Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי אבלציה Ex vivo של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה

Published: August 25, 2021 doi: 10.3791/62740
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע נוקאאוטים של גנים שהם in vivo קטלניים עובריים בגידולים שמקורם במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ולאחר מכן מעריכים את ההשפעה שיש לנוקאאוט על צמיחת הגידול, התפשטותו, הישרדותו, הגירה, פלישה, והתעתיק in vitro ו- in vivo.

Abstract

פיתוח תרופות חדשות המכוונות במדויק לחלבונים מרכזיים בסרטן האדם משנה באופן יסודי את הטיפולים בסרטן. עם זאת, לפני שניתן יהיה להשתמש בתרופות אלה, חלבוני המטרה שלהן חייבים להיות מאומתים כמטרות טיפוליות בסוגי סרטן ספציפיים. אימות זה מבוצע לעתים קרובות על ידי דחיקת הגן המקודד את המטרה הטיפולית המועמדת במודל עכבר מהונדס גנטית (GEM) של סרטן וקביעת איזו השפעה יש לכך על צמיחת הגידול. למרבה הצער, סוגיות טכניות כמו קטלניות עוברית בנוקאאוטים קונבנציונליים ופסיפסיזם בנוקאאוטים מותנים מגבילים לעתים קרובות את הגישה הזו. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחה גישה לניצול גן קטלני עוברי מרופט בעל עניין בתרביות קצרות טווח של גידולי מעטפת עצבים היקפיים ממאירים (MPNSTs) שנוצרו במודל GEM.

מאמר זה מתאר כיצד לבסס מודל עכברים עם הגנוטיפ המתאים, להפיק תרביות גידול קצרות טווח מבעלי חיים אלה, ולאחר מכן להפוך את הגן הקטלני העוברי הפגום באמצעות וקטור אדנובירלי המבטא את Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP). לאחר מכן מפורט טיהור של תאים שעברו התמרה באמצעות אדנו-וירוס באמצעות מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה (FACS) וכימות ההשפעות שאבלציה גנטית מפעילה על התפשטות התאים, הכדאיות, השעתוק וצמיחת האלוגרפט האורתוטופי. מתודולוגיות אלה מספקות גישה יעילה וניתנת להכללה לזיהוי ואימות של מטרות טיפוליות במבחנה וב-in vivo. גישות אלה מספקות גם מקור מתחדש של תאים שמקורם בגידולים בעלי מעבר נמוך עם תוצרי גדילה מופחתים במבחנה . זה מאפשר לחקור את התפקיד הביולוגי של הגן הממוקד בתהליכים ביולוגיים מגוונים כמו הגירה, פלישה, גרורות ותקשורת בין-תאית המתווכת על ידי הסוד.

Introduction

לפני שני העשורים האחרונים, הטיפול בסרטן אנושי הסתמך במידה רבה על הקרנות וחומרים כימותרפיים שהתמקדו באופן נרחב באוכלוסיות תאיות המתרבות במהירות על ידי פגיעה בדנ"א או עיכוב סינתזת DNA. אף על פי שגישות אלה אכן עיכבו את צמיחת התאים הסרטניים, היו להן גם תופעות לוואי מזיקות על סוגי תאים נורמליים המתרבים במהירות, כגון תאי אפיתל במעיים ותאי זקיק שיער. לאחרונה, הטיפול בסרטן החל להשתמש בחומרים כימותרפיים המכוונים במדויק לחלבונים בתוך מסלולי איתות שהם בעלי חשיבות קריטית לצמיחת הניאופלזמה של המטופל הבודד. גישה זו, המכונה בדרך כלל "רפואה מדויקת", הובילה לפיתוח רפרטואר הולך ומתרחב של נוגדנים חד שבטיים ומעכבים מולקולריים קטנים. חומרים אלה מעכבים ביעילות את התפשטותם והישרדותם של תאי הגידול תוך הימנעות מתופעות הלוואי המזיקות על סוגי תאים תקינים הנראים בחומרים כימותרפיים קונבנציונליים ובהקרנות. נוגדנים חד-שבטיים המשמשים לטיפול בסרטן אנושי מתמקדים בדרך כלל במולקולות של פני השטח של התא, כגון קולטני גורם גדילה1 (למשל, המשפחה הגדולה של קולטן טירוזין קינאזות המשתרעות על פני ממברנה) ומודולטורים של תגובה חיסונית2 (למשל, חלבון מוות תאי מתוכנת 1, ליגנדת מוות מתוכנתת 1). מעכבים מולקולריים קטנים יכולים לעכב חלבונים על פני התא או חלבוני איתות הממוקמים בתוך התא3. עם זאת, כדי להשתמש ביעילות בחומרים טיפוליים חדשים אלה, יש לקבוע כי סרטן מסוים תלוי במולקולה הממוקדת על ידי סוכן טיפולי מועמד.

למרות שלסוכנים טיפוליים חדשים אלה יש השפעות ממוקדות יותר, רבים מהם עדיין מעכבים את פעולתו של יותר מחלבון אחד. בנוסף, סוכנים מרובים עם יעילות וספציפיות משתנות זמינים לעתים קרובות כדי להתמקד בחלבון מסוים. כתוצאה מכך, במהלך חקירות פרה-קליניות, כדאי להשתמש בגישות נוספות כגון אבלציה גנטית כדי לאמת חלבון מועמד כמטרה טיפולית. גישה שימושית במיוחד לאימות חלבון כמטרה טיפולית היא לנטרל את הגן המקודד את החלבון המועמד במודל חייתי מהונדס גנטית המפתח את סוג העניין הספציפי של הסרטן. גישה זו יכולה להיות פשוטה יחסית אם עכברים עם מוטציה אפסית (או מוטציה טבעית, מוטציה null מהונדסת גנטית ["נוקאאוט"], או מוטציה null שהוכנסה על ידי מלכודת גנים) זמינים, והעכברים הם בני קיימא לבגרות. למרבה הצער, עכברים עם מוטציה אפסית העונים על קריטריונים אלה לרוב אינם זמינים, בדרך כלל משום שמוטציית האפס גורמת למוות באופן עוברי או בימים הראשונים של החיים שלאחר הלידה. בנסיבות אלה, עכברים הנוטים לפתח את סוג העניין של הגידול עשויים במקום זאת להיות מוצלבים לעכברים שבהם מקטעים מרכזיים של הגן המעניין מוקפים על ידי אתרי loxP ("floxed"), מה שמאפשר לגן להיות אבלציה על ידי החדרת טרנסגן המבטא Cre רקומבינאז לתוך תאי הגידול (נוקאאוט מותנה). גישה זו מספקת מספר יתרונות. ראשית, אם קיים נהג Cre זמין המתבטא בגידול אך לא בסוג התא שהוביל למוות בנוקאאוטים קונבנציונליים, גישה זו יכולה לאמת את המטרה הטיפולית המועמדת. שנית, ניתוק הגן המקודד את החלבון המועמד בתאי הגידול, אך לא באלמנטים תוך-סרטניים אחרים כגון פיברובלסטים הקשורים לגידול או תאי חיסון, מאפשר לחוקר להבחין בין השפעות אוטונומיות של התאים לבין השפעות לא-אוטונומיות-תאיות של המטרה הטיפולית. לבסוף, נהג Cre (CreERT2) הניתן להשראה של טמוקסיפן מאפשר לחוקר למחוק את הגן המעניין בשלבים שונים בהתפתחות הגידול ולהגדיר את החלון שבו הסוכן הטיפולי המועמד הוא בעל הסבירות הגבוהה ביותר להיות יעיל.

למרבה הצער, יש גם בעיות טכניות שיכולות להגביל את השימוש בנוקאאוטים מותנים בגידולים הנובעים במודלים של GEM. לדוגמה, ייתכן שנהג Cre המתבטא בתאי הגידול ונמנע ממחיקת גנים בתאים תקינים החיוניים לחיים אינו זמין. בעיה נוספת, שניתן לזלזל בה, היא שנהגי Cre ו-CreERT2 לעתים קרובות מתבלים באופן משתנה אללים מרופטים בעכברים, וכתוצאה מכך נוצר פסיפס למוטציה האפסית בסרטן GEM. כאשר זה קורה, תאים סרטניים שבהם הגן הממוקד לא היה אבלציה ימשיכו להתרבות במהירות, להגדיל את תאי הגידול עם אללים אבלים. פסיפס בקווי הנהג של Cre יכול להתרחש עקב ביטוי Cre שאינו בכל מקום בשושלת הממוקדת ועל ידי רקומבינציה כושלת בתאים בודדים ללא תלות בביטוי Cre4. זוהי תופעה ידועה של נהגי Cre התלויה בסוג התא ויש לקחת אותה בחשבון במהלך תכנון הניסוי ופרשנות הנתונים. פסיפסיזם יכול להסוות את השפעת הנוקאאוט ולהוביל חוקר למסקנה שגויה כי הגן המעניין אינו חיוני להתרבות ו/או להישרדות של תאי הגידול ולכן אינו מטרה טיפולית תקפה.

