Her presenterer vi en protokoll for å utføre gen knockouts som er embryonale dødelige in vivo i genetisk utviklede musemodellavledede svulster og deretter vurdere effekten som knockout har på tumorvekst, spredning, overlevelse, migrasjon, invasjon og transkriptomet in vitro og in vivo.
Utviklingen av nye legemidler som nettopp retter seg mot nøkkelproteiner i humane kreftformer, endrer kreftbehandlingen fundamentalt. Men før disse stoffene kan brukes, må deres målproteiner valideres som terapeutiske mål i bestemte krefttyper. Denne valideringen utføres ofte ved å slå ut genet som koder for kandidatens terapeutiske mål i en genetisk konstruert musemodell (GEM) av kreft og bestemme hvilken effekt dette har på tumorvekst. Dessverre begrenser tekniske problemer som embryonal dødelighet i konvensjonelle knockouts og mosaikk i betingede knockouts ofte denne tilnærmingen. For å overvinne disse begrensningene ble det utviklet en tilnærming til å ablisere et floxed embryonalt dødelig gen av interesse for kortsiktige kulturer av ondartede perifere nerveskjedetumorer (MPNST) generert i en GEM-modell.
Dette papiret beskriver hvordan man etablerer en musemodell med riktig genotype, utleder kortsiktige tumorkulturer fra disse dyrene, og deretter ablate det floxed embryonale dødelige genet ved hjelp av en adenoviral vektor som uttrykker Cre recombinase og forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP). Rensing av celler transducert med adenovirus ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og kvantifisering av effektene som genablasjon utøver på cellulær proliferasjon, levedyktighet, transkriptom og ortotopisk allograftvekst blir deretter detaljert. Disse metodene gir en effektiv og generaliserbar tilnærming til å identifisere og validere terapeutiske mål in vitro og in vivo. Disse tilnærmingene gir også en fornybar kilde til lavpassasje tumoravledede celler med reduserte in vitro vekstartefakter. Dette gjør at den biologiske rollen til det målrettede genet kan studeres i ulike biologiske prosesser som migrasjon, invasjon, metastase og intercellulær kommunikasjon formidlet av sekretomet.
Før de siste to tiårene var behandlingen av humane kreftformer avhengig av strålebehandling og kjemoterapeutiske midler som i stor grad målrettet raskt prolifererende cellulære populasjoner ved å skade DNA eller hemme DNA-syntese. Selv om disse tilnærmingene hemmet kreftcellevekst, hadde de også skadelige bivirkninger på normale raskt prolifererende celletyper som tarmepitelceller og hårsekkceller. Mer nylig har kreftbehandling begynt å bruke kjemoterapeutiske midler som nettopp retter seg mot proteiner i signalveier som er kritisk viktige for veksten av en enkelt pasients neoplasma. Denne tilnærmingen, ofte referert til som “presisjonsmedisin”, har ført til utviklingen av et stadig voksende repertoar av monoklonale antistoffer og små molekylære hemmere. Disse midlene hemmer effektivt tumorcelleproliferasjon og overlevelse, samtidig som de unngår skadelige bivirkninger på normale celletyper sett med konvensjonelle kjemoterapeutiske midler og strålebehandling. Monoklonale antistoffer som brukes til behandling av humane kreftformer, retter seg oftest mot celleoverflatemolekyler som vekstfaktorreseptorer1 (f.eks. den store familien av membranspennende reseptortyrosinkinaser) og immunresponsmodulatorer2 (f.eks. programmert celledødsprotein 1, programmert dødligand 1). Små molekylære hemmere kan hemme enten celleoverflateproteiner eller signalproteiner som befinner seg intracellulært3. For å effektivt bruke disse nye terapeutiske midlene, må det imidlertid fastslås at en bestemt kreft er avhengig av molekylet som blir målrettet av et kandidat terapeutisk middel.
Selv om disse nye terapeutiske midlene har mer fokuserte effekter, hemmer mange av dem fortsatt virkningen av mer enn ett protein. I tillegg er flere midler med varierende effektivitet og spesifisitet ofte tilgjengelige for å målrette mot et bestemt protein. Derfor, under prekliniske undersøkelser, er det lurt å bruke flere tilnærminger som genetisk ablasjon for å validere et kandidatprotein som et terapeutisk mål. En spesielt nyttig tilnærming til å validere et protein som et terapeutisk mål er å ablate genet som koder kandidatproteinet i en genetisk konstruert dyremodell som utvikler den spesifikke krefttypen av interesse. Denne tilnærmingen kan være relativt enkel hvis mus med en nullmutasjon (enten en naturlig mutasjon, en genetisk konstruert nullmutasjon [en “knockout”] eller en nullmutasjon introdusert av en genfelle) er tilgjengelige, og musene er levedyktige i voksen alder. Dessverre er mus med en nullmutasjon som oppfyller disse kriteriene ofte ikke tilgjengelige, vanligvis fordi nullmutasjonen resulterer i død embryonalt eller i de første dagene av postnatallivet. I dette tilfellet kan mus som er utsatt for å utvikle tumortypen av interesse i stedet krysses til mus der nøkkelsegmenter av genet av interesse er flankert av loxP-steder (“floxed”), som gjør at genet kan ablated ved å introdusere et transgen som uttrykker Cre recombinase i tumorcellene (en betinget knockout). Denne tilnærmingen gir flere fordeler. For det første, hvis en Cre-driver er tilgjengelig som uttrykkes i svulsten, men ikke i celletypen som førte til døden i konvensjonelle knockouts, kan denne tilnærmingen potensielt validere kandidatens terapeutiske mål. For det andre, ved å ablisere genet som koder kandidatproteinet i tumorceller, men ikke i andre intratumorale elementer som tumorassosierte fibroblaster eller immunceller, kan etterforskeren skille mellom celleautonome og ikke-celle-autonome effekter av det terapeutiske målet. Til slutt tillater en tamoxifen-induserbar Cre-driver (CreERT2) etterforskeren å slette genet av interesse på forskjellige stadier i tumorutvikling og definere vinduet der kandidatens terapeutiske middel mest sannsynlig vil være effektivt.
Dessverre er det også tekniske problemer som kan begrense bruken av betingede knockouts i svulster som oppstår i GEM-modeller. For eksempel kan en Cre-driver som uttrykkes i tumorceller og unngår gensletting i normale celler som er essensielle for livet, ikke være tilgjengelig. Et annet problem, som kan undervurderes, er at Cre- og CreERT2-drivere ofte varierer floxed alleler hos mus, noe som resulterer i mosaikk for nullmutasjonen i en GEM-kreft. Når dette skjer, vil tumorceller der det målrettede genet ikke har blitt ablated fortsette å spre seg raskt, overgrowing tumorcellene med ablated alleler. Mosaicism i Cre driver linjer kan oppstå på grunn av ikke-allestedsnærværende Cre uttrykk i avstamningen målrettet og ved mislykket rekombinasjon i individuelle celler uavhengig av Cre uttrykk4. Dette er et kjent fenomen av Cre-drivere som er celletypeavhengige og bør vurderes under eksperimentell design og datatolkning. Mosaicism kan maskere effekten av knockout og føre en etterforsker til feilaktig å konkludere med at genet av interesse ikke er avgjørende for tumorcelleproliferasjon og / eller overlevelse og dermed ikke er et gyldig terapeutisk mål.
Flere av disse problemene ble oppdaget i en tidligere studie som forsøkte å avgjøre om reseptortyrosinkinase erbB4 var et potensielt terapeutisk mål i MPNST-celler5. I disse studiene ble mus brukt som uttrykker et transgen som koder for neuregulin-1 (NRG1) isoform glialvekstfaktor-β3 (GGFβ3) under kontroll av Schwann-cellespesifikt myelinprotein nullpromotor (P 0-GGFβ3 mus). P 0-GGFβ3 mus utvikler flere pleksiforme nevrofibromer som utvikler seg til å bli MPNT via en prosess som rekapitulerer prosessene for nevrofibroma patogenese og pleksiform nevrofibroma-MPNST progresjon sett hos pasienter med autosomal dominant tumor følsomhet syndrom nevrofibromatose type 1 (NF1)6. Når krysset til mus med en Trp53 null mutasjon, den resulterende P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus utvikler MPNSTs de novo som ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- mus.
Disse MPNST-ene rekapitulerer progresjonen fra lesjoner i Verdens helseorganisasjon (WHO) grad II til WHO grad IV sett hos mennesker7. Hos P 0-GGFβ3-mus oppstår MPNT i eksisterende pleksiforme nevrofibromer i trigeminusnerven (58 %) og spinale dorsale nerverøtter (68 %)7; MPNT-ene som oppstår i P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus har en svært lik fordeling. Hos mennesker oppstår MPNT oftest i isjiasnerven etterfulgt av plexus brachialis, spinalnerverøtter, vagus, femoral, median, sakral plexus, popliteal obturator og bakre tibial og ulnarnerve8. Denne tumorfordelingen i disse GEM-modellene er noe forskjellig fra det som ses hos mennesker. Imidlertid MPNT-ene som oppstår i P 0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- mus er histologisk identiske med humane MPNT-er, bærer mange av de samme mutasjonene som ses i humane MPNT-er, og rekapitulerer prosessen med nevrofibroma-MPNST-progresjon sett hos NF1-pasienter. Genereringen av P 0-GGFβ3 eller P0-GGFβ3; Trp53+/- mus som var Erbb4-/- var ikke gjennomførbare da mus med to Erbb4 null alleler dør in utero ved embryonal dag 10,5 sekundært til hjertefeil9. Fordi redning av Erbb4-uttrykk i hjertet ved å introdusere et hjertespesifikt Erbb4-transgen (α-myosin tung kjede (MHC)-Erbb4) resulterer i levedyktige Erbb4-/- mus10, generasjonen av mus med en komplisert P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotype ble forsøkt.
Parringene produserte imidlertid ikke mus i de forventede mendelske forholdene, noe som indikerer at den ønskede genotypen var skadelig. Derfor generasjonen av P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus med floxed Erbb4 alleler11 og en CreERT2 driver ble forsøkt å tillate sletting av Erbb4 i MPNSTene som oppstår i disse musene. I disse dyrene var mange tumorceller med intakte Erbb4-alleler fortsatt tilstede (mosaikk). Mosaikken som ble observert kunne skyldes ineffektiv tamoxifen-levering, noe som resulterte i forskjeller i rekombinasjonseffektivitet i vevet. Muligheten for spontane kompenserende mekanismer kan ytterligere bidra til mosaikk i tamoxifen-mediert rekombinasjon ved å omgå kravet til Erbb4-uttrykk. Det er mulig at tapet av Trp53 gjør tumorceller utsatt for ytterligere spontane “permissive” mutasjoner som kan forvirre tolkningen av dataene. Da det virket sannsynlig at Erbb4-intakte MPNST-celler ville maskere konsekvensene av å ablisere Erbb4 i andre tumorceller, ble denne tilnærmingen forlatt.
Disse hindringene førte til utviklingen av en metodikk for ablating Erbb4 i svært tidlig passasje MPNST celler ved hjelp av en adenovirus uttrykker Cre recombinase og eGFP. Disse cellene kan skilles fra ikke-infiserte celler ved hjelp av FACS, noe som markant reduserer mosaikk for det ablerte Erbb4-genet . Nedenfor beskrives metodene som brukes for å oppnå dette, sammen med metodene som brukes til å vurdere effekten av genablasjon in vitro og in vivo. Følgende protokoll er et eksempel på hvordan man produserer tumorbærende mus som gir svulster som bærer floxed alleler av embryonale dødelige gener av interesse for ex vivo eksisjon før in vivo allograft tumorvekstvurdering. Dette inkluderer en beskrivelse av tilnærmingene som brukes til å analysere effekten som Erbb4-ablasjon utøver på tumorcelleproliferasjon, overlevelse og genuttrykk in vitro og proliferasjon, overlevelse og angiogenese i ortotopiske allotransplantater.
De detaljerte metodene som presenteres her ble utviklet ved hjelp av en GEM-modell av MPNST-er. Men hvis tumorvevet av interesse kan spres i individuelle celler, er disse metodene lett tilpasningsdyktige for ulike tumortyper som oppstår i GEMs. Det er viktig å sikre at floxed allelet ikke resulterer i i) redusert overlevelse som kan gjøre det vanskelig å oppnå tilstrekkelige mus til å screene for svulster, eller ii) økt tumorforsinkelse som kan gjøre det vanskelig å oppnå nok tumorbærende mus. Hvis floxed alle…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), National Cancer Institute (R01 CA122804), Forsvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 og W81XWH-15-1-0193), og The Children’s Tumor Foundation (2014-04-001 og 2015-05-007).
Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
CD31 | Abcam | ab28364 | |
Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |