Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra gen knockouts som är embryonala dödliga in vivo i genetiskt modifierade musmodell-härledda tumörer och sedan bedöma effekten som knockouten har på tumörtillväxt, proliferation, överlevnad, migration, invasion och transkriptomet in vitro och in vivo.
Abstract
Utvecklingen av nya läkemedel som exakt riktar sig mot nyckelproteiner i mänskliga cancerformer förändrar cancerbehandlingar i grunden. Men innan dessa läkemedel kan användas måste deras målproteiner valideras som terapeutiska mål i specifika cancertyper. Denna validering utförs ofta genom att slå ut genen som kodar för det terapeutiska målet i en genetiskt modifierad musmodell (GEM) av cancer och bestämma vilken effekt detta har på tumörtillväxt. Tyvärr begränsar tekniska problem som embryonal dödlighet i konventionella knockouts och mosaicism i villkorliga knockouts ofta detta tillvägagångssätt. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades ett tillvägagångssätt för att bränna en floxerad embryonal dödlig gen av intresse för kortvariga kulturer av maligna perifera nervhöljestumörer (MPNST) som genereras i en GEM-modell.
Denna uppsats beskriver hur man etablerar en musmodell med lämplig genotyp, härleder kortvariga tumörkulturer från dessa djur och sedan ablaterar den floxerade embryonala dödliga genen med hjälp av en adenoviral vektor som uttrycker Cre-rekombinas och förbättrat grönt fluorescerande protein (eGFP). Rening av celler transducerade med adenovirus med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och kvantifieringen av de effekter som genablation utövar på cellulär proliferation, livskraft, transkriptom och ortotopisk allografttillväxt beskrivs sedan. Dessa metoder ger ett effektivt och generaliserbart tillvägagångssätt för att identifiera och validera terapeutiska mål in vitro och in vivo. Dessa tillvägagångssätt ger också en förnybar källa till tumörderiverade celler med låg passage med reducerade in vitro-tillväxtartefakter. Detta gör att den riktade genens biologiska roll kan studeras i olika biologiska processer såsom migration, invasion, metastasering och intercellulär kommunikation medierad av sekretomet.
Introduction
Före de senaste två decennierna förlitade sig behandlingen av mänskliga cancerformer starkt på strålbehandling och kemoterapeutiska medel som i stort sett riktade sig mot snabbt spridande cellulära populationer genom att skada DNA eller hämma DNA-syntesen. Även om dessa tillvägagångssätt hämmade cancercellstillväxt, hade de också skadliga biverkningar på normala snabbt spridande celltyper såsom tarmepitelceller och hårsäcksceller. På senare tid har cancerbehandling börjat använda kemoterapeutiska medel som exakt riktar sig mot proteiner inom signalvägar som är kritiskt viktiga för tillväxten av en enskild patients neoplasma. Detta tillvägagångssätt, vanligtvis kallat "Precision Medicine", har lett till utvecklingen av en ständigt växande repertoar av monoklonala antikroppar och små molekylära hämmare. Dessa medel hämmar effektivt tumörcellsproliferation och överlevnad samtidigt som de skadliga biverkningarna på normala celltyper som ses med konventionella kemoterapeutiska medel och strålbehandling undviks. Monoklonala antikroppar som används för behandling av humana cancerformer riktar sig oftast mot cellytemolekyler såsom tillväxtfaktorreceptorer1 (t.ex. den stora familjen av membranspännande receptortyrosinkinaser) och immunsvarsmodulatorer2 (t.ex. programmerat celldödsprotein 1, programmerad dödsligand 1). Småmolekylära hämmare kan hämma antingen cellyteproteiner eller signalproteiner som ligger intracellulärt3. För att effektivt kunna använda dessa nya terapeutiska medel måste det dock fastställas att en viss cancer är beroende av den molekyl som riktas mot ett terapeutiskt kandidatmedel.
Även om dessa nya terapeutiska medel har mer fokuserade effekter, hämmar många av dem fortfarande verkan av mer än ett protein. Dessutom är flera medel med varierande effektivitet och specificitet ofta tillgängliga för att rikta in sig på ett specifikt protein. Under prekliniska undersökningar är det därför klokt att använda ytterligare metoder såsom genetisk ablation för att validera ett kandidatprotein som ett terapeutiskt mål. Ett särskilt användbart tillvägagångssätt för att validera ett protein som ett terapeutiskt mål är att ablatera genen som kodar för kandidatproteinet i en genetiskt konstruerad djurmodell som utvecklar den specifika cancertypen av intresse. Detta tillvägagångssätt kan vara relativt enkelt om möss med en nollmutation (antingen en naturlig mutation, en genetiskt konstruerad nollmutation [en "knockout"] eller en nollmutation introducerad av en genfälla) är tillgängliga och mössen är livskraftiga i vuxen ålder. Tyvärr är möss med en nollmutation som uppfyller dessa kriterier ofta inte tillgängliga, vanligtvis eftersom nollmutationen resulterar i död embryonalt eller under de första dagarna av postnatalt liv. Under denna omständighet kan möss som är benägna att utveckla tumörtypen av intresse istället korsas till möss där viktiga segment av genen av intresse flankeras av loxP-platser ("floxed"), vilket gör att genen kan brännas genom att införa en transgen som uttrycker Cre-rekombinas i tumörcellerna (en villkorlig knockout). Detta tillvägagångssätt ger flera fördelar. För det första, om en Cre-drivrutin är tillgänglig som uttrycks i tumören men inte i celltypen som ledde till döden i konventionella knockouts, kan detta tillvägagångssätt potentiellt validera det terapeutiska målet för kandidaten. För det andra, ablating av genen som kodar för kandidatproteinet i tumörceller men inte i andra intratumorala element såsom tumörassocierade fibroblaster eller immunceller gör det möjligt för utredaren att skilja mellan cellautonoma och icke-cellautonoma effekter av det terapeutiska målet. Slutligen tillåter en tamoxifeninducerbar Cre-drivrutin (CreERT2) utredaren att radera genen av intresse i olika stadier i tumörutveckling och definiera det fönster där kandidaten terapeutiskt medel sannolikt kommer att vara effektivt.
Tyvärr finns det också tekniska problem som kan begränsa användningen av villkorliga knockouts i tumörer som uppstår i GEM-modeller. Till exempel kanske en Cre-drivrutin som uttrycks i tumörceller och undviker genradering i normala celler som är väsentliga för livet inte är tillgänglig. En annan fråga, som kan underskattas, är att Cre- och CreERT2-drivrutiner ofta varierar floxerade alleler hos möss, vilket resulterar i mosaik för nollmutationen i en GEM-cancer. När detta inträffar kommer tumörceller där den riktade genen inte har bränts att fortsätta att sprida sig snabbt och överväxa tumörcellerna med bräkta alleler. Mosaicism i Cre-drivlinjer kan uppstå på grund av icke-allestädes närvarande Cre-uttryck i den riktade härstamningen och genom misslyckad rekombination i enskilda celler oberoende av Cre-uttryck4. Detta är ett känt fenomen av Cre-drivrutiner som är beroende av celltyp och bör beaktas vid experimentell design och datatolkning. Mosaicism kan maskera effekten av knockouten och leda till att en utredare felaktigt drar slutsatsen att genen av intresse inte är nödvändig för tumörcellsproliferation och / eller överlevnad och därmed inte är ett giltigt terapeutiskt mål.
Flera av dessa problem uppstod i en tidigare studie som försökte avgöra om receptortyrosinkinasen erbB4 var ett potentiellt terapeutiskt mål i MPNST-celler5. I dessa studier användes möss som uttrycker en transgen som kodar för neuregulin-1 (NRG1) isoform glialtillväxtfaktor-β3 (GGFβ3) under kontroll av Schwann-cellspecifika myelinprotein nollpromotor (P 0-GGFβ3-möss). P 0-GGFβ3-möss utvecklar flera plexiforma neurofibrom som utvecklas till att bli MPNST via en process som rekapitulerar processerna för neurofibrompatogenes och plexiform neurofibrom-MPNST-progression som ses hos patienter med det autosomala dominerande tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1)6. När den korsas till möss med en Trp53-nollmutation, den resulterande P 0-GGFβ3; Trp53+/- möss utvecklar MPNST de novo som ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- möss.
Dessa MPNSTs rekapitulerar utvecklingen från Världshälsoorganisationens (WHO) grad II till WHO grad IV-lesioner som ses hos människor7. Hos P 0-GGFβ3-möss uppstår MPNST inom redan existerande plexiforma neurofibrom i trigeminusnerven (58%) och spinal dorsala nervrötter (68%)7; MPNST som uppstår i P 0-GGFβ3; Trp53+/- möss har en mycket liknande fördelning. Hos människor uppstår MPNSTs oftast i ischiasnerven följt av brachial plexus, spinal nervrötter, vagus, femoral, median, sakral plexus, popliteal obturator och bakre tibial- och ulnarnerver8. Denna tumörfördelning i dessa GEM-modeller skiljer sig något från vad som ses hos människor. Emellertid de MPNSTs som uppstår i P 0-GGFβ3 och P0-GGFβ3; Trp53 +/- möss är histologiskt identiska med humana MPNST, bär många av samma mutationer som ses hos humana MPNST och rekapitulerar processen för neurofibrom-MPNST-progression som ses hos NF1-patienter. Genereringen av P 0-GGFβ3 eller P0-GGFβ3; Trp53+/- möss som var Erbb4-/- var inte genomförbara eftersom möss med två Erbb4 null-alleler dör i livmodern vid embryonal dag 10,5 sekundärt till hjärtfel9. Eftersom att rädda Erbb4-uttryck i hjärtat genom att införa en hjärtspecifik Erbb4-transgen (α-myosin tung kedja (MHC) -Erbb4) resulterar i livskraftiga Erbb4-/- möss10, generationen möss med en komplicerad P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotyp försöktes.
Parningarna producerade emellertid inte möss i de förväntade mendeliska förhållandena, vilket indikerar att den önskade genotypen var skadlig. Därför genereringen av P 0-GGFβ3; Trp53+/- möss med floxerade Erbb4-alleler 11 och en CreERT2-drivrutin försökte tillåta radering av Erbb4 i MPNST:erna som uppstod hos dessa möss. Hos dessa djur var många tumörceller med intakta Erbb4-alleler fortfarande närvarande (mosaicism). Den observerade mosaiken kan bero på ineffektiv tamoxifenleverans, vilket resulterade i skillnader i rekombinationseffektivitet i vävnaden. Möjligheten till spontana kompensationsmekanismer kan ytterligare bidra till mosaicism vid tamoxifenmedierad rekombination genom att kringgå kravet på Erbb4-uttryck. Det är möjligt att förlusten av Trp53 gör tumörceller mottagliga för ytterligare spontana "tillåtna" mutationer som kan förvirra tolkningen av data. Eftersom det verkade troligt att De Erbb4-intakta MPNST-cellerna skulle maskera konsekvenserna av att bränna Erbb4 i andra tumörceller, övergavs detta tillvägagångssätt.
Dessa hinder ledde till utvecklingen av en metod för att bränna Erbb4 i mycket tidiga passage MPNST-celler med hjälp av ett adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas och eGFP. Dessa celler kan separeras från icke-infekterade celler med hjälp av FACS, vilket markant minskar mosaicismen för den brända Erbb4-genen . Nedan beskrivs de metoder som används för att uppnå detta, tillsammans med de metoder som används för att bedöma effekterna av genablation in vitro och in vivo. Följande protokoll är ett exempel på hur man producerar tumörbärande möss som ger tumörer som bär floxerade alleler av embryonala dödliga gener av intresse för ex vivo excision före in vivo allograft tumörtillväxtbedömning. Detta inkluderar en beskrivning av de metoder som används för att analysera effekten som Erbb4-ablation utövar på tumörcellsproliferation, överlevnad och genuttryck in vitro och proliferation, överlevnad och angiogenes i ortotopiska allografter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Innan du utför några procedurer med möss måste alla procedurer granskas och godkännas av institutional animal care and use committee. Protokollet som beskrivs i detta manuskript godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Medical University of South Carolina. Detta protokoll utfördes av korrekt utbildad personal enligt MUSC: s riktlinjer för institutionell djurvård.
1. Generation av möss som utvecklar MPNSTs homozygota för Erbb4 flox-alleler
- Producera F1-generationen av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ djur genom parning av P 0-GGFβ3; Trp53+/- möss7 med Erbb4fl/fl möss11. Använd en Punnett-kvadrat (figur 1) för att styra avelssystemet för att säkerställa att tillräckligt många manliga och kvinnliga F1-valpar genereras med önskad P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ genotyp.
- Genotyp F1-avkomma genom att isolera genomiskt DNA från en svansklipp som samlats in i enlighet med IACUC-riktlinjer och sedan utföra PCR med hjälp av tidigare beskrivnaprimers för att detektera P 0-GGFβ3-transgenen12, Trp53 vildtyp (+) och noll (-) alleler7 och Erbb4flox och Erbb4 vildtypsalleler13.
- Isolera svans-DNA med metoder som beskrivs på jacks-lab.mit.edu/protocols.
- Låt PCR-reaktionen blandas med 25 ng DNA, 0,25 nM dNTP, 0,02 U / μL Taq, 0,5 μM av varje primer och 1x PCR-buffert. Utföra PCR-reaktion med en enda 95 °C inkubation (för att smälta det genomiska DNA:t och aktivera Taq) i 1 min följt av 35 PCR-cykler på 94 °C, 10 s (smältning). 55 °C, 30 s (glödgning). 72 °C, 40 s (förlängning) följt av en enda 72 °C (förlängning) i 5 min. Förvara reaktionerna vid 4 °C tills de är klara att köras på en 1,2-1,5% agarosgel.
OBS: Glödgningstemperaturen beror på vilket PCR-buffertsystem som används; Att utföra en glödgningstemperaturgradient för att bestämma rätt glödgningstemperatur rekommenderas.
- Producera F2-generationen av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl-djur genom parning av lämplig F1-avkomma (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) med varandra.
OBS: Figur 1 illustrerar Punnet-kvadratförutsägelserna som används för att beräkna det förväntade antalet F2-avkommor med önskad genotyp. - Identifiera djur med önskad P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl-genotyp enligt beskrivningen i steg 1.2.
- Mate F2 avkomma till varandra för att upprätthålla P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl koloni och genotyp alla valpar. Bekräfta att den nyligen introducerade floxerade allelen inte äventyrar överlevnad eller tumörlatens. Uppnå detta genom att etablera kohorter (20 möss/kohort) av P 0-GGFβ3; Trp53+/- och P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl möss och följ deras överlevnad och frekvens av tumörförekomst.
- Övervaka djur flera gånger per vecka tills det experimentella effektmåttet har uppnåtts (maximal tillåten tumörstorlek/humant effektmått godkänt av IACUC).
- Under veckoövervakningen, bedöma kroppsvikt, normalt socialt och grooming beteende och tumörstorleksmätningar. Ordna veterinärbedömning vid viktminskning på >10% av kroppsvikt, social avskildhet och hunching.
- När en tumörbärande mus identifieras och har nått sin humana slutpunkt, avliva djuret humant med koldioxidinhalation följt av cervikal dislokation och ta bort tumören sterilt med en skalpellkniv. Ta tumörmätningar genom att mäta längd, bredd och djup med hjälp av en bromsok och vikttumör (massa och volym). Arbeta snabbt för att undvika autolys.
- Dela tumören i tre sektioner med hjälp av brödlimpa med en skalpellkniv under sterila förhållanden för att generera vävnadssegment för formalinfixering / paraffininbäddning (FFPE), tidig passagekulturgenerering och blixtfryst material (Figur 2A).
- Se till att avsnitt 1 (för tidig passagekulturgenerering, steg 1.7.2) är cirka 10% av den totala tumörvolymen, avsnitt 2 (för fixering och IHC, steg 1.7.3) är 70% av den totala tumörvolymen och avsnitt 3 (för blixtfrysning, steg 1.7.4) är 20% av den totala tumörvolymen.
- Ta avsnitt 1 av tumören för beredning av tidiga passagekulturer (se nedan).
- Fixera sektion 2 av tumören i 4% paraformaldehyd över natten vid 4 °C och bädda sedan in i paraffin (formalinfixerad paraffininbäddad (FFPE) för diagnostisk workup.
- Blixtfrysningsavsnitt 3 för analytiska analyser (t.ex. immunoblots för att verifiera att protein som kodas av den riktade floxerade genen uttrycks på lämpligt sätt).
- Fläck 5 μm tjocka FFPE-vävnadssektioner med hematoxylin och eosin (H&E) för att bekräfta tumördiagnosen av en kvalificerad patolog. Om lämpligt, utför immunohistokemisk färgning (IHC) för att bekräfta tumördiagnosen.
- Immunostain MPNSTs för S100 kalciumbindande protein B (S100β), nestin och könsbestämmande region Y (SRY) -Box transkriptionsfaktor 10 (Sox10) -tre markörer som uttrycks i både MPNST och Schwann-celler (tumörcellens ursprung)5,6,14,15. Färga tumörerna med antikroppar som känner igen erbB4, proteinet som kodas av genen som är inriktad på ablation i nedströms steg.
- För att bekräfta diagnosen, låt en kvalificerad veterinär eller mänsklig patolog bedöma alla färgade tumörglas enligt WHO: s diagnostiska och betygskriterier 5,6,7,16.
2. Ex vivo-ablation av floxerade Erbb4-alleler i MPNST-celler
- Upprätta tidiga passagekulturer från nyligen insamlad MPNST-vävnad genom att placera vävnaden från avsnitt 1 (steg 1.7.3) i 10 ml iskall steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is och sedan överföra den till ett sterilt arbetsområde (figur 2B)16.
OBS: Alla efterföljande procedurer ska utföras i en steril vävnadsodlingshuv. - Hacka tumörvävnaden i 2-4 mm bitar och triturera 8-10 gånger i en 10 cm2 behandlad vävnadsodlingsskål med 10 ml tillväxtmedium. Odla dessa preparat i dmem-10-tillväxtmedium med hög glukoshalt (Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) innehållande 10% fetalt kalvserum, 1% glutamin, 10 μg/ml streptomycin och 10 IE/ml penicillin) kompletterat med 10 nM neuregulin-1β (NRG1β) och 2 μM forskolin. Lägg till forskolin i detta skede för att hämma tillväxten av vanliga förorenande celltyper såsom fibroblaster.
- Håll den mekaniskt dissocierade vävnaden och cellerna i upp till 3 dagar vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär för att etablera en tidig passagekultur. Separera inte dispergerade celler och återstående vävnadsfragment vid denna tidpunkt.
- Uppdatera kulturerna med nytt medium var 3-4: e dag. Låt tumörcellerna föröka sig tills de är sammanflytande.
- Expandera de tidiga passagekulturerna genom att dela upp de sammanflytande kulturerna i flera rätter. Ta bort tillväxtmediet och tvätta cellerna med 1x dPBS. Tillsätt sedan 1 ml 0,25% trypsin i 2-5 min vid rumstemperatur per 10 cm2 behandlad cellodlingsskål. Triturera försiktigt kulturen för att underlätta lossning och generera en encellssuspension.
- Avsluta trypsiniseringen genom att tillsätta 2 ml DMEM-10 tillväxtmedium. Samla upp den trypsiniserade cellblandningen och överför den till ett 5 ml sterilt centrifugrör. Pelletera cellerna genom centrifugering i 5 min vid 500 × g vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellpelleten i 5 ml DMEM-10. Dela cellerna i två till fyra 10 cm cellodlingsrätter, var och en innehållande 10 ml tillväxtmedia (cirka 1 × 106 celler per skål).
- Efter 5 passager (upprepande steg i 2.5), använd tillväxtmedium utan NRG1β och forskolin. Immunostain ett prov av kulturen med en anti-S100β-antikropp för att verifiera att kulturen enbart består av tumörceller. Behåll cellerna i DMEM-10 tillväxtmedium i alla efterföljande passager.
- Vid nästa passage, räkna cellerna och frys ner en del av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler som samlats in från sammanflytande kulturer (3 × 106 celler/injektionsflaska).
- Platta P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST-celler med tidig passage med en densitet av 1,5 × 106 celler per 10 cm behandlad cellodlingsskål i DMEM-10 tillväxtmedium.
- Dag 0: (Cirka 12-16 timmar efter plätering), tvätta de vidhäftande kulturerna med 2-4 ml dPBS och infektera med Ad5CMV-Cre / eGFP eller Ad5CMV-eGFP vid cirka 400 plackbildande enheter (pfu) / cell i 10 ml serumfri DMEM (dvs. 30 μL av 2 × 1010 pfu virus per 10 cm skål). Ablatera de floxerade Erbb4-allelerna med användning av adenoviruset vid den maximalt tolererade viruskoncentrationen (multiplicitet av infektion, MOI), som bestäms empiriskt. Se bild 2C för ett schema över arbetsflödet för den här ablationen.
- Dag 1: Cirka 16 timmar senare räddar du kulturerna genom att tillsätta 10 ml DMEM-10 till infektionscocktailen.
- Dag 2 - 3: FACS sorterar infekterade celler enligt det rekommenderade protokollet från kärnanläggningen för att sortera eGFP-positiva celler cirka 48 timmar efter infektion. Innan FACS-sortering, kontrollera kort celler för eGFP-signal på ett fluorescensmikroskop för att säkerställa att kulturerna har infekterats effektivt (~ 50-100% positiva celler). Returnera celler som återvunnits efter FACS till 10 cm vävnadsodlingsrätter; reservera en maträtt för genomisk DNA-isolering.
- Dag 4 - 5: Efter FACS-sortering, låt cellerna återhämta sig i en vävnadsodlingsinkubator i minst 24-48 timmar och förbered sedan cellerna för in vitro-cellbaserade analyser eller in vivo-ympning . Bekräfta Erbb4-radering via PCR med hjälp av genomiskt DNA isolerat från en del av de sorterade eGFP-positiva cellerna. Kontrollera att eGFP-positiva celler är ErbB4-negativa genom PCR eller genom att immunfärga ett prov av kulturen med en anti-erbB4-antikropp.
- Isolera genomiskt DNA från cellerna med hjälp av standard syra-guanidinium-fenol och kloroformbaserad DNA-isoleringsmetod17.
- Utför standard PCR för att skilja floxerade Erbb4-alleler och ablated Erbb4-alleler . Utför 40 cykler med 2 ng DNA, 20 μM primers 1 + 2 för att producera en 250 bp Erbb4-null-produkt och en 350 bp floxad produkt13. Utför både PCR- och antikroppsbaserade metoder för att bekräfta knockout när inga tillförlitliga antikroppar finns tillgängliga.
OBS: Cellerna är redo för in vitro-cellbaserade analyser enligt beskrivningen nedan. Många typer av nedströmsanalyser kan utföras med celler framställda på detta sätt. Syftet med protokollen som presenteras nedan är att ge några exempel på in vitro- och in vivo-tillämpningar av dessa tumörceller efter ablation av Erbb4-genen .
3. Proliferations- och viabilitetsanalyser i MPNST-celler med brända Erbb4-alleler
- Utför spridningsanalyser under de kommande sju dagarna på sorterade MPNST-celler pläterade i en flerbrunnsplatta med hjälp av en bildbaserad automatiserad cytometer.
- Dag 6: Platta 2 000 celler per brunn i en slutlig volym på 150 μL (~ 13 300 celler / ml) tillväxtmedium i en 96-brunnsplatta. Utför mätningar i tre exemplar för varje experimentell kohort och 4 dagliga slutpunktsläsningar (3 replikat x 2 förhållanden x 4 dagar).
-
Dag 7, 9, 11, 13: Färga celler med Hoechst- och propidiumjodidfärger (PI) och avbilda dem på en automatiserad plattläsare för att räkna antalet levande och döda celler i varje brunn. För att uppnå detta, färga samtidigt cellerna med Hoechst-färgämne för att färga kärnorna i både levande och döda celler och med propidiumjodid (PI) för att märka de döda cellerna. Utför alla läsningar vid samma tidpunkt varje dag eller varannan dag.
- Tillsätt 50 μl av en 4x PI/Hoechst-färgningslösning (4 μg/ml vardera) till varje brunn som kvantifierats den dagen (t.ex. endast dag 7) och inkubera i 30 minuter vid 37 °C i vävnadsodlingsinkubatorn. Håll plattan skyddad från ljus.
OBS: Färgningskoncentrationen av Hoechst måste bestämmas empiriskt och kan sträcka sig från 1 till 10 μg / ml beroende på celltyp. - Läs de färgade brunnarna efter inkubation med lämplig fluorescerande kanal på den automatiserade cellbildaren. Efter läsning, returnera plattan till inkubatorn för framtida läsningar på efterföljande dagar (dvs dag 9, 11, 13).
- Kvantifiera färgningsintensiteterna baserat på det bildsystem som används och beräkna antalet döda celler, levande celler och totala celler med hjälp av följande inställningar: blå kanal (377/50 nm, Hoechst): totalt antal celler (levande och döda); Röd kanal (531/40 nm, PI): endast döda celler. blå - röd (totalt - död) = levande celler.
- Tillsätt 50 μl av en 4x PI/Hoechst-färgningslösning (4 μg/ml vardera) till varje brunn som kvantifierats den dagen (t.ex. endast dag 7) och inkubera i 30 minuter vid 37 °C i vävnadsodlingsinkubatorn. Håll plattan skyddad från ljus.
- Utför cellviabilitetsanalysen under tre dagar, om så önskas, enligt analystillverkarnas protokoll.
OBS: Viabilitetsanalyser kan kombineras med proliferationsanalyser genom att utföra en trippel fläck inklusive kalcein AM (488/32 nm; grön kanal, specifikt etiketter levande celler), PI och Hoechst. En apoptosanalys kan också utföras med hjälp av kulturer som är inställda enligt beskrivningen ovan; det specifika protokollet beror på bildsystemet.- Dag 6: Platta 4 000 celler per brunn i en slutlig volym på 150 μL i en 96-brunnsplatta i tre exemplar.
- Dag 7 - 9: Tillsätt 2 000x bioluminescerande cellviabilitetsanalysreagenser (materialtabell), återför plattan till inkubatorn och läs plattan 1 h senare. Utför efterföljande läsningar vid samma tidpunkt varje dag. För bioluminescens (MTT) -analyserna, utför analysen exakt som beskrivs i tillverkarens instruktioner var 24: e timme i 72 timmar med hjälp av en luminometerplattaläsare.
4. RNA-Seq-analyser och identifiering av gener vars uttryck förändras av Erbb4-förlust
- Dag 6: Isolera totalt RNA från sorterade MPNST-celler med hjälp av standard syra-guanidinium-fenol och kloroformbaserade metoder. För experiment utformade för att detektera förändringar i mRNA-nivåer mellan två kohorter, förbered totalt RNA från minst tre biologiska replikat i varje kohort.
- För att eliminera händelser orsakade av adenoviral vektor eller eGFP-uttryck snarare än Erbb4-förlust, isolera RNA från tre biologiska replikat av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler transducerade med Ad5CMV-Cre/eGFP och tre biologiska replikat transducerade med Ad5CMV-eGFP.
OBS: Isolerat RNA måste ha ett RNA-integritetsnummer (RIN) ≥ 8 för RNA-Seq-analys. Se till att sekvenseringskärnan bestämmer RIN för alla exempel innan du skapar bibliotek.
- För att eliminera händelser orsakade av adenoviral vektor eller eGFP-uttryck snarare än Erbb4-förlust, isolera RNA från tre biologiska replikat av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler transducerade med Ad5CMV-Cre/eGFP och tre biologiska replikat transducerade med Ad5CMV-eGFP.
- Använd 100-200 ng högkvalitativt totalt RNA från varje prov för att förbereda RNA-Seq-bibliotek (arbeta med kärnsekvenseringsanläggningen för detta steg). Utför sekvensering med hög genomströmning med hjälp av nästa generations DNA-sekvenserare. För mRNA-kvantifiering utför du enkelsekvensering för att generera Fastq-filer. Se till att minst 50 miljoner läsningar för varje prov.
OBS: Se figur 3 för ett schema som illustrerar arbetsflödet som används för att bearbeta RNA-Seq-data och för att kvantifiera uttrycket av differentiellt uttryckta transkript. Sekvensdata, i form av Fastq-filer, utsätts för kvalitetskontrollprocedurer; >80% av läsningarna bör ge en Phred-poäng på 30 för att anses vara lämplig för efterföljande analys. Sekvenserna är också förbearbetade (trimmade) med Trimmomatic18 för att ta bort adaptersekvenser och filtrera bort läsningar av låg kvalitet. - Utför RNA-Seq-justering och analys på de fastq-genererade filerna med hjälp av alla kapabla program (t.ex. DNAStar19,20 eller Partek21). Följ de programspecifika stegen med standardinställningarna för att justera fastq-filerna till musens referensgenom (GRCm38/mm10).
OBS: Med DNAStar som exempel beskrivs det allmänna arbetsflödet nedan (kompletterande figur 1).- Välj analysmetod, RNA-Seq.
- Välj referensgenomet, Mus.
- Ladda upp BED-filen om den tillhandahålls av sekvenseringskärnan.
- Ladda upp fastq-sekvenseringsfilerna och tilldela dem unika repliknamn.
- Gruppreplikera fastq-filerna och ange dem till en replikatuppsättning (dvs . GFP, CRE)
OBS: Varje justeringsprogram har sina specifika steg, och användaren måste konsultera programmets användarhandbok för det programspecifika protokollet. Programmet kommer sedan att generera genspecifika råräkningsdata från dessa Fastq-filer.
- Utföra statistisk analys och normaliseringsanalys (DESeq2, EdgeR) på råräkningsdata med hjälp av alla kapabla program, som beskrivs i 4.3, med Ad5CMV-eGFP-provuppsättningen som kontrolldatauppsättning och Ad5CMV-Cre-uppsättning som testdatauppsättning för att identifiera differentiella genuttryckssignaler med robust statistisk effekt22,23.
- Välj GFP fastq-filer som kontrolldatauppsättning.
- Välj DESeq2 som statistik- och normaliseringsmetod.
- Starta montering och analys.
OBS: Varje justeringsprogram har sina specifika steg, och användaren måste konsultera programmets användarhandbok för det programspecifika protokollet. Programmet kommer sedan att generera genspecifika råräkningsdata från dessa Fastq-filer. Den statistiska analysen och normaliseringsanalysen är ett inbyggt steg i många program, som visas i exemplet här, inom sekvensjusteringsprotokollet. Om ett alternativt program för sekvensjustering används som inte erbjuder detta efterföljande inbyggda steg, utför den statistiska analysen och normaliseringsanalysen på råräkningsdata på terminalnivå med hjälp av DESeq2- eller EdgeR-kodningspaketen skrivna i R, fritt tillgängliga för nedladdning på Bioconductor.org.
- Använd dessa metoder för att identifiera förändringar som representerar minst en 1,5-faldig ökning eller minskning i förhållande till kontrollen (i detta fall celler som transduceras med Ad5CMV-eGFP-viruset). Använd endast de differentiellt uttryckta gener (DEG) som fastställts vara statistiskt signifikanta som visar ≥1,5-faldiga förändringar och ett p-värde 0,05 eller en padj på 0,1 för efterföljande funktionell anrikningsanalys.
OBS: Detta kommer att generera en lista över DEG-gener och deras statistiska kraft för funktionell anrikningsanalys. - Utföra funktionell anrikningsanalys på statistiskt signifikant Erbb4-medierad DEG identifierad i 4.4 med en rankad genlistfil med hjälp av något av de fritt tillgängliga webbaserade verktygen. Bestäm biologisk och vägbetydelse av Erbb4-genförlust genom genontologidatauppsättningar integrerade i dessa öppna funktionella anrikningsanalysverktyg 24,25,26,27 (se materialtabellen för exempel och figur 3 för ett exempel på arbetsflöde med Panther).
- Exportera data som erhölls i steg 4.4 som ett kalkylblad.
- Rangordna data efter log2-viksändring, p/padj-värde eller båda.
- Var noga med att ta bort alla icke-statistiskt signifikanta data.
- Exportera den rankade genlistan med gen-ID endast som en .txt fil och ladda upp den till webbplatsen.
OBS: Använd endast statistiskt signifikant DEG (p/padj-värden < 0,05 respektive 0,1) för att generera en rangordnad indatagenlista med log2-vikändringar (högsta till lägsta), p/padj-värden (lägsta till högsta) eller båda [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Det finns flera metoder för att generera en rankad genlista och bestäms empiriskt för datasetet och frågan som ställs. Den specifika typen av analysverktyg för funktionell anrikning som används kan också hjälpa till att bestämma lämplig typ av ranggenlista. För ytterligare resurser om RNA-Seq, se följande artiklar 28,29,30.
5. Ortotopisk allografering av MPNST-celler med bräkta Erbb4-alleler och analys av effekterna av Erbb4-ablation
- Innan du utför ortotopisk allografering av sorterade MPNST-celler, se till att alla procedurer granskas och godkänns av institutional animal care and use committee, och att alla procedurer utförs av välutbildad personal.
- På injektionsdagen, ta bort celler med låg passage (cirka 85% sammanflöde) från cellodlingsplattor eller kolvar med hjälp av en icke-enzymatisk celldissociationslösning (t.ex. en blandning av kelatorer; se materialtabellen) och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. För ortotopiska injektioner i ischiasnerven, rekonstituera cellerna vid 16 667 celler/ml (50 000 celler per 3 μl för varje djur) i DMEM-1031. Håll cellerna på is.
OBS: Vissa kulturer kommer inte att lyckas etablera transplantat om inte cellerna injiceras i källarmembranmatris med låg tillväxtfaktor. Kravet på en källarmembranmatris (10-50%) måste bestämmas empiriskt. - Bedöm in vivo allograft tillväxtpotential i postinfekterade celler genom att injicera MPNST-celler i ischiasnerven hos 8-10 bedövade Hsd: Arytmiska Nude-Foxn1 nu-möss per kohort (i åldern 4-8 veckor). För ortotopisk injektion av tumörceller, se Turk et al31. Här demonstreras en subkutan injektion.
OBS: För att bestämma antalet försöksdjur som behövs för statistisk signifikans, kontakta en biostatistiker eller det rekommenderas att använda G * Power3, en fritt tillgänglig programvara32. - Övervaka djuren noggrant två gånger dagligen under den första veckan efter injektionen för tecken på smärta. Därefter övervaka de ympade mössen tre gånger per vecka för bromsokmätningar och bedöma kroppstillståndspoäng (BCS) som tidigare beskrivits 5,31. Som beskrivs i IACUC:s riktlinjer, avliva djur med ett BCS på 2 eller mindre.
- När ympade celler växer i olika takt, bestäm transplantattider empiriskt med hjälp av kontrollceller (omodifierade) innan du utför experiment som beskrivs i detta avsnitt. För att samla transplantaten vid den experimentella slutpunkten, avliva mössen humant med koldioxidinhalation följt av cervikal dislokation som en sekundär åtgärd. Registrera de slutliga volym- och massmätningarna för varje transplantat.
OBS: Som omodifierad P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST-celler når vanligtvis den maximala storleken som tillåts av IACUC inom 30-45 dagar, en typisk tidslinje är cirka 30-45 dagar efter injektion. - Isolera och sektionera vävnad enligt beskrivningen i steg 1.6-1.8. Fixera en del av transplantatvävnaden över natten i 4% paraformaldehyd (figur 2) och bädda sedan in den i paraffin. Förbered 5 μm sektioner från FFPE-vävnaden och montera dem på bilder. Utför H&E-färgning och annan nödvändig immunfärgning för att bekräfta att transplantatvävnaden består av tumörceller enligt beskrivningen i 1.8.1. Snap-frys resten av tumörvävnaden för nedströmsanalyser, såsom validering av förlusten av Erbb4-uttryck och bedömning av effekterna av Erbb4-förlust på uttrycket av andra Erbb-familjemedlemmar .
OBS: Bekräftelse av tumörceller i transplantatvävnaden måste göras eftersom immunbristmöss är benägna att utveckla neoplasmer. När det gäller små transplantat är det viktigt att se till att ärrvävnad eller inflammation inte misstas för en neoplasma.- Utför standard IHC-färgning på FFPE-vävnaden för att jämföra uttrycket av proteiner av intresse i allografter odlade från Ad5CMV-eGFP och Ad5CMV-Cre / eGFP-behandlade celler. Färga den utskurna transplantatvävnaden med erbB4-specifika antikroppar för att bekräfta skillnader i in vivo erbB4-uttryck mellan de två experimentella förhållandena. Bestäm det proliferativa indexet via Ki67-färgning och nivån av apoptos via terminal deoxynucleotidyl transferase-medierad dUTP nick-end-märkning (TUNEL) färgning.
OBS: Alla proteinmål av intresse kan också bedömas via IHC. Till exempel bedöma vaskulär densitet genom att immunfärga allografter med en anti-CD31-antikropp (1:50 utspädning) för att bestämma in vivo vaskulära mikromiljöskillnader medierade av genablation. Antalet vaskulära profiler per 40x fält kan räknas för kvantifiering. För dessa IHC-baserade analyser, följ standard IHC-protokoll för färgningsprocedurer och tillverkarens protokoll för TUNEL-färgning. För kvantifiering av bilder använder du plugin-programmet ImageJ "automatisk räkning av enfärgad bild".
- Utför standard IHC-färgning på FFPE-vävnaden för att jämföra uttrycket av proteiner av intresse i allografter odlade från Ad5CMV-eGFP och Ad5CMV-Cre / eGFP-behandlade celler. Färga den utskurna transplantatvävnaden med erbB4-specifika antikroppar för att bekräfta skillnader i in vivo erbB4-uttryck mellan de två experimentella förhållandena. Bestäm det proliferativa indexet via Ki67-färgning och nivån av apoptos via terminal deoxynucleotidyl transferase-medierad dUTP nick-end-märkning (TUNEL) färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 illustrerar ett typiskt resultat som erhålls vid generering av P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl / fl MPNST-celler med antingen Ad5CMV-eGFP adenovirus eller Ad5CMV-Cre / eGFP adenovirus (Figur 4A). Kulturer ses med fluorescensmikroskopi för att identifiera eGFP-uttryckande celler och genom faskontrastmikroskopi för att bestämma det totala antalet celler som finns i samma fält vid 10x (överst) och 40x (botten). Procentandelen celler som uttrycker eGFP kan sedan beräknas om så önskas. Representativa FACS-utdata visas i kompletterande figur S2. Efter FACS kommer andelen eGFP-uttryckande celler att ökas markant, med praktiskt taget alla celler i varje fält som uttrycker eGFP. Typiska PCR-genotypningsresultat som förväntas efter krerelationsmedierad genablation, beroende på transfektionseffektiviteten, är fullständig gen knockout (100% effektivitet) eller en heterogen population av inducerade och oinducerade celler (<100% effektivitet) jämfört med kontrolltransduktionsresultat (endast GFP, fl / fl) (Figur 4B). Figur 4C illustrerar den karakteristiska histopatologin som finns i ortotopiska allografter av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl /fl MPNSTs jämfört med tumörerna härledda från de ursprungliga GEM-djurmodellerna.
I dessa experiment resulterade Erbb4-ablation i minskningar av cellulär proliferation och cellulär densitet in vitro och in vivo, ökningar av TUNEL-märkningsindex in vivo och minskad vaskulär densitet in vivo. Figur 5 illustrerar representativa resultat erhållna med en bildbaserad automatiserad cytometer som visar minskad cellulär proliferation i Ad5CMV-Cre ablated celler jämfört med kontroll Ad5CMV-GFP-transducerade celler (Figur 5A); dessa experiment utfördes med tidigt passage odlade celler. Uttryck av ErbB4 via immunohistokemi i P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl /fl MPNST-celler transducerade med Ad5CMV-Cre- eller eGFP-virus minskade i de resulterande Ad5CMV-Cre-transducerade allografterna jämfört med kontroll Ad5CMV-eGFP-behandlade allografttumörer (figur 5B). Vaskulär densitet bedömdes via immunoreaktivitetsdetektion för CD31; vaskulär densitet kan ses vara markant reducerad i allaografter av Ad5CMV-Cre-transducerade celler (Figur 5C). Signalintensiteten kan kvantifieras, om så önskas, med hjälp av ImageJ.
Figur 1: Punnet kvadratberäkningar av förhållandena mellan förväntade genotyper vid generering och korsning av P 0-GGFβ3; Trp53+/- möss med Erbb4fl/fl möss (F1). Punnet kvadratberäkningar av förhållandena för förväntade genotyper vid generering och underhåll av P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+ med varandra (F2). Förkortning: fl = Floxed. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Arbetsflöde för processenanvänds för att ablera floxerade Erbb4-alleler i tidiga passagekulturer av MPNST-celler härledda från P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl möss. (A) Skörda tumören som uttrycker den floxade genen. (B) Skapa tidiga passagekulturer från den utskurna tumören. (C) Infektera tidiga passagekulturer för att ablatera den floxerade genen och utföra nedströmsanalyser. Förkortningar: MPNST = malign perifer nervhölje tumör; IHC = Immunohistokemi; PFA = Paraformaldehyd; FFPE = Formalinfixerad paraffininbäddad; H&E = Hematoxylin och eosin; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; GFP = grönt fluorescerande protein; K/O = knockout; PCR = polymeraskedjereaktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Schematisk illustration av RNA-Seq-arbetsflödet. Arbetsflödet används för att identifiera differentiellt uttryckta transkript mellan kontrollceller (GFP-inducerade) och Erbb4-null (Cre-inducerade) celler och den resulterande biologiska betydelsen. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; RNA-Seq = RNA-sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa resultat av transduktionseffektivitet bedömda med mikroskopi i P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-celler. (A) Celler som transduceras med antingen Ad5CMV-eGFP adenovirus eller Ad5CMV-Cre / eGFP adenovirus. (B) PCR-resultat av potentiella genpopulationer efter Ad5CMV-infektion. (C) Karakteristisk histopatologi som jämför tumörerna som genereras i de ursprungliga GEM-modellerna med den ortotopiskt allograferade P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl / fl MPNST-celler via H&E-färgning. Bilderna togs vid 40x. Isotypmatchade negativa kontrollantikroppar användes för kontrollfärgning. Skalstänger = 400 μm (A, övre panel); 100 μm (A, nedre panelen), 20 μm (C). Förkortningar: MPNST = malign perifer nervhölje tumör; GFP = grönt fluorescerande protein; BF = ljusfält; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; Neg Ctrl = negativ kontroll; PCR = polymeraskedjereaktion; GEM = genetiskt konstruerad mus; fl = floxad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa resultat erhållna i odlade MPNST-tidiga passagekulturer och ortotopiskt allograferade MPNST-celler efter transduktion med antingen Ad5CMV-eGFP eller Ad5CMV-Cre / eGFP. (A) Proliferationsanalys av odlade MPNST-celler som visar minskad cellulär densitet i celler transducerade med Ad5CMV-Cre / eGFP jämfört med de som transduceras med Ad5CMV-eGFP. Kvantifierade data visas på dag 1, 3 och 5 (vänster). Dag 1 och dag 5 sammanflödesbilder tagna på den bildbaserade automatiska cytometern visas till höger (Bilder tagna med 4x förstoring med ljusfältsmikroskopi). Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM) för minst 3 olika oberoende experiment. (B) Representativ ErbB4-färgning i allografttumörer transducerade med Ad5CMV-eGFP eller Ad5CMV-Cre / eGFP adenovirus taget vid 20x förstoring. Röd kanal (Alexa 564, CD31), blå kanal (Hoechst, kärnor). (C) Representativa bilder av vaskulär densitet i allografter av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST-celler transducerade med Ad5CMV-eGFP kontra Ad5CMV-Cre / eGFP-virus. Bilderna togs vid 40x. Isotypmatchade negativa kontrollantikroppar användes för kontrollfärgning. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: MPNST = malign perifer nervhölje tumör; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; IgG = immunglobulin G; NEG = negativ kontroll; CD = kluster av differentiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: Schematisk illustration av ett arbetsflöde för sekvensjustering och analys. Arbetsflödet som används i DNAStar för att justera och analysera RNA-sekvenseringsfiler (fastq-filer). Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; RNA-Seq = RNA-sekvensering., DEG = differentiellt uttryckta gener. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Representativa FACS-data från tidiga passagekulturer med grönt fluorescerande protein. (A) GFP-uttryckande celler sorteras efter FACS efter inställning av fluorescerande grindparametrar från icke-infekterade celler. (B) När lämplig detektionsport har ställts in separeras GFP-positiva (transducerade) celler från GFP-negativa (icke-transducerade) celler. Förkortningar: SSC-A = sidospridningsarea av topp; FSC-H = toppens främre spridningshöjd; FSC-W = toppens främre spridningsbredd; GFP = grönt fluorescerande protein; FACS = Fluorescensaktiverad cellsortering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De detaljerade metoderna som presenteras här utvecklades med hjälp av en GEM-modell av MPNST: er. Men om tumörvävnaden av intresse kan spridas i enskilda celler, är dessa metoder lätt anpassningsbara för olika tumörtyper som uppstår i GEM. Det är viktigt att säkerställa att den floxerade allelen inte resulterar i i) minskad överlevnad som kan göra det svårt att få tillräckligt med möss för att screena för tumörer, eller ii) ökad tumörlatens som kan göra det svårt att få tillräckligt med tumörbärande möss. Om den floxerade allelen inte påverkar överlevnaden kommer överlevnaden för båda kohorterna att vara likvärdig. Om det inte har någon effekt på tumörlatens bör motsvarande antal tumörbärande möss uppstå i båda kohorterna med liknande tidsförlopp.
Liknande metoder har använts för att studera neurofibrom och MPNST med hjälp av villkorliga knockouts och tamoxifeninducerbara Cre-djur för att generera inducerbara villkorliga knockout-djur33,34. Skillnaden mellan dessa studier och den här, bortsett från användningen av tamoxifen för Cre-induktion som tidigare diskuterats, är att dessa studier fokuserar på tumörutveckling med en vävnadsspecifik knockout av NF1. Eftersom denna studie och dessa andra studier också använder GEMM-genererade tumörer ligger skillnaden i frågan som ställs. I detta protokoll studerar vi inte den roll som NF1-förlust spelar i MPNST-patogenes utan studerar istället den roll som en specifik gen (Erbb4) i GEMM-genererade MPNST utövar på in vivo tumörtillväxt, vilket annars skulle vara omöjligt på grund av att det är embryonalt dödligt. Dessutom undviker detta protokoll användning av tamoxifen för de metoder som kräver sådana parametrar.
Andra har studerat etablerade humana MPNST-cellinjer i xenograftmodeller35. Den studien skiljer sig från den här genom att de ympade cellerna som används är välstuderade men högpassage humana MPNST-cellinjer, och den fokuserar på att etablera läkemedelssvar hos xenografter. Dessa forskare studerar inte rollen av en specifik gen i dessa MPNST-celler för in vivo-tillväxt och effekterna av genförlust på läkemedelssvar. En annan studie som liknar den här utfördes av Dodd et al., med hjälp av adenovirus Cre-rekombinas (Ad-Cre) -medierad NF1-förlust på ett tidsmässigt och rumsligt beroende sätt, återigen en kraftfull metod för att utöka MPNST-translationella ansträngningar36. Studien fokuserade på rollen av NF1 och Ink4a / Arf-förlust, två mycket vanliga samraderade gener i humana MPNST, i ischiasnerven genom Ad-Cre-injektion. P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl-möss som beskrivs i denna studie kan användas på detta sätt genom att injicera Ad-Cre i Schwann-cellprekursorlinjer. Frågorna som ställs i denna studie är dock inte fokuserade på Erbb4s evolutionära roll vid MPNST-initiering utan på hur MPNST kan kapa Erbb4-signalering för tumörtillväxtfördel.
Det finns alternativ till det tillvägagångssätt som beskrivs här, inklusive att slå ner genuttryck via RNA-interferens (RNAi) eller inaktivera genen av intresse med CRISPR i mänskliga cancercellinjer. Dessa alternativa tillvägagångssätt är värdefulla och kan kombineras med genablation i celler härledda från GEM-tumörer för att verifiera att effekterna som observerats i mustumörceller rekapituleras i sina mänskliga motsvarigheter. Det finns dock några tydliga fördelar med den metod som beskrivs här. För det första är genetiskt ablating floxed gener i GEM cancerceller snabb och producerar fullständig inaktivering av den riktade genen. Däremot observeras det ofta att användningen av korta hårnåls-RNA endast resulterar i en partiell knockdown av genuttryck. Även om CRISPR kan producera fullständig geninaktivering, kräver identifieringen av kloner som har fullständig inaktivering en långvarig urvalsprocess.
Vidare måste flera kloner undersökas för att säkerställa att effekterna av CRISPR-ablation inte skiljer sig åt mellan olika kloner. För det andra är förmågan att ablera floxerade alleler i gem-tumörkulturer med tidig passage fördelaktig eftersom detta minimerar möjligheten att välja för distinkta tumörcellsunderpopulationer som växer effektivt i odling. I jämförelse härrör mänskliga cellinjer, som vanligtvis har bibehållits i odling i flera år, ofta från distinkta delpopulationer som är väl anpassade för odling och ofta genomgår genetisk drift under denna process. Detta resulterar i att dessa cellinjer utvecklar nya mutationer som inte fanns i deras modertumör. Slutligen, även om ympningen av GEM-tumörceller till immunbristmöss beskrivs i detta manuskript, noteras att GEM-tumörceller härrörande från tumörer som uppstår i inavlade musstammar kan allograferas till möss av samma stam. Detta skulle göra det möjligt för utredaren att bedöma tumörbiologi hos djur med ett intakt immunsystem i närvaro eller frånvaro av den riktade genen.
Det kritiska steget i protokollet som beskrivs här är ablationen av den floxerade genen med Ad5CMV-Cre / eGFP och säkerställer överlevnaden av tumörcellerna efter genablation och FACS. Eftersom detta är en process som är beroende av förmågan hos Cre-rekombinas att ablera den floxerade genen, är den potentiellt föremål för några av samma problem som kan uppstå vid ablating av en floxerad gen in vivo; dessa frågor skulle manifesteras som en ofullständig ablation av den riktade allelen. Observera att förmågan att rena celler som framgångsrikt har transducerats med den eGFP-uttryckande adenovirala vektorn verkar minimera mosaicism jämfört med in vivo-genablation med CreERT2. När det gäller riktade gener som kodar för proteiner, såsom ErbB4 som uttrycks på cellytan, kan det dock vara möjligt att ytterligare säkerställa förlusten av den riktade genen genom att utföra FACS med både eGFP och en antikropp som känner igen proteinet av intresse (dvs sortera de eGFP-positiva / erbB4-negativa cellerna).
Eftersom, som noterades i inledningen, många av de proteiner som riktas terapeutiskt av monoklonala antikroppar är cellyteproteiner, bör detta tillvägagångssätt ofta vara genomförbart. Det bör också noteras att det är viktigt att låta tumörcellerna återhämta sig i minst 2-3 dagar efter FACS om RNA-Seq ska utföras på dem för att bedöma effekten som genablation har haft på transkriptomet. RNA-Seq-dataset som erhållits mycket snart efter FACS visar ofta mer variation i genuttryck mellan biologiska replikat i vissa celltyper. Detta kan vara en följd av det trauma som celler lider av när de går igenom FACS; därför måste cellerna tillåtas en återhämtningsperiod efter denna process. RNA-Seq-dataset kan analyseras med hjälp av DESeq2, som använder den negativa binomialfördelningen och en krympningsberäknare för distributionens varians. I dessa analyser sorteras prover efter deras q-värde, vilket är den minsta falska upptäcktshastigheten (FDR) vid vilken förändringar i transkriptnivåer är signifikanta; FDR beräknas med hjälp av Benjamini-Hochbergs multipeltestjusteringsförfarande. Alternativt kan DEG identifieras med hjälp av annan tillgänglig programvara som kan RNA-Seq-analysarbetsflöden.
För denna MPNST-djurmodell kräver identifiering av den experimentella slutpunkten en förståelse för den naturliga historien om neoplasmerna i djurmodellen som används. Den naturliga historien om MPNSTs i denna GEM bestämdes genom att följa överlevnaden av en serie av 44 P 0-GGFβ3 möss6 och 19 P 0-GGFβ3; Trp53+/- möss7 och sedan utföra fullständiga obduktioner på alla dessa djur när de nådde sin överlevnadsslutpunkt. De typiska överlevnadstiderna och platsen där MPNST vanligtvis uppstod bestämdes i varje djurmodell. I de flesta av dessa möss uppstod MPNST i trigeminusnerven. MPNST som uppstår i trigeminusnerven producerade vanligtvis ptos associerad med hornhinnans grumlighet (ett resultat av problem med tårfördelning som produceras av ptos), vilket gav ett kliniskt användbart tecken för att identifiera tumörbärande möss. Tumördiagnos bör bekräftas genom att utföra H&E-fläckar och flera ytterligare diagnostiska fläckar (S100β, nestin Sox 10, H&E, Mart1) följt av en undersökning av en kvalificerad veterinär eller humanpatolog. Detta är också viktigt eftersom Trp53-nollallelen i denna modell predisponerar mössen för utvecklingen av andra neoplasmer såsom lymfom, och dessa tumörer måste särskiljas från MPNST.
Slutligen har denna metod flera potentiella tillämpningar som ännu inte utforskats men som kan vara genomförbara i framtida undersökningar. Till exempel främjar neuregulin 1 (NRG1), liganden som aktiverar både erbB3 och erbB4, migrationen av MPNST-celler på ett kemotaktiskt sätt; både erbB3 och erbB4 finns i invadopodierna hos MPNST-celler37. Det är emellertid inte klart om erbB3 eller erbB4 förmedlar det kemotaktiska svaret på NRG1. Följaktligen kan celler där erbB4 är ablated med denna metod användas för att ta itu med denna fråga. En naturlig uppföljning av dessa experiment är att bedöma om erbB4 krävs för metastasering med hjälp av det vanligt förekommande tillvägagångssättet där tumörceller injiceras via svansvenen och antalet lungmetastaser som sedan bedöms. Denna metod erbjuder en klar fördel jämfört med andra metoder, till exempel att använda shRNA för att slå ner erbB4-uttryck eftersom shRNA-uttryck ofta tystas i celler efter ett tag. Vidare förväntas tidiga passagekulturer innehålla en blandning av tumör-härledda subpopulationer, inklusive delpopulationer av celler som är benägna att metastasera. Att utföra metastaseringsanalyser med celler framställda med hjälp av den metod som beskrivs här kommer att möjliggöra en bedömning av metastatisk potential som är mer representativ för modertumören än en etablerad cellinje. Detta är naturligtvis bara ett exempel på framtida applikationer som kan använda denna metodik. Vi hoppas att andra utredare kommer att kombinera denna metodik med problem av särskilt intresse för att förbättra förmågan att identifiera proteiner som är viktiga terapeutiska mål i mänskliga cancerformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), National Cancer Institute (R01 CA122804), Försvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 och W81XWH-15-1-0193) och The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 och 2015-05-007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
References
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J.
- Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
- Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
- Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
- Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
- Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
- Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
- Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
- Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
- Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
- Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
- Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
- Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
- Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
- Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
- Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
- Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
- Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
- Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