כמה מהבעיות הללו נתקלו במחקר קודם שניסה לקבוע אם הקולטן טירוזין קינאז erbB4 היה מטרה טיפולית פוטנציאלית בתאי MPNST5. במחקרים אלה נעשה שימוש בעכברים המבטאים טרנסגן המקודד את גורם הגדילה האיזופורמי של הנוירגולין-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) תחת שליטתו של מקדם האפס של חלבון המיאלין הספציפי לתאי שוואן (P 0-GGFβ3). עכברי P 0-GGFβ3 מפתחים נוירופיברומות פלקסיפורמיות מרובות שמתקדמות והופכות ל- MPNSTs באמצעות תהליך המשחזר את התהליכים של נוירופיברומה פתוגנזה והתקדמות נוירופיברומה-MPNST פרספקסית שנראית בחולים עם תסמונת רגישות הגידול האוטוזומלית הדומיננטית נוירופיברומטוזיס סוג 1 (NF1)6. כאשר נחצה לעכברים עם מוטציה אפסית Trp53, וכתוצאה מכך P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים מפתחים MPNSTs דה נובו כפי שניתן לראות ב- cis-Nf1+/-; Trp53+/- עכברים.

MPNSTs אלה מסכמים את ההתקדמות מארגון הבריאות העולמי (WHO) דרגה II לנגעים בדרגה IV של ארגון הבריאות העולמי שנראו בבני אדם7. בעכברי P 0-GGFβ3, MPNSTs מופיעים בתוך נוירופיברומות פרספקס קיימות בעצב הטריגמינלי (58%) ובשורשי העצב הגבי בעמוד השדרה (68%)7; ה- MPNSTs הנובעים מ- P 0-GGFβ3; לעכברים Trp53+/- יש התפלגות דומה מאוד. בבני אדם, MPNSTs מופיעים בדרך כלל בעצב הסיאטי ואחריו מקלעת הברכיאל, שורשי העצבים בעמוד השדרה, הוואגוס, הירך, החציון, מקלעת העצה, האובטורטור הפופליטי, והעצבים הטיביאליים והאולנאריים האחוריים8. התפלגות גידול זו במודלים אלה של GEM שונה במקצת ממה שרואים בבני אדם. עם זאת, ה- MPNSTs המתעוררים ב- P 0-GGFβ3 ו- P0-GGFβ3; עכברי Trp53+/- זהים מבחינה היסטולוגית ל-MPNSTs אנושיים, נושאים רבות מאותן מוטציות שנראו ב-MPNSTs אנושיים, ומשחזרים את תהליך התקדמות הנוירופיברומה-MPNST שנראה בחולי NF1. הדור של P 0-GGFβ3 או P0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים שהיו Erbb4-/- לא היה אפשרי מכיוון שעכברים עם שני אללים ריקים של Erbb4 מתים ברחם ביום העוברי 10.5 משני למומים לבביים9. מכיוון שהצלת ביטוי Erbb4 בלב על ידי החדרת טרנסגן Erbb4 ספציפי ללב (שרשרת כבדה α-מיוזין (MHC)-Erbb4) גורמת לעכברים Erbb4-/- 10 בני קיימא, דור העכברים עם P 0-GGFβ3 מסובך; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- ניסה גנוטיפ.

עם זאת, ההזדווגויות לא הניבו עכברים ביחסים המנדליאניים הצפויים, מה שמעיד על כך שהגנוטיפ הרצוי היה מזיק. לכן, הדור של P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים עם אללים Erbb4 11 ונהג CreERT2 ניסה לאפשר את המחיקה של Erbb4 ב- MPNSTs הנובעים מעכברים אלה. בבעלי חיים אלה, תאי גידול רבים עם אללים שלמים Erbb4 עדיין היו נוכחים (פסיפס). הפסיפס שנצפה יכול לנבוע ממתן טמוקסיפן לא יעיל, מה שהביא להבדלים ביעילות הרקומבינציה בתוך הרקמה. האפשרות של מנגנוני פיצוי ספונטניים עשויה לתרום עוד יותר לפסיפסיזם ברקומבינציה בתיווך טמוקסיפן על ידי עקיפת הדרישה לביטוי Erbb4. זה אפשרי כי אובדן של Trp53 הופך את תאי הגידול רגישים למוטציות "מתירניות" ספונטניות נוספות שעלולות לבלבל את הפרשנות של הנתונים. מכיוון שנראה היה סביר שתאי ה-MPNST השלמים של Erbb4 יסתירו את ההשלכות של התבלטות Erbb4 בתאי גידול אחרים, גישה זו נזנחה.

מכשולים אלה הובילו לפיתוח מתודולוגיה להפלת Erbb4 בתאי MPNST במעבר מוקדם מאוד באמצעות אדנו-וירוס המבטא Cre רקומבינאז ו- eGFP. ניתן להפריד בין תאים אלה לבין תאים שאינם נגועים באמצעות FACS, מה שמפחית במידה ניכרת את הפסיפסיות של הגן Erbb4 האבל. להלן מתוארות השיטות המשמשות להשגת מטרה זו, יחד עם השיטות המשמשות להערכת ההשפעות של אבלציה גנטית במבחנה וב - in vivo. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה כיצד לייצר עכברים נושאי גידול המניבים גידולים הנושאים אללים מרופטים של גנים קטלניים עובריים בעלי עניין לכריתת ex vivo לפני הערכת גדילת הגידול in vivo allograft. זה כולל תיאור של הגישות המשמשות לניתוח ההשפעה שאבלציה Erbb4 מפעילה על התפשטות תאי הגידול, הישרדותם וביטוי גנים במבחנה והתפשטות, הישרדות ואנגיוגנזה באלוגרפטים אורתוטופיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לפני ביצוע הליכים כלשהם עם עכברים, כל ההליכים חייבים להיבדק ולאשר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה. פרוטוקול זה בוצע על ידי צוות מיומן כראוי בהתאם להנחיות המוסדיות של MUSC לטיפול בבעלי חיים.

1. דור של עכברים שמפתחים MPNSTs הומוזיגוטיים עבור אללים Erbb4 flox

  1. לייצר את הדור F1 של P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ בעלי חיים על ידי הזדווגות P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים7 עם עכברי Erbb4fl/fl 11. השתמשו בריבוע Punnett (איור 1) כדי להנחות את ערכת הרבייה כדי להבטיח שמספיק גורי F1 זכרים ונקבות ייווצרו עם P 0-GGFβ3 הרצוי; Trp53+/-; Erbb4fl/+ גנוטיפ.
  2. צאצאי גנוטיפ F1 על ידי בידוד דנ"א גנומי מחיתוך זנב שנאסף בהתאם להנחיות IACUC ולאחר מכן לבצע PCR באמצעות פריימרים שתוארו קודם לכן כדי לזהות את האללים מסוג P 0-GGFβ3טרנסג'ין 12, Trp53 מסוג בר (+) ו-null (-) אללים7, ו-Erbb4flox ו-Erbb4 אללים מסוג בר13.
    1. לבודד דנ"א זנב בשיטות המפורטות על jacks-lab.mit.edu/protocols.
    2. צור את תערובת תגובת ה-PCR עם דנ"א של 25 ננוגרם, 0.25 ננומטר dNTPs, 0.02 U/μL Taq, 0.5 μM של כל פריימר ו-1x PCR buffer. בצע תגובת PCR עם דגירה אחת של 95 °C (כדי להמיס את הדנ"א הגנומי ולהפעיל את Taq) במשך דקה אחת ואחריה 35 מחזורי PCR של 94 °C ( 94 ° C, 10 s (התכה); 55 מעלות צלזיוס, 30 שניות (חישול); 72 מעלות צלזיוס, 40 שניות (הרחבה) ואחריה 72 מעלות צלזיוס (הרחבה) אחת למשך 5 דקות. אחסנו את התגובות ב-4 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להפעלה על ג'ל אגרוז 1.2-1.5%.
      הערה: טמפרטורת החישול תלויה במערכת מאגר PCR המשמשת; מומלץ לבצע שיפוע טמפרטורת חישול כדי לקבוע את טמפרטורת החישול המתאימה.
  3. לייצר את דור F2 של P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl animals על ידי הזדווגות של צאצאי F1 המתאימים (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) אחד עם השני.
    הערה: איור 1 ממחיש את התחזיות הריבועיות של Punnet המשמשות לחישוב המספר הצפוי של צאצאי F2 עם הגנוטיפ הרצוי.
  4. זהה בעלי חיים עם P 0-GGFβ3 הרצוי; Trp53-/+; Erbb4fl/fl גנוטיפ כמתואר בשלב 1.2.
  5. צאצאי Mate F2 זה לזה כדי לשמור על P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl colony וגנוטיפ כל הגורים. אשרו כי האלל החדש שהוצג אינו פוגע בהישרדות או בהשהיית הגידול. השג זאת על ידי הקמת קבוצות (20 עכברים/קוהורטות) של P 0-GGFβ3; Trp53+/- ו-P 0-GGFβ3; Trp53+/-; עכברי Erbb4fl/fl ועוקבים אחר הישרדותם ותדירות התרחשות הגידול שלהם.
  6. עקוב אחר בעלי חיים מספר פעמים בשבוע עד להגעה לנקודת הקצה הניסויית (גודל הגידול המרבי המותר / נקודת הקצה ההומאנית שאושרה על ידי IACUC).
    1. במהלך הניטור השבועי, העריכו את משקל הגוף, התנהגות חברתית וטיפוח תקינה ומדידות גודל הגידול. ארגן הערכה וטרינרית במקרה של ירידה במשקל של >10% ממשקל הגוף, בידוד חברתי וחיבוק.
    2. כאשר עכבר נושא גידול מזוהה והגיע לנקודת הקצה ההומאנית שלו, הרדימו את החיה באופן הומאני באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני ולאחר מכן נקע צוואר הרחם והסירו את הגידול באופן סטרילי באמצעות סכין אזמל. קח מדידות גידול על ידי מדידת אורך, רוחב ועומק באמצעות גידול קליפר ומשקל (מסה ונפח). עבוד במהירות כדי למנוע אוטוליזה.
  7. חתכו את הגידול לשלושה חלקים תוך שימוש בחיתוכים בסגנון לחם עם סכין אזמל בתנאים סטריליים כדי ליצור מקטעי רקמה לקיבוע פורמלין/הטבעת פרפין (FFPE), יצירת תרביות מעבר מוקדמות וחומר קפוא הבזק (איור 2A).
    1. ודא כי סעיף 1 (ליצירת תרביות מעבר מוקדמות, שלב 1.7.2) הוא כ -10% מנפח הגידול הכולל, סעיף 2 (עבור קיבוע ו- IHC, שלב 1.7.3) הוא 70% מנפח הגידול הכולל, וסעיף 3 (עבור הקפאת הבזק, שלב 1.7.4) הוא 20% מנפח הגידול הכולל.
    2. קח את סעיף 1 של הגידול להכנת תרביות מעבר מוקדמות (ראה להלן).
    3. תקן את סעיף 2 של הגידול ב 4% paraformaldehyde לילה ב 4 ° C ולאחר מכן להטביע פרפין (פורמלין קבוע פרפין מוטבע (FFPE) לעבודה אבחון.
    4. החלק 3 של הקפאת הבזק לניתוחים אנליטיים (למשל, אימונובלוטים כדי לוודא שחלבון המקודד על ידי הגן הממוקד של פלוקס מבוטא כראוי).
  8. כתם 5 מיקרומטר מקטעי רקמת FFPE בעובי של 5 מיקרומטר עם המטוקסילין ואוזין (H&E) כדי לאשר את אבחנת הגידול על ידי פתולוג מוסמך. במידת הצורך, בצע צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) כדי לאשר את אבחנת הגידול.
    1. MPNSTs של אימונוסטין עבור S100 חלבון קושר סידן B (S100β), נסטין ואזור קביעת מין Y (SRY)-גורם שעתוק תיבה 10 (Sox10)-שלושה סמנים המתבטאים הן ב- MPNSTs והן בתאי שוואן (מקור תאי הגידול)5,6,14,15. הכתימו את הגידולים בנוגדנים המזהים את erbB4, החלבון המקודד על ידי הגן המיועד לאבלציה במדרגות במורד הזרם.
    2. כדי לאשר את האבחנה, בקשו מווטרינר מוסמך או פתולוג אנושי להעריך את כל שקופיות הגידול המוכתמות בהתאם לקריטריונים לאבחון ודירוג של ארגון הבריאות העולמי 5,6,7,16.

2. אבלציה Ex vivo של אללים Erbb4 מפוקסלים בתאי MPNST

  1. צרו תרביות מעבר מוקדמות מרקמת MPNST שזה עתה נאספה על ידי הנחת הרקמה ממקטע 1 (שלב 1.7.3) ב-10 מ"ל של מלח סטרילי עם חציצת פוספט (PBS) קר כקרח על קרח, ולאחר מכן העברתה לאזור עבודה סטרילי (איור 2B)16.
    הערה: כל ההליכים הבאים יבוצעו במכסה מנוע של תרבית רקמה סטרילית.
  2. מצמצמים את רקמת הגידול לחתיכות של 2-4 מ"מ ומקצינים 8-10 פעמים בצלחת תרבית רקמה מטופלת של 10 ס"מעם 10 מ"ל של מדיום גדילה. תרבית תכשירים אלה במדיום גדילה DMEM-10 עתיר גלוקוז (מדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי, 1% גלוטמין, סטרפטומיצין של 10 מיקרוגרם/מ"ל ו-10 יב"ל/מ"ל פניצילין) בתוספת 10 ננומטר נוירגולין-1β (NRG1β) ו-2 מיקרומטר פורסקולין. הוסף פורסקולין בשלב זה כדי לעכב את הצמיחה של סוגי תאים מזהמים נפוצים כגון פיברובלסטים.
  3. שמור על הרקמה והתאים המנותקים מכנית עד 3 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% CO2 כדי ליצור תרבית מעבר מוקדמת. אין להפריד בין תאים מפוזרים לבין שברי רקמות שנותרו בשלב זה.
  4. רענן את התרבויות עם מדיום חדש כל 3-4 ימים. אפשרו לתאי הגידול להתרבות עד שהם נפגשים.
  5. הרחב את תרבויות המעבר המוקדמות על ידי פיצול תרבויות המפגש למספר מנות. הסר את מדיום הגדילה ושטפו תאים עם 1x dPBS. לאחר מכן, הוסיפו 1 מ"ל של 0.25% טריפסין למשך 2-5 דקות בטמפרטורת החדר לכל צלחת תרבית תאים מטופלת של 10 ס"מ2 . בצעו טריטורציה עדינה של התרבית כדי להקל על הניתוק וליצור תרחיף חד-תאי.
    1. סיים את הטריפסיניזציה על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום הצמיחה DMEM-10. לאסוף את תערובת התאים tripsinized ולהעביר אותו לצינור צנטריפוגה סטרילית 5 מ"ל. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 × גרם בטמפרטורת החדר.
    2. החייאת גלולת התא ב-5 מ"ל של DMEM-10. פצלו את התאים לשתיים עד ארבע מנות תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ, שכל אחת מהן מכילה 10 מ"ל של מדיית גדילה (כ-1 ×-106 תאים בכל מנה).
  6. לאחר 5 קטעים (חזרה על שלבים ב-2.5), השתמש במדיום גדילה ללא NRG1β ופורסקולין. Immunostain דגימה של התרבית עם נוגדן anti-S100β כדי לוודא שהתרבית מורכבת אך ורק מתאי הגידול. שמור על התאים במדיום הגדילה DMEM-10 בכל המעברים הבאים.
  7. בקטע הבא, ספרו את התאים והקפיאו חלק מ-P 0-GGFβ3; Trp53+/-; תאי Erbb4fl/fl MPNST שנאספו מתרביות מפגש (3 × 106 תאים/בקבוקון).
  8. לוח P 0-GGFβ3; Trp53+/-; תאי MPNST במעבר מוקדם של Erbb4fl/fl בצפיפות של 1.5 × 106 תאים לכל צלחת תרבית תאים מטופלת של 10 ס"מ במדיום גדילה DMEM-10.
  9.  יום 0: (כ-12-16 שעות לאחר הציפוי), שטפו את תרביות הדבק עם 2-4 מ"ל של dPBS והזיקו ב-Ad5CMV-Cre/eGFP או Ad5CMV-eGFP בכ-400 יחידות יוצרות פלאק (pfu)/תא ב-10 מ"ל של DMEM ללא סרום (כלומר, 30 μL של 2 × 1010 pfu של וירוס לכל מנה של 10 ס"מ). בטל את אללי Erbb4 המנומרים באמצעות אדנו-וירוס בריכוז הנגיף המרבי הנסבל (ריבוי זיהום, MOI), כפי שנקבע באופן אמפירי. עיין באיור 2C לקבלת שרטוט של זרימת העבודה עבור אבלציה זו.
  10. יום 1: כ-16 שעות לאחר מכן, הצילו את התרביות על ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM-10 לקוקטייל ההדבקה.
  11. יום 2 - 3: FACS ממיין תאים נגועים בהתאם לפרוטוקול המומלץ ממתקן הליבה כדי למיין תאים חיוביים ל-eGFP כ-48 שעות לאחר ההדבקה. לפני מיון ה-FACS, בדקו לזמן קצר את אות ה-eGFP במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שהתרביות נדבקו ביעילות (כ-50-100% תאים חיוביים). תאים חוזרים שהתאוששו לאחר FACS למנות תרבית רקמה של 10 ס"מ; שמור מנה אחת לבידוד דנ"א גנומי.
  12. יום 4 - 5: לאחר מיון FACS, תנו לתאים להתאושש באינקובטור תרבית רקמה למשך 24-48 שעות לפחות, ולאחר מכן הכינו את התאים לניתוחים מבוססי תאים במבחנה או להשתלת in vivo . אשר את מחיקת Erbb4 באמצעות PCR באמצעות דנ"א גנומי שבודד מחלק מהתאים החיוביים ל-eGFP הממוינים. ודא שתאים חיוביים ל-eGFP הם שליליים ל-ErbB4 על ידי PCR או על ידי חיסון דגימה של התרבית עם נוגדן נגד erbB4.
    1. בודדו את הדנ"א הגנומי מהתאים באמצעות שיטת בידוד DNA סטנדרטית של חומצה-גואנידיניום-פנול ושיטת בידוד DNA מבוססת כלורופורם17.
    2. בצע PCR סטנדרטי כדי להבחין בין אללים Erbb4 מרופדים לבין אללים Erbb4 עם אבלציה. בצע 40 מחזורים עם דנ"א של 2 ננוגרם, 20 פריימרים של μM 1 + 2 כדי לייצר מכפלה של 250 bp Erbb4-null ותוצר של 350 bp floxed13. בצע גם גישות PCR וגם גישות מבוססות נוגדנים כדי לאשר נוקאאוט כאשר אין נוגדנים אמינים זמינים.
      הערה: תאים מוכנים לבדיקות מבוססות תאים במבחנה כמתואר להלן. סוגים רבים של ניתוחים במורד הזרם יכולים להתבצע עם תאים מוכנים באופן זה. מטרת הפרוטוקולים המוצגים להלן היא לספק כמה דוגמאות ליישומי in vitro ו- in vivo של תאי הגידול הללו לאחר אבלציה של הגן Erbb4 .

3. מבחני התפשטות וכדאיות בתאי MPNST עם אללים Erbb4 עם אבלציה

  1. בצע מבחני התפשטות במהלך שבעת הימים הבאים על תאי MPNST ממוינים המצופים בלוח מולטיוול באמצעות ציטומטר אוטומטי מבוסס תמונה.
    1. יום 6: צלחת 2,000 תאים לבאר בנפח סופי של 150 μL (כ-13,300 תאים/מ"ל) של מדיום גדילה בצלחת של 96 בארות. בצע מדידות במשולש עבור כל קבוצת ניסוי ו-4 קריאות יומיות של נקודות קצה (3 שכפולים x 2 תנאים x 4 ימים).
    2. ימים 7, 9, 11, 13: מכתימים את התאים בצבעי Hoechst ו-propidium iodide (PI) ומדמיינים אותם על קורא צלחות אוטומטי כדי לספור את מספר התאים החיים והמתים בכל באר. כדי להשיג זאת, הכתימו בו זמנית את התאים בצבע Hoechst כדי להכתים את הגרעינים של תאים חיים ומתים כאחד ועם פרופידיום יודיד (PI) כדי לתייג את התאים המתים. בצע את כל הקריאות באותה השעה בכל יום או בכל יום אחר.
      1. הוסיפו 50 μL של תמיסת צביעה של 4x PI/Hoechst (4 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד) לכל תמיסת צביעה של 4x PI/Hoechst (4 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד) לכל באר שכמתה באותו יום (למשל, יום 7 בלבד), ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרביות הרקמה. שמור על הצלחת מוגנת מפני אור.
        הערה: ריכוז הכתם של Hoechst צריך להיות מוגדר באופן אמפירי ויכול לנוע בין 1 ל-10 מיקרוגרם/מ"ל בהתאם לסוג התא.
      2. קרא את הבארות המוכתמות לאחר הדגירה באמצעות הערוץ הפלואורסצנטי המתאים במצלמת התא האוטומטית. לאחר הקריאה, החזירו את הצלחת לחממה לקריאה עתידית בימים שלאחר מכן (כלומר, ימים 9, 11, 13).
      3. לכמת את עוצמות הכתם בהתבסס על מערכת ההדמיה שבה נעשה שימוש וחשב את מספר התאים המתים, התאים החיים וסך התאים באמצעות ההגדרות הבאות: תעלה כחולה (377/50 ננומטר, Hoechst): סך התאים (חיים ומתים); ערוץ אדום (531/40 ננומטר, PI): תאים מתים בלבד; כחול - אדום (סה"כ - מת) = תאים חיים.
  2. בצע את בדיקת הכדאיות של התא במשך שלושה ימים, אם תרצה בכך, בהתאם לפרוטוקול של יצרני הבדיקה.
    הערה: ניתן לשלב מבחני כדאיות עם מבחני התפשטות על ידי ביצוע כתם משולש הכולל קלצין AM (488/32 ננומטר; תעלה ירוקה, במיוחד תוויות תאים חיים), PI ו- Hoechst. בדיקת אפופטוזיס עשויה להתבצע גם באמצעות תרביות שהוגדרו כמתואר לעיל; הפרוטוקול הספציפי יהיה תלוי במערכת ההדמיה.
    1. יום 6: צלחת 4,000 תאים לבאר בנפח סופי של 150 μL בצלחת של 96 בארות במשולש.
    2. ימים 7 - 9: הוסיפו 2,000 ריאגנטים לבדיקת כדאיות של תאים ביולומינסנטיים (טבלת חומרים), החזירו את הצלחת לחממה וקראו את הצלחת כעבור שעה. בצע את הקריאות הבאות באותה השעה בכל יום. עבור מבחני bioluminescence (MTT), בצע את הבדיקה בדיוק כפי שמתואר בהוראות היצרן כל 24 שעות במשך 72 שעות באמצעות קורא לוחות לומינומטר.

4. ניתוח RNA-Seq וזיהוי של גנים שהביטוי שלהם משתנה על ידי אובדן Erbb4

  1. יום 6: בודדו את הרנ"א הכולל מתאי MPNST ממוינים באמצעות שיטות סטנדרטיות המבוססות על חומצה-גואנידיניום-פנול וכלורופורם. לניסויים שנועדו לזהות שינויים ברמות ה-mRNA בין שתי קבוצות, הכינו רנ"א כולל משלושה שכפולים ביולוגיים לפחות בכל קבוצה.
    1. כדי למנוע אירועים הנגרמים על ידי וקטור אדנו-ויראלי או ביטוי eGFP ולא על ידי אובדן Erbb4, לבודד RNA משלושה שכפולים ביולוגיים של P 0-GGFβ3; Trp53+/-; תאי MPNST מסוג Erbb4fl/fl הומרו עם Ad5CMV-Cre/eGFP ושלושה שכפולים ביולוגיים שעברו טרנספורמציה עם Ad5CMV-eGFP.
      הערה: רנ"א מבודד חייב להיות בעל ציון של מספר שלמות RNA (RIN) ≥ 8 לניתוח RNA-Seq. ודא שליבת הריצוף קובעת את ה- RIN של כל הדגימות לפני בניית ספריות.
  2. השתמש ב- 100-200 ננוגרם של RNA כולל באיכות גבוהה מכל דגימה כדי להכין ספריות RNA-Seq (עבוד עם מתקן ריצוף הליבה עבור שלב זה). בצע ריצוף בתפוקה גבוהה באמצעות רצף דנ"א מהדור הבא. עבור כימות mRNA, בצע ריצוף חד-צדדי כדי ליצור קבצי Fastq. הבטיחו מינימום של 50 מיליון קריאות עבור כל דגימה.
    הערה: עיין באיור 3 לקבלת שרטוט הממחיש את זרימת העבודה המשמשת לעיבוד נתוני RNA-Seq ולכימות הביטוי של תעתיקים המבוטאים באופן דיפרנציאלי. נתוני רצף, בצורה של קבצי Fastq, כפופים להליכי בקרת איכות; >80% מהקריאות אמורות להניב ציון Phred של 30 כדי להיחשב מתאים לניתוח הבא. הרצפים גם מעובדים מראש (גזומים) באמצעות Trimmomatic18 כדי להסיר רצפי מתאמים ולסנן קריאות באיכות נמוכה.
  3. בצע יישור וניתוח של RNA-Seq על הקבצים שנוצרו על ידי fastq באמצעות כל תוכנה בעלת יכולת (לדוגמה, DNAStar19,20 או Partek21). בצע את השלבים הספציפיים לתוכנית באמצעות הגדרות ברירת המחדל כדי ליישר את קבצי fastq לגנום הפניה לעכבר (GRCm38/mm10).
    הערה: באמצעות DNAStar כדוגמה, זרימת העבודה הכללית מתוארת להלן (איור משלים 1).
    1. בחר את שיטת הניתוח, RNA-Seq.
    2. בחר את גנום הייחוס, עכבר.
    3. העלה את קובץ BED אם הוא מסופק על-ידי ליבת הריצוף.
    4. העלה את קבצי הריצוף של fastq, והקצה להם שמות ייחודיים המשוכפלים.
    5. שכפול קבוצתי של קבצי fastq וייעד אותם לקבוצת שכפול (כלומר, GFP, CRE)
      הערה: לכל תוכנית יישור יש את השלבים הספציפיים שלה, ועל המשתמש להתייעץ עם מדריך למשתמש בתוכנית עבור הפרוטוקול הספציפי לתוכנית. לאחר מכן, התוכנית תיצור נתוני ספירת גלם ספציפיים לגנים מקבצי Fastq אלה.
  4. בצע ניתוח סטטיסטי וסלמול (DESeq2, EdgeR) על נתוני הספירה הגולמית באמצעות כל תוכנה בעלת יכולת, כמתואר ב- 4.3, כאשר הדגימה Ad5CMV-eGFP מוגדרת כמערכת נתוני הבקרה ו- Ad5CMV-Cre מוגדרת כנתוני הבדיקה כדי לזהות אותות ביטוי גנים דיפרנציאליים עם הספק סטטיסטי חזק 22,23.
    1. בחר קבצי GFP fastq כמערכת נתוני הבקרה.
    2. בחר DESeq2 כשיטת הסטטיסטיקה והנורמליזציה .
    3. התחל הרכבה וניתוח.
      הערה: לכל תוכנית יישור יש את השלבים הספציפיים שלה, ועל המשתמש להתייעץ עם מדריך למשתמש בתוכנית עבור הפרוטוקול הספציפי לתוכנית. לאחר מכן, התוכנית תיצור נתוני ספירת גלם ספציפיים לגנים מקבצי Fastq אלה. הניתוח הסטטיסטי והנורמליזציה הוא שלב מובנה בתוכניות רבות, כפי שמוצג בדוגמה כאן, בתוך פרוטוקול יישור הרצף. אם נעשה שימוש בתוכנת יישור רצף חלופית שאינה מציעה את השלב המובנה הבא, בצע את הניתוח הסטטיסטי והנורמליזציה על נתוני הספירה הגולמית ברמת המסוף באמצעות חבילות הקידוד DESeq2 או EdgeR שנכתבו ב- R, הזמינות באופן חופשי להורדה ב- Bioconductor.org.
  5. השתמש בגישות אלה כדי לזהות שינויים המייצגים עלייה או ירידה של פי 1.5 לפחות ביחס לבקרה (במקרה זה, תאים שעברו טרנספורמציה עם נגיף Ad5CMV-eGFP). השתמש רק באותם גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) שנקבעו כמובהקים סטטיסטית המראים שינויים ≥ פי 1.5 וערך p 0.05 או padj של 0.1 לניתוח העשרה תפקודית לאחר מכן.
    הערה: פעולה זו תיצור רשימה של גנים של DEG והכוח הסטטיסטי שלהם לניתוח העשרה תפקודי.
  6. בצע ניתוח העשרה תפקודי על DEG בתיווך Erbb4 בעל מובהקות סטטיסטית המזוהה ב-4.4 עם קובץ רשימת גנים מדורג באמצעות כל אחד מהכלים מבוססי האינטרנט הזמינים באופן חופשי. קביעת משמעות ביולוגית ומסלולית של אובדן גנים Erbb4 באמצעות מערכי נתונים אונטולוגיים של גנים המשולבים בכלי ניתוח העשרה פונקציונליים בגישה פתוחה אלה 24,25,26,27 (ראו לדוגמה את טבלת החומרים ואת איור 3 לזרימת עבודה לדוגמה באמצעות Panther).
    1. ייצא את הנתונים שהתקבלו בשלב 4.4 כגיליון אלקטרוני.
    2. דרג את הנתונים לפי שינוי קיפול log2, ערך p/padj או שניהם.
    3. הקפד להסיר את כל הנתונים שאינם מובהקים סטטיסטית.
    4. ייצא את רשימת הגנים המדורגים עם מזהה גנים רק כקובץ .txt והעלה אותה לאתר האינטרנט.
      הערה: השתמש רק ב- DEG מובהק סטטיסטית (ערכי p/padj < 0.05 או 0.1, בהתאמה) כדי ליצור רשימת גנים של קלט מדורג באמצעות שינויים בקיפול log2 (הגבוה ביותר עד הנמוך ביותר), ערכי p/padj (הנמוך ביותר לגבוה ביותר) או שניהם [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. ישנן מספר גישות ליצירת רשימת גנים מדורגת והיא נקבעת באופן אמפירי עבור מערך הנתונים והשאלה הנשאלת. הסוג הספציפי של כלי ניתוח העשרה תפקודי שבו נעשה שימוש יכול גם לסייע בקביעת הסוג המתאים של רשימת הגנים בדרגה. לקבלת משאבים נוספים על RNA-Seq, ראה את המאמרים הבאים 28,29,30.

5. אלוגרציה אורתוטופית של תאי MPNST עם אללים Erbb4 אבלציה וניתוח של ההשפעות של אבלציה Erbb4

  1. לפני ביצוע אלגרינג אורתוטופי של תאי MPNST ממוינים, ודא שכל ההליכים נבדקים ומאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים, וכי כל ההליכים מבוצעים על ידי כוח אדם מיומן כראוי.
  2. ביום ההזרקה, הסר תאי מעבר נמוכים (כ-85% מפגש) מלוחות תרבית תאים או צלוחיות באמצעות תמיסת דיסוציאציה של תאים שאינם אנזימטיים (למשל, תערובת של כלאטורים; ראו טבלת החומרים) וספור את התאים באמצעות המוציטומטר. עבור זריקות אורתוטופיות לתוך העצב הסיאטי, שחזרו את התאים ב-16,667 תאים/מ"ל (50,000 תאים ל-3 מיקרול' לכל חיה) ב-DMEM-1031. שמור את התאים על קרח.
    הערה: תרביות מסוימות לא יצליחו ליצור שתלים אלא אם כן התאים מוזרקים במטריצת קרום מרתף של גורם גדילה נמוך. הדרישה למטריצת קרום מרתף (10-50%) חייבת להיקבע באופן אמפירי.
  3. הערך את פוטנציאל הגדילה של in vivo allograft בתאים שלאחר ההדבקה על ידי הזרקת תאי MPNST לתוך העצב הסיאטי של 8-10 Hsd מורדם : Athymic Nude-Foxn1nu עכברים לכל קבוצה (בגילאי 4-8 שבועות). להזרקה אורתוטופית של תאי גידול, עיין Turk et al31. כאן, הזרקה תת עורית הוא הוכיח.
    הערה: כדי לקבוע את מספר בעלי החיים הניסיוניים הדרושים למובהקות סטטיסטית, התייעץ עם ביו-סטטיסטיקאי או שמומלץ להשתמש ב-G*Power3, תוכנה זמינה באופן חופשי32.
  4. עקוב מקרוב אחר בעלי החיים פעמיים ביום במשך השבוע הראשון שלאחר ההזרקה עבור כל סימן של כאב. לאחר מכן, עקוב אחר העכברים המושתלים שלוש פעמים בשבוע לצורך מדידות קליפר והערך את ציוני מצב הגוף (BCSs) כפי שתואר קודם לכן 5,31. כפי שמתואר בהנחיות IACUC, המתת בעלי חיים עם BCS של 2 או פחות.
  5. כאשר תאים מושתלים גדלים בקצבים שונים, קבעו את זמני השתל באופן אמפירי באמצעות תאי בקרה (ללא שינוי) לפני ביצוע ניסויים המתוארים בסעיף זה. כדי לאסוף את השתלים בנקודת הקצה הניסיונית, הרדים את העכברים באופן הומני באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני ולאחריה נקע צוואר הרחם כאמצעי משני. רשום את מדידות הנפח והמסה הסופיות של כל שתל.
    הערה: כ- P 0-GGFβ3 ללא שינוי; Trp53+/-; תאי Erbb4fl/fl MPNST מגיעים בדרך כלל לגודל המרבי המותר על ידי IACUC תוך 30-45 יום, ציר זמן טיפוסי הוא בסביבות 30-45 יום לאחר ההזרקה.
  6. לבודד ולחלק רקמה כמתואר בשלבים 1.6-1.8. קבעו חלק מרקמת השתל למשך הלילה ב-4% פרפורמלדהיד (איור 2) ואז הטמיעו אותו בפרפין. הכינו מקטעים של 5 מיקרומטר מרקמת ה-FFPE והרכיבו אותם על שקופיות. בצע צביעת H&E ומחלות חיסון נחוצות אחרות כדי לאשר כי רקמת השתל מורכבת מתאי הגידול כמתואר ב- 1.8.1. הקפיאו את שאר רקמת הגידול לצורך ניתוחים במורד הזרם, כגון אימות אובדן ביטוי Erbb4 והערכת ההשפעות של אובדן Erbb4 על הביטוי של בני משפחת ארב אחרים.
    הערה: אישור של תאי הגידול ברקמת השתל חייב להיעשות מכיוון שעכברים בעלי השפעה חיסונית נוטים לפתח גידולים. במקרה של שתלים קטנים, חשוב לוודא כי רקמת צלקת או דלקת אינה טועה עבור neoplasm.
    1. בצע צביעת IHC סטנדרטית על רקמת ה-FFPE כדי להשוות את הביטוי של חלבונים בעלי עניין בתאים המטופלים ב-Allografts שגדלו מ-Ad5CMV-eGFP ומ-Ad5CMV-Cre/eGFP שטופלו. הכתימו את רקמת השתל שנכרתה באמצעות נוגדנים ספציפיים ל-erbB4 כדי לאשר את ההבדלים בביטוי in vivo erbB4 בין שני מצבי הניסוי. קבעו את מדד ההתפשטות באמצעות צביעת Ki67 ואת רמת האפופטוזיס באמצעות צביעת dUTP dUTP בתיווך טרנספראז (TUNEL) בתיווך דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז בתיווך DUTP.
      הערה: כל יעד חלבון בעל עניין יכול להיות מוערך גם באמצעות IHC. לדוגמה, הערך את צפיפות כלי הדם על ידי חיסון allografts עם נוגדן anti-CD31 (דילול 1:50) כדי לקבוע הבדלים במיקרו-סביבה של כלי דם in vivo המתווכים על ידי אבלציה של גנים. ניתן לספור את מספר פרופילי כלי הדם לכל שדה 40x לצורך כימות. עבור מבחנים מבוססי IHC אלה, יש לעקוב אחר פרוטוקולי IHC סטנדרטיים עבור נהלי הכתם ופרוטוקול היצרן לצביעת TUNEL. לכימות תמונות, השתמש בתוסף ImageJ "ספירה אוטומטית של תמונה בצבע יחיד".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 4 ממחיש תוצאה אופיינית המתקבלת בעת התמרות P 0-GGFβ3; Trp53-/+; תאי MPNST מסוג Erbb4fl/fl עם אדנו-וירוס Ad5CMV-eGFP או אדנו-וירוס Ad5CMV-Cre/eGFP (איור 4A). תרביות נצפות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לזהות תאים המבטאים eGFP ועל ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים הנמצאים באותו שדה ב-10x (למעלה) וב-40x (למטה). לאחר מכן ניתן לחשב את אחוז התאים המבטאים eGFP אם תרצה בכך. נתוני פלט FACS מייצגים מוצגים באיור משלים S2. לאחר FACS, אחוז התאים המבטאים eGFP יגדל במידה ניכרת, כאשר כמעט כל התאים בכל שדה מבטאים eGFP. תוצאות גנוטיפ אופייניות של PCR הצפויות לאחר אבלציה גנטית בתיווך Cre, בהתאם ליעילות הטרנספקציה, הן נוקאאוט גנים מלא (100% יעילות) או אוכלוסייה הטרוגנית של תאים מושרים ולא מושרים (יעילות <100%) בהשוואה לתוצאות התמרת בקרה (GFP בלבד, fl/fl) (איור 4B). איור 4C ממחיש את ההיסטופתולוגיה האופיינית שנמצאה באלוגרפטים אורתוטופיים של P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNSTs בהשוואה לגידולים שנגזרו מהמודלים המקוריים של בעלי חיים GEM.

בניסויים אלה, אבלציה של Erbb4 הביאה לירידה בשגשוג התאים ובצפיפות התאים במבחנה וב-in vivo, לעלייה במדדי הסימון של TUNEL ב-vivo ולירידה בצפיפות כלי הדם in vivo. איור 5 ממחיש תוצאות מייצגות שהתקבלו באמצעות ציטומטר אוטומטי מבוסס תמונה שהראה ירידה בשגשוג התאים בתאי Ablated Ad5CMV-Cre לעומת תאים מותמרים Ad5CMV-GFP מבוקרים (איור 5A); ניסויים אלה בוצעו עם תאים בתרבית מעבר מוקדמת. ביטוי של ErbB4 באמצעות אימונוהיסטוכימיה ב- P 0-GGFβ3; Trp53+/-; תאי MPNST מסוג Erbb4fl/fl שעברו התמרה עם נגיף Ad5CMV-Cre או eGFP הופחתו ב-Allografts המתומרים של Ad5CMV-Cre כתוצאה מכך בהשוואה לבקרה Ad5CMV-eGFP שטופלה בגידולי אלוגרפט (איור 5B). צפיפות כלי הדם הוערכה באמצעות זיהוי פעילות חיסונית עבור CD31; ניתן לראות כי צפיפות כלי הדם מופחתת במידה ניכרת באלוגרפטים של תאים מותמרים Ad5CMV-Cre (איור 5C). ניתן לכמת את עוצמת האות, אם תרצה בכך, באמצעות ImageJ.

Figure 1
איור 1: חישובים ריבועיים של פונט של יחסי הגנוטיפים הצפויים בעת יצירה וחצייה של P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים עם עכברי Erbb4fl/fl (F1). חישובים ריבועיים של Punnet של היחסים בין הגנוטיפים הצפויים בעת יצירה ושמירה על P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+ אחד עם השני (F2). קיצור: fl = Floxed. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: זרימת עבודה של התהליכים המשמשים להפלת אללים Erbb4 מפולפלים בתרביות מעבר מוקדמות של תאי MPNST שמקורם ב-P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl עכברים. (A) לקצור את הגידול המבטא את הגן הפלוקס. (B) ליצור תרביות מעבר מוקדמות מהגידול שנכרת. (C) להדביק תרביות מעבר מוקדמות כדי לנטרל את הגן הפלוקסי ולבצע בדיקות במורד הזרם. קיצורים: MPNST = גידול מעטפת עצב היקפי ממאיר; IHC = אימונוהיסטוכימיה; PFA = Paraformaldehyde; FFPE = פרפין קבוע פורמלין-מוטבע; H&E = המטוקסילין ואוזין; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; K/O = נוקאאוט; PCR = תגובת שרשרת פולימראז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: סכמטי הממחיש את זרימת העבודה של RNA-Seq. זרימת העבודה משמשת לזיהוי תעתיקים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בין תאי בקרה (המושרים על-ידי GFP) לבין תאי Erbb4-null (המושרים על-ידי Cre) לבין המשמעות הביולוגית הנובעת מכך. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; RNA-Seq = ריצוף RNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות יעילות התמרה מייצגת המוערכות על ידי מיקרוסקופיה ב-P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl תאי MPNST. (A) תאים שעברו התמרה עם אדנו-וירוס Ad5CMV-eGFP או אדנו-וירוס Ad5CMV-Cre/eGFP. (B) תוצאות PCR של אוכלוסיות גנים פוטנציאליות לאחר זיהום Ad5CMV. (C) היסטופתולוגיה אופיינית המשווה את הגידולים הנוצרים במודלים המקוריים של GEM ל- P 0-GGFβ3 בעל השתגרות אורתוטופית; Trp53-/+; תאי MPNST Erbb4fl/fl באמצעות צביעת H&E. התמונות צולמו פי 40. נוגדני בקרה שלילית תואמי איזוטיפ שימשו להדברת כתמים. סרגלי קנה מידה = 400 מיקרומטר (A, לוח עליון); 100 מיקרומטר (A, לוח תחתון), 20 מיקרומטר (C). קיצורים: MPNST = גידול מעטפת עצב היקפי ממאיר; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; BF = ברייטפילד; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה; Neg Ctrl = שליטה שלילית; PCR = תגובת שרשרת פולימראז; GEM = עכבר מהונדס גנטית; fl = fl = floxed. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות מייצגות שהתקבלו בתרביות מעבר מוקדמות של MPNST בתרבית ובתאי MPNST שעברו תרומה אורתוטופית לאחר התמרה עם Ad5CMV-eGFP או Ad5CMV-Cre/eGFP. (A) בדיקת התפשטות של תאי MPNST בתרבית המדגימה ירידה בצפיפות התאים בתאים שעברו התמרה עם Ad5CMV-Cre/eGFP בהשוואה לאלה שעברו התמרה עם Ad5CMV-eGFP. נתונים מכמתים מוצגים בגרף בימים 1, 3 ו-5 (משמאל). תמונות מפגש של יום 1 ויום 5 שצולמו על הציטומטר האוטומטי מבוסס התמונה מוצגות בצד ימין (תמונות שצולמו בהגדלה של פי 4 עם מיקרוסקופ שדה בהיר). סרגלי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) של לפחות 3 ניסויים בלתי תלויים שונים. (B) צביעת ErbB4 מייצגת בגידולי allograft שעברו טרנספורמציה עם Ad5CMV-eGFP או אדנו-וירוס Ad5CMV-Cre/eGFP שנלקחו בהגדלה של פי 20. ערוץ אדום (Alexa 564, CD31), ערוץ כחול (Hoechst, גרעינים). (C) תמונות מייצגות של צפיפות כלי הדם באלוגרפטים של P 0-GGFβ3; Trp53+/-; תאי MPNST מסוג Erbb4fl/fl הומרו עם Ad5CMV-eGFP לעומת נגיף Ad5CMV-Cre/eGFP. התמונות צולמו פי 40. נוגדני בקרה שלילית תואמי איזוטיפ שימשו להדברת כתמים. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: MPNST = גידול מעטפת עצב היקפי ממאיר; eGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; IgG = אימונוגלובולין G; NEG = שליטה שלילית; CD = אשכול של דיפרנציאציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים S1: סכמטי הממחיש זרימת עבודה של יישור וניתוח רצף. זרימת העבודה המשמשת ב- DNAStar כדי ליישר ולנתח קבצי ריצוף RNA (קבצי fastq). קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; RNA-Seq = ריצוף RNA., DEG = גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: נתוני FACS מייצגים מתרביות מעבר מוקדמות באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק. (A) תאים המבטאים GFP ממוינים לפי FACS לאחר הגדרת פרמטרים של שער פלואורסצנטי מתאים שאינם נגועים. (B) לאחר הגדרת שער הזיהוי המתאים, תאים חיוביים ל-GFP (מותמרים) מופרדים מתאים שליליים ל-GFP (שאינם מומרים). קיצורים: SSC-A = אזור פיזור צדדי של שיא; FSC-H = גובה פיזור קדימה של שיא; FSC-W = רוחב פיזור קדימה של שיא; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות המפורטות שהוצגו כאן פותחו באמצעות מודל GEM של MPNSTs. עם זאת, אם ניתן לפזר את רקמת הגידול המעניינת לתאים בודדים, מתודולוגיות אלה ניתנות להתאמה בקלות לסוגי גידולים שונים הנובעים מ- GEMs. חשוב לוודא כי אלל floxed לא לגרום i) ירידה בהישרדות שיכולה להקשות על השגת עכברים מספיקים כדי לסנן גידולים, או ii) חביון גידול מוגבר שיכול להקשות על השגת מספיק עכברים נושאי גידול. אם האלל המנומר אינו משפיע על ההישרדות, ההישרדות של שתי הקבוצות תהיה שקולה. אם אין לו השפעה על חביון הגידול, מספרים שווים של עכברים נושאי גידול צריכים להופיע בשתי הקבוצות עם מסלול זמן דומה.

גישות דומות שימשו לחקר נוירופיברומות ו- MPNSTs באמצעות נוקאאוטים מותנים וחיות Cre שאינן ניתנות להשראה של טמוקסיפן כדי ליצור חיות נוקאאוט מותנות33,34. ההבדל בין מחקרים אלה לבין זה, מלבד השימוש בטמוקסיפן לאינדוקציה של Cre כפי שנדון קודם לכן, הוא שמחקרים אלה מתמקדים בהתפתחות הגידול עם נוקאאוט ספציפי לרקמות של NF1. מכיוון שמחקר זה ומחקרים אחרים אלה משתמשים גם בגידולים שנוצרו על ידי GEMM, ההבדל טמון בשאלה הנשאלת. בפרוטוקול זה, איננו חוקרים את התפקיד שאובדן NF1 ממלא בפתוגנזה של MPNST, אלא חוקרים את התפקיד שגן מסוים (Erbb4) ב- MPNSTs שנוצרו על ידי GEMM מפעיל על צמיחת גידול in vivo, שאחרת היה בלתי אפשרי בשל היותו קטלני עוברי. יתר על כן, פרוטוקול זה מונע את השימוש בטמוקסיפן עבור אותן גישות הדורשות פרמטרים כאלה.

אחרים חקרו קווי תאי MPNST אנושיים מבוססים במודלים של קסנוגרפט35. מחקר זה שונה מזה בכך שהתאים המושתלים שבהם נעשה שימוש נחקרים היטב אך קווי תאי MPNST אנושיים בעלי מעבר גבוה, והוא מתמקד בביסוס תגובות לתרופות ב-xenografts. חוקרים אלה אינם חוקרים את תפקידו של גן מסוים בתאי MPNST אלה לצמיחת in vivo ואת ההשפעות של אובדן גנים על התגובה לתרופות. מחקר נוסף דומה לזה בוצע על ידי Dodd et al., תוך שימוש באובדן NF1 בתיווך אדנו-וירוס Cre (Ad-Cre) באופן זמני ומרחבי תלוי, שוב שיטה רבת עוצמה להרחבת מאמצי התרגום של MPNST36. המחקר התמקד בתפקיד של אובדן NF1 ו-Ink4a/Arf, שני גנים נפוצים מאוד שנמחקו ב-MPNSTs אנושיים, בעצב הסיאטי על ידי הזרקת Ad-Cre. P 0-GGFβ3; Trp53+/-; עכברי Erbb4fl/fl המתוארים במחקר זה יכולים לשמש באופן זה על ידי הזרקת Ad-Cre לשושלות מבשרי התאים של שוואן. עם זאת, השאלות שנשאלו במחקר זה אינן מתמקדות בתפקיד האבולוציוני של Erbb4 בייזום MPNST אלא באופן שבו MPNSTs עשויים לחטוף איתות Erbb4 ליתרון גדילת הגידול.

ישנן חלופות לגישה המתוארת כאן, כולל הפלת ביטוי גנים באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או השבתת הגן המעניין עם קריספר בקווי תאים סרטניים אנושיים. גישות חלופיות אלה הן בעלות ערך וניתן לשתף אותן עם אבלציה גנטית בתאים שמקורם בגידולי GEM כדי לוודא שההשפעות שנצפו בתאי הגידול של העכברים נקלטות אצל עמיתיהם האנושיים. עם זאת, ישנם כמה יתרונות ברורים למתודולוגיה המתוארת כאן. ראשית, פגיעה גנטית בגנים של פלוקס בתאי סרטן GEM היא מהירה ומייצרת השתקה מוחלטת של הגן הממוקד. לעומת זאת, לעתים קרובות נצפה כי השימוש ב-RNA קצרים של סיכות שיער גורם לפגיעה חלקית בלבד בביטוי הגנים. למרות שקריספר יכול לייצר השבתה מלאה של גנים, זיהוי של שיבוטים שיש להם השבתה מלאה דורש תהליך בחירה ממושך.

יתר על כן, יש לבחון שיבוטים מרובים כדי לוודא שההשפעות הנובעות מאבלציה של CRISPR אינן שונות בין שיבוטים שונים. שנית, היכולת לנטרל אללים פלוקסים בתרביות גידול GEM במעבר מוקדם היא יתרון מכיוון שהדבר ממזער את האפשרות לבחור עבור תת-אוכלוסיות שונות של תאי גידול הגדלים ביעילות בתרבית. לשם השוואה, קווי תאים אנושיים, שבדרך כלל נשמרים בתרבית במשך שנים, נגזרים לעתים קרובות מתת-אוכלוסיות שונות המותאמות היטב לתרבית ועוברות לעתים קרובות סחף גנטי במהלך תהליך זה. התוצאה היא שקווי תאים אלה מפתחים מוטציות חדשות שלא היו קיימות בגידול האב שלהם. לבסוף, אף על פי שהשתלת תאי גידול GEM לעכברים אימונו-יעילים מתוארת בכתב יד זה, צוין כי תאי גידול GEM שמקורם בגידולים הנובעים מזני עכברים גזעיים יכולים להיות מושתלים בעכברים מאותו זן. זה יאפשר לחוקר להעריך את הביולוגיה של הגידולים בבעלי חיים עם מערכת חיסונית שלמה בנוכחות או בהיעדר הגן הממוקד.

השלב הקריטי בפרוטוקול המתואר כאן הוא אבלציה של הגן הפלוקס עם Ad5CMV-Cre/eGFP והבטחת הישרדותם של תאי הגידול לאחר אבלציה גנטית ו-FACS. מכיוון שמדובר בתהליך שתלוי ביכולתו של קר רקומבינאז לנטרל את הגן הפלוקס, הוא עלול להיות נתון לכמה מאותן בעיות שניתן להיתקל בהן כאשר מתפוצצים בגן פלוקס in vivo; סוגיות אלה יתבטאו כאבלציה לא שלמה של האלל הממוקד. שימו לב שהיכולת לטהר תאים שעברו התמרה בהצלחה עם הווקטור האדנו-ויראלי המבטא eGFP אכן ממזערת את הפסיפס בהשוואה לאבלציה של גנים in vivo עם CreERT2. עם זאת, במקרה של גנים ממוקדים המקודדים חלבונים, כגון ErbB4 המתבטאים על פני התא, ייתכן שניתן יהיה להבטיח עוד יותר את אובדן הגן הממוקד על ידי ביצוע FACS תוך שימוש הן ב-eGFP והן בנוגדן המזהה את החלבון בעל העניין (כלומר, למיין את התאים החיוביים ל-eGFP/erbB4-negative).

מכיוון שכפי שצוין במבוא, רבים מהחלבונים הממוקדים באופן טיפולי על ידי נוגדנים חד שבטיים הם חלבונים על פני התא, גישה זו אמורה להיות אפשרית לעתים קרובות. כמו כן יש לציין כי חשוב לתת לתאי הגידול להתאושש לפחות 2-3 ימים לאחר FACS אם יש לבצע עליהם RNA-Seq כדי להעריך את ההשפעה שהייתה לאבלציה גנטית על השעתוק. מערכי נתונים של RNA-Seq שהתקבלו זמן קצר מאוד לאחר FACS מראים לעתים קרובות שונות רבה יותר בביטוי גנים בין שכפולים ביולוגיים בסוגי תאים מסוימים. זה עשוי להיות תוצאה של הטראומה שהתאים סובלים כאשר הם עוברים FACS; לפיכך, יש לאפשר לתאים תקופת התאוששות לאחר תהליך זה. ניתן לנתח מערכי נתונים של RNA-Seq באמצעות DESeq2, המשתמש בהתפלגות הבינומית השלילית ובמעריך התכווצות עבור השונות של ההתפלגות. בניתוחים אלה, הדגימות ממוינות לפי ערך ה-q שלהן, שהוא קצב הגילוי הכוזב הקטן ביותר (FDR) שבו השינויים ברמות התעתיק הם משמעותיים; FDRs מחושבים באמצעות הליך התאמת הבדיקות המרובות של בנג'מיני-הוכברג. לחלופין, ניתן לזהות DEGs באמצעות תוכנות זמינות אחרות המסוגלות לזרימות עבודה של ניתוח RNA-Seq.

עבור מודל זה של בעלי חיים מסוג MPNST, זיהוי נקודת הקצה הניסיונית דורש הבנה של ההיסטוריה הטבעית של הגידולים במודל החיה שבו נעשה שימוש. ההיסטוריה הטבעית של MPNSTs ב- GEM זה נקבעה על ידי מעקב אחר הישרדותם של סדרה של 44 P 0-GGFβ3 עכברים6 ו-19 P0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים7 ולאחר מכן מבצעים נמקים מוחלטים על כל בעלי החיים האלה כשהם מגיעים לנקודת הקצה ההישרדותית שלהם. זמני ההישרדות האופייניים והמיקום שבו נוצרו בדרך כלל MPNSTs נקבעו בכל מודל של בעלי חיים. ברוב העכברים האלה, MPNSTs התעוררו בעצב הטריגמינלי. MPNSTs שהתעוררו בעצב הטריגמינלי יצרו בדרך כלל פטוזיס הקשור לעכירות הקרנית (תוצאה של בעיות בחלוקת הדמעות המיוצרת על ידי הפטוזיס), אשר סיפקה סימן שימושי מבחינה קלינית לזיהוי עכברים נושאי גידול. אבחון הגידול צריך להיות מאושר על ידי ביצוע כתמי H&E ומספר כתמי אבחון נוספים (S100β, nestin Sox 10, H&E, Mart1) ולאחר מכן בדיקה על ידי וטרינר מוסמך או פתולוג אנושי. זה חשוב גם משום שאלל האפס Trp53 במודל זה גורם לנטייה של העכברים להתפתחות גידולים אחרים כגון לימפומות, ויש להבחין בין גידולים אלה לבין MPNSTs.

לבסוף, למתודולוגיה זו יש מספר יישומים פוטנציאליים שטרם נחקרו, אך עשויים להיות אפשריים בחקירות עתידיות. לדוגמה, neuregulin 1 (NRG1), הליגנד המפעיל הן את erbB3 והן את erbB4, מקדם את הנדידה של תאי MPNST באופן כימוטקטי; גם erbB3 וגם erbB4 ממוקמים בפלופודיה של תאי MPNST37. עם זאת, לא ברור אם erbB3 או erbB4 מתווכים את התגובה הכימוטקטית ל-NRG1. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש בתאים שבהם erbB4 עם מתודולוגיה זו כדי לענות על שאלה זו. מעקב טבעי לניסויים אלה הוא להעריך אם erbB4 נדרש עבור גרורות באמצעות הגישה הנפוצה שבה תאי הגידול מוזרקים דרך וריד הזנב ומספר הגרורות הריאתיות שהוערכו לאחר מכן. מתודולוגיה זו מציעה יתרון ברור על פני גישות אחרות, כגון שימוש ב- shRNA כדי להפיל את ביטוי erbB4 מכיוון שביטוי shRNA מושתק לעתים קרובות בתאים לאחר זמן מה. יתר על כן, תרביות מעבר מוקדמות צפויות להכיל תערובת של תת-אוכלוסיות שמקורן בגידול, כולל תת-אוכלוסיות של תאים המועדים לגרורות. ביצוע בדיקות גרורות עם תאים שהוכנו באמצעות המתודולוגיה המתוארת כאן יאפשר הערכה של פוטנציאל גרורתי המייצג יותר את גידול האב מאשר קו תאים מבוסס. זוהי, כמובן, רק דוגמה אחת ליישומים העתידיים שיכולים להשתמש במתודולוגיה זו. אנו מקווים שחוקרים אחרים ישלבו מתודולוגיה זו עם בעיות בעלות עניין מיוחד כדי לשפר את היכולת לזהות חלבונים שהם מטרות טיפוליות מרכזיות בסרטן אנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי (R01 NS048353, R01 NS109655), המכון הלאומי לסרטן (R01 CA122804), משרד ההגנה (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073, ו- W81XWH-15-1-0193), והקרן לגידול ילדים (2014-04-001 ו-2015-05-007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ad5CMV-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody Thermo/Fisher GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics Bioconductor http://www.bioconductor.org alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31 Abcam ab28364
Celigo Image Cytometer Nexcelom Bioscience N/A
Cell Stripper Corning 25-056-Cl mixture of chelators
DAB staining kit Vector Labs MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) DAVID https://david.ncifcrf.gov functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM Corning 15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) Thermo/Fisher EP0701 and K1072
erbB4 antibodies Santa Cruz sc-284
erbB4 antibodies Abcam ab35374
erbB4 antibodies Millipore HFR1: 05-1133
FACS Sorter BD Biosciences Aria II
Forskolin Sigma F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources GenomeSpace https://genomespace.org/support/tools/ general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine Corning 25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool Gorilla N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis Broad Institute N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice Envigo (Previously Harlan Labs) 69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) Illumina Hi Seq 2500 DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis DNAStar LaserGene software N/A software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly software alignment used for step 4.3 N/A software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix Corning 354230
NRG1-beta In house Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342 Thermo 62249
Panther Gene Ontology Classification System Panther http://pantherdb.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer) Partek, Ver 7 N/A software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep Corning 30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

 Eurofins Genomics Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine Fisher 51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays R&D Systems ARY003B
Real time glo Promega G9712 bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite ToppGene https://toppgene.cchmc.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) Invitrogen 15596026
Tyramide Signal Amplification Kit Perkin Elmer NEL721001EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
  2. Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
  3. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
  4. Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
  5. Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
  6. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  7. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
  8. Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
  9. Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
  10. Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
  11. Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
  12. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  13. Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
  14. Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
  15. Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
  16. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  17. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  18. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  19. Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
  20. Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
  21. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  23. Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
  24. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  25. Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
  26. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  27. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  28. Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
  29. Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
  30. Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
  31. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
  32. Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
  33. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  34. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
  35. Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
  36. Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
  37. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).

Tags

חקר הסרטן גיליון 174 עכברים מהונדסים גנטית סרקומה אדנו-וירוס המבטא Cre ציטומטריה של זרימה מבחני הישרדות מבחני התפשטות מבחני התפשטות קסנוגראפטינג RNA-Seq נוקאאוט קטלני עוברי
הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי <em>אבלציה Ex vivo</em> של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Longo, J. F., Brosius, S. N.,… More

Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells. J. Vis. Exp. (174), e62740, doi:10.3791/62740 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter