Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Определение функций генов в опухолевом генезе путем абляции Ex vivo флоксированных аллелей в злокачественных опухолевых клетках оболочки периферических нервов

Published: August 25, 2021 doi: 10.3791/62740
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

Здесь мы представляем протокол для выполнения нокаутов генов, которые являются эмбриональными летальными in vivo в генетически модифицированных опухолях, полученных из мышиной модели, а затем оцениваем влияние, которое нокаут оказывает на рост опухоли, пролиферацию, выживание, миграцию, инвазию и транскриптом in vitro и in vivo.

Abstract

Разработка новых лекарств, которые точно нацелены на ключевые белки при раке человека, коренным образом изменяет терапию рака. Однако, прежде чем эти препараты могут быть использованы, их целевые белки должны быть подтверждены в качестве терапевтических мишеней при конкретных типах рака. Эта проверка часто выполняется путем выбивания гена, кодирующего потенциальную терапевтическую мишень в генно-инженерной мышиной модели рака (GEM), и определения того, какое влияние это оказывает на рост опухоли. К сожалению, технические проблемы, такие как эмбриональная летальность в обычных нокаутах и мозаицизм в условных нокаутах, часто ограничивают этот подход. Чтобы преодолеть эти ограничения, был разработан подход к абляции флоксированного эмбрионального летального гена, представляющего интерес в краткосрочных культурах злокачественных опухолей оболочки периферических нервов (MPNST), генерируемых в модели GEM.

В этой статье описывается, как установить модель мыши с соответствующим генотипом, получить краткосрочные опухолевые культуры от этих животных, а затем аблактировать флокированный эмбриональный летальный ген с использованием аденовирусного вектора, который экспрессирует рекомбиназу Cre и усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP). Затем подробно описывается очистка клеток, трансдуцированных аденовирусом, с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и количественная оценка эффектов, которые абляция генов оказывает на клеточную пролиферацию, жизнеспособность, транскриптом и рост ортотопического аллотрансплантата. Эти методологии обеспечивают эффективный и обобщающий подход к выявлению и подтверждению терапевтических мишеней in vitro и in vivo. Эти подходы также обеспечивают возобновляемый источник низкопроходимых опухолевых клеток с уменьшенными артефактами роста in vitro . Это позволяет изучать биологическую роль гена-мишени в различных биологических процессах, таких как миграция, инвазия, метастазирование и межклеточная связь, опосредованная секретомом.

Introduction

До последних двух десятилетий лечение рака человека в значительной степени зависело от лучевой терапии и химиотерапевтических агентов, которые широко нацеливались на быстро размножающиеся клеточные популяции, повреждая ДНК или ингибируя синтез ДНК. Хотя эти подходы ингибировали рост раковых клеток, они также имели вредные побочные эффекты на нормальные быстро размножающиеся типы клеток, такие как эпителиальные клетки кишечника и клетки волосяных фолликулов. Совсем недавно терапия рака начала использовать химиотерапевтические агенты, которые точно нацелены на белки в сигнальных путях, которые критически важны для роста новообразования отдельного пациента. Этот подход, обычно называемый «прецизионной медициной», привел к разработке постоянно расширяющегося репертуара моноклональных антител и малых молекулярных ингибиторов. Эти агенты эффективно ингибируют пролиферацию и выживание опухолевых клеток, избегая вредных побочных эффектов на нормальные типы клеток, наблюдаемых с помощью обычных химиотерапевтических агентов и лучевой терапии. Моноклональные антитела, используемые для лечения рака человека, чаще всего нацелены на молекулы клеточной поверхности, такие как рецепторы фактора роста1 (например, большое семейство тирозинкиназ мембранных рецепторов) и модуляторы иммунного ответа2 (например, запрограммированный белок гибели клеток 1, запрограммированный лиганд смерти 1). Малые молекулярные ингибиторы могут ингибировать либо белки клеточной поверхности, либо сигнальные белки, которые расположены внутриклеточнымобразом 3. Однако, чтобы эффективно использовать эти новые терапевтические агенты, необходимо установить, что конкретный рак зависит от молекулы, на которую нацелен кандидат терапевтический агент.

Хотя эти новые терапевтические агенты имеют более целенаправленные эффекты, многие из них по-прежнему ингибируют действие более чем одного белка. Кроме того, несколько агентов с различной эффективностью и специфичностью часто доступны для нацеливания на конкретный белок. Следовательно, во время доклинических исследований целесообразно использовать дополнительные подходы, такие как генетическая абляция, для проверки белка-кандидата в качестве терапевтической мишени. Одним из особенно полезных подходов к проверке белка в качестве терапевтической мишени является удаление гена, кодирующего белок-кандидат, в генетически модифицированной животной модели, которая развивает конкретный тип рака. Этот подход может быть относительно простым, если мыши с нулевой мутацией (либо естественная мутация, либо генетически модифицированная нулевая мутация [«нокаут»], либо нулевая мутация, введенная генной ловушкой), доступны, и мыши жизнеспособны во взрослой жизни. К сожалению, мыши с нулевой мутацией, которые соответствуют этим критериям, часто недоступны, как правило, потому, что нулевая мутация приводит к смерти эмбрионально или в первые дни постнатальной жизни. В этом случае мыши, склонные к развитию опухолевого типа интереса, могут быть вместо этого скрещены с мышами, у которых ключевые сегменты интересующего гена окружены участками loxP («floxed»), что позволяет удалять ген путем введения трансгена, экспрессирующего Cre recombinase в опухолевые клетки (условный нокаут). Такой подход дает ряд преимуществ. Во-первых, если доступен драйвер Cre, который экспрессируется в опухоли, но не в типе клеток, который привел к смерти в обычных нокаутах, этот подход может потенциально подтвердить потенциальную терапевтическую мишень. Во-вторых, удаление гена, кодирующего белок-кандидат в опухолевых клетках, но не в других внутриопухолевых элементах, таких как опухолеассоциированные фибробласты или иммунные клетки, позволяет исследователю различать клеточные автономные и неклеточные автономные эффекты терапевтической мишени. Наконец, индуцируемый тамоксифен драйвером Cre (CreERT2) позволяет исследователю удалить ген, представляющий интерес на разных стадиях развития опухоли, и определить окно, в котором потенциальный терапевтический агент, скорее всего, будет эффективным.

К сожалению, существуют и технические проблемы, которые могут ограничить использование условных нокаутов при опухолях, возникающих в моделях GEM. Например, драйвер Cre, который экспрессируется в опухолевых клетках и избегает делеции генов в нормальных клетках, необходимых для жизни, может быть недоступен. Другая проблема, которую можно недооценивать, заключается в том, что драйверы Cre и CreERT2 часто по-разному удаляют флоксированные аллели у мышей, что приводит к мозаицизму для нулевой мутации при раке GEM. Когда это происходит, опухолевые клетки, в которых ген-мишень не был абляционным, будут продолжать быстро размножаться, перерастая опухолевые клетки с помощью абляционных аллелей. Мозаицизм в линиях драйвера Cre может возникать из-за не вездесущей экспрессии Cre в целевой линии и неудачной рекомбинации в отдельных клетках, независимых от экспрессии Cre4. Это известное явление драйверов Cre, которое зависит от клеточного типа и должно быть рассмотрено при экспериментальном проектировании и интерпретации данных. Мозаицизм может замаскировать эффект нокаута и привести исследователя к ошибочному выводу, что ген, представляющий интерес, не является существенным для пролиферации опухолевых клеток и / или выживания и, следовательно, не является действительной терапевтической мишенью.

Некоторые из этих проблем были обнаружены в предыдущем исследовании, в котором пытались определить, является ли рецептор тирозинкиназы erbB4 потенциальной терапевтической мишенью в клетках MPNST5. В этих исследованиях использовались мыши, которые экспрессируют трансген, кодирующий изоформу глиального фактора роста неурегулина-1 (NRG1)-β3 (GGFβ3) под контролем нулевого промотора миелинового белка Шванна (мыши P 0-GGFβ3). У мышей P 0-GGFβ3 развиваются множественные плексиформные нейрофибромы, которые прогрессируют, чтобы стать MPNST посредством процесса, который повторяет процессы патогенеза нейрофибромы и прогрессирование плексиформной нейрофибромы-MPNST, наблюдаемое у пациентов с синдромом аутосомно-доминантной восприимчивости к опухоли нейрофиброматоза типа 1 (NF1)6. При скрещивании с мышами с нулевой мутацией Trp53 получается P 0-GGFβ3; Trp53+/- у мышей развиваются MPNST de novo, как это наблюдается у цис-Nf1+/-; Trp53+/- мыши.

Эти MPNST повторяют прогрессирование от II степени Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) к поражениям IV степени ВОЗ, наблюдаемым у людей7. У мышей P 0-GGFβ3 MPNST возникают в пределах ранее существовавших плексиформных нейрофибром в тройничном нерве (58%) и спинномозговых спинных нервных корешках (68%)7; MPNST, возникающие в P 0-GGFβ3; Trp53+/- мыши имеют очень похожее распределение. У людей MPNST чаще всего возникают в седалищном нерве, за которым следуют плечевое сплетение, спинномозговые нервные корешки, блуждающие, бедренные, срединные, крестцовые сплетения, подколенный обтуратор и задний большеберцовый и локтевой нервы8. Это распределение опухолей в этих моделях GEM несколько отличается от того, что наблюдается у людей. Однако MPNST, которые возникают в P 0-GGFβ3 и P0-GGFβ3; Trp53+/- мыши гистологически идентичны человеческим MPNST, несут многие из тех же мутаций, которые наблюдаются у людей MPNST, и повторяют процесс прогрессирования нейрофибромы-MPNST, наблюдаемый у пациентов с NF1. Генерация P 0-GGFβ3 или P0-GGFβ3; Trp53+/- мыши, которые были Erbb4-/- были невозможны, так как мыши с двумя нулевыми аллелями Erbb4 умирают в утробе матери на эмбриональном дне 10,5, вторичном по отношению к порокам сердца9. Поскольку спасение экспрессии Erbb4 в сердце путем введения кардиоспецифического трансгена Erbb4 (тяжелая цепь α-миозина (MHC)-Erbb4) приводит к жизнеспособным мышам Erbb4-/-mice10, генерации мышей со сложным P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Была предпринята попытка генотипа Erbb4-/-.

Тем не менее, спаривания не производили мышей в ожидаемых менделевских соотношениях, что указывает на то, что желаемый генотип был вредным. Поэтому генерация P 0-GGFβ3; Trp53+/- мыши с флокированными аллелями Erbb4 11 и драйвером CreERT2 были предприняты, чтобы разрешить удаление Erbb4 в MPNST, возникающих у этих мышей. У этих животных все еще присутствовали многочисленные опухолевые клетки с интактными аллелями Erbb4 (мозаицизм). Наблюдаемый мозаицизм может быть результатом неэффективной доставки тамоксифена, что привело к различиям в эффективности рекомбинации в ткани. Возможность спонтанных компенсаторных механизмов может еще больше способствовать мозаицизму в тамоксифен-опосредованной рекомбинации, минуя требование экспрессии Erbb4. Вполне возможно, что потеря Trp53 делает опухолевые клетки восприимчивыми к дополнительным спонтанным «разрешающим» мутациям, которые могут запутать интерпретацию данных. Поскольку казалось вероятным, что Erbb4-интактные MPNST-клетки будут маскировать последствия абляции Erbb4 в других опухолевых клетках, от этого подхода отказались.

Эти препятствия привели к разработке методологии абляции Erbb4 в очень раннем прохождении клеток MPNST с использованием аденовируса, экспрессирующего cre-рекомбиназу и eGFP. Эти клетки могут быть отделены от неинфицированных клеток с помощью FACS, что заметно снижает мозаицизм для абляционного гена Erbb4 . Ниже описаны методы, используемые для достижения этого, вместе с методами, используемыми для оценки эффектов абляции генов in vitro и in vivo. Следующий протокол является примером того, как производить опухоленосных мышей, которые дают опухоли, несущие флокированные аллели эмбриональных летальных генов, представляющих интерес для иссечения ex vivo до оценки роста опухоли аллотрансплантата in vivo . Это включает в себя описание подходов, используемых для анализа эффекта, который абляция Erbb4 оказывает на пролиферацию опухолевых клеток, выживаемость и экспрессию генов in vitro и пролиферацию, выживаемость и ангиогенез в ортотопических аллотрансплантатах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Прежде чем выполнять какие-либо процедуры с мышами, все процедуры должны быть рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Протокол, описанный в этой рукописи, был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского университета Южной Каролины. Этот протокол был выполнен должным образом обученным персоналом в соответствии с институциональными руководящими принципами MUSC по уходу за животными.

1. Генерация мышей, у которых развиваются гомозиготные MPNSTs для аллелей флокса Erbb4

  1. Производят поколение F1 P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Erbb4fl/+ животных путем спаривания P 0-GGFβ3; Trp53+/- мыши7 с Erbb4fl/fl мышей11. Используйте квадрат Паннетта (рисунок 1) для руководства схемой размножения, чтобы гарантировать, что достаточное количество детенышей F1 мужского и женского пола генерируется с желаемым P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Генотип Erbb4fl/+ .
  2. Потомство генотипа F1 путем выделения геномной ДНК из хвостового среза, собранного в соответствии с руководящими принципами IACUC, а затем выполняет ПЦР с использованием ранее описанных праймеров для обнаружения трансгена P0-GGFβ3 12, аллелей дикого типа Trp53 (+) и нуля (-)7, а также аллелей дикого типа Erbb4и Erbb4 дикого типа13.
    1. Изолируйте ДНК хвоста, используя методы, подробно описанные в jacks-lab.mit.edu/protocols.
    2. Сделайте реакционную смесь ПЦР с 25 нг ДНК, 0,25 нМ дНТП, 0,02 ЕД/мкл Taq, 0,5 мкМ каждого праймера и 1x буфером ПЦР. Проводят ПЦР-реакцию с однократной инкубацией при 95 °C (для расплавления геномной ДНК и активации Taq) в течение 1 мин с последующим 35 циклами ПЦР при 94 °C, 10 с (плавление); 55 °C, 30 с (отжиг); 72 °C, 40 с (расширение) с последующим однократным 72 °C (расширение) в течение 5 мин. Хранить реакции при 4 °C до готовности к запуску на 1,2-1,5% агарозном геле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура отжига зависит от используемой буферной системы ПЦР; рекомендуется выполнить градиент температуры отжига для определения правильной температуры отжига.
  3. Производят поколение F2 P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Erbb4fl/fl животных путем спаривания соответствующего потомства F1 (P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Erbb4fl/+) друг с другом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1 иллюстрирует предсказания квадрата Пуннета, используемые для расчета ожидаемого числа потомков F2 с желаемым генотипом.
  4. Идентификация животных с желаемым P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Генотип Erbb4fl/fl, описанный на этапе 1.2.
  5. Сопряжение потомства F2 друг с другом для поддержания P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Erbb4fl/fl колония и генотип всех детенышей. Подтвердите, что недавно введенный флоксированный аллель не ставит под угрозу выживаемость или латентность опухоли. Достичь этого путем создания когорт (20 мышей/когорт) P 0-GGFβ3; Trp53+/- и P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Erbb4fl/fl мышей и следить за их выживаемостью и частотой возникновения опухолей.
  6. Мониторинг животных несколько раз в неделю до тех пор, пока не будет достигнута экспериментальная конечная точка (максимально допустимый размер опухоли / гуманная конечная точка, одобренная IACUC).
    1. Во время еженедельного мониторинга оцените массу тела, нормальное социальное и груминговое поведение, а также измерения размера опухоли. Организуйте ветеринарную оценку в случае потери веса >10% от массы тела, социальной изоляции и горбиться.
    2. Когда опухоленосная мышь идентифицирована и достигла своей гуманной конечной точки, гуманно усыпьте животное с помощью вдыхания углекислого газа с последующим вывихом шейки матки и стерильно удалите опухоль с помощью скальпельного ножа. Проведите измерения опухоли, измерив длину, ширину и глубину с помощью штангенциркуля и веса опухоли (массы и объема). Работайте быстро, чтобы избежать автолиза.
  7. Разделите опухоль на три секции, используя порезы в стиле хлебного рулета скальпелевым ножом в стерильных условиях для генерации сегментов ткани для фиксации формалина / встраивания парафина (FFPE), генерации культуры раннего прохождения и замороженного материала (рисунок 2A).
    1. Убедитесь, что раздел 1 (для раннего формирования культуры, шаг 1.7.2) составляет примерно 10% от общего объема опухоли, раздел 2 (для фиксации и IHC, шаг 1.7.3) составляет 70% от общего объема опухоли, а раздел 3 (для замораживания вспышки, шаг 1.7.4) составляет 20% от общего объема опухоли.
    2. Принимают 1 участок опухоли для приготовления культур раннего прохождения (см. ниже).
    3. Зафиксируйте участок 2 опухоли в 4% параформальдегиде на ночь при 4 °C, а затем вставьте в парафин (формалин-фиксированный парафин-внедренный (FFPE) для диагностического исследования.
    4. Раздел 3 флэш-замораживания для аналитического анализа (например, иммуноблоты для проверки того, что белок, кодируемый целевым геном флоксированной, соответствующим образом экспрессируется).
  8. Окрашивание участков ткани FFPE толщиной 5 мкм гематоксилином и эозином (H&E) для подтверждения диагноза опухоли квалифицированным патологоанатомом. При необходимости выполните иммуногистохимическое окрашивание (IHC) для подтверждения диагноза опухоли.
    1. Иммуноусадочные MPNST для S100 кальций-связывающего белка B (S100β), нестина и определяющей пол области Y (SRY)-Box транскрипционного фактора 10 (Sox10) - трех маркеров, которые экспрессируются как в MPNTS, так и в шванновских клетках (происхождение опухолевых клеток)5,6,14,15. Окрашивайте опухоли антителами, распознающими erbB4, белок, кодируемый геном, предназначенным для абляции, на последующих этапах.
    2. Чтобы подтвердить диагноз, попросите квалифицированного ветеринара или патологоанатома оценить все окрашенные опухолевые слайды в соответствии с диагностическими и классификационными критериями ВОЗ 5,6,7,16.

2. Абляция ex vivo флокированных аллелей Erbb4 в клетках MPNST

  1. Устанавливают культуры раннего прохождения из свежесобранной ткани MPNST, помещая ткань из секции 1 (стадия 1.7.3) в 10 мл ледяного стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) на льду и затем перенося ее в стерильную рабочую зону (рисунок 2B)16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие процедуры должны выполняться в стерильной культуральной вытяжке.
  2. Измельчите опухолевую ткань на кусочки по 2-4 мм и тритурируйте 8-10 раз в обработанной 10 см2 чашке для культивированиятканей с 10 мл питательной среды. Культивируйте эти препараты в питательной среде с высоким содержанием глюкозы DMEM-10 (модифицированная среда Dulbecco Eagle's (DMEM), содержащая 10% сыворотки для телят плода, 1% глутамина, 10 мкг / мл стрептомицина и 10 МЕ / мл пенициллина), дополненная 10 нМ неурегулина-1β (NRG1β) и 2 мкМ форсколина. Добавьте форсколин на этом этапе, чтобы ингибировать рост распространенных загрязняющих типов клеток, таких как фибробласты.
  3. Поддерживайте механически диссоциированную ткань и клетки в течение 3 дней при 37 °C в атмосфере 5% CO2 для создания культуры раннего прохождения. Не разделяйте дисперсные клетки и оставшиеся фрагменты тканей в этот момент.
  4. Обновляйте культуры новой средой каждые 3-4 дня. Позвольте опухолевым клеткам размножаться до тех пор, пока они не сольются.
  5. Расширить ранние проходные культуры, разделив сливающиеся культуры на несколько блюд. Удалите питательную среду и промыть клетки 1x dPBS. Затем добавляют 1 мл 0,25% трипсина в течение 2-5 мин при комнатной температуре на 10см2 обработанной чашки для культивирования клеток. Осторожно протритурируйте культуру, чтобы облегчить отслоение и создать одноклеточную суспензию.
    1. Прекратить трипсинизацию путем добавления 2 мл питательной среды DMEM-10. Соберите трипсинизированную клеточную смесь и переложите ее в стерильную центрифужную трубку объемом 5 мл. Гранулируют ячейки центрифугированием в течение 5 мин при 500 × г при комнатной температуре.
    2. Повторно суспендировать ячейку гранулы в 5 мл ДМЭМ-10. Разделите клетки на две-четыре чашки для культивирования клеток по 10 см, каждая из которых содержит 10 мл питательной среды (примерно 1 × 106 клеток на чашку).
  6. После 5 пассажей (повторение шагов в 2,5) используют питательную среду без NRG1β и форсколина. Иммуноокрашивает образец культуры антителом против S100β, чтобы убедиться, что культура состоит исключительно из опухолевых клеток. Поддерживайте клетки в питательной среде DMEM-10 во всех последующих проходах.
  7. При следующем прохождении подсчитайте клетки и заморозьте часть P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Erbb4fl/fl MPNST клеток, собранных из сливающихся культур (3 × 106 клеток/флакон).
  8. Пластина P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Erbb4fl/fl раннего прохождения MPNST клеток при плотности 1,5 × 106 клеток на 10 см обработанную чашку для культивирования клеток в питательной среде DMEM-10.
  9.  День 0: (Приблизительно через 12-16 ч после нанесения покрытия) промыть адгезивные культуры 2-4 мл dPBS и заразить Ad5CMV-Cre/eGFP или Ad5CMV-eGFP примерно в 400 бляшеобразующих единицах (pfu) на клетку в 10 мл DMEM без сыворотки (т.е. 30 мкл 2 × 1010 pfu вируса на 10 см чашки). Аблятируют флокированные аллели Erbb4 с использованием аденовируса при максимально переносимой концентрации вируса (множественность инфекции, MOI), определяемой эмпирически. Схема рабочего процесса для этой абляции приведена на рисунке 2C .
  10. День 1: Примерно через 16 часов спасите культуры, добавив 10 мл DMEM-10 в коктейль инфекции.
  11. День 2 - 3: FACS сортирует инфицированные клетки в соответствии с рекомендуемым протоколом от основного объекта для сортировки eGFP-положительных клеток примерно через 48 ч после заражения. Перед сортировкой FACS кратко проверьте клетки на наличие сигнала eGFP на флуоресцентном микроскопе, чтобы убедиться, что культуры были эффективно инфицированы (~ 50-100% положительные клетки). Возврат клеток, восстановленных после FACS, в 10 см тканей культуры посуды; зарезервируйте одно блюдо для выделения геномной ДНК.
  12. День 4 - 5: После сортировки FACS дайте клеткам восстановиться в инкубаторе культуры тканей в течение не менее 24-48 ч, а затем подготовьте клетки к анализу на основе клеток in vitro или трансплантации in vivo . Подтвердите делецию Erbb4 с помощью ПЦР с помощью геномной ДНК, выделенной из части отсортированных eGFP-положительных клеток. Убедитесь, что eGFP-положительные клетки являются ErbB4-отрицательными с помощью ПЦР или путем иммуноокраширования образца культуры антителом против erbB4.
    1. Выделяют геномную ДНК из клеток с помощью стандартногометода выделения ДНК на основе кислоты-гуанидиний-фенола и хлороформа.
    2. Выполняют стандартную ПЦР для различения флоксированных аллелей Erbb4 и абляционных аллелей Erbb4 . Выполните 40 циклов с 2 нг ДНК, 20 мкМ праймеров 1 + 2 для получения продукта 250 bp Erbb4-null и 350 bp floxed продукта13. Выполняйте как ПЦР, так и подходы на основе антител для подтверждения нокаута, когда нет надежных антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки готовы к клеточным анализам in vitro , как описано ниже. Многие типы последующих анализов могут быть выполнены с клетками, подготовленными таким образом. Целью протоколов, представленных ниже, является предоставление нескольких примеров применения in vitro и in vivo этих опухолевых клеток после абляции гена Erbb4 .

