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Cancer Research

घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर कोशिकाओं में फ्लोक्स्ड एलील के पूर्व विवो पृथक्करण द्वारा ट्यूमरजेनेसिस में जीन कार्यों को परिभाषित करना

Published: August 25, 2021 doi: 10.3791/62740
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

यहां, हम जीन नॉकआउट करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल-व्युत्पन्न ट्यूमर में विवो में भ्रूण घातक होते हैं और फिर ट्यूमर के विकास, प्रसार, अस्तित्व, प्रवासन, आक्रमण और इन विट्रो और विवो में ट्रांसक्रिप्टोम पर नॉकआउट के प्रभाव का आकलन करते हैं।

Abstract

नई दवाओं का विकास जो मानव कैंसर में प्रमुख प्रोटीन को सटीक रूप से लक्षित करता है, मौलिक रूप से कैंसर चिकित्सीय को बदल रहा है। हालांकि, इन दवाओं का उपयोग करने से पहले, उनके लक्ष्य प्रोटीन को विशिष्ट कैंसर प्रकारों में चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में मान्य किया जाना चाहिए। यह सत्यापन अक्सर कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल में उम्मीदवार चिकित्सीय लक्ष्य को एन्कोडिंग करने वाले जीन को खटखटाकर और यह निर्धारित करके किया जाता है कि ट्यूमर के विकास पर इसका क्या प्रभाव पड़ता है। दुर्भाग्य से, पारंपरिक नॉकआउट में भ्रूण घातकता और सशर्त नॉकआउट में मोज़ेकवाद जैसे तकनीकी मुद्दे अक्सर इस दृष्टिकोण को सीमित करते हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, जीईएम मॉडल में उत्पन्न घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर (एमपीएनएसटी) की अल्पकालिक संस्कृतियों में रुचि के एक फ्लोक्स्ड भ्रूण घातक जीन को कम करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया गया था।

यह पत्र वर्णन करता है कि उपयुक्त जीनोटाइप के साथ एक माउस मॉडल कैसे स्थापित किया जाए, इन जानवरों से अल्पकालिक ट्यूमर संस्कृतियों को प्राप्त किया जाए, और फिर एक एडेनोवायरल वेक्टर का उपयोग करके फ्लॉक्स्ड भ्रूण घातक जीन को कम किया जाए जो क्रे रीकॉम्बिनेज और बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) को व्यक्त करता है। प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके एडेनोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं की शुद्धि और सेलुलर प्रसार, व्यवहार्यता, ट्रांसक्रिप्टोम और ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट विकास पर जीन पृथक्करण के प्रभावों की मात्रा का ठहराव तब विस्तृत है। ये पद्धतियां इन विट्रो और विवो में चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और मान्य करने के लिए एक प्रभावी और सामान्यीकृत दृष्टिकोण प्रदान करती हैं। ये दृष्टिकोण कम इन विट्रो विकास कलाकृतियों के साथ कम-मार्ग ट्यूमर-व्युत्पन्न कोशिकाओं का एक नवीकरणीय स्रोत भी प्रदान करते हैं। यह लक्षित जीन की जैविक भूमिका को विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं जैसे कि प्रवास, आक्रमण, मेटास्टेसिस और स्राव द्वारा मध्यस्थता वाले अंतरकोशिकीय संचार में अध्ययन करने की अनुमति देता है।

Introduction

पिछले दो दशकों से पहले, मानव कैंसर का उपचार रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेप्यूटिक एजेंटों पर बहुत अधिक निर्भर था जो डीएनए को नुकसान पहुंचाकर या डीएनए संश्लेषण को बाधित करके तेजी से बढ़ती सेलुलर आबादी को लक्षित करते थे। यद्यपि इन दृष्टिकोणों ने कैंसर कोशिका वृद्धि को बाधित किया, लेकिन आंतों के उपकला कोशिकाओं और बालकूप कोशिकाओं जैसे सामान्य तेजी से फैलने वाले सेल प्रकारों पर उनके हानिकारक दुष्प्रभाव भी थे। हाल ही में, कैंसर थेरेपी ने कीमोथेरेप्यूटिक एजेंटों का उपयोग करना शुरू कर दिया है जो सिग्नलिंग मार्गों के भीतर प्रोटीन को सटीक रूप से लक्षित करते हैं जो व्यक्तिगत रोगी के नियोप्लाज्म के विकास के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। इस दृष्टिकोण, जिसे आमतौर पर "प्रेसिजन मेडिसिन" के रूप में जाना जाता है, ने मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और छोटे आणविक अवरोधकों के कभी-कभी विस्तारित प्रदर्शनों की सूची के विकास का नेतृत्व किया है। ये एजेंट पारंपरिक कीमोथेरेप्यूटिक एजेंटों और रेडियोथेरेपी के साथ देखे जाने वाले सामान्य सेल प्रकारों पर हानिकारक दुष्प्रभावों से परहेज करते हुए ट्यूमर सेल प्रसार और अस्तित्व को प्रभावी ढंग से रोकते हैं। मानव कैंसर के उपचार के लिए उपयोग किए जाने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आमतौर पर कोशिका सतह के अणुओं को लक्षित करते हैं जैसे कि विकास कारक रिसेप्टर्स1 (उदाहरण के लिए, झिल्ली-फैले रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस का बड़ा परिवार) और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मॉड्यूलेटर2 (जैसे, प्रोग्राम्ड सेल डेथ प्रोटीन 1, प्रोग्राम्ड डेथ-लिगैंड 1)। छोटे आणविक अवरोधक या तो कोशिका सतह प्रोटीन या सिग्नलिंग प्रोटीन को बाधित कर सकते हैं जो इंट्रासेल्युलर रूप से स्थित हैं3. हालांकि, इन नए चिकित्सीय एजेंटों को प्रभावी ढंग से नियोजित करने के लिए, यह स्थापित किया जाना चाहिए कि एक विशेष कैंसर उस अणु पर निर्भर है जिसे उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंट द्वारा लक्षित किया जा रहा है।

यद्यपि इन नए चिकित्सीय एजेंटों के अधिक केंद्रित प्रभाव हैं, उनमें से कई अभी भी एक से अधिक प्रोटीन की कार्रवाई को रोकते हैं। इसके अलावा, अलग-अलग प्रभावशीलता और विशिष्टता वाले कई एजेंट अक्सर एक विशिष्ट प्रोटीन को लक्षित करने के लिए उपलब्ध होते हैं। नतीजतन, प्रीक्लिनिकल जांच के दौरान, चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उम्मीदवार प्रोटीन को मान्य करने के लिए आनुवंशिक पृथक्करण जैसे अतिरिक्त दृष्टिकोणों का उपयोग करना बुद्धिमानी है। एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में एक प्रोटीन को मान्य करने के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु मॉडल में उम्मीदवार प्रोटीन को एन्कोडिंग जीन को कम करना है जो विशिष्ट कैंसर प्रकार की रुचि विकसित करता है। यह दृष्टिकोण अपेक्षाकृत सरल हो सकता है यदि एक शून्य उत्परिवर्तन वाले चूहे (या तो एक प्राकृतिक उत्परिवर्तन, एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर शून्य उत्परिवर्तन [एक "नॉकआउट"], या जीन जाल द्वारा पेश किया गया एक शून्य उत्परिवर्तन) उपलब्ध हैं, और चूहे वयस्कता में व्यवहार्य हैं। दुर्भाग्य से, इन मानदंडों को पूरा करने वाले शून्य उत्परिवर्तन वाले चूहे अक्सर उपलब्ध नहीं होते हैं, आमतौर पर क्योंकि शून्य उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप भ्रूण या प्रसवोत्तर जीवन के पहले दिनों में मृत्यु हो जाती है। इस परिस्थिति में, ट्यूमर प्रकार की रुचि विकसित करने के लिए प्रवण चूहों को चूहों को पार किया जा सकता है जिसमें ब्याज के जीन के प्रमुख खंडों को लॉक्सपी साइटों ("फ्लोक्स") द्वारा फ्लैंक किया जाता है, जो ट्यूमर कोशिकाओं (एक सशर्त नॉकआउट) में क्रे पुन: संयोजकता को व्यक्त करने वाले ट्रांसजीन को पेश करके जीन को कम करने की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, यदि एक क्रे ड्राइवर उपलब्ध है जो ट्यूमर में व्यक्त किया जाता है, लेकिन सेल प्रकार में नहीं जो पारंपरिक नॉकआउट में मृत्यु का कारण बनता है, तो यह दृष्टिकोण संभावित रूप से उम्मीदवार चिकित्सीय लक्ष्य को मान्य कर सकता है। दूसरा, ट्यूमर कोशिकाओं में उम्मीदवार प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन को कम करना, लेकिन ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट या प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे अन्य इंट्राट्यूमोरल तत्वों में नहीं, अन्वेषक को चिकित्सीय लक्ष्य के सेल-स्वायत्त और गैर-सेल-स्वायत्त प्रभावों के बीच अंतर करने की अनुमति देता है। अंत में, एक टैमोक्सीफेन-इंड्यूसिबल क्रे ड्राइवर (सीआरईईआरटी 2) अन्वेषक को ट्यूमर के विकास में विभिन्न चरणों में ब्याज के जीन को हटाने और उस खिड़की को परिभाषित करने की अनुमति देता है जिसमें उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंट प्रभावी होने की सबसे अधिक संभावना है।

दुर्भाग्य से, ऐसे तकनीकी मुद्दे भी हैं जो जीईएम मॉडल में उत्पन्न होने वाले ट्यूमर में सशर्त नॉकआउट के उपयोग को सीमित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक क्रे ड्राइवर जो ट्यूमर कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और जीवन के लिए आवश्यक सामान्य कोशिकाओं में जीन विलोपन से बचा जाता है, उपलब्ध नहीं हो सकता है। एक और मुद्दा, जिसे कम करके आंका जा सकता है, यह है कि क्रे और क्रीयरटी 2 ड्राइवर अक्सर चूहों में फ्लॉक्स्ड एलील को अलग-अलग रूप से कम करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप जीईएम कैंसर में शून्य उत्परिवर्तन के लिए मोज़ेकवाद होता है। जब ऐसा होता है, तो ट्यूमर कोशिकाएं जिनमें लक्षित जीन को कम नहीं किया गया है, तेजी से फैलता रहेगा, ट्यूमर कोशिकाओं को एब्लेटेड एलील के साथ बढ़ा देगा। क्रे ड्राइवर लाइनों में मोज़ेकवाद लक्षित वंश में गैर-सर्वव्यापी क्रे अभिव्यक्ति के कारण हो सकता है और क्रे अभिव्यक्ति 4 से स्वतंत्र व्यक्तिगत कोशिकाओं में असफल पुनर्संयोजन द्वारा हो सकताहै। यह क्रे ड्राइवरों की एक ज्ञात घटना है जो सेल-प्रकार पर निर्भर है और प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा व्याख्या के दौरान विचार किया जाना चाहिए। मोज़ेकवाद नॉकआउट के प्रभाव को मुखौटा कर सकता है और एक अन्वेषक को गलत तरीके से निष्कर्ष निकालने के लिए प्रेरित कर सकता है कि ब्याज का जीन ट्यूमर सेल प्रसार और / या अस्तित्व के लिए आवश्यक नहीं है और इस प्रकार एक वैध चिकित्सीय लक्ष्य नहीं है।

इनमें से कई समस्याओं का सामना पिछले अध्ययन में किया गया था जिसने यह निर्धारित करने का प्रयास किया था कि क्या रिसेप्टर टायरोसिन किनेज ईआरबीबी 4 एमपीएनएसटी कोशिकाओं में एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य था5. इन अध्ययनों में, चूहों का उपयोग किया गया था जो श्वान सेल-विशिष्ट माइलिन प्रोटीन शून्य प्रमोटर (पी 0-जीजीएफβ3 चूहों) के नियंत्रण में न्यूरेगुलिन -1 (एनआरजी 1) आइसोफॉर्म ग्लियाल ग्रोथ फैक्टर-β3 (जीजीएफβ3)को एन्कोडिंग करने वाले ट्रांसजीन को व्यक्त करते हैं। पी0-जीजीएफ β3 चूहों में कई प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफाइब्रोमा विकसित होते हैं जो एक प्रक्रिया के माध्यम से एमपीएनएसटी बनने के लिए प्रगति करते हैं जो ऑटोसोमल प्रमुख ट्यूमर संवेदनशीलता सिंड्रोम न्यूरोफाइब्रोमैटोसिस टाइप 1 (एनएफ 1) 6 वाले रोगियों में न्यूरोफाइब्रोमा रोगजनन और प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफाइब्रोमा-एमपीएनएसटी प्रगति की प्रक्रियाओं को दोहराता है। जब एक टीआरपी 53 शून्य उत्परिवर्तन के साथ चूहों को पार किया जाता है, तो परिणामस्वरूप पी 0-जीजीएफβ3; टीआरपी 53 +/- चूहों में एमपीएनएसटी डे नोवो विकसित होता है जैसा कि सीआईएस-एनएफ 1 +/- में देखा जाता है; टीआरपी 53 +/- चूहों।

ये एमपीएनएसटी विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ग्रेड II से डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV घावों में मनुष्यों में देखी गई प्रगति कोदोहराते हैं। पी0-जीजीएफ β3 चूहों में, एमपीएनएसटी ट्राइजेमिनल तंत्रिका (58%) और रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय तंत्रिका जड़ों (68%) में पहले से मौजूद प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफाइब्रोमा के भीतर उत्पन्न होते हैं; पी0-जीजीएफβ3 में उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी; टीआरपी 53 +/- चूहों का अत्यधिक समान वितरण होता है। मनुष्यों में, एमपीएनएसटी सबसे अधिक कटिस्नायुशूल तंत्रिका में उत्पन्न होते हैं, इसके बाद ब्रैकियल प्लेक्सस, रीढ़ की हड्डी की तंत्रिका जड़ें, योनि, ऊरु, माध्यिका, त्रिक जाल, पॉप्लिटियल ओब्यूरेटर, और पीछे टिबियल और उलनार तंत्रिकाएं8. इन जीईएम मॉडल में यह ट्यूमर वितरण मनुष्यों में देखी जाने वाली चीज़ों से कुछ अलग है। हालांकि, पी0-जीजीएफβ3 और पी 0-जीजीएफβ3 में उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी; टीआरपी 53 +/- चूहे हिस्टोलॉजिकल रूप से मानव एमपीएनएसटी के समान होते हैं, मानव एमपीएनएसटी में देखे गए कई समान उत्परिवर्तन ों को ले जाते हैं, और एनएफ 1 रोगियों में देखे गए न्यूरोफाइब्रोमा-एमपीएनएसटी प्रगति की प्रक्रिया को दोहराते हैं। पी 0-जीजीएफβ3 या पी0-जीजीएफβ3 की पीढ़ी; टीआरपी 53 +/- चूहे जो एआरबी 4-/- थे, संभव नहीं थे क्योंकि दो एआरबी 4 शून्य एलील वाले चूहे भ्रूण के दिन 10.5 माध्यमिक हृदय दोष 9 पर गर्भाशय में मर जातेहैं। क्योंकि हृदय-विशिष्ट एर्ब 4 ट्रांसजीन (α-मायोसिन भारी श्रृंखला (एमएचसी) -एआरबी 4) पेश करके दिल में एरबी 4 अभिव्यक्ति को बचाने के परिणामस्वरूप व्यवहार्य एर्ब 4-/- चूहे10, एक जटिल पी0-जीजीएफ β3 के साथ चूहों की पीढ़ी; टीआरपी 53 +/-; α-एमएचसी-ईआरबी 4; ईआरबी 4-/- जीनोटाइप का प्रयास किया गया था।

हालांकि, संभोग ने अपेक्षित मेंडेलियन अनुपात में चूहों का उत्पादन नहीं किया, यह दर्शाता है कि वांछित जीनोटाइप हानिकारक था। इसलिए, पी 0-जीजीएफβ3 की पीढ़ी; - फ्लॉक्स्ड एर्ब 4 एलील11 और एक क्रीयरटी 2 ड्राइवर के साथ चूहों को इन चूहों में उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी में ईआरबी 4 को हटाने की अनुमति देने का प्रयास किया गया था। इन जानवरों में, बरकरार एर्ब 4 एलील के साथ कई ट्यूमर कोशिकाएं अभी भी मौजूद थीं (मोज़ेकवाद)। मनाया गया मोज़ेकवाद अक्षम टैमोक्सीफेन डिलीवरी के परिणामस्वरूप हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक के भीतर पुनर्संयोजन दक्षता में अंतर होता है। सहज प्रतिपूरक तंत्र की संभावना एर्ब 4 अभिव्यक्ति की आवश्यकता को दरकिनार करके टैमोक्सीफेन-मध्यस्थता पुनर्संयोजन में मोज़ेकवाद में योगदान दे सकती है। यह संभव है कि टीआरपी 53 का नुकसान ट्यूमर कोशिकाओं को अतिरिक्त सहज "अनुमेय" उत्परिवर्तनों के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है जो डेटा की व्याख्या को भ्रमित कर सकते हैं। जैसा कि ऐसा लग रहा था कि एर्ब 4-बरकरार एमपीएनएसटी कोशिकाएं अन्य ट्यूमर कोशिकाओं में एआरबी 4 को खत्म करने के परिणामों को मुखौटा करेंगी, इस दृष्टिकोण को छोड़ दिया गया था।

इन बाधाओं ने बहुत शुरुआती मार्ग में ईआरबी 4 को खत्म करने के लिए एक पद्धति के विकास का नेतृत्व किया एमपीएनएसटी क्रे रिकॉम्बिनेज और ईजीएफपी को व्यक्त करने वाले एडेनोवायरस का उपयोग करके। इन कोशिकाओं को एफएसीएस का उपयोग करके गैर-संक्रमित कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है, जो स्पष्ट रूप से एब्लेटेड एर्ब 4 जीन के लिए मोज़ेकवाद को कम करता है। नीचे, इसे प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों, इन विट्रो और विवो में जीन पृथक्करण के प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों का वर्णन किया गया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ट्यूमर असर चूहों है कि कैसे ट्यूमर असर चूहों है कि विवो एलोग्राफ्ट ट्यूमर विकास मूल्यांकन में से पहले पूर्व विवो छांटना के लिए ब्याज की भ्रूण घातक जीन के फ्लोक्स्ड एलील ले जाने ट्यूमर का उत्पादन करने का एक उदाहरण है। इसमें उस प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोणों का वर्णन शामिल है जो एर्ब 4 पृथक्करण ट्यूमर सेल प्रसार, अस्तित्व और जीन अभिव्यक्ति पर इन विट्रो और प्रसार, अस्तित्व और ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट में एंजियोजेनेसिस पर डालता है।

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Protocol

चूहों के साथ किसी भी प्रक्रिया को करने से पहले, सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की जानी चाहिए और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए। इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल को दक्षिण कैरोलिना के मेडिकल यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। यह प्रोटोकॉल एमयूएससी के संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करते हुए ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया गया था।

1. चूहों की पीढ़ी जो एआरबीबी 4 फ्लॉक्स एलील के लिए एमपीएनएसटी समरूप विकसित करती है

  1. पी0-जीजीएफβ3 की एफ 1 पीढ़ी का उत्पादन; टीआरपी 53 +/-; + जानवरों को संभोग करके पी 0-जीजीएफβ3; टीआरपी 53 +/- चूहों7 के साथ एर्ब 4एफएल / प्रजनन योजना का मार्गदर्शन करने के लिए एक पुनेट वर्ग (चित्रा 1) का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वांछित पी0-जीजीएफβ3 के साथ पर्याप्त नर और मादा एफ 1 पिल्ले उत्पन्न होते हैं; टीआरपी 53 +/-; + जीनोटाइप।
  2. आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार एकत्र किए गए पूंछ स्निप से जीनोमिक डीएनए को अलग करके जीनोटाइप एफ 1 संतान और फिर पी 0-जीजीएफβ3 ट्रांसजीन12, टीआरपी 53 जंगली प्रकार (+) और शून्य (-) एलील7, और एर्ब 4फ्लॉक्स और एर्बबी 4 जंगली प्रकार के एलील13 का पता लगाने के लिए पहले वर्णित प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर का प्रदर्शन करते हैं।
    1. jacks-lab.mit.edu/protocols पर विस्तृत तरीकों का उपयोग करके पूंछ डीएनए को अलग करें।
    2. 25 एनजी डीएनए, 0.25 एनएम डीएनटीपी, 0.02 यू / μL टैक, प्रत्येक प्राइमर के 0.5 μM, और 1x पीसीआर बफर के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण करें। 94 डिग्री सेल्सियस, 10 एस (पिघलने) के 35 पीसीआर चक्रों के बाद 1 मिनट के लिए एक एकल 95 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन (जीनोमिक डीएनए को पिघलाने और टैक को सक्रिय करने के लिए) के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया करें; 55 डिग्री सेल्सियस, 30 एस (एनीलिंग); 72 डिग्री सेल्सियस, 40 एस (एक्सटेंशन) 5 मिनट के लिए एक एकल 72 डिग्री सेल्सियस (एक्सटेंशन) के बाद। 1.2-1.5% एगरोज़ जेल पर चलाने के लिए तैयार होने तक प्रतिक्रियाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: एनीलिंग तापमान उपयोग किए गए पीसीआर बफर सिस्टम पर निर्भर करता है; उचित एनीलिंग तापमान निर्धारित करने के लिए एक एनीलिंग तापमान ढाल करने की सिफारिश की जाती है।
  3. पी0-जीजीएफβ3 की एफ 2 पीढ़ी का उत्पादन करें; टीआरपी 53 +/-; उपयुक्त एफ 1 संतान (पी 0-जीजीएफβ3) संभोग करके ईआरबी 4 एफएल / टीआरपी 53-/+; एक दूसरे के साथ एर्ब 4एफएल /+)।
    नोट: चित्रा 1 वांछित जीनोटाइप के साथ एफ 2 संतानों की अपेक्षित संख्या की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पुननेट वर्ग भविष्यवाणियों को दर्शाता है।
  4. वांछित पी0-जीजीएफβ3 के साथ जानवरों की पहचान करें; टीआरपी 53-/+; चरण 1.2 में वर्णित के रूप में ईआरबी 4एफएल /
  5. पी0-जीजीएफβ3 को बनाए रखने के लिए एक दूसरे के लिए मेट एफ 2 संतान; टीआरपी 53-/+; एफएल कॉलोनी और जीनोटाइप सभी पिल्ले। पुष्टि करें कि नए पेश किए गए फ्लोक्स्ड एलील अस्तित्व या ट्यूमर विलंबता से समझौता नहीं करता है। पी 0-जीजीएफβ3 के कोहोर्ट्स (20 चूहों/पलटन) की स्थापना करके इसे प्राप्त करें; टीआरपी 53 +/- और पी 0-जीजीएफβ3; टीआरपी 53 +/-; एफएल चूहों और उनके अस्तित्व और ट्यूमर घटना की आवृत्ति का पालन करें।
  6. प्रायोगिक समापन बिंदु तक पहुंचने तक प्रति सप्ताह कई बार जानवरों की निगरानी करें (आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित अधिकतम स्वीकार्य ट्यूमर आकार /
    1. साप्ताहिक निगरानी के दौरान, शरीर के वजन, सामान्य सामाजिक और सौंदर्य व्यवहार और ट्यूमर आकार माप का आकलन करें। शरीर के वजन, सामाजिक एकांत और कूबड़ के >10% वजन घटाने के मामले में पशु चिकित्सा मूल्यांकन की व्यवस्था करें।
    2. जब एक ट्यूमर असर माउस की पहचान की जाती है और अपने मानवीय समापन बिंदु तक पहुंच गया है, तो गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना का उपयोग करके जानवर को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दें और स्केलपेल चाकू का उपयोग करके ट्यूमर को बाँझ रूप से हटा दें। कैलिपर और वजन ट्यूमर (द्रव्यमान और मात्रा) का उपयोग करके लंबाई, चौड़ाई और गहराई को मापकर ट्यूमर माप लें। ऑटोलिसिस से बचने के लिए जल्दी से काम करें।
  7. पैराफिन-एम्बेडिंग (एफएफपीई), प्रारंभिक मार्ग संस्कृति पीढ़ी, और फ्लैश-जमे हुए सामग्री (चित्रा 2 ए) के लिए ऊतक खंड उत्पन्न करने के लिए बाँझ परिस्थितियों में एक स्केलपेल चाकू के साथ ब्रेडलोफ शैली में कटौती का उपयोग करके ट्यूमर को तीन वर्गों में विभाजित करें।
    1. सुनिश्चित करें कि धारा 1 (प्रारंभिक मार्ग संस्कृति पीढ़ी के लिए, चरण 1.7.2) कुल ट्यूमर की मात्रा का लगभग 10% है, धारा 2 (निर्धारण और आईएचसी के लिए, चरण 1.7.3) कुल ट्यूमर मात्रा का 70% है, और धारा 3 (फ्लैश फ्रीज के लिए, चरण 1.7.4) कुल ट्यूमर मात्रा का 20% है।
    2. प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों की तैयारी के लिए ट्यूमर का खंड 1 लें (नीचे देखें)।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ट्यूमर के अनुभाग 2 को ठीक करें और फिर नैदानिक वर्कअप के लिए पैराफिन (फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) में एम्बेड करें।
    4. विश्लेषणात्मक विश्लेषण के लिए फ्लैश-फ्रीज अनुभाग 3 (उदाहरण के लिए, इम्यूनोब्लॉट्स यह सत्यापित करने के लिए कि लक्षित फ्लॉक्स्ड जीन द्वारा एन्कोडेड प्रोटीन उचित रूप से व्यक्त किया गया है)।
  8. एक योग्य रोगविज्ञानी द्वारा ट्यूमर निदान की पुष्टि करने के लिए हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ दाग 5 μm-मोटी एफएफपीई ऊतक वर्गों। यदि उपयुक्त हो, तो ट्यूमर निदान की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला (आईएचसी) करें।
    1. एस 100 कैल्शियम-बाइंडिंग प्रोटीन बी (एस 100β), नेस्टिन, और लिंग-निर्धारण क्षेत्र वाई (एसआरवाई) -बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 10 (सोक्स 10) के लिए इम्यूनोस्टेन एमपीएनएसटी -तीन मार्कर जो एमपीएनएसटी और श्वान कोशिकाओं (ट्यूमर सेल मूल) 5,6,14,15 दोनों में व्यक्त किए जाते हैं। ट्यूमर को ईआरबीबी 4 को पहचानने वाले एंटीबॉडी के साथ दाग दें, डाउनस्ट्रीम चरणों में पृथक्करण के लिए लक्षित जीन द्वारा एन्कोडेड प्रोटीन।
    2. निदान की पुष्टि करने के लिए, एक योग्य पशु चिकित्सा या मानव रोगविज्ञानी डब्ल्यूएचओ नैदानिक और ग्रेडिंग मानदंड 5,6,7,16 के बाद सभी दाग ट्यूमर स्लाइड का आकलन करें।

2. एमपीएनएसटी कोशिकाओं में फ्लॉक्स्ड ईआरबी 4 एलील का पूर्व विवो पृथक्करण

  1. बर्फ पर बर्फ-ठंडा बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 10 मिलीलीटर में धारा 1 (चरण 1.7.3) से ऊतक रखकर ताजा एकत्र किए गए एमपीएनएसटी ऊतक से प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों की स्थापना करें और फिर इसे बाँझ कार्य क्षेत्र (चित्रा 2 बी) 16 में स्थानांतरित करें।
    नोट: बाद की सभी प्रक्रियाओं को बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में किया जाना है।
  2. ट्यूमर ऊतक को 2-4 मिमी टुकड़ों में कीमा बनाएं और 10 मिलीलीटर विकास माध्यम के साथ 10 सेमी2 उपचारित टिशू कल्चर डिश में 8-10 बार ट्राइट्यूरेट करें। उच्च ग्लूकोज डीएमईएम -10 विकास माध्यम (डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में इन तैयारियों को संस्कृति करें जिसमें 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% ग्लूटामाइन, 10 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10 आईयू / एमएल पेनिसिलिन शामिल हैं) 10 एनएम न्यूरेगुलिन -1β (एनआरजी 1β) और 2 μM फोर्स्कोलिन के साथ पूरक। फाइब्रोब्लास्ट जैसे सामान्य दूषित कोशिका प्रकारों के विकास को रोकने के लिए इस स्तर पर फोर्स्कोलिन जोड़ें।
  3. एक प्रारंभिक मार्ग संस्कृति स्थापित करने के लिए एक 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए यांत्रिक रूप से पृथक ऊतक और कोशिकाओं को बनाए रखें। इस बिंदु पर छितरी हुई कोशिकाओं और शेष ऊतक टुकड़ों को अलग न करें।
  4. हर 3-4 दिनों में नए माध्यम से संस्कृतियों को ताज़ा करें। ट्यूमर कोशिकाओं को तब तक फैलने दें जब तक कि वे संगम न हों।
  5. संगम संस्कृतियों को कई व्यंजनों में विभाजित करके प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों का विस्तार करें। विकास माध्यम निकालें और 1x डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। फिर, प्रति 10 सेमी 2 इलाज सेल संस्कृति पकवान प्रति कमरे के तापमान पर 2-5 मिनट के लिए0.25 % ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें। टुकड़ी को सुविधाजनक बनाने और एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए धीरे-धीरे संस्कृति को ट्रिट्यूरेट करें।
    1. डीएमईएम -10 विकास माध्यम के 2 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिनाइजेशन समाप्त करें। ट्रिप्सिनाइज्ड सेल मिश्रण को इकट्ठा करें और इसे 5 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 500 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं गोली।
    2. डीएमईएम -10 के 5 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को दो से चार 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजनों में विभाजित करें, जिनमें से प्रत्येक में 10 मिलीलीटर विकास मीडिया (लगभग 1 × प्रति डिश 106 कोशिकाएं) होती हैं।
  6. 5 मार्गों के बाद (2.5 में चरणों को दोहराते हुए), एनआरजी 1β और फोर्स्कोलिन के बिना विकास माध्यम का उपयोग करें। इम्यूनोस्टेन एक एंटी-एस 100β एंटीबॉडी के साथ संस्कृति का एक नमूना यह सत्यापित करने के लिए कि संस्कृति पूरी तरह से ट्यूमर कोशिकाओं से बना है। बाद के सभी मार्गों में डीएमईएम -10 विकास माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखें।
  7. अगले मार्ग पर, कोशिकाओं की गिनती करें और पी0-जीजीएफβ3 के एक हिस्से को फ्रीज करें; टीआरपी 53 +/-; संगम संस्कृतियों (3 × 106 कोशिकाओं / शीशी) से एकत्र की गई ईआरबीबी 4एफएल / एफएल एमपीएनएसटी कोशिकाएं।
  8. प्लेट पी 0-जीजीएफβ3; टीआरपी 53 +/-; डीएमईएम -10 विकास माध्यम में 10 सेमी प्रति 10 सेमी उपचारित सेल संस्कृति पकवान में 1.5 × 106 कोशिकाओं के घनत्व पर प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी कोशिकाएं।
  9.  दिन 0: (चढ़ाना के बाद लगभग 12-16 घंटे), डीपीबीएस के 2-4 एमएल के साथ अनुयायी संस्कृतियों को धो लें और लगभग 400 पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) / सेल में लगभग 400 पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) / सेल में एडी × 5 सीएमवी-क्रे / अधिकतम सहन किए गए वायरस एकाग्रता (संक्रमण की बहुलता, एमओआई) पर एडेनोवायरस का उपयोग करके फ्लॉक्स्ड एर्ब 4 एलील को एब्लेट करें, जैसा कि अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया है। इस पृथक्करण के लिए वर्कफ़्लो की योजनाबद्धता के लिए चित्रा 2 सी देखें।
  10. पहला दिन: लगभग 16 घंटे बाद, संक्रमण कॉकटेल में डीएमईएम -10 के 10 एमएल जोड़कर संस्कृतियों को बचाएं।
  11. दिन 2 - 3: एफएसीएस संक्रमण के लगभग 48 घंटे बाद ईजीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए कोर सुविधा से अनुशंसित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए संक्रमित कोशिकाओं को सॉर्ट करता है। एफएसीएस छँटाई से पहले, संक्षेप में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर ईजीएफपी संकेत के लिए कोशिकाओं की जाँच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि संस्कृतियों को कुशलतापूर्वक संक्रमित किया गया है (~ 50-100% सकारात्मक कोशिकाएं)। 10 सेमी टिशू कल्चर व्यंजनों के लिए एफएसीएस के बाद बरामद वापसी कोशिकाओं; जीनोमिक डीएनए अलगाव के लिए एक डिश आरक्षित करें।
  12. दिन 4 - 5: एफएसीएस छँटाई के बाद, कोशिकाओं को कम से कम 24-48 घंटे के लिए एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में ठीक होने दें और फिर इन विट्रो सेल-आधारित विश्लेषण या विवो ग्राफ्टिंग में कोशिकाओं को तैयार करें। सॉर्ट किए गए ईजीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं के एक हिस्से से अलग जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके पीसीआर के माध्यम से ईआरबी 4 विलोपन की पुष्टि करें। सत्यापित करें कि ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाएं पीसीआर द्वारा या एंटी-ईआरबीबी 4 एंटीबॉडी के साथ संस्कृति के नमूने को इम्यूनोस्टेन करके ईआरबीबी 4-नकारात्मक हैं।
    1. मानक एसिड-गुआनिडिनियम-फिनोल और क्लोरोफॉर्म-आधारित डीएनए अलगाव विधि का उपयोग करके कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए को अलग करें17.
    2. फ्लॉक्स्ड एर्ब 4 एलील और एब्लेटेड एर्ब 4 एलील को अलग करने के लिए मानक पीसीआर करें। 2 एनजी डीएनए, 20 μM प्राइमरों 1 + 2 के साथ 40 चक्र करें ताकि 250 बीपी ईआरबी 4-शून्य उत्पाद और 350 बीपी फ्लॉक्स उत्पाद13 का उत्पादन किया जा सके। जब कोई विश्वसनीय एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हो तो नॉकआउट की पुष्टि करने के लिए पीसीआर और एंटीबॉडी-आधारित दृष्टिकोण दोनों करें।
      नोट: कोशिकाएं इन विट्रो सेल-आधारित परख के लिए तैयार हैं जैसा कि नीचे वर्णित है। इस तरह से तैयार कोशिकाओं के साथ कई प्रकार के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण किए जा सकते हैं। नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य इन विट्रो के कुछ उदाहरण प्रदान करना है और इन ट्यूमर कोशिकाओं के विवो अनुप्रयोगों में एर्ब 4 जीन के पृथक्करण के बाद।

3. एब्लेटेड एआरबी 4 एलील के साथ एमपीएनएसटी कोशिकाओं में प्रसार और व्यवहार्यता परख

  1. छवि-आधारित स्वचालित साइटोमीटर का उपयोग करके मल्टीवेल प्लेट में चढ़ाया गया क्रमबद्ध एमपीएनएसटी कोशिकाओं पर अगले सात दिनों में प्रसार परख करें।
    1. छठा दिन: एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में विकास माध्यम के 150 μL (~ 13,300 कोशिकाओं / एमएल) की अंतिम मात्रा में अच्छी तरह से प्रति प्लेट 2,000 कोशिकाओं। प्रत्येक प्रयोगात्मक पलटन और 4 दैनिक समापन बिंदु पढ़ता है (3 प्रतिकृति x 2 शर्तों x 4 दिनों) के लिए ट्रिप्लिकेट में माप प्रदर्शन करें।
    2. दिन 7, 9, 11, 13: होचस्ट और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) रंगों के साथ दाग कोशिकाएं और प्रत्येक कुएं में जीवित और मृत कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए उन्हें एक स्वचालित प्लेट रीडर पर चित्रित करें। इसे प्राप्त करने के लिए, एक साथ जीवित और मृत कोशिकाओं दोनों के नाभिक को दागने के लिए होचस्ट डाई के साथ कोशिकाओं को दाग दें और मृत कोशिकाओं को लेबल करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ। हर दिन या हर दूसरे दिन एक ही समय में सभी रीड्स करें।
      1. होचस्ट धुंधला समाधान (4 μg /mL प्रत्येक) के 50 μL जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से उस दिन मात्रा निर्धारित करने के लिए (उदाहरण के लिए, दिन 7 केवल), और ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। प्लेट को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
        नोट: होचस्ट की धुंधला एकाग्रता को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है और सेल प्रकार के आधार पर 1 से 10 μg /
      2. स्वचालित सेल इमेजर पर उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनल का उपयोग करके इनक्यूबेशन के बाद दाग वाले कुओं को पढ़ें। पढ़ने के बाद, प्लेट को बाद के दिनों में भविष्य के पढ़ने के लिए इनक्यूबेटर में वापस करें (यानी, दिन 9, 11, 13)।
      3. उपयोग की जाने वाली इमेजिंग प्रणाली के आधार पर धुंधला तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें और निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके मृत कोशिकाओं, जीवित कोशिकाओं और कुल कोशिकाओं की संख्या की गणना करें: नीला चैनल (377/50 एनएम, होचस्ट): कुल कोशिकाएं (जीवित और मृत); लाल चैनल (531/40 एनएम, पीआई): केवल मृत कोशिकाएं; नीला - लाल (कुल - मृत) = जीवित कोशिकाएं।
  2. तीन दिनों में सेल व्यवहार्यता परख प्रदर्शन, यदि वांछित, परख निर्माताओं के प्रोटोकॉल के बाद.
    नोट: व्यवहार्यता परख कैल्सीन एएम (488/32 एनएम; ग्रीन चैनल, विशेष रूप से जीवित कोशिकाओं को लेबल), पीआई, और होचस्ट सहित ट्रिपल दाग प्रदर्शन करके प्रसार परख के साथ जोड़ा जा सकता है। ऊपर वर्णित संस्कृतियों का उपयोग करके एक एपोप्टोसिस परख भी की जा सकती है; विशिष्ट प्रोटोकॉल इमेजिंग सिस्टम पर निर्भर करेगा।
    1. छठा दिन: प्लेट 4,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से 150 μL की अंतिम मात्रा में एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में ट्रिप्लिकेट.
    2. दिन 7 - 9: 2,000x बायोल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख अभिकर्मकों (सामग्री की तालिका) जोड़ें, इनक्यूबेटर को प्लेट वापस, और प्लेट 1 घंटे बाद पढ़ें। हर दिन एक ही समय में बाद के रीड्स करें। बायोल्यूमिनेसेंस (एमटीटी) परख के लिए, एक ल्यूमिनोमीटर प्लेट रीडर का उपयोग करके 72 घंटे के लिए हर 24 घंटे में निर्माता के निर्देशों में उल्लिखित परख का प्रदर्शन करें।

4. आरएनए-सेक जीन का विश्लेषण और पहचान करता है जिनकी अभिव्यक्ति ईआरबी 4 हानि द्वारा बदल जाती है

  1. छठा दिन: मानक एसिड-गुआनिडिनियम-फिनोल और क्लोरोफॉर्म-आधारित तरीकों का उपयोग करके क्रमबद्ध एमपीएनएसटी कोशिकाओं से कुल आरएनए को अलग करें। दो समूहों के बीच एमआरएनए स्तरों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों के लिए, प्रत्येक पलटन में कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियों से कुल आरएनए तैयार करें।
    1. ईआरबी 4 हानि के बजाय एडेनोवायरल वेक्टर या ईजीएफपी अभिव्यक्ति के कारण होने वाली घटनाओं को खत्म करने के लिए, पी0-जीजीएफβ3 के तीन जैविक प्रतिकृतियों से आरएनए को अलग करें; टीआरपी 53 +/-; ईजीएफपी और एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी के साथ ट्रांसड्यूस किए गए तीन जैविक प्रतिकृतियों के साथ ईआरबी 4एफएल / एफएल एमपीएनएसटी कोशिकाएं ट्रांसड्यूस की गईं।
      नोट: पृथक आरएनए में आरएनए-सेक विश्लेषण के लिए 8 ≥ एक आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) स्कोर होना चाहिए। सुनिश्चित करें कि अनुक्रमण कोर पुस्तकालयों के निर्माण से पहले सभी नमूनों के आरआईएन को निर्धारित करता है।
  2. आरएनए-सेक पुस्तकालयों (इस चरण के लिए कोर अनुक्रमण सुविधा के साथ काम करें) तैयार करने के लिए प्रत्येक नमूने से उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए के 100-200 एनजी का उपयोग करें। अगली पीढ़ी के डीएनए सीक्वेंसर का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण करें। एमआरएनए परिमाणीकरण के लिए, फास्टक्यू फ़ाइलों को उत्पन्न करने के लिए एकल-समाप्त अनुक्रमण करें। प्रत्येक नमूने के लिए न्यूनतम 50 मिलियन पढ़ना सुनिश्चित करें।
    नोट: आरएनए-सेक डेटा को संसाधित करने और अलग-अलग व्यक्त टेपों की अभिव्यक्ति को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्कफ़्लो को चित्रित करने के लिए एक योजनाबद्ध चित्रण के लिए चित्रा 3 देखें। फास्टक फ़ाइलों के रूप में अनुक्रम डेटा, गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रियाओं के अधीन हैं; >80% रीड्स को बाद के विश्लेषण के लिए उपयुक्त माना जाने के लिए 30 का फ्रेड स्कोर प्राप्त करना चाहिए। एडाप्टर अनुक्रमों को हटाने और कम गुणवत्ता वाले रीड्स को फ़िल्टर करने के लिए ट्रिमोमैटिक18 का उपयोग करके अनुक्रमों को प्रीप्रोसेस्ड (ट्रिम) भी किया जाता है।
  3. किसी भी सक्षम सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम (जैसे, डीएनएस्टार 19,20 या पार्टेक 21) का उपयोग करके फास्टक जेनरेट कीगई फ़ाइलों पर आरएनए-सेक संरेखण और विश्लेषण करें। माउस संदर्भ जीनोम (GRCm38/mm10) के लिए फास्टक्यू फ़ाइलों को संरेखित करने के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग कर प्रोग्राम-विशिष्ट चरणों का पालन करें।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में डीएनएस्टार का उपयोग करते हुए, सामान्य वर्कफ़्लो नीचे वर्णित है (पूरक चित्रा 1)।
    1. विश्लेषण विधि, आरएनए-सेक का चयन करें।
    2. संदर्भ जीनोम, माउस का चयन करें।
    3. अनुक्रमण कोर द्वारा प्रदान किए जाने पर बीईडी फ़ाइल अपलोड करें।
    4. फास्टक्यू अनुक्रमण फ़ाइलों को अपलोड करें, उन्हें अद्वितीय प्रतिकृति नाम असाइन करें।
    5. फास्टक्यू फ़ाइलों को समूह-प्रतिकृति करें और उन्हें एक प्रतिकृति सेट (यानी, जीएफपी, सीआरई) में नामित करें
      नोट: प्रत्येक संरेखण प्रोग्राम के अपने विशिष्ट चरण हैं, और उपयोगकर्ता प्रोग्राम-विशिष्ट प्रोटोकॉल के लिए प्रोग्राम उपयोगकर्ता गाइड से परामर्श करना चाहिए। कार्यक्रम तब इन फास्टक फ़ाइलों से जीन-विशिष्ट कच्चे गिनती डेटा उत्पन्न करेगा।
  4. किसी भी सक्षम सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके कच्चे गिनती डेटा पर सांख्यिकीय और सामान्यीकरण विश्लेषण (डीईएसईक्यू 2, एजआर) करें, जैसा कि 4.3 में वर्णित है, एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी नमूना सेट के साथ नियंत्रण डेटा सेट के रूप में सेट और मजबूत सांख्यिकीय शक्ति22,23 के साथ अंतर जीन अभिव्यक्ति संकेतों की पहचान करने के लिए परीक्षण डेटा सेट के रूप में एडी 5 सीएमवी-क्रे सेट।
    1. नियंत्रण डेटा सेट के रूप में GFP फास्टक फ़ाइलों का चयन करें।
    2. सांख्यिकीय और सामान्यीकरण विधि के रूप में DESeq2 का चयन करें।
    3. असेंबली और विश्लेषण शुरू करें।
      नोट: प्रत्येक संरेखण प्रोग्राम के अपने विशिष्ट चरण हैं, और उपयोगकर्ता प्रोग्राम-विशिष्ट प्रोटोकॉल के लिए प्रोग्राम उपयोगकर्ता गाइड से परामर्श करना चाहिए। कार्यक्रम तब इन फास्टक फ़ाइलों से जीन-विशिष्ट कच्चे गिनती डेटा उत्पन्न करेगा। सांख्यिकीय और सामान्यीकरण विश्लेषण कई कार्यक्रमों में एक अंतर्निहित कदम है, जैसा कि यहां उदाहरण में दिखाया गया है, अनुक्रम संरेखण प्रोटोकॉल के भीतर। यदि एक वैकल्पिक अनुक्रम संरेखण सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग किया जाता है जो इस बाद के अंतर्निहित चरण की पेशकश नहीं करता है, तो आर में लिखे गए डीईएसईक्यू 2 या एजआर कोडिंग पैकेज का उपयोग करके टर्मिनल स्तर पर कच्चे गिनती डेटा पर सांख्यिकीय और सामान्यीकरण विश्लेषण करें, Bioconductor.org पर डाउनलोड के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है।
  5. नियंत्रण के सापेक्ष कम से कम 1.5 गुना वृद्धि या कमी का प्रतिनिधित्व करने वाले परिवर्तनों की पहचान करने के लिए इन दृष्टिकोणों का उपयोग करें (इस मामले में, एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी वायरस के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाएं)। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण होने के लिए निर्धारित केवल उन अलग-अलग व्यक्त जीन (डीईजी) का उपयोग करें जो बाद के कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण के लिए ≥1.5 गुना परिवर्तन और पी-वैल्यू 0.05 या 0.1 का पैडज दिखाते हैं।
    नोट: यह कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण के लिए डीईजी जीन और उनकी सांख्यिकीय शक्ति की एक सूची उत्पन्न करेगा।
  6. स्वतंत्र रूप से उपलब्ध वेब-आधारित उपकरणों में से किसी का उपयोग करके रैंक जीन सूची फ़ाइल के साथ 4.4 में पहचाने गए सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण ईआरबी 4-मध्यस्थता डीईजी पर कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण करें। इन ओपन-एक्सेस कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण उपकरण 24,25,26,27 में एकीकृत जीन ऑन्टोलॉजी डेटासेट के माध्यम से ईआरबी 4 जीन हानि के जैविक और मार्ग महत्व का निर्धारण करें (उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका और पैंथर का उपयोग करके उदाहरण वर्कफ़्लो के लिए चित्रा 3 देखें)।
    1. एक स्प्रेडशीट के रूप में चरण 4.4 में प्राप्त डेटा निर्यात करें।
    2. लॉग 2 गुना परिवर्तन, पी / पैडज मान, या दोनों द्वारा डेटा रैंक करें।
    3. सभी गैर-सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण डेटा को निकालना सुनिश्चित करें।
    4. जीन आईडी के साथ रैंक की गई जीन सूची को केवल एक .txt फ़ाइल के रूप में निर्यात करें और इसे वेबसाइट पर अपलोड करें।
      नोट: लॉग 2 गुना परिवर्तन (उच्चतम से निम्नतम), पी / पैडज-मान (सबसे कम से उच्चतम) या दोनों [(-लॉग 10 (पीवीएएल) * साइन (लॉग 2 एफसी)] का उपयोग करके रैंक किए गए इनपुट जीन सूची उत्पन्न करने के लिए केवल सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण डीईजी (क्रमशः 0.05 या 0.1 के < पी / एक रैंक जीन सूची उत्पन्न करने के लिए कई दृष्टिकोण हैं और डेटासेट और पूछे जाने वाले प्रश्न के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है। उपयोग किए जा रहे विशिष्ट प्रकार के कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण उपकरण भी उचित प्रकार की रैंक जीन सूची निर्धारित करने में सहायता कर सकते हैं। आरएनए-सेक पर अतिरिक्त संसाधनों के लिए, निम्नलिखित कागजात 28,29,30 देखें।

5. एब्लेटेड एआरबी 4 एलील के साथ एमपीएनएसटी कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्टिंग और एआरबी 4 पृथक्करण के प्रभावों का विश्लेषण

  1. क्रमबद्ध एमपीएनएसटी कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्टिंग करने से पहले, सुनिश्चित करें कि संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा और अनुमोदन किया जाता है, और सभी प्रक्रियाएं ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा की जाती हैं।
  2. इंजेक्शन के दिन, एक गैर-एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण समाधान (जैसे, चेलेटर का मिश्रण; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके सेल संस्कृति प्लेटों या फ्लास्क से कम मार्ग कोशिकाओं (लगभग 85% संगम) को हटा दें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। कटिस्नायुशूल तंत्रिका में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए, डीएमईएम -10 31 में 16,667 कोशिकाओं / एमएल (प्रत्येक जानवर के लिए 3 μL प्रति 50,000 कोशिकाओं) पर कोशिकाओं का पुनर्गठन करें। कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
    नोट: कुछ संस्कृतियां सफलतापूर्वक ग्राफ्ट स्थापित नहीं करेंगी जब तक कि कोशिकाओं को कम विकास कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में इंजेक्ट नहीं किया जाता है। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (10-50%) की आवश्यकता अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए।
  3. 8-10 संवेदनाहारी एचएसडी के कटिस्नायुशूल तंत्रिका में एमपीएनएसटी कोशिकाओं को इंजेक्ट करके पोस्ट-संक्रमित कोशिकाओं में विवो एलोग्राफ्ट विकास क्षमता का आकलन करें : एथिमिक न्यूड-फॉक्सन 1नू चूहों प्रति पलटन (4-8 सप्ताह की आयु)। ट्यूमर कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए, तुर्क एट अल31 देखें। यहां, एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन का प्रदर्शन किया जाता है।
    नोट: सांख्यिकीय महत्व के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक जानवरों की संख्या निर्धारित करने के लिए, एक जैव सांख्यिकीविद् से परामर्श करें या जी * पावर 3, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर32 का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  4. दर्द के किसी भी संकेत के लिए इंजेक्शन के बाद पहले सप्ताह के लिए जानवरों की बारीकी से निगरानी करें। इसके बाद, कैलिपर माप के लिए प्रति सप्ताह तीन बार ग्राफ्टेड चूहों की निगरानी करें और शरीर की स्थिति स्कोर (बीसीएस) का आकलन करें जैसा कि पहले 5,31 वर्णित है। जैसा कि आईएसीयूसी दिशानिर्देशों में उल्लिखित है, 2 या उससे कम के बीसीएस के साथ जानवरों को इच्छामृत्यु दें।
  5. जैसा कि ग्राफ्टेड कोशिकाएं अलग-अलग दरों पर बढ़ती हैं, इस खंड में वर्णित प्रयोगों को करने से पहले नियंत्रण (असंशोधित) कोशिकाओं का उपयोग करके अनुभवजन्य रूप से ग्राफ्ट समय निर्धारित करें। प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर ग्राफ्ट एकत्र करने के लिए, एक माध्यमिक उपाय के रूप में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना का उपयोग करके चूहों को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दें। प्रत्येक ग्राफ्ट की अंतिम मात्रा और द्रव्यमान माप रिकॉर्ड करें।
    नोट: असंशोधित पी 0-जीजीएफβ3 के रूप में; टीआरपी 53 +/-; एफएल एमपीएनएसटी कोशिकाएं आमतौर पर आईएसीयूसी द्वारा अनुमत अधिकतम आकार तक 30-45 दिनों के भीतर पहुंचती हैं, इंजेक्शन के लगभग 30-45 दिनों के बाद एक विशिष्ट समयरेखा होती है।
  6. चरण 1.6-1.8 में वर्णित के रूप में पृथक और अनुभाग ऊतक। 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (चित्रा 2) में रात भर ग्राफ्ट ऊतक का हिस्सा ठीक करें और फिर इसे पैराफिन में एम्बेड करें। एफएफपीई ऊतक से 5 μm वर्गों तैयार करें और उन्हें स्लाइड पर माउंट करें। एच एंड ई धुंधला और अन्य आवश्यक इम्यूनोस्टेनिंग करें ताकि यह पुष्टि हो सके कि ग्राफ्ट ऊतक ट्यूमर कोशिकाओं से बना है जैसा कि 1.8.1 में वर्णित है। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए ट्यूमर ऊतक के बाकी हिस्सों को स्नैप-फ्रीज करें, जैसे कि ईआरबी 4 अभिव्यक्ति के नुकसान को मान्य करना और अन्य एर्ब परिवार के सदस्यों की अभिव्यक्ति पर एआरबी 4 हानि के प्रभावों का आकलन करना।
    नोट: ग्राफ्ट ऊतक में ट्यूमर कोशिकाओं की पुष्टि की जानी चाहिए क्योंकि इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों को नियोप्लाज्म विकसित करने का खतरा होता है। छोटे ग्राफ्ट के मामले में, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि निशान ऊतक या सूजन नियोप्लाज्म के लिए गलत नहीं है।
    1. एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी और एडी 5 सीएमवी-सीआरई / ईजीएफपी उपचारित कोशिकाओं से उगाए गए एलोग्राफ्ट में रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए एफएफपीई ऊतक पर मानक आईएचसी धुंधला प्रदर्शन करें। दो प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच विवो ईआरबीबी 4 अभिव्यक्ति में अंतर की पुष्टि करने के लिए ईआरबी 4-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके एक्साइज्ड ग्राफ्ट ऊतक को दाग दें। केआई 67 धुंधला के माध्यम से प्रोलिफेरेटिव इंडेक्स और टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडिल ट्रांसफरेज-मध्यस्थता वाले डीयूटीपी निक-एंड लेबलिंग (ट्यूनल) धुंधला के माध्यम से एपोप्टोसिस के स्तर का निर्धारण करें।
      नोट: ब्याज के किसी भी प्रोटीन लक्ष्य का मूल्यांकन आईएचसी के माध्यम से भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जीन पृथक्करण द्वारा मध्यस्थता वाले विवो संवहनी माइक्रोएन्वायरमेंट मतभेदों में निर्धारित करने के लिए एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी (1:50 कमजोर पड़ने) के साथ इम्यूनोस्टेनिंग एलोग्राफ्ट द्वारा संवहनी घनत्व का आकलन करें। 40x क्षेत्र प्रति संवहनी प्रोफाइल की संख्या मात्रा का ठहराव के लिए गिना जा सकता है। इन आईएचसी-आधारित परखों के लिए, धुंधला प्रक्रियाओं के लिए मानक आईएचसी प्रोटोकॉल और ट्यूनेल धुंधला के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें। छवियों की मात्रा का ठहराव के लिए, इमेजजे प्लग-इन "एकल-रंग छवि की स्वचालित गिनती" का उपयोग करें।

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Representative Results

चित्रा 4 पी0-जीजीएफβ3 को स्थानांतरित करते समय प्राप्त एक विशिष्ट परिणाम को दर्शाता है; टीआरपी 53-/+; एफएल एमपीएनएसटी कोशिकाओं को या तो एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी एडेनोवायरस या एडी 5 सीएमवी-क्रे / ईजीएफपी एडेनोवायरस (चित्रा 4 ए) के साथ। संस्कृतियों को ईजीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ देखा जाता है और 10x (शीर्ष) और 40x (नीचे) पर एक ही क्षेत्र में मौजूद कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जाता है। ईजीएफपी व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना तब की जा सकती है यदि वांछित हो। प्रतिनिधि एफएसीएस आउटपुट डेटा पूरक चित्रा एस 2 में दिखाया गया है। एफएसीएस के बाद, ईजीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत स्पष्ट रूप से बढ़ जाएगा, प्रत्येक क्षेत्र में लगभग सभी कोशिकाएं ईजीएफपी व्यक्त करती हैं। अभिकर्मक दक्षता के आधार पर क्रे-मध्यस्थता जीन पृथक्करण के बाद अपेक्षित विशिष्ट पीसीआर जीनोटाइपिंग परिणाम, पूर्ण जीन नॉकआउट (100% दक्षता) या प्रेरित और प्रेरित कोशिकाओं (<100% दक्षता) की विषम आबादी नियंत्रण पारगमन परिणामों (जीएफपी केवल, एफएल / चित्रा 4 सी पी0-जीजीएफβ3 के ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट में पाए जाने वाले विशेषता हिस्टोपैथोलॉजी को दर्शाता है; टीआरपी 53 +/-; मूल जीईएम पशु मॉडल से प्राप्त ट्यूमर की तुलना में ईआरबी 4एफएल /

इन प्रयोगों में, ईआरबी 4 पृथक्करण के परिणामस्वरूप इन विट्रो और विवो में सेलुलर प्रसार और सेलुलर घनत्व में कमी आई, विवो में ट्यूनेल लेबलिंग सूचकांकों में वृद्धि हुई, और विवो में संवहनी घनत्व में कमी आई। चित्रा 5 एक छवि-आधारित स्वचालित साइटोमीटर के साथ प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है जो एडी 5 सीएमवी-क्रे एब्लेटेड कोशिकाओं बनाम नियंत्रण एडी 5 सीएमवी-जीएफपी ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं (चित्रा 5 ए) में सेलुलर प्रसार में कमी दिखा रहा है; इन प्रयोगों को प्रारंभिक मार्ग सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ किया गया था। पी0-जीजीएफβ3 में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से ईआरबीबी 4 की अभिव्यक्ति; टीआरपी 53 +/-; एडी 5 सीएमवी-क्रे या ईजीएफपी वायरस के साथ ट्रांसड्यूस्ड ईआरबी 4एफएल / एफएल एमपीएनएसटी कोशिकाओं को एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी उपचारित एलोग्राफ्ट ट्यूमर (चित्रा 5 बी) को नियंत्रित करने की तुलना में परिणामी एडी 5 सीएमवी-सीआर ट्रांसड्यूस्ड एलोग्राफ्ट में कमी आई थी। संवहनी घनत्व का मूल्यांकन सीडी 31 के लिए प्रतिरक्षात्मकता का पता लगाने के माध्यम से किया गया था; संवहनी घनत्व को एडी 5 सीएमवी-क्रे ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं (चित्रा 5 सी) के एलोग्राफ्ट में स्पष्ट रूप से कम देखा जा सकता है। इमेजजे का उपयोग करके वांछित होने पर सिग्नल तीव्रता की मात्रा निर्धारित की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: पी0-जीजीएफβ3 उत्पन्न करने और पार करते समय अपेक्षित जीनोटाइप के अनुपात की पुननेट वर्ग गणना; टीआरपी 53 +/- एर्ब 4एफएल / एफएल चूहों (एफ 1) के साथ चूहों। पी0-जीजीएफβ3 उत्पन्न करने और बनाए रखने पर अपेक्षित जीनोटाइप के अनुपात की पुननेट वर्ग गणना; टीआरपी 53-/+; + एक दूसरे के साथ (एफ 2)। संक्षिप्त नाम: फ्ल = फ्लॉक्स्ड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पी 0-जीजीएफβ3 से प्राप्त एमपीएनएसटी कोशिकाओं के प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों में फ्लॉक्स्ड एर्ब 4 एलील को कम करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया का वर्कफ़्लो; टीआरपी 53-/+; एरबी 4एफएल / एफएल चूहों। (ए) फ्लोक्स जीन को व्यक्त करने वाले ट्यूमर को हार्वेस्ट करें। (बी) एक्साइज्ड ट्यूमर से प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों का निर्माण करें। (सी) फ्लोक्स जीन को कम करने और डाउनस्ट्रीम परख करने के लिए प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों को संक्रमित करें। संक्षिप्त नाम: एमपीएनएसटी = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर; आईएचसी = इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री; पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड; एफएफपीई = फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड; एच एंड ई = हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई; जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; के/ओ = नॉकआउट; पीसीआर = पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आरएनए-सेक वर्कफ़्लो को चित्रित करने वाला योजनाबद्ध। वर्कफ़्लो का उपयोग नियंत्रण (जीएफपी-प्रेरित) और एआरबी 4-शून्य (क्रे-प्रेरित) कोशिकाओं और परिणामी जैविक महत्व के बीच अलग-अलग व्यक्त टेपों की पहचान करने के लिए किया जाता है। संक्षिप्त नाम: जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आरएनए-सेक = आरएनए अनुक्रमण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि पारगमन दक्षता परिणाम पी0-जीजीएफβ3 में माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया; टीआरपी 53-/+; एफएल एमपीएनएसटी कोशिकाओं। (ए) एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी एडेनोवायरस या एडी 5 सीएमवी-सीआरई / ईजीएफपी एडेनोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाएं। (बी) एडी 5 सीएमवी संक्रमण के बाद संभावित जीन आबादी के पीसीआर परिणाम। (सी) विशेषता हिस्टोपैथोलॉजी मूल जीईएम मॉडल में उत्पन्न ट्यूमर की तुलना ऑर्थोटोपिक रूप से एलोग्राफ्टेड पी 0-जीजीएफβ 3 से करती है; टीआरपी 53-/+; एच एंड ई धुंधला के माध्यम से ईआरबी 4एफएल / तस्वीरें 40x पर ली गई थीं। आइसोटाइप-मिलान नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग नियंत्रण धुंधला के लिए किया गया था। स्केल सलाखों = 400 μm (ए, ऊपरी पैनल); 100 μm (ए, निचला पैनल), 20 μm (सी)। संक्षिप्त नाम: एमपीएनएसटी = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर; जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; बीएफ = ब्राइटफील्ड; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई; एनईजी सीटीआरएल = नकारात्मक नियंत्रण; पीसीआर = पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; जीईएम = आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस; एफएल = फ्लॉक्स्ड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सुसंस्कृत एमपीएनएसटी प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों और ऑर्थोटोपिक रूप से एलोग्राफ्टेड एमपीएनएसटी कोशिकाओं में प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम या तो एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी या एडी 5 सीएमवी-क्रे / ईजीएफपी के साथ पारगमन के बाद (ए) सुसंस्कृत एमपीएनएसटी कोशिकाओं का प्रसार परख विज्ञापन 5 सीएमवी-क्रे / ईजीएफपी के साथ ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में सेलुलर घनत्व में कमी का प्रदर्शन करता है। परिमाणित डेटा को दिन 1, 3 और 5 (बाएं) पर रेखांकित किया जाता है। छवि-आधारित स्वचालित साइटोमीटर पर ली गई दिन 1 और दिन 5 संगम छवियों को दाईं ओर दिखाया गया है (ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ 4x आवर्धन पर ली गई छवियां)। त्रुटि सलाखों कम से कम 3 अलग स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब (एसईएम) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी या एडी 5 सीएमवी-सीआरई / ईजीएफपी एडेनोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किए गए एलोग्राफ्ट ट्यूमर में प्रतिनिधि ईआरबीबी 4 धुंधला हो जाना 20 एक्स आवर्धन पर लिया जाता है। लाल चैनल (एलेक्सा 564, सीडी 31), ब्लू चैनल (होचस्ट, नाभिक)। (सी) पी0-जीजीएफβ3 के एलोग्राफ्ट में संवहनी घनत्व की प्रतिनिधि छवियां; टीआरपी 53 +/-; एफएल एमपीएनएसटी कोशिकाओं को एडी 5 सीएमवी-ईजीएफपी बनाम एडी 5 सीएमवी-क्रे / ईजीएफपी वायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया। तस्वीरें 40x पर ली गई थीं। आइसोटाइप-मिलान नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग नियंत्रण धुंधला के लिए किया गया था। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त नाम: एमपीएनएसटी = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर; ईजीएफपी = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आईजीजी = इम्युनोग्लोबुलिन जी; एनईजी = नकारात्मक नियंत्रण; सीडी = भेदभाव का क्लस्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: योजनाबद्ध एक अनुक्रम संरेखण और विश्लेषण वर्कफ़्लो को दर्शाता है। आरएनए-अनुक्रमण फ़ाइलों (फास्टक्यू फ़ाइलों) को संरेखित और विश्लेषण करने के लिए डीएनएस्टार में उपयोग किया जाने वाला वर्कफ़्लो। संक्षिप्त नाम: जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आरएनए-सेक = आरएनए अनुक्रमण, डीईजी = अलग-अलग व्यक्त जीन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों से प्रतिनिधि एफएसीएस डेटा। (ए) गैर-संक्रमित कोशिकाओं से फ्लोरोसेंट गेट पैरामीटर सेट करने के बाद एफएसीएस द्वारा जीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं को क्रमबद्ध किया जाता है। (बी) उपयुक्त डिटेक्शन गेट सेट होने के बाद, जीएफपी-पॉजिटिव (ट्रांसड्यूस्ड) कोशिकाओं को जीएफपी-नेगेटिव (गैर-ट्रांसड्यूस्ड) कोशिकाओं से अलग किया जाता है। संक्षिप्त नाम: एसएससी-ए = चोटी का साइड स्कैटर-क्षेत्र; एफएससी-एच = चोटी की आगे बिखराव-ऊंचाई; एफएससी-डब्ल्यू = चोटी के आगे बिखराव-चौड़ाई; जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत विस्तृत विधियों को एमपीएनएसटी के जीईएम मॉडल का उपयोग करके विकसित किया गया था। हालांकि, अगर ब्याज के ट्यूमर ऊतक को व्यक्तिगत कोशिकाओं में फैलाया जा सकता है, तो ये पद्धतियां जीईएम में उत्पन्न होने वाले विभिन्न ट्यूमर प्रकारों के लिए आसानी से अनुकूलनीय हैं। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि फ्लॉक्स्ड एलील के परिणामस्वरूप i) अस्तित्व में कमी आती है जो ट्यूमर के लिए स्क्रीन करने के लिए पर्याप्त चूहों को प्राप्त करना मुश्किल बना सकती है, या ii) ट्यूमर विलंबता में वृद्धि हुई है जो पर्याप्त ट्यूमर-असर वाले चूहों को प्राप्त करना मुश्किल बना सकती है। यदि फ्लोक्स्ड एलील अस्तित्व को प्रभावित नहीं करता है, तो दोनों समूहों का अस्तित्व बराबर होगा। यदि ट्यूमर विलंबता पर इसका कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, तो ट्यूमर-असर वाले चूहों की बराबर संख्या एक समान समय पाठ्यक्रम के साथ दोनों समूहों में उत्पन्न होनी चाहिए।

इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग न्यूरोफाइब्रोमा और एमपीएनएसटी का अध्ययन करने के लिए सशर्त नॉकआउट और टैमोक्सीफेन-इंड्यूसिबल क्रे जानवरों का उपयोग करके प्रेरक सशर्त नॉकआउटजानवरों 33,34 उत्पन्न करने के लिए किया गया है। इन अध्ययनों और इस के बीच का अंतर, क्रे प्रेरण के लिए टैमोक्सीफेन के उपयोग के अलावा, जैसा कि पहले चर्चा की गई थी, यह है कि ये अध्ययन एनएफ 1 के ऊतक-विशिष्ट नॉकआउट के साथ ट्यूमर के विकास पर ध्यान केंद्रित करते हैं। चूंकि यह अध्ययन और ये अन्य अध्ययन जीईएमएम-जनित ट्यूमर का भी उपयोग करते हैं, इसलिए अंतर पूछे जाने वाले प्रश्न के साथ निहित है। इस प्रोटोकॉल में, हम उस भूमिका का अध्ययन नहीं कर रहे हैं जो एनएफ 1 हानि एमपीएनएसटी रोगजनन में निभाती है, बल्कि इसके बजाय उस भूमिका का अध्ययन कर रहे हैं जो जीईएमएम-जनित एमपीएनएसटी में एक विशिष्ट जीन (ईआरबी 4) विवो ट्यूमर के विकास में डालता है, जो अन्यथा भ्रूण घातक होने के कारण असंभव होगा। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल ऐसे मापदंडों की आवश्यकता वाले उन दृष्टिकोणों के लिए टैमोक्सीफेन के उपयोग से बचा जाता है।

दूसरों ने ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल35 में स्थापित मानव एमपीएनएसटी सेल लाइनों का अध्ययन किया है। यह अध्ययन इससे अलग है कि उपयोग की जाने वाली ग्राफ्टेड कोशिकाओं का अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है लेकिन उच्च-मार्ग मानव एमपीएनएसटी सेल लाइनें होती हैं, और यह ज़ेनोग्राफ्ट में दवा प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने पर केंद्रित होती है। वे शोधकर्ता विवो विकास और दवा प्रतिक्रिया पर जीन हानि के प्रभावों के लिए इन एमपीएनएसटी कोशिकाओं में एक विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन नहीं कर रहे हैं। इस तरह का एक अन्य अध्ययन डोड एट अल द्वारा किया गया था, एडेनोवायरस क्रे रिकॉम्बिनेज (एड-क्रे) -मध्यस्थता एनएफ 1 हानि का उपयोग एक अस्थायी और स्थानिक निर्भर तरीके से, फिर से एमपीएनएसटी ट्रांसलेशनलप्रयासों के विस्तार के लिए एक शक्तिशाली तरीका 36। अध्ययन ने एनएफ 1 और इंक 4 ए / एआरएफ हानि की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया, मानव एमपीएनएसटी में दो बहुत ही आमतौर पर सह-हटाए गए जीन, एड-क्रे इंजेक्शन द्वारा कटिस्नायुशूल तंत्रिका में। पी 0-जीजीएफβ3; टीआरपी 53 +/-; इस अध्ययन में वर्णित एर्ब 4एफएल / एफएल चूहों का उपयोग इस फैशन में एड-क्रे को श्वान सेल अग्रदूत वंशावली में इंजेक्ट करके किया जा सकता है। हालांकि, इस अध्ययन में पूछे गए प्रश्न एमपीएनएसटी दीक्षा पर ईआरबी 4 की विकासवादी भूमिका पर केंद्रित नहीं हैं, लेकिन इस बात पर कि एमपीएनएसटी ट्यूमर विकास लाभ के लिए ईआरबी 4 सिग्नलिंग का अपहरण कैसे कर सकते हैं।

यहां वर्णित दृष्टिकोण के विकल्प हैं, जिनमें आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को खटखटाना या मानव कैंसर सेल लाइनों में सीआरआईएसपीआर के साथ ब्याज के जीन को निष्क्रिय करना शामिल है। ये वैकल्पिक दृष्टिकोण मूल्यवान हैं और जीईएम ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं में जीन पृथक्करण के साथ भागीदारी की जा सकती है ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि माउस ट्यूमर कोशिकाओं में देखे गए प्रभाव उनके मानव समकक्षों में पुनरावृत्ति कर रहे हैं। हालांकि, यहां वर्णित पद्धति के कुछ स्पष्ट फायदे हैं। सबसे पहले, जीईएम कैंसर कोशिकाओं में आनुवंशिक रूप से एब्लेटिंग फ्लॉक्स्ड जीन तेजी से होता है और लक्षित जीन की पूर्ण निष्क्रियता पैदा करता है। इसके विपरीत, यह अक्सर देखा जाता है कि छोटे हेयरपिन आरएनए के उपयोग के परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति का केवल आंशिक नॉकडाउन होता है। यद्यपि सीआरआईएसपीआर पूर्ण जीन निष्क्रियता का उत्पादन कर सकता है, लेकिन पूर्ण निष्क्रियता वाले क्लोन की पहचान के लिए लंबी चयन प्रक्रिया की आवश्यकता होती है।

इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए कई क्लोनों की जांच की जानी चाहिए कि सीआरआईएसपीआर पृथक्करण से उत्पन्न प्रभाव विभिन्न क्लोनों के बीच भिन्न नहीं हैं। दूसरा, प्रारंभिक मार्ग जीईएम ट्यूमर संस्कृतियों में फ्लॉक्स्ड एलील को कम करने की क्षमता फायदेमंद है क्योंकि यह संस्कृति में प्रभावी ढंग से बढ़ने वाले अलग-अलग ट्यूमर सेल उप-आबादी के लिए चयन करने की संभावना को कम करता है। इसकी तुलना में, मानव कोशिका रेखाएं, जिन्हें आमतौर पर वर्षों से संस्कृति में बनाए रखा जाता है, अक्सर अलग-अलग उप-आबादी से प्राप्त होती हैं जो संस्कृति के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित होती हैं और अक्सर इस प्रक्रिया के दौरान आनुवंशिक बहाव से गुजरती हैं। इसके परिणामस्वरूप इन सेल लाइनों में नए उत्परिवर्तन विकसित होते हैं जो उनके मूल ट्यूमर में मौजूद नहीं थे। अंत में, हालांकि इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों में जीईएम ट्यूमर कोशिकाओं के ग्राफ्टिंग का वर्णन इस पांडुलिपि में किया गया है, यह ध्यान दिया जाता है कि इनब्रेड माउस उपभेदों में उत्पन्न होने वाले ट्यूमर से प्राप्त जीईएम ट्यूमर कोशिकाओं को एक ही तनाव के चूहों में एलोग्राफ्ट किया जा सकता है। यह अन्वेषक को लक्षित जीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली वाले जानवरों में ट्यूमर जीव विज्ञान का आकलन करने की अनुमति देगा।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम एडी 5 सीएमवी-क्रे / ईजीएफपी के साथ फ्लोक्स्ड जीन का पृथक्करण है और जीन पृथक्करण और एफएसीएस के बाद ट्यूमर कोशिकाओं के अस्तित्व को सुनिश्चित करना है। चूंकि यह एक ऐसी प्रक्रिया है जो फ्लोक्स्ड जीन को कम करने के लिए क्रे रीकॉम्बिनेज की क्षमता पर निर्भर है, यह संभावित रूप से कुछ समान समस्याओं के अधीन है जो विवो में एक फ्लॉक्स्ड जीन को कम करते समय सामना किया जा सकता है; ये मुद्दे लक्षित एलील के अधूरे पृथक्करण के रूप में प्रकट होंगे। ध्यान दें कि ईजीएफपी-एक्सप्रेसिंग एडेनोवायरल वेक्टर के साथ सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं को शुद्ध करने की क्षमता क्रीयरटी 2 के साथ विवो जीन पृथक्करण की तुलना में मोज़ेकवाद को कम करने के लिए प्रकट होती है। हालांकि, लक्षित जीन एन्कोडिंग प्रोटीन के मामले में, जैसे कि ईआरबीबी 4 जो कोशिका की सतह पर व्यक्त किए जाते हैं, ईजीएफपी और ब्याज के प्रोटीन को पहचानने वाले एंटीबॉडी दोनों का उपयोग करके एफएसीएस करके लक्षित जीन के नुकसान को और सुनिश्चित करना संभव हो सकता है (यानी, ईजीएफपी-पॉजिटिव /

क्योंकि, जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया था, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा चिकित्सीय रूप से लक्षित