상 수를 계산하는 데 사용되는 Punnet 제곱 예측을 보여줍니다. - 원하는 P0-GGFβ3을 가진 동물을 확인; Trp53-/+; Erbb4 fl/fl 유전자형은 단계 1.2에 기재된 바와 같다.
- P0-GGFβ3을 유지하기 위해 서로 짝짓기 F2 자손; Trp53-/+; Erbb4fl / fl 식민지 및 유전자형 모든 강아지. 새로 도입된 플록스 대립유전자가 생존 또는 종양 잠복기를 손상시키지 않는지 확인하십시오. P0-GGFβ3의 코호트 (20 마우스/코호트)를 확립함으로써 이를 달성하고; Trp53+/- 및 P0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4 fl/fl 마우스는 종양 발생의 그들의 생존 및 빈도를 따른다.
- 실험 종점에 도달 할 때까지 일주일에 여러 번 동물을 모니터링하십시오 (IACUC에서 승인 한 최대 허용 종양 크기 / 인간 종말점).
- 주간 모니터링 중에 체중, 정상적인 사회 및 손질 행동, 종양 크기 측정을 평가하십시오. 체중의 >10 %의 체중 감소, 사회적 격리 및 발목을 잡는 경우 수의학 평가를 준비하십시오.
- 종양을 가진 마우스가 확인되고 그 인간적 종말점에 도달했을 때, 이산화탄소 흡입을 사용하여 동물을 인도적으로 안락사시키고 자궁 경부 탈구를 한 다음 메스 나이프를 사용하여 종양을 멸균 적으로 제거하십시오. 캘리퍼와 무게 종양(질량 및 부피)을 사용하여 길이, 너비 및 깊이를 측정하여 종양 측정을 수행합니다. 자동 분해를 피하기 위해 신속하게 작업하십시오.
- 종양을 멸균 조건 하에서 메스 나이프로 브레드로프 스타일 절단을 사용하여 세 개의 절편으로 절편하여 포르말린 고정/파라핀 임베딩(FFPE), 조기 통과 배양 생성 및 플래시 냉동 물질을 위한 조직 세그먼트를 생성합니다(그림 2A).
- 섹션 1(조기 통과 배양 생성의 경우, 단계 1.7.2)이 전체 종양 부피의 약 10%, 섹션 2(고정 및 IHC의 경우, 단계 1.7.3)가 전체 종양 부피의 70%, 섹션 3(플래시 동결의 경우, 단계 1.7.4)이 전체 종양 부피의 20%인지 확인하십시오.
- 조기 통과 배양의 준비를 위해 종양의 섹션 1을 취하십시오 (아래 참조).
- 종양의 섹션 2를 4°C에서 하룻밤 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 다음, 진단 워크업을 위해 파라핀(포르말린-고정 파라핀 포매(FFPE))에 포매하였다.
- 플래시-분석 분석을 위한 섹션 3 (예를 들어, 표적화된 플록스 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 적절하게 발현되는지를 검증하기 위한 면역블롯).
- 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 5 μm 두께의 FFPE 조직 절편을 염색하여 자격을 갖춘 병리학자에 의한 종양 진단을 확인하였다. 적절한 경우, 면역 조직 화학 염색 (IHC)을 수행하여 종양 진단을 확인하십시오.
- S100 칼슘-결합 단백질 B (S100β), 네스틴, 및 성-결정 영역 Y (SRY)-박스 전사 인자 10 (Sox10)-MPNSTs 및 슈완 세포 (종양 세포 기원) 둘 다에서 발현되는 세 개의 마커에 대한 면역염색 MPNSTs5,6,14,15. 종양을 erbB4를 인식하는 항체로 염색시키고, 하류 단계에서 절제를 위해 표적화된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다.
- 진단을 확인하기 위해, 자격을 갖춘 수의학 또는 인간 병리학자가 WHO 진단 및 등급 기준 5,6,7,16에 따라 모든 염색된 종양 슬라이드를 평가하도록 한다.
2. MPNST 세포에서 플록스된 Erbb4 대립유전자의 생체외 절제
- 갓 채취한 MPNST 조직으로부터 조기 계대 배양을 확립하고, 섹션 1(단계 1.7.3)로부터의 조직을 얼음 위에 빙냉 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 10 mL에 위치시킨 다음, 이를 멸균 작업 영역으로 옮기는 것이다(도 2B)16.
주: 모든 후속 절차는 멸균 조직 배양 후드에서 수행되어야 한다. - 종양 조직을 2-4 mm 조각으로 다듬고 10 mL의 성장 배지로 처리된 10cm2 처리 조직 배양 접시에 8-10회 트리투레이트한다. 이러한 제제를 10 nM 뉴레귤린-1β (NRG1β) 및 2 μM 포스콜린으로 보충된 10% 태아 송아지 혈청, 1% 글루타민, 10 μg/mL 스트렙토마이신 및 10 IU/mL 페니실린을 함유하는 고글루코스 DMEM-10 성장 배지 (둘베코 변형 이글 배지 (DMEM))에서 배양한다. 이 단계에서 포스콜린을 첨가하여 섬유아세포와 같은 일반적인 오염 세포 유형의 성장을 억제한다.
- 기계적으로 해리된 조직과 세포를 5%CO2 분위기에서 37°C에서 최대 3일 동안 유지시켜 조기 계대 배양을 확립한다. 이 시점에서 분산된 세포 및 남아있는 조직 단편을 분리하지 마십시오.
- 3-4 일마다 새로운 배지로 배양물을 새로 고칩니다. 종양 세포가 합류 할 때까지 증식하도록 허용하십시오.
- 합류 문화를 여러 가지 요리로 나눠서 초기 통과 문화를 확장하십시오. 성장 배지를 제거하고 세포를 1x dPBS로 세척한다. 이어서, 0.25% 트립신 1 mL를 10 cm2 처리된 세포 배양 접시 당 실온에서2-5분 동안 첨가한다. 배양물을 부드럽게 트리튜레이트하여 분리를 촉진하고 단일 세포 현탁액을 생성한다.
- DMEM-10 성장 배지 2 mL를 첨가하여 트립신화를 종료한다. 트립신화된 세포 혼합물을 수집하고, 이를 5 mL 멸균 원심분리 튜브로 옮긴다. 세포를 실온에서 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다.
- 세포 펠릿을 DMEM-10 5 mL에 재현탁시킨다. 세포를 두 개 내지 네 개의 10 cm 세포 배양 접시로 나누고, 각각은 10 mL의 성장 배지 (접시 당 약 1 × 106 세포)를 함유한다.
- 5 계대 후 (2.5에서 단계 반복), NRG1β 및 포스콜린이없는 성장 배지를 사용하십시오. 배양물의 샘플을 항-S100β 항체로 면역염색하여 배양물이 종양 세포로만 구성되어 있는지 검증한다. 세포를 모든 후속 계대에서 DMEM-10 성장 배지에 유지시킨다.
- 다음 계대에서, 세포를 계수하고 P0-GGFβ3의 일부를 동결시키고; Trp53+/-; 합류 배양물로부터 수집된 Erbb4 fl/fl MPNST 세포 (3 × 106 세포/바이알).
- 플레이트 P0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl 조기 계대 MPNST 세포는 DMEM-10 성장 배지에서 처리된 세포 배양 접시 10 cm 당 10 × 106 세포의 밀도로 처리하였다.
- 제0일: (도금 후 약 12-16시간), 부착제 배양물을 2-4 mL의 dPBS로 세척하고, 무혈청 DMEM 10 mL (즉, 10 cm 디쉬당 2 × 1010 pfu의 바이러스 중 약 400 플라크 형성 유닛(pfu)/세포에서 Ad5CMV-Cre/eGFP 또는 Ad5CMV-eGFP로 감염시킨다. 경험적으로 결정된 바와 같이 최대 허용 바이러스 농도(감염의 다중성, MOI)에서 아데노바이러스를 사용하여 플록싱된 Erbb4 대립유전자를 제거한다. 이 절제에 대한 워크플로우의 개략도는 그림 2C 를 참조하십시오.
- 1일차: 약 16시간 후, 10 mL의 DMEM-10을 감염 칵테일에 첨가하여 배양물을 구한다.
- 2 일 - 3 일 : FACS는 감염 후 약 48시간 후에 eGFP 양성 세포를 분류하기 위해 코어 시설의 권장 프로토콜에 따라 감염된 세포를 분류합니다. FACS 분류에 앞서, 형광 현미경에서 eGFP 신호에 대한 세포를 간략하게 확인하여 배양물이 효율적으로 감염되었는지 확인하십시오 (~ 50-100 % 양성 세포). FACS 후 회수된 세포를 10 cm 조직 배양 접시로 복귀시키고; 게놈 DNA 분리를 위해 한 접시를 예약하십시오.
- 4 일 - 5 일 : FACS 분류 후, 세포를 조직 배양 배양기에서 적어도 24-48 시간 동안 회복시킨 다음, 시험관 내 세포 기반 분석 또는 생체내 이식을 위해 세포를 준비시킨다. 분류된 eGFP 양성 세포의 일부로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 통해 Erbb4 결실을 확인하였다. eGFP 양성 세포가 ErbB4 음성인지 PCR 또는 항- erbB4 항체로 배양한 샘플을 면역염색하여 검증한다.
- 표준 산-구아니디늄-페놀 및 클로로포름-기반 DNA 분리 방법17을 사용하여 세포로부터 게놈 DNA를 분리한다.
- 표준 PCR을 수행하여 플록스된 Erbb4 대립유전자와 절제된 Erbb4 대립유전자를 구별한다. 2 ng DNA, 20 μM 프라이머 1 + 2로 40 사이클을 수행하여 250 bp Erbb4-null 생성물 및 350 bp 플록스 생성물13을 생성한다. PCR 및 항체 기반 접근법을 모두 수행하여 신뢰할 수 있는 항체가 없을 때 녹아웃을 확인합니다.
참고: 세포는 하기에 기재된 바와 같이 시험관내 세포 기반 검정을 위해 준비된다. 많은 유형의 하류 분석이 이러한 방식으로 제조된 세포로 수행될 수 있다. 이하에 제시된 프로토콜의 목적은 Erbb4 유전자의 절제 후 이들 종양 세포의 시험관내 및 생체내 응용의 몇 가지 예를 제공하는 것이다.
3. 절제된 Erbb4 대립유전자를 갖는 MPNST 세포에서의 증식 및 생존력 검정
- 이미지 기반 자동 세포계를 사용하여 멀티웰 플레이트에 플레이팅된 분류된 MPNST 세포 상에서 다음 칠일에 걸쳐 증식 검정을 수행한다.
- 6일차: 96-웰 플레이트에서 성장 배지의 최종 부피 150 μL (∼13,300 세포/mL)에서 웰당 2,000개의 세포를 플레이트한다. 각 실험 코호트에 대해 삼중으로 측정을 수행하고 매일 4개의 종점 판독(3회 반복실험 x 2 조건 x 4일)을 수행합니다.
-
7일, 9일, 11일, 13일: Hoechst 및 프로피듐 요오드화물 (PI) 염료로 얼룩진 세포를 자동화된 플레이트 리더에 이미지화하여 각 웰의 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 계산합니다. 이를 달성하기 위해, 동시에 Hoechst 염료로 세포를 염색하여 살아있는 세포와 죽은 세포 모두의 핵을 염색하고 죽은 세포를 표지하는 프로피듐 요오드화물 (PI)로 염색하십시오. 매일 또는 격일로 같은 시간에 모든 읽기를 수행합니다.
- 50 μL의 4x PI/Hoechst 염색 용액(각각 4 μg/mL)을 그날 정량화된 각 웰(예를 들어, 7일째만)에 첨가하고, 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 빛으로부터 보호하십시오.
참고 : Hoechst의 염색 농도는 경험적으로 결정되어야하며 세포 유형에 따라 1 ~ 10 μg / mL의 범위를 가질 수 있습니다. - 자동화된 세포 이미저 상에서 적절한 형광 채널을 사용하여 인큐베이션 후에 염색된 웰을 판독한다. 판독 후, 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 보내 후속 날(즉, 9일, 11일, 13일)에 대한 향후 판독을 가능하게 한다.
- 사용된 이미징 시스템에 기초하여 염색 강도를 정량화하고, 다음의 설정을 사용하여 죽은 세포, 살아있는 세포 및 총 세포의 수를 계산한다: 청색 채널 (377/50 nm, Hoechst): 총 세포 (살과 사죽); 적색 채널(531/40 nm, PI): 죽은 세포만; 파란색 - 빨간색 (총 - 죽은) = 살아있는 세포.
- 50 μL의 4x PI/Hoechst 염색 용액(각각 4 μg/mL)을 그날 정량화된 각 웰(예를 들어, 7일째만)에 첨가하고, 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 빛으로부터 보호하십시오.
- 원하는 경우 분석 제조업체의 프로토콜에 따라 사흘에 걸쳐 세포 생존율 분석을 수행하십시오.
참고: 생존력 분석은 칼세인 AM (488/32 nm; 녹색 채널, 특히 살아있는 세포 표지), PI 및 Hoechst를 포함하는 삼중 염색을 수행하여 증식 분석과 조합될 수 있다. 아폽토시스 분석은 또한 상기 기재된 바와 같이 설정된 배양물을 사용하여 수행될 수 있고; 특정 프로토콜은 이미징 시스템에 따라 달라집니다.- 6일차: 96-웰 플레이트에서 150 μL의 최종 부피로 웰당 4,000개의 세포를 트리플리케이트로 플레이트한다.
- 여행 7일 - 9일: 2,000x 생체발광 세포 생존율 분석 시약 (표 재료)을 첨가하고, 플레이트를 인큐베이터로 복귀시키고, 1 h 후에 플레이트를 판독한다. 매일 같은 시간에 후속 읽기를 수행합니다. 생체 발광 (MTT) 분석의 경우, 루미노미터 플레이트 리더를 사용하여 72 시간 동안 매 24 시간마다 제조업체의 지침에 설명 된대로 정확하게 분석을 수행하십시오.
4. RNA-Seq 분석 및 Erbb4 손실에 의해 발현이 변경되는 유전자의 동정
- 6일차: 표준 산-구아니디늄-페놀 및 클로로포름 기반 방법을 사용하여 분류된 MPNST 세포로부터 총 RNA를 분리한다. 두 코호트 사이의 mRNA 수준의 변화를 검출하기 위해 고안된 실험의 경우, 각 코호트에서 적어도 세 개의 생물학적 반복실험으로부터 총 RNA를 준비한다.
- Erbb4 손실보다는 아데노바이러스 벡터 또는 eGFP 발현에 의해 야기되는 사건을 제거하기 위해, P0-GGFβ3의 3개의 생물학적 반복실험으로부터 RNA를 분리하고; Trp53+/-; Erbb4 fl/fl MPNST 세포는 Ad5CMV-Cre/eGFP로 형질도입되고 Ad5CMV-eGFP로 형질도입된 세 가지 생물학적 복제물.
참고: 분리된 RNA는 RNA-Seq 분석을 위해 RNA 무결성 번호(RIN) 점수 ≥ 8을 가져야 합니다. 라이브러리를 구성하기 전에 시퀀싱 코어가 모든 샘플의 RIN을 결정하는지 확인하십시오.
- Erbb4 손실보다는 아데노바이러스 벡터 또는 eGFP 발현에 의해 야기되는 사건을 제거하기 위해, P0-GGFβ3의 3개의 생물학적 반복실험으로부터 RNA를 분리하고; Trp53+/-; Erbb4 fl/fl MPNST 세포는 Ad5CMV-Cre/eGFP로 형질도입되고 Ad5CMV-eGFP로 형질도입된 세 가지 생물학적 복제물.
- 각 샘플에서 100-200ng의 고품질 총 RNA를 사용하여 RNA-Seq 라이브러리를 준비합니다(이 단계의 핵심 시퀀싱 시설과 협력). 차세대 DNA 시퀀서를 사용하여 고처리량 시퀀싱을 수행합니다. mRNA 정량화를 위해 단일 종단 시퀀싱을 수행하여 Fastq 파일을 생성합니다. 각 샘플에 대해 최소 5천만 읽기를 보장합니다.
참고: RNA-Seq 데이터를 처리하고 차등적으로 발현된 전사체의 발현을 정량화하는 데 사용되는 워크플로우를 설명하는 개략도에 대해서는 도 3 을 참조한다. 시퀀스 데이터는 Fastq 파일 형태로 품질 관리 절차를 거칩니다. 판독의 >80%는 후속 분석에 적합한 것으로 간주되기 위해 30의 Phred 점수를 산출해야 한다. 시퀀스는 또한 Trimmomatic18 을 사용하여 전처리(트리밍)되어 어댑터 시퀀스를 제거하고 저품질 판독을 필터링합니다. - 임의의 가능한 소프트웨어 프로그램(예를 들어, DNAStar 19,20 또는 Partek21)을 사용하여 fastq 생성 파일에 대해 RNA-Seq 정렬 및 분석을 수행한다. 기본 설정을 사용하여 프로그램별 단계에 따라 fastq 파일을 마우스 참조 게놈(GRCm38/mm10)에 정렬합니다.
참고: DNAStar를 예로 들어 일반적인 워크플로우가 아래에 설명되어 있습니다(보충 그림 1).- 분석 방법인 RNA-Seq를 선택합니다.
- 참조 게놈인 마우스를 선택합니다.
- 시퀀싱 코어에서 제공하는 경우 BED 파일을 업로드합니다.
- fastq 시퀀싱 파일을 업로드하고 고유한 복제 이름을 할당합니다.
- fastq 파일을 그룹 복제하여 복제 세트(예: GFP, CRE)로 지정합니다.
참고: 각 정렬 프로그램에는 특정 단계가 있으며 사용자는 프로그램별 프로토콜에 대한 프로그램 사용 설명서를 참조해야 합니다. 그런 다음 프로그램은 이러한 Fastq 파일에서 유전자 별 원시 카운트 데이터를 생성합니다.
- 4.3에 설명된 바와 같이 Ad5CMV-eGFP 샘플 세트를 제어 데이터 세트로, Ad5CMV-Cre 세트를 테스트 데이터 세트로 사용하여 원시 카운트 데이터에 대한 통계 및 정규화 분석(DESeq2, EdgeR)을 수행하여 강력한 통계적 파워(22,23)로 차등 유전자 발현 신호를 식별합니다.
- GFP fastq 파일을 제어 데이터 세트로 선택합니다.
- DESeq2를 통계 및 정규화 방법으로 선택합니다.
- 조립 및 분석을 시작합니다.
참고: 각 정렬 프로그램에는 특정 단계가 있으며 사용자는 프로그램별 프로토콜에 대한 프로그램 사용 설명서를 참조해야 합니다. 그런 다음 프로그램은 이러한 Fastq 파일에서 유전자 별 원시 카운트 데이터를 생성합니다. 통계 및 정규화 분석은 여기 예제와 같이 시퀀스 정렬 프로토콜 내에서 많은 프로그램에서 기본 제공되는 단계입니다. 이 후속 기본 제공 단계를 제공하지 않는 대체 시퀀스 정렬 소프트웨어 프로그램이 사용되는 경우 Bioconductor.org 에서 무료로 다운로드할 수 있는 R로 작성된 DESeq2 또는 EdgeR 코딩 패키지를 사용하여 터미널 수준에서 원시 카운트 데이터에 대한 통계 및 정규화 분석을 수행합니다.
- 이러한 접근법을 사용하여 대조군에 비해 적어도 1.5배 증가 또는 감소를 나타내는 변화를 확인한다(이 경우, Ad5CMV-eGFP 바이러스로 형질도입된 세포). 후속 기능적 농축 분석을 위해 ≥1.5배 변화와 p-값 0.05 또는 padj가 0.1인 통계적으로 유의한 것으로 판단되는 차등적으로 발현된 유전자(DEGs)만을 사용하십시오.
참고 : 이것은 DEG 유전자 목록과 기능적 농축 분석을위한 통계적 힘을 생성합니다. - 자유롭게 이용 가능한 웹 기반 도구 중 하나를 사용하여 순위가 매겨진 유전자 목록 파일로 4.4에서 확인된 통계적으로 유의미한 Erbb4 매개 DEG에 대한 기능적 농축 분석을 수행합니다. 이러한 오픈 액세스 기능적 농축 분석 도구 24,25,26,27에 통합된 유전자 온톨로지 데이터 세트를 통해 Erbb4 유전자 손실의 생물학적 및 경로 유의성을 결정한다(Panther를 사용한 예시적인 워크플로우에 대해서는 예를 위한 재료 표 및 도 3 참조).
- 4.4단계에서 얻은 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
- log2 폴드 변경, p/padj 값 또는 둘 다로 데이터의 순위를 매깁니다.
- 통계적으로 유의하지 않은 모든 데이터를 제거해야 합니다.
- 유전자 ID로만 순위가 매겨진 유전자 목록을 .txt 파일로 내보내고 웹 사이트에 업로드하십시오.
참고: 통계적으로 유의한 DEG(각각 0.05 또는 0.1< p/padj 값)만 사용하여 log2 배 변경(가장 높은 값에서 가장 낮은 값), p/padj-값(가장 낮은 값에서 가장 높은 값) 또는 둘 다[(-log10(pval)*sign(log2FC)]를 사용하여 순위가 매겨진 입력 유전자 목록을 생성합니다. 순위가 매겨진 유전자 목록을 생성하는 몇 가지 접근법이 있으며 데이터 세트 및 질문되는 질문에 대해 경험적으로 결정됩니다. 사용되는 특정 유형의 기능적 농축 분석 도구는 또한 적절한 유형의 순위 유전자 목록을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. RNA-Seq에 대한 추가 자원은 다음 논문 28,29,30을 참조한다.
5. 절제된 Erbb4 대립유전자를 사용한 MPNST 세포의 동위원소 동종이식편 및 Erbb4 절제 의 효과 분석
- 분류된 MPNST 세포의 동위원소 동종이식편을 수행하기 전에, 모든 절차가 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되고, 모든 절차가 적절하게 훈련된 인력에 의해 수행되는지 확인하십시오.
- 주사 당일에, 비효소적 세포 해리 용액(예를 들어, 킬레이터의 혼합물; 물질의 표 참조)을 사용하여 세포 배양 플레이트 또는 플라스크로부터 낮은 통과 세포(대략 85% 합류율)를 제거하고, 혈구측정기를 사용하여 세포를 계수한다. 좌골 신경에 동형 외과 주사를 위해, DMEM-1031에서 16,667 세포 / mL (각 동물에 대해 3 μL 당 50,000 세포)에서 세포를 재구성하십시오. 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 일부 배양물은 세포가 저성장 인자 기저막 매트릭스에 주입되지 않는 한 이식편을 성공적으로 확립하지 못할 것이다. 기저막 매트릭스 (10-50 %)에 대한 요구 사항은 경험적으로 결정되어야합니다. - MPNST 세포를 마취된 8-10마리의 좌골 신경에 주입하여 감염 후 세포에서 생체내 동종이식편 성장 잠재력을 평가한다: 코호트 당 Athymic Nude-Foxn1nu 마우스(노화 4-8주). 종양 세포의 동위원소 주사에 대해서는 Turk et al. 31을 참조한다. 여기에서, 피하 주사가 입증된다.
참고: 통계적 유의성에 필요한 실험 동물의 수를 결정하려면 생물통계학자와 상의하거나 자유롭게 이용 가능한 소프트웨어(32)인 G*Power3를 사용하는 것이 좋습니다. - 통증의 징후가 있는지 주사 후 첫 주 동안 매일 두 번 동물을 면밀히 모니터링하십시오. 그 후, 캘리퍼 측정을 위해 일주일에 세 번 이식된 마우스를 모니터링하고, 앞서 기술된 바와 같이 신체 상태 점수(BCSs)를 평가한다(5,31). IACUC 지침에 명시된 바와 같이, BCS가 2 이하인 동물을 안락사시킵니다.
- 이식된 세포가 상이한 속도로 성장함에 따라, 이 섹션에 설명된 실험을 수행하기 전에 조절된(변형되지 않은) 세포를 사용하여 경험적으로 이식 시간을 결정한다. 실험 종점에서 이식편을 수집하기 위해, 이산화탄소 흡입을 사용하여 마우스를 인도적으로 안락사시킨 다음, 보조 조치로서 자궁경부 탈구를 이용한다. 각 이식편의 최종 부피 및 질량 측정을 기록한다.
참고: 수정되지 않은 P0-GGFβ3으로서; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST 세포는 일반적으로 30-45 일 이내에 IACUC가 허용하는 최대 크기에 도달하며, 전형적인 타임 라인은 주사 후 약 30-45 일입니다. - 단계 1.6-1.8에 기재된 바와 같이 조직을 분리하고 절편한다. 이식편 조직의 일부를 4% 파라포름알데히드(도 2)에 하룻밤 동안 고정시킨 다음, 이를 파라핀에 임베드하였다. FFPE 조직에서 5 μm 절편을 준비하고 슬라이드에 장착하십시오. H&E 염색 및 기타 필요한 면역염색을 수행하여 이식편 조직이 1.8.1에 설명된 대로 종양 세포로 구성되어 있는지 확인합니다. 스냅-동결 하류 분석을 위해 종양 조직의 나머지 부분, 예컨대 Erbb4 발현의 손실을 검증하고 다른 Erbb 패밀리 구성원의 발현에 대한 Erbb4 손실 의 효과를 평가한다.
참고 : 이식 조직에서 종양 세포의 확인은 면역 결핍 마우스가 신 생물을 개발하는 경향이 있기 때문에 수행되어야합니다. 작은 이식편의 경우, 흉터 조직이나 염증이 신 생물로 오인되지 않도록하는 것이 중요합니다.- FFPE 조직에서 표준 IHC 염색을 수행하여 Ad5CMV-eGFP 및 Ad5CMV-Cre/eGFP 처리된 세포에서 성장한 동종이식편에서 관심있는 단백질의 발현을 비교한다. 적출된 이식편 조직을 erbB4 특이적 항체를 사용하여 염색하여 두 실험 조건 간의 생체 내 erbB4 발현 차이를 확인하였다. Ki67 염색을 통해 증식 지수를 결정하고, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 매개 dUTP 닉-엔드 라벨링(TUNEL) 염색을 통해 아폽토시스의 수준을 결정한다.
참고: 관심있는 모든 단백질 표적은 IHC를 통해 평가할 수도 있습니다. 예를 들어, 유전자 절제에 의해 매개되는 생체내 혈관 미세환경 차이를 결정하기 위해 항-CD31 항체(1:50 희석)로 동종이식편을 면역염색함으로써 혈관 밀도를 평가한다. 40x 필드 당 혈관 프로파일의 수는 정량화를 위해 계산 될 수있다. 이러한 IHC 기반 분석의 경우, 염색 절차를 위한 표준 IHC 프로토콜과 TUNEL 염색을 위한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 이미지의 정량화를 위해 ImageJ 플러그인 "단색 이미지의 자동 계산"을 사용하십시오.
- FFPE 조직에서 표준 IHC 염색을 수행하여 Ad5CMV-eGFP 및 Ad5CMV-Cre/eGFP 처리된 세포에서 성장한 동종이식편에서 관심있는 단백질의 발현을 비교한다. 적출된 이식편 조직을 erbB4 특이적 항체를 사용하여 염색하여 두 실험 조건 간의 생체 내 erbB4 발현 차이를 확인하였다. Ki67 염색을 통해 증식 지수를 결정하고, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 매개 dUTP 닉-엔드 라벨링(TUNEL) 염색을 통해 아폽토시스의 수준을 결정한다.
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Representative Results
도 4는 P0-GGFβ3을 형질도입할 때 얻어지는 전형적인 결과를 도시한다; Trp53-/+; Ad5CMV-eGFP 아데노바이러스 또는 Ad5CMV-Cre/eGFP 아데노바이러스를 갖는 Erbb4fl/fl MPNST 세포(그림 4A). 배양물을 형광 현미경으로 관찰하여 eGFP 발현 세포를 확인하고 위상차 현미경으로 10x (상단) 및 40x (하단)에서 동일한 분야에 존재하는 총 세포 수를 결정합니다. 이어서, eGFP를 발현하는 세포의 백분율은 원하는 경우 계산될 수 있다. 대표적인 FACS 출력 데이터는 보충 그림 S2에 도시되어 있다. FACS 이후, eGFP 발현 세포의 백분율은 현저하게 증가될 것이며, 각 분야의 거의 모든 세포가 eGFP를 발현한다. 형질감염 효율에 따라 Cre 매개 유전자 절제 후 예상되는 일반적인 PCR 유전자형 분석 결과는 대조군 형질도입 결과(GFP 전용, fl/fl)와 비교하여 완전한 유전자 녹아웃(100% 효율) 또는 유도 및 비유도 세포의 이종 집단(<100% 효율)이다(도 4B). 도 4C는 P0-GGFβ3의 동종이식편에서 발견되는 특징적인 조직병리학을 도시한다; Trp53+/-; Erbb4 fl/fl MPNSTs는 원래의 GEM 동물 모델로부터 유래된 종양과 비교하였다.
이들 실험에서, Erbb4 절제는 시험관내 및 생체내에서 세포 증식 및 세포 밀도의 감소, 생체내에서 TUNEL 표지 지수의 증가, 및 생체내 혈관 밀도 감소를 가져왔다. 도 5는 Ad5CMV-Cre 절제 세포 대 대조군 Ad5CMV-GFP 형질도입된 세포에서 감소된 세포 증식을 나타내는 이미지 기반 자동화 세포계로 수득된 대표적인 결과를 도시한다(도 5A); 이들 실험은 초기 계대 배양된 세포와 함께 수행되었다. P0-GGFβ3에서의 면역조직화학을 통한 ErbB4의 발현; Trp53+/-; Ad5CMV-Cre 또는 eGFP 바이러스로 형질도입된 Erbb4fl/fl MPNST 세포는 대조군 Ad5CMV-eGFP 처리된 동종이식편 종양에 비해 결과적인 Ad5CMV-Cre 형질도입된 동종이식편에서 감소하였다(도 5B). 혈관 밀도는 CD31에 대한 면역반응성 검출을 통해 평가되었다; 혈관 밀도는 Ad5CMV-Cre 형질도입된 세포의 동종이식편에서 현저하게 감소되는 것을 알 수 있다(도 5C). 신호 강도는 원하는 경우 ImageJ를 사용하여 정량화할 수 있습니다.
도 1: P0-GGFβ3을 생성 및 교차시킬 때 예상되는 유전자형의 비율의 푸넷 제곱 계산; Trp53+/- Erbb4 fl/fl 마우스(F1)를 갖는 마우스. P0-GGFβ3을 생성 및 유지할 때 예상되는 유전자형의 비율의 푸넷 제곱 계산; Trp53-/+; Erbb4fl/+ 서로 (F2). 약어 : fl = Floxed. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: P0-GGFβ3로부터 유래된 MPNST 세포의 초기 계대 배양물에서 플록싱된 Erbb4 대립유전자를 절제하기 위해 사용된 공정의 워크플로우; Trp53-/+; Erbb4 fl/fl 마우스. (a) 플록스 유전자를 발현하는 종양을 수확한다. (B) 적출된 종양으로부터 조기 통과 배양물을 생성한다. (c) 초기 계대 배양물을 감염시켜 플록스된 유전자를 절제하고 하류 분석을 수행한다. 약어: MPNST = 악성 말초 신경 외피 종양; IHC = 면역조직화학; PFA = 파라포름알데히드; FFPE = 포르말린-고정 파라핀-임베디드; H&E = 헤마톡실린 및 에오신; FACS = 형광-활성화된 세포 분류; GFP = 녹색 형광 단백질; K/O = 녹아웃; PCR = 중합효소 연쇄 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RNA-Seq 워크플로우를 보여주는 개략도. 워크플로우는 대조군(GFP-유도)과 Erbb4-null(Cre-유도된) 세포 사이의 차등적으로 발현된 전사체와 결과적인 생물학적 유의성을 확인하는 데 사용됩니다. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; RNA-Seq = RNA 시퀀싱. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: P0-GGFβ3에서 현미경으로 평가된 대표적인 형질도입 효율 결과; Trp53-/+; Erbb4 fl/fl MPNST 세포. (A) Ad5CMV-eGFP 아데노바이러스 또는 Ad5CMV-Cre/eGFP 아데노바이러스로 형질도입된 세포. (b) Ad5CMV 감염 후 잠재적인 유전자 집단의 PCR 결과. (c) 기원 GEM 모델에서 생성된 종양을 직교적으로 동종이식된 P0-GGFβ3와 비교하는 특징적인 조직병리학; Trp53-/+; H&E 염색을 통한 Erbb4 fl/fl MPNST 세포. 이미지는 40x에서 촬영되었습니다. 이소형-매칭된 음성 대조군 항체를 대조군 염색에 사용하였다. 스케일 바 = 400 μm (A, 상부 패널); 100 μm (A, 하부 패널), 20 μm (C). 약어: MPNST = 악성 말초 신경 외피 종양; GFP = 녹색 형광 단백질; BF = 브라이트필드; FACS = 형광-활성화된 세포 분류; Neg Ctrl = 음성 대조군; PCR = 중합효소 연쇄반응; GEM = 유전자 조작된 마우스; fl = 플록스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: Ad5CMV-eGFP 또는 Ad5CMV-Cre/eGFP로 형질도입 후 배양된 MPNST 조기 계대 배양 및 직교적으로 동종이식된 MPNST 세포에서 얻은 대표적인 결과. (A) Ad5CMV-Cre/eGFP로 형질도입된 세포에서 Ad5CMV-eGFP로 형질도입된 세포에서 Ad5CMV-eGFP로 형질도입된 세포에서 감소된 세포 밀도를 보여주는 배양된 MPNST 세포의 증식 분석. 정량화된 데이터는 1일, 3일 및 5일에 그래프로 표시됩니다(왼쪽). 이미지 기반 자동 세포계에서 촬영된 1일차 및 5일째 컨플루언시 이미지가 오른쪽에 표시됩니다(브라이트필드 현미경으로 4x 배율로 촬영된 이미지). 오차 막대는 적어도 3개의 상이한 독립적인 실험의 평균(SEM)의 표준 오차를 나타낸다. (B) Ad5CMV-eGFP 또는 Ad5CMV-Cre/eGFP 아데노바이러스로 형질도입된 동종이식편 종양에서 대표적인 ErbB4 염색을 20x 배율로 촬영. 레드 채널 (알렉사 564, CD31), 블루 채널 (Hoechst, 핵). (c) P0-GGFβ3의 동종이식편에서 혈관 밀도의 대표적인 이미지; Trp53+/-; Erbb4 fl/fl MPNST 세포는 Ad5CMV-eGFP 대 Ad5CMV-Cre/eGFP 바이러스로 형질도입되었습니다. 이미지는 40x에서 촬영되었습니다. 이소형-매칭된 음성 대조군 항체를 대조군 염색에 사용하였다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: MPNST = 악성 말초 신경 외피 종양; eGFP = 강화된 녹색 형광 단백질; IgG = 면역글로불린 G; NEG = 음성 대조군; CD = 차별화의 클러스터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 시퀀스 정렬 및 분석 워크플로우를 보여주는 개략도. DNAStar에서 RNA 시퀀싱 파일(fastq 파일)을 정렬하고 분석하는 데 사용되는 워크플로우입니다. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; RNA-Seq = RNA 시퀀싱., DEG = 차등적으로 발현된 유전자. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 S2: 녹색 형광 단백질을 이용한 초기 계대 배양으로부터의 대표적인 FACS 데이터. (a) GFP 발현 세포는 감염되지 않은 세포로부터의 형광 게이트 파라미터를 설정한 후 FACS에 의해 분류된다. (b) 적절한 검출 게이트가 설정된 후, GFP 양성(형질도입된) 세포는 GFP 음성(비-형질도입된) 세포로부터 분리된다. 약어: SSC-A = 피크의 측면 산란 영역; FSC-H = 피크의 전방 산란-높이; FSC-W = 피크의 순방향 산란폭; GFP = 녹색 형광 단백질; FACS = 형광 활성화 세포 분류. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 상세한 방법은 MPNST의 GEM 모델을 사용하여 개발되었습니다. 그러나, 관심있는 종양 조직이 개별 세포 내로 분산될 수 있다면, 이들 방법론은 GEMs에서 발생하는 다양한 종양 유형에 대해 쉽게 적응할 수 있다. 플록스된 대립유전자가 i) 종양을 스크리닝하기에 충분한 마우스를 수득하는 것을 어렵게 만들 수 있는 감소된 생존, 또는 ii) 충분한 종양 보유 마우스를 수득하는 것을 어렵게 만들 수 있는 증가된 종양 잠복기를 초래하지 않도록 하는 것이 중요하다. 플록스 대립 유전자가 생존에 영향을 미치지 않으면 두 코호트의 생존은 동등합니다. 종양 잠복기에 아무런 영향을 미치지 않는 경우, 유사한 시간 과정을 가진 두 코호트 모두에서 동등한 수의 종양 보유 마우스가 발생해야합니다.
유사한 접근법이 유도성 조건부 녹아웃 동물33,34를 생성하기 위해 조건부 녹아웃 및 타목시펜-유도성 Cre 동물을 사용하는 신경섬유종 및 MPNST를 연구하는데 사용되었다. 앞서 논의된 바와 같이 Cre 유도를 위한 타목시펜의 사용을 제외하고, 이들 연구와 본 연구의 차이점은 이들 연구가 NF1의 조직 특이적 녹아웃을 갖는 종양 발달에 초점을 맞추고 있다는 것이다. 이 연구와 다른 연구에서도 GEMM에서 생성 된 종양을 사용하기 때문에 차이점은 질문하는 질문과 관련이 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 MPNST 병인에서 NF1 손실이 수행하는 역할을 연구하는 것이 아니라 GEMM에서 생성 된 MPNST의 특정 유전자 (Erbb4)가 생체 내 종양 성장에 미치는 역할을 연구하고 있으며, 그렇지 않으면 배아 치명적이기 때문에 불가능합니다. 또한, 이 프로토콜은 이러한 파라미터를 필요로 하는 접근법에 대해 타목시펜의 사용을 피한다.
다른 이들은 이종이식편 모델35에서 확립된 인간 MPNST 세포주를 연구하였다. 이 연구는 사용 된 이식 된 세포가 잘 연구되었지만 고통과 인간 MPNST 세포주이며, 이종이식편에서 약물 반응을 확립하는 데 중점을두고 있다는 점에서이 연구와 다릅니다. 이들 연구진은 생체 내 성장에 대한 이러한 MPNST 세포에서 특정 유전자의 역할과 약물 반응에 대한 유전자 손실의 영향을 연구하지 않고 있다. 이와 유사한 또 다른 연구는 Dodd et al., 아데노바이러스 Cre 재조합효소(Ad-Cre)-매개 NF1 손실을 시간적 및 공간적 의존적 방식으로 사용하여, MPNST 번역 노력을 확장시키기 위한 강력한 방법(36)에 의해 수행되었다. 이 연구는 Ad-Cre 주사에 의한 좌골 신경에서 인간 MPNST에서 매우 일반적으로 공동 결실 된 두 개의 유전자 인 NF1 및 Ink4a / Arf 손실의 역할에 중점을 두었습니다. 상기 P0-GGFβ3; Trp53+/-; 이 연구에서 기술된 Erbb4fl/fl 마우스는 Ad-Cre를 Schwann 세포 전구체 계통에 주입함으로써 이러한 방식으로 사용될 수 있었다. 그러나이 연구에서 질문 된 질문은 MPNST 개시에 대한 Erbb4의 진화론 적 역할에 초점을 맞추지 않고 MPNST가 종양 성장 이점을 위해 Erbb4 신호 전달을 어떻게 납치 할 수 있는지에 초점을 맞추고 있습니다.
RNA 간섭 (RNAi)을 통해 유전자 발현을 녹다운하거나 인간 암 세포주에서 CRISPR로 관심있는 유전자를 불활성화시키는 것을 포함하여 여기에 기술된 접근법에 대한 대안이 있다. 이러한 대안적인 접근법은 가치가 있으며 GEM 종양으로부터 유래된 세포에서 유전자 절제와 파트너 관계를 맺어 마우스 종양 세포에서 관찰된 효과가 그들의 인간 대응물에서 재생산된다는 것을 검증할 수 있다. 그러나 여기에 설명 된 방법론에는 몇 가지 분명한 이점이 있습니다. 첫째, GEM 암 세포에서 유전적으로 플록스 된 유전자를 절제하는 것은 신속하고 표적 유전자의 완전한 불활성화를 일으킨다. 대조적으로, 짧은 헤어핀 RNAs의 사용은 단지 유전자 발현의 부분적인 녹다운을 초래한다는 것이 종종 관찰된다. CRISPR은 완전한 유전자 불활성화를 일으킬 수 있지만, 완전한 불활성화를 갖는 클론의 동정은 장기간의 선택 과정을 필요로 한다.
또한, CRISPR 절제술로 인한 효과가 상이한 클론들 간에 다르지 않은지 확인하기 위해 다수의 클론을 검사해야 한다. 둘째, 초기 계대 GEM 종양 배양물에서 플록스된 대립유전자를 절제하는 능력은 이것이 배양물에서 효과적으로 성장하는 별개의 종양 세포 하위집단에 대한 선택의 가능성을 최소화함에 따라 유리하다. 비교해 보면, 전형적으로 수년 동안 배양물에서 유지되어 온 인간 세포주는 종종 배양에 잘 적응하고 이 과정 동안 종종 유전적 표류를 겪는 뚜렷한 하위집단으로부터 유래된다. 이로 인해 이들 세포주는 부모 종양에 존재하지 않았던 새로운 돌연변이를 개발하게 된다. 마지막으로, GEM 종양 세포를 면역결핍 마우스로의 그라프팅이 이 원고에 기술되어 있지만, 교배 마우스 균주에서 발생하는 종양으로부터 유래된 GEM 종양 세포는 동일한 균주의 마우스로 동종이식될 수 있음이 주목된다. 이것은 조사자가 표적 유전자의 존재 또는 부재 하에 온전한 면역계를 가진 동물에서 종양 생물학을 평가할 수 있게 할 것이다.
여기에 설명 된 프로토콜의 중요한 단계는 Ad5CMV-Cre / eGFP로 플록스 된 유전자를 절제하고 유전자 절제 및 FACS에 따라 종양 세포의 생존을 보장하는 것입니다. 이것은 플록스 유전자를 절제하는 Cre 재조합효소의 능력에 의존하는 과정이기 때문에, 잠재적으로 생체내에서 플록싱된 유전자를 절제할 때 발생할 수 있는 동일한 문제 중 일부에 종속된다; 이러한 문제는 표적 대립 유전자의 불완전한 절제술로 나타납니다. eGFP 발현 아데노바이러스 벡터로 성공적으로 형질도입된 세포를 정제하는 능력은 CreERT2를 사용한 생체내 유전자 절제에 비해 모자이크를 최소화하는 것으로 나타난다는 점에 유의한다. 그러나, 세포 표면에서 발현되는 ErbB4와 같은 단백질을 코딩하는 표적화된 유전자의 경우, eGFP와 관심있는 단백질을 인식하는 항체를 모두 이용하는 FACS를 수행함으로써 표적화된 유전자의 손실을 더욱 보장할 수 있다(즉, eGFP 양성/erbB4 음성 세포를 정렬).
도입에서 언급된 바와 같이, 단일클론 항체에 의해 치료적으로 표적화된 많은 단백질이 세포 표면 단백질이기 때문에, 이러한 접근법은 빈번하게 실현가능해야 한다. 또한 RNA-Seq 가 전사체에 미친 영향을 평가하기 위해 RNA-Seq 가 수행되어야하는 경우 FACS 후 적어도 2-3 일 동안 종양 세포가 회복되도록하는 것이 중요하다는 점에 유의해야합니다. FACS 직후에 수득된 RNA-Seq 데이터세트는 종종 일부 세포 유형에서 생물학적 반복실험 사이의 유전자 발현에서 더 많은 가변성을 나타낸다. 이것은 세포가 FACS를 통과 할 때 겪는 외상의 결과 일 수 있습니다. 따라서, 세포는 이 과정 후에 회복 기간을 허용해야 한다. RNA-Seq 데이터 세트는 분포의 분산에 대해 음의 이항 분포 및 수축 추정기를 사용하는 DESeq2를 사용하여 분석할 수 있습니다. 이러한 분석에서 샘플은 q-값에 따라 정렬되며, 이는 전사체 수준의 변화가 중요한 가장 작은 허위 발견률 (FDR)입니다. FDR은 Benjamini-Hochberg 다중 테스트 조정 절차를 사용하여 계산됩니다. 대안적으로, DEG는 RNA-Seq 분석 워크플로우가 가능한 다른 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 식별될 수 있다.
이 MPNST 동물 모델의 경우, 실험 종점을 식별하려면 사용 중인 동물 모델에서 신생물의 자연사에 대한 이해가 필요합니다. 이러한 GEM에서 MPNSTs의 자연사는 일련의 44P0-GGFβ3 마우스6 및 19P0-GGFβ3의 생존에 이어 결정되었다; Trp53+/- 마우스7은 생존 종점에 도달했을 때 이들 동물 모두에 대해 완전한 부검을 수행한다. 전형적인 생존 시간 및 MPNST가 전형적으로 발생하는 위치는 각 동물 모델에서 결정되었다. 이 생쥐의 대부분에서 MPNST는 삼차 신경에서 발생했습니다. 삼차 신경에서 발생하는 MPNST는 전형적으로 각막 백탁과 관련된 안검하수증 (안검하수증에 의해 생성 된 눈물 분포 문제의 결과)을 생성했으며, 이는 종양 보유 마우스를 확인하는 데 임상적으로 유용한 징후를 제공했습니다. 종양 진단은 H & E 염색 및 몇 가지 추가 진단 얼룩 (S100β, nestin Sox 10, H & E, Mart1)을 수행 한 다음 자격을 갖춘 수의사 또는 인간 병리학 자의 검사를 통해 확인해야합니다. 이 모델에서 Trp53 null 대립 유전자는 마우스가 림프종과 같은 다른 신 생물의 발달에 걸리기 때문에 이것은 또한 중요하며, 이러한 종양은 MPNST와 구별되어야합니다.
마지막으로,이 방법론에는 아직 탐구되지 않은 몇 가지 잠재적 인 응용 프로그램이 있지만 향후 조사에서 실현 가능할 수 있습니다. 예를 들어, erbB3 및 erbB4 둘 다를 활성화시키는 리간드인 뉴레귤린 1(NRG1)은 화학주성 방식으로 MPNST 세포의 이동을 촉진한다; erbB3 및 erbB4 둘 모두는 MPNST 세포(37)의 내혈관에 위치한다. 그러나, erbB3 또는 erbB4가 NRG1에 대한 화학주성 반응을 매개하는지 여부는 명확하지 않다. 결과적으로, erbB4가이 방법론으로 절제되는 세포는이 질문을 해결하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 실험에 대한 자연스러운 후속 조치는 종양 세포가 꼬리 정맥을 통해 주입되는 일반적으로 사용되는 접근 방식을 사용하여 erbB4가 전이에 필요한지 여부를 평가하고 폐 전이의 수를 평가하는 것입니다. 이 방법론은 shRNA 발현이 종종 잠시 후 세포에서 침묵하기 때문에 shRNA를 사용하여 erbB4 발현을 녹다운하는 것과 같은 다른 접근법에 비해 명확한 이점을 제공합니다. 또한, 초기 계대 배양물은 전이되기 쉬운 세포의 하위집단을 포함하는 종양 유래 하위집단의 혼합물을 함유할 것으로 예상된다. 여기에 기재된 방법론을 사용하여 제조된 세포로 전이 분석을 수행하는 것은 확립된 세포주보다 모 종양을 더 대표하는 전이성 전위의 평가를 허용할 것이다. 물론 이것은 이 방법론을 활용할 수 있는 미래의 응용 프로그램의 한 예에 불과합니다. 우리는 다른 연구자들이이 방법론을 특히 관심있는 문제와 결합하여 인간 암의 핵심 치료 표적 인 단백질을 식별하는 능력을 향상 시키길 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소 (R01 NS048353, R01 NS109655), 국립 암 연구소 (R01 CA122804), 국방부 (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 및 W81XWH-15-1-0193) 및 어린이 종양 재단 (2014-04-001 및 2015-05-007)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
References
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