3. Анализы пролиферации и жизнеспособности в клетках MPNST с абляционными аллелями Erbb4

  1. Выполните анализы пролиферации в течение следующих семи дней на отсортированных клетках MPNST, покрытых многолуночной пластиной, с использованием автоматизированного цитометра на основе изображений.
    1. День 6: Пластина 2000 клеток на скважину в конечном объеме 150 мкл (~13 300 клеток/мл) питательной среды в 96-луночной пластине. Выполняйте измерения в трех экземплярах для каждой экспериментальной когорты и 4 ежедневных считывания конечных точек (3 реплика x 2 условия x 4 дня).
    2. Дни 7, 9, 11, 13: Окрашивайте клетки красителями Hoechst и propidium iodide (PI) и визуализируйте их на автоматизированном считывателе пластин для подсчета количества живых и мертвых клеток в каждой скважине. Чтобы достичь этого, одновременно окрашивайте клетки красителем Hoechst, чтобы окрасить ядра как живых, так и мертвых клеток, и йодидом пропидия (PI), чтобы пометить мертвые клетки. Выполняйте все чтения в одно и то же время каждый день или через день.
      1. Добавьте 50 мкл 4-кратного окрашивающего раствора PI/Hoechst (по 4 мкг/мл каждый) к каждой скважине, количественно оцененной в этот день (например, только на 7-й день), и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C в инкубаторе культуры тканей. Держите пластину защищенной от света.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация окрашивания Hoechst должна быть определена эмпирически и может варьироваться от 1 до 10 мкг/мл в зависимости от типа клетки.
      2. Считывание окрашенных лунок после инкубации с помощью соответствующего флуоресцентного канала на автоматизированном ячеистом тепловизоре. После прочтения верните пластину в инкубатор для будущих чтений в последующие дни (т.е. дни 9, 11, 13).
      3. Количественно оценить интенсивность окрашивания на основе используемой системы визуализации и рассчитать количество мертвых клеток, живых клеток и всего клеток, используя следующие настройки: синий канал (377/50 нм, Hoechst): общее количество клеток (живых и мертвых); красный канал (531/40 нм, PI): только мертвые ячейки; синий - красный (всего - мертвый) = живые клетки.
  2. При желании выполните анализ жизнеспособности клеток в течение трех дней, следуя протоколу производителей анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы жизнеспособности могут быть объединены с анализами пролиферации путем выполнения тройного окрашивания, включая кальцеин AM (488/32 нм; зеленый канал, в частности метки живых клеток), PI и Hoechst. Анализ апоптоза также может быть выполнен с использованием культур, созданных, как описано выше; конкретный протокол будет зависеть от системы визуализации.
    1. День 6: Пластина 4000 ячеек на скважину в конечном объеме 150 мкл в 96-луночной пластине в трех экземплярах.
    2. Дни 7 - 9: Добавьте 2000x реагентов для анализа жизнеспособности биолюминесцентных клеток (Таблица материалов), верните пластину в инкубатор и прочитайте пластину через 1 ч. Выполняйте последующие чтения в одно и то же время каждый день. Для анализов биолюминесценции (MTT) выполняйте анализ в точности так, как указано в инструкциях производителя, каждые 24 часа в течение 72 часов с помощью считывателя пластин люминометра.

4. Анализ RNA-Seq и идентификация генов, экспрессия которых изменяется в результате потери Erbb4

  1. День 6: Изолируйте общую РНК из отсортированных клеток MPNST с использованием стандартных методов на основе кислоты-гуанидиний-фенола и хлороформа. Для экспериментов, предназначенных для обнаружения изменений уровней мРНК между двумя когортами, подготовьте общую РНК по крайней мере из трех биологических реплик в каждой когорте.
    1. Чтобы устранить события, вызванные аденовирусным вектором или экспрессией eGFP, а не потерей Erbb4, выделяют РНК из трех биологических реплик P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Клетки Erbb4fl/fl MPNST трансдуцируются Ad5CMV-Cre/eGFP и три биологических реплики трансдуцируются Ad5CMV-eGFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированная РНК должна иметь показатель целостности РНК (RIN) ≥ 8 для анализа РНК-Seq. Убедитесь, что ядро виртуализации определяет RIN всех образцов перед созданием библиотек.
  2. Используйте 100-200 нг высококачественной общей РНК из каждого образца для подготовки библиотек RNA-Seq (работа с основным средством секвенирования для этого этапа). Выполняйте высокопроизводительное секвенирование с помощью секвенатора ДНК следующего поколения. Для количественного определения мРНК выполните несимметричное секвенирование для генерации файлов Fastq. Обеспечьте минимум 50 миллионов операций чтения для каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схему, иллюстрирующую рабочий процесс, используемый для обработки данных RNA-Seq и количественной оценки выражения дифференциально выраженных транскриптов, см. рисунок 3 . Данные последовательности в виде файлов Fastq подвергаются процедурам контроля качества; >80% показаний должны давать оценку Phred 30, чтобы считаться подходящей для последующего анализа. Последовательности также предварительно обрабатываются (обрезаются) с использованием Trimmomatic18 для удаления последовательностей адаптеров и фильтрации низкокачественных считываний.
  3. Выполните выравнивание и анализ RNA-Seq на файлах, сгенерированных fastq, с помощью любого программного обеспечения (например, DNAStar19,20 или Partek21). Выполните действия для конкретной программы, используя настройки по умолчанию, чтобы выровнять файлы fastq с эталонным геномом мыши (GRCm38/mm10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя DNAStar в качестве примера, общий рабочий процесс описан ниже (дополнительный рисунок 1).
    1. Выберите метод анализа, RNA-Seq.
    2. Выберите эталонный геном Mouse.
    3. Загрузите файл BED, если он предоставлен ядром виртуализации.
    4. Загрузите файлы секвенирования fastq, присвоив им уникальные имена реплик.
    5. Групповая репликация файлов fastq и назначение их в набор реплицированных данных (например, GFP, CRE)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая программа выравнивания имеет свои конкретные шаги, и пользователь должен проконсультироваться с руководством пользователя программы для протокола для конкретной программы. Затем программа будет генерировать генные необработанные данные о количестве из этих файлов Fastq.
  4. Выполните статистический анализ и анализ нормализации (DESeq2, EdgeR) необработанных данных подсчета с помощью любых программных программ, как описано в 4.3, с набором образцов Ad5CMV-eGFP в качестве набора контрольных данных и Ad5CMV-Cre в качестве набора тестовых данных для идентификации дифференциальных сигналов экспрессии генов с надежной статистической мощностью22,23.
    1. Выберите файлы GFP fastq в качестве набора данных элемента управления.
    2. Выберите DESeq2 в качестве статистического метода и метода нормализации.
    3. Начните сборку и анализ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая программа выравнивания имеет свои конкретные шаги, и пользователь должен проконсультироваться с руководством пользователя программы для протокола для конкретной программы. Затем программа будет генерировать генные необработанные данные о количестве из этих файлов Fastq. Статистический анализ и анализ нормализации является встроенным шагом во многих программах, как показано в примере здесь, в рамках протокола выравнивания последовательностей. Если используется альтернативное программное обеспечение для выравнивания последовательностей, которое не предлагает этот последующий встроенный шаг, выполните статистический и нормализованный анализ необработанных данных подсчета на терминальном уровне с использованием пакетов кодирования DESeq2 или EdgeR, написанных на R, свободно доступных для загрузки на Bioconductor.org.
  5. Используйте эти подходы для выявления изменений, представляющих собой по меньшей мере 1,5-кратное увеличение или уменьшение относительно контроля (в данном случае клетки трансдуцируются вирусом Ad5CMV-eGFP). Используйте только те дифференциально экспрессированные гены (DEG), которые признаны статистически значимыми, которые показывают изменения ≥1,5 раза и p-значение 0,05 или padj 0,1 для последующего анализа функционального обогащения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это сгенерирует список генов DEG и их статистическую мощность для анализа функционального обогащения.
  6. Выполните анализ функционального обогащения на статистически значимом Erbb4-опосредованном DEG, идентифицированном в 4.4, с файлом ранжированного списка генов, используя любой из свободно доступных веб-инструментов. Определить биологическую и pathway значимость потери гена Erbb4 с помощью наборов данных генной онтологии, интегрированных в эти инструменты анализа функционального обогащения с открытым доступом 24,25,26,27 (см. Таблицу материалов для примеров и Рисунок 3 для примера рабочего процесса с использованием Panther).
    1. Экспортируйте данные, полученные на шаге 4.4, в виде электронной таблицы.
    2. Ранжируйте данные по изменению log2 fold, значению p/padj или по обоим параметрам.
    3. Обязательно удалите все статистически значимые данные.
    4. Экспортируйте ранжированный список генов с идентификатором гена только в виде файла .txt и загрузите его на веб-сайт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только статистически значимый DEG (значения p/padj < 0,05 или 0,1 соответственно) для создания ранжированного списка входных генов с использованием изменений log2 fold (от самого высокого к самому низкому), p/padj-значений (от самого низкого к самому высокому) или обоих [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Существует несколько подходов к созданию ранжированного списка генов, который эмпирически определяется для набора данных и задаваемого вопроса. Используемый конкретный тип инструмента анализа функционального обогащения также может помочь в определении соответствующего типа ранжированного списка генов. Дополнительные ресурсы по RNA-Seq см. в следующих статьях 28,29,30.

5. Ортотопическое аллотрансплантатирование клеток MPNST с абляционными аллелями Erbb4 и анализ эффектов абляции Erbb4

  1. Прежде чем выполнять ортотопическую аллотрансплантацию отсортированных клеток MPNST, убедитесь, что все процедуры рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию, и что все процедуры выполняются должным образом обученным персоналом.
  2. В день инъекции удалите клетки с низким проходом (приблизительно 85% конфюлюзии) из пластин или колб клеточной культуры с помощью неферментативного раствора для диссоциации клеток (например, смеси хелаторов; см. Таблицу материалов) и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Для ортотопических инъекций в седалищный нерв восстановите клетки на 16 667 клеток / мл (50 000 клеток на 3 мкл для каждого животного) в DMEM-1031. Держите клетки на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые культуры не будут успешно создавать трансплантаты, если клетки не будут введены в базальную мембранную матрицу с низким фактором роста. Потребность в базальной мембранной матрице (10-50%) должна быть определена эмпирически.
  3. Оценить потенциал роста аллотрансплантата in vivo в постинфицированных клетках путем введения клеток MPNST в седалищный нерв 8-10 анестезированных Hsd: Athymic Nude-Foxn1nu мышей на когорту (в возрасте 4-8 недель). Для ортотопической инъекции опухолевых клеток обратитесь к Turk et al31. Здесь демонстрируется подкожная инъекция.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить количество экспериментальных животных, необходимых для статистической значимости, проконсультируйтесь с биостатистиком или рекомендуется использовать G*Power3, свободно доступное программное обеспечение32.
  4. Внимательно следите за животными два раза в день в течение первой недели после инъекции на наличие любых признаков боли. После этого контролируйте привитых мышей три раза в неделю для измерений суппорта и оценивайте показатели состояния тела (BCS), как описано ранее 5,31. Как указано в руководящих принципах IACUC, усыпляйте животных с BCS 2 или менее.
  5. Поскольку привитые клетки растут с разной скоростью, определите время трансплантата эмпирически, используя контрольные (немодифицированные) клетки, прежде чем выполнять эксперименты, описанные в этом разделе. Чтобы собрать трансплантаты в экспериментальной конечной точке, усыпьте мышей гуманно, используя вдыхание углекислого газа с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичной меры. Запишите окончательные измерения объема и массы каждого трансплантата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В виде немодифицированного P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Клетки Erbb4fl / fl MPNST обычно достигают максимального размера, разрешенного IACUC в течение 30-45 дней, типичная временная шкала составляет около 30-45 дней после инъекции.
  6. Изолируют и срезают ткань, как описано в шагах 1.6-1.8. Зафиксируйте часть ткани трансплантата на ночь в 4% параформальдегиде (рисунок 2), а затем встройте его в парафин. Подготовьте 5 мкм срезов из ткани FFPE и установите их на слайды. Выполните окрашивание H&E и другие необходимые иммуноокрашивания, чтобы подтвердить, что ткань трансплантата состоит из опухолевых клеток, как описано в 1.8.1. Заморозьте остальную часть опухолевой ткани для последующего анализа, такого как проверка потери экспрессии Erbb4 и оценка влияния потери Erbb4 на экспрессию других членов семьи Erbb .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждение опухолевых клеток в ткани трансплантата должно быть сделано, потому что иммунодефицитные мыши склонны к развитию новообразований. В случае небольших трансплантатов важно следить за тем, чтобы рубцовая ткань или воспаление не были ошибочно приняты за новообразование.
    1. Выполните стандартное окрашивание IHC на ткани FFPE для сравнения экспрессии белков, представляющих интерес в аллотрансплантатах, полученных из клеток, обработанных Ad5CMV-eGFP и Ad5CMV-Cre / eGFP. Окрашивание иссеченной ткани трансплантата с использованием erbB4-специфических антител для подтверждения различий в экспрессии in vivo erbB4 между двумя экспериментальными условиями. Определение пролиферативного индекса с помощью окрашивания Ki67 и уровня апоптоза с помощью терминального дезоксинуклеотидилтрансферазно-опосредованного dUTP маркировки конца (TUNEL) окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любая интересующая белковая мишень также может быть оценена с помощью IHC. Например, оценить плотность сосудов путем иммуноокрашивания аллотрансплантатов антителом против CD31 (разведение 1:50) для определения различий в микроокружении сосудов in vivo, опосредованных абляцией генов. Количество сосудистых профилей на поле 40x может быть подсчитано для количественной оценки. Для этих анализов на основе IHC следуйте стандартным протоколам IHC для процедур окрашивания и протоколу производителя для окрашивания TUNEL. Для количественной оценки изображений используйте плагин ImageJ «Автоматический подсчет одноцветного изображения».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Фиг.4 иллюстрирует типичный результат, полученный при преобразователе P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Клетки Erbb4fl/fl MPNST с аденовирусом Ad5CMV-eGFP или аденовирусом Ad5CMV-Cre/eGFP (рисунок 4A). Культуры рассматриваются с помощью флуоресцентной микроскопии для идентификации eGFP-экспрессирующих клеток и с помощью фазово-контрастной микроскопии для определения общего количества клеток, присутствующих в одном поле в 10x (вверху) и 40x (внизу). При желании можно рассчитать процент клеток, экспрессирующих eGFP. Репрезентативные выходные данные СУИМ показаны на дополнительном рисунке S2. После FACS процент клеток, экспрессирующих eGFP, будет заметно увеличен, причем практически все клетки в каждом поле экспрессируют eGFP. Типичными результатами генотипирования ПЦР, ожидаемыми после cre-опосредованной абляции гена, в зависимости от эффективности трансфекции, являются полный нокаут гена (100% эффективность) или гетерогенная популяция индуцированных и неиндукционных клеток (эффективность <100%) по сравнению с результатами контрольной трансдукции (только GFP, fl / fl) (Рисунок 4B). Рисунок 4C иллюстрирует характерную гистопатологию, обнаруженную у ортотопических аллотрансплантатов P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Erbb4fl/fl MPNST по сравнению с опухолями, полученными из оригинальных моделей животных GEM.

В этих экспериментах абляция Erbb4 приводила к снижению клеточной пролиферации и клеточной плотности in vitro и in vivo, увеличению индексов маркировки TUNEL in vivo и снижению плотности сосудов in vivo. На рисунке 5 показаны репрезентативные результаты, полученные с помощью автоматизированного цитометра на основе изображений, показывающего снижение клеточной пролиферации в абляционных клетках Ad5CMV-Cre по сравнению с контрольными трансдуцированными клетками Ad5CMV-GFP (рисунок 5A); эти эксперименты проводились с культивируемыми клетками раннего прохождения. Экспрессия ErbB4 с помощью иммуногистохимии в P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Клетки Erbb4fl/fl MPNST, трансдуцированные вирусом Ad5CMV-Cre или eGFP, уменьшались в результирующих аллотрансплантатах Ad5CMV-Cre по сравнению с контрольными опухолями аллотрансплантата Ad5CMV-eGFP (рисунок 5B). Плотность сосудов оценивали с помощью иммунореактивности для обнаружения CD31; можно увидеть, что плотность сосудов заметно снижается в аллотрансплантатах трансдуцированных клеток Ad5CMV-Cre (рисунок 5C). При желании интенсивность сигнала может быть количественно определена с помощью ImageJ.

Figure 1
Рисунок 1: Расчет квадрата Пуннета соотношений ожидаемых генотипов при генерации и скрещивании P 0-GGFβ3; Trp53+/- мыши с Erbb4fl/fl мышей (F1). Пуннетовые квадратные расчеты соотношений ожидаемых генотипов при генерации и поддержании P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Erbb4fl/+ друг с другом (F2). Аббревиатура: fl = Floxed. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Рабочий процесс процесса, используемого для абляции флокированных аллелей Erbb4 в культурах раннего прохождения клеток MPNST, полученных из P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Erbb4fl/fl мыши. (A) Собрать опухоль, экспрессирующую ген флоксированной. (B) Создание культур раннего пассажа из иссеченной опухоли. (C) Инфицировать культуры раннего прохождения для удаления флоксированного гена и выполнения последующих анализов. Сокращения: MPNST = злокачественная опухоль оболочки периферического нерва; IHC = иммуногистохимия; PFA = параформальдегид; FFPE = Формалин-фиксированный парафин-встроенный; H&E = гематоксилин и эозин; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; GFP = зеленый флуоресцентный белок; K/O = нокаут; ПЦР = полимеразная цепная реакция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Схема, иллюстрирующая рабочий процесс RNA-Seq. Рабочий процесс используется для идентификации дифференциально экспрессированных транскриптов между контрольной (GFP-индуцированной) и Erbb4-нулевой (Cre-индуцированной) клетками и результирующей биологической значимости. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; RNA-Seq = секвенирование РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты эффективности трансдукции, оцененные с помощью микроскопии в P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Ячейки Erbb4fl/fl MPNST. (A) Клетки, трансдуцированные либо аденовирусом Ad5CMV-eGFP, либо аденовирусом Ad5CMV-Cre/eGFP. (B) Результаты ПЦР потенциальных популяций генов после инфекции Ad5CMV. (C) Характерная гистопатология, сравнивающая опухоли, генерируемые в исходных моделях GEM, с ортотопически аллотрансплантированной P 0-GGFβ3; Трп53-/+; Ячейки Erbb4fl/fl MPNST через окрашивание H&E. Снимки были сделаны в 40x. Для контрольного окрашивания использовались отрицательные контрольные антитела, соответствующие изотипу. Шкала стержней = 400 мкм (А, верхняя панель); 100 мкм (A, нижняя панель), 20 мкм (C). Сокращения: MPNST = злокачественная опухоль оболочки периферического нерва; GFP = зеленый флуоресцентный белок; BF = яркое поле; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; Neg Ctrl = отрицательный контроль; ПЦР = полимеразная цепная реакция; GEM = генетически модифицированная мышь; fl = floxed. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные результаты, полученные в культивируемых культурах раннего прохождения MPNST и ортотопически аллотрансплантированных клетках MPNST после трансдукции либо Ad5CMV-eGFP, либо Ad5CMV-Cre/eGFP. (A) Анализ пролиферации культивируемых клеток MPNST, демонстрирующий снижение клеточной плотности в клетках, трансдуцированных Ad5CMV-Cre/eGFP, по сравнению с трансдуцированными Ad5CMV-eGFP. Количественные данные отображаются на графиках по дням 1, 3 и 5 (слева). Справа показаны снимки слияния 1-го и 5-го дней, сделанные на автоматическом цитометре на основе изображений (изображения, сделанные с 4-кратным увеличением с помощью микроскопии яркого поля). Полосы ошибок представляют собой стандартную погрешность среднего значения (SEM) по меньшей мере 3 различных независимых экспериментов. (B) Репрезентативное окрашивание ErbB4 в опухолях аллотрансплантата, трансдуцированных Ad5CMV-eGFP или Ad5CMV-Cre/eGFP аденовирусом, взятым при 20-кратном увеличении. Красный канал (Alexa 564, CD31), синий канал (Hoechst, ядра). (C) Репрезентативные изображения плотности сосудов в аллотрансплантатах P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Клетки Erbb4fl/fl MPNST трансдуцируются ad5CMV-eGFP по сравнению с вирусом Ad5CMV-Cre/eGFP. Снимки были сделаны в 40x. Для контрольного окрашивания использовались отрицательные контрольные антитела, соответствующие изотипу. Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: MPNST = злокачественная опухоль оболочки периферического нерва; eGFP = усиленный зеленый флуоресцентный белок; IgG = иммуноглобулин G; NEG = отрицательный контроль; CD = кластер дифференциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Схема, иллюстрирующая рабочий процесс выравнивания и анализа последовательностей. Рабочий процесс, используемый в DNAStar для выравнивания и анализа файлов секвенирования РНК (файлов fastq). Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; RNA-Seq = секвенирование РНК., DEG = дифференциально экспрессированные гены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Репрезентативные данные FACS из культур раннего прохождения с использованием зеленого флуоресцентного белка. (A) GFP-экспрессирующие клетки сортируются FACS после установки параметров флуоресцентного затвора от неинфицированных клеток. (B) После установки соответствующего детекторного затвора GFP-положительные (трансдуцированные) клетки отделяются от GFP-отрицательных (нетрансдуцированных) клеток. Сокращения: SSC-A = боковая площадь рассеяния пика; FSC-H = прямая высота рассеяния пика; FSC-W = прямая ширина рассеяния пика; GFP = зеленый флуоресцентный белок; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Подробные методы, представленные здесь, были разработаны с использованием gem модели MPNST. Однако, если интересующая опухолевая ткань может быть рассеяна в отдельных клетках, эти методологии легко адаптируются для различных типов опухолей, возникающих в GEMs. Важно убедиться, что флокированный аллель не приводит к i) снижению выживаемости, что может затруднить получение достаточного количества мышей для скрининга опухолей, или ii) увеличению латентности опухоли, что может затруднить получение достаточного количества опухоленосных мышей. Если флоксированный аллель не влияет на выживаемость, выживаемость обеих когорт будет эквивалентной. Если он не влияет на латентность опухоли, эквивалентное количество опухоленосных мышей должно возникнуть в обеих когортах с одинаковым временным течением.

Аналогичные подходы были использованы для изучения нейрофибром и MPNST с использованием условных нокаутов и тамоксифен-индуцируемых животных Cre для получения индуцируемых условных нокаутирующих животных33,34. Разница между этими и этим, помимо использования тамоксифена для индукции Cre, как обсуждалось ранее, заключается в том, что эти исследования сосредоточены на развитии опухоли с тканеспецифическим нокаутом NF1. Поскольку в этом исследовании и в этих других исследованиях также используются опухоли, генерируемые GEMM, разница заключается в задаваемом вопросе. В этом протоколе мы не изучаем роль, которую потеря NF1 играет в патогенезе MPNST, а вместо этого изучаем роль, которую конкретный ген (Erbb4) в MPNST, генерируемых GEMM, оказывает на рост опухоли in vivo, что в противном случае было бы невозможно из-за эмбриональной летальности. Кроме того, этот протокол позволяет избежать использования тамоксифена для тех подходов, которые требуют таких параметров.

Другие изучали установленные клеточные линии MPNST человека в моделях ксенотрансплантатов35. Это исследование отличается от этого тем, что используемые трансплантатированные клетки являются хорошо изученными, но высокопроходимыми клеточными линиями MPNST человека, и оно фокусируется на установлении ответов на лекарства в ксенотрансплантатах. Эти исследователи не изучают роль конкретного гена в этих клетках MPNST для роста in vivo и влияние потери генов на реакцию на лекарства. Другое исследование, похожее на это, было выполнено Dodd et al., используя аденовирус Cre рекомбиназу (Ad-Cre) -опосредованную потерю NF1 во временной и пространственной зависимости, опять же мощный метод расширения трансляционных усилий MPNST36. Исследование было сосредоточено на роли потери NF1 и Ink4a / Arf, двух очень часто совместно удаленных генов в человеческих MPNST, в седалищном нерве путем инъекции Ad-Cre. P 0-GGFβ3; Трп53+/-; Мыши Erbb4fl/fl, описанные в этом исследовании, могут быть использованы таким образом путем введения Ad-Cre в линии предшественников клеток Шванна. Тем не менее, вопросы, задаваемые в этом исследовании, сосредоточены не на эволюционной роли Erbb4 в инициировании MPNST, а на том, как MPNST могут использовать сигнализацию Erbb4 для преимущества роста опухоли.

Существуют альтернативы описанному здесь подходу, включая снижение экспрессии генов через РНК-интерференцию (RNAi) или инактивацию гена, представляющего интерес, с помощью CRISPR в линиях раковых клеток человека. Эти альтернативные подходы ценны и могут сочетаться с абляцией генов в клетках, полученных из опухолей GEM, чтобы убедиться, что эффекты, наблюдаемые в опухолевых клетках мыши, повторяются у их человеческих аналогов. Тем не менее, есть некоторые явные преимущества методологии, описанной здесь. Во-первых, генетическая абляция флоксированных генов в раковых клетках GEM происходит быстро и приводит к полной инактивации целевого гена. Напротив, часто отмечается, что использование коротких РНК приводит лишь к частичному снижению экспрессии генов. Хотя CRISPR может производить полную инактивацию генов, идентификация клонов, которые имеют полную инактивацию, требует длительного процесса отбора.

Кроме того, необходимо исследовать несколько клонов, чтобы убедиться, что эффекты, полученные в результате абляции CRISPR, не различаются между различными клонами. Во-вторых, способность абляции флокированных аллелей в ранних опухолевых культурах GEM является предпочтительной, поскольку это сводит к минимуму возможность отбора для отдельных субпопуляций опухолевых клеток, которые эффективно растут в культуре. Для сравнения, клеточные линии человека, которые обычно поддерживались в культуре в течение многих лет, часто происходят из различных субпопуляций, которые хорошо приспособлены для культуры и часто подвергаются генетическому дрейфу во время этого процесса. Это приводит к тому, что эти клеточные линии развивают новые мутации, которые не присутствовали в их родительской опухоли. Наконец, хотя трансплантация опухолевых клеток GEM мышам с иммунодефицитом описана в этой рукописи, отмечается, что опухолевые клетки GEM, полученные из опухолей, возникающих в инбредных штаммах мышей, могут быть аллотрансплантированы мышам того же штамма. Это позволило бы исследователю оценить биологию опухоли у животных с интактной иммунной системой в присутствии или отсутствии целевого гена.

Критическим шагом в описанном здесь протоколе является абляция флоксированного гена Ad5CMV-Cre/eGFP и обеспечение выживания опухолевых клеток после абляции генов и FACS. Поскольку это процесс, который зависит от способности cre recombinase абляции флоксированного гена, он потенциально подвержен некоторым из тех же проблем, которые могут возникнуть при абляции флоксированного гена in vivo; эти проблемы будут проявляться в виде неполной абляции целевого аллеля. Обратите внимание, что способность очищать клетки, которые были успешно трансдуцированы аденовирусным вектором, экспрессирующим eGFP, по-видимому, сводит к минимуму мозаицизм по сравнению с абляцией гена in vivo с CreERT2. Однако в случае целевых генов, кодирующих белки, такие как ErbB4, которые экспрессируются на поверхности клетки, может быть возможно дополнительно обеспечить потерю целевого гена, выполнив FACS, используя как eGFP, так и антитело, распознающее интересующий белок (т. Е. Сортировать eGFP-положительные / erbB4-отрицательные клетки).

Поскольку, как было отмечено во введении, многие из белков, терапевтически нацеленных моноклональными антителами, являются белками клеточной поверхности, этот подход часто должен быть осуществимым. Следует также отметить, что важно позволить опухолевым клеткам восстановиться в течение как минимум 2-3 дней после FACS, если на них должна быть выполнена РНК-Seq для оценки эффекта, который абляция генов оказала на транскриптом. Наборы данных RNA-Seq, полученные очень скоро после FACS, часто показывают большую вариабельность экспрессии генов между биологическими репликациями в некоторых типах клеток. Это может быть следствием травмы, которую клетки получают при прохождении FACS; следовательно, клеткам должен быть предоставлен период восстановления после этого процесса. Наборы данных RNA-Seq могут быть проанализированы с использованием DESeq2, который использует отрицательное биномиальное распределение и оценщик усадки для дисперсии распределения. В этих анализах образцы сортируются в соответствии с их q-значением, которое является наименьшим коэффициентом ложного обнаружения (FDR), при котором изменения в уровнях транскриптов значительны; FDR рассчитываются с использованием процедуры множественной корректировки тестирования Бенджамини-Хохберга. В качестве альтернативы, DEG могут быть идентифицированы с помощью другого доступного программного обеспечения, способного к рабочим процессам анализа RNA-Seq.

Для этой модели MPNST на животных идентификация экспериментальной конечной точки требует понимания естественной истории новообразований в используемой животной модели. Естественная история MPNST в этом GEM была определена путем выживания серии из 44 P 0-GGFβ3 мышей6 и 19 P0-GGFβ3; Trp53+/- мыши7, а затем выполнили полную некропсию на всех этих животных, когда они достигли конечной точки выживания. Типичное время выживания и место, где обычно возникали MPNST, были определены в каждой модели животного. У большинства этих мышей MPNST возникали в тройничном нерве. MPNST, возникающие в тройничном нерве, обычно вызывали птоз, связанный с помутнением роговицы (результат проблем с распределением разрыва, вызванных птозом), что обеспечило клинически полезный признак для идентификации опухоленосных мышей. Диагноз опухоли должен быть подтвержден путем выполнения окрашиваний H &E и нескольких дополнительных диагностических пятен (S100β, nestin Sox 10, H & E, Mart1) с последующим обследованием квалифицированным ветеринаром или патологоанатомом человека. Это также важно, потому что нулевой аллель Trp53 в этой модели предрасполагает мышей к развитию других новообразований, таких как лимфомы, и эти опухоли необходимо отличать от MPNST.

Наконец, эта методология имеет несколько потенциальных применений, которые еще не изучены, но могут быть осуществимы в будущих исследованиях. Например, неурегулин 1 (NRG1), лиганд, который активирует как erbB3, так и erbB4, способствует миграции клеток MPNST хемотаксическим образом; как erbB3, так и erbB4 расположены в инвадоподиях клетокMPNST 37. Однако неясно, опосредует ли erbB3 или erbB4 хемотаксический ответ на NRG1. Следовательно, ячейки, в которых erbB4 удаляется с помощью этой методологии, могут быть использованы для решения этого вопроса. Естественным продолжением этих экспериментов является оценка того, требуется ли erbB4 для метастазирования, используя широко используемый подход, при котором опухолевые клетки вводятся через хвостовую вену, и затем оценивается количество легочных метастазов. Эта методология предлагает явное преимущество перед другими подходами, такими как использование шРНК для снижения экспрессии erbB4 , потому что экспрессия шРНК часто заглушается в клетках через некоторое время. Кроме того, ожидается, что культуры раннего прохождения будут содержать смесь субпопуляций, полученных из опухолей, включая субпопуляции клеток, склонных к метастазированию. Выполнение анализов метастазирования с клетками, подготовленными с использованием методологии, описанной здесь, позволит оценить метастатический потенциал, который является более репрезентативным для родительской опухоли, чем установленная клеточная линия. Это, конечно, лишь один пример будущих приложений, которые могут использовать эту методологию. Мы надеемся, что другие исследователи объединят эту методологию с проблемами, представляющими особый интерес, чтобы повысить способность идентифицировать белки, которые являются ключевыми терапевтическими целями при раке человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национального института неврологических заболеваний и инсульта (R01 NS048353, R01 NS109655), Национального института рака (R01 CA122804), Министерства обороны (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 и W81XWH-15-1-0193) и Фонда детских опухолей (2014-04-001 и 2015-05-007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ad5CMV-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody Thermo/Fisher GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics Bioconductor http://www.bioconductor.org alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31 Abcam ab28364
Celigo Image Cytometer Nexcelom Bioscience N/A
Cell Stripper Corning 25-056-Cl mixture of chelators
DAB staining kit Vector Labs MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) DAVID https://david.ncifcrf.gov functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM Corning 15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) Thermo/Fisher EP0701 and K1072
erbB4 antibodies Santa Cruz sc-284
erbB4 antibodies Abcam ab35374
erbB4 antibodies Millipore HFR1: 05-1133
FACS Sorter BD Biosciences Aria II
Forskolin Sigma F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources GenomeSpace https://genomespace.org/support/tools/ general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine Corning 25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool Gorilla N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis Broad Institute N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice Envigo (Previously Harlan Labs) 69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) Illumina Hi Seq 2500 DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis DNAStar LaserGene software N/A software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly software alignment used for step 4.3 N/A software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix Corning 354230
NRG1-beta In house Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342 Thermo 62249
Panther Gene Ontology Classification System Panther http://pantherdb.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer) Partek, Ver 7 N/A software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep Corning 30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

 Eurofins Genomics Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine Fisher 51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays R&D Systems ARY003B
Real time glo Promega G9712 bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite ToppGene https://toppgene.cchmc.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) Invitrogen 15596026
Tyramide Signal Amplification Kit Perkin Elmer NEL721001EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
  2. Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
  3. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
  4. Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
  5. Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
  6. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  7. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
  8. Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
  9. Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
  10. Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
  11. Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
  12. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  13. Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
  14. Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
  15. Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
  16. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  17. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  18. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  19. Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
  20. Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
  21. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  23. Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
  24. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  25. Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
  26. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  27. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  28. Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
  29. Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
  30. Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
  31. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
  32. Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
  33. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  34. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
  35. Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
  36. Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
  37. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).

Tags

Исследования рака Выпуск 174 Генетически модифицированные мыши саркома Cre-экспрессирующий аденовирус проточная цитометрия анализы выживаемости анализы пролиферации ксенотрансплантатация РНК-Seq эмбриональный смертельный нокаут
Определение функций генов в опухолевом генезе путем <em>абляции Ex vivo</em> флоксированных аллелей в злокачественных опухолевых клетках оболочки периферических нервов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Longo, J. F., Brosius, S. N.,… More

Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells. J. Vis. Exp. (174), e62740, doi:10.3791/62740 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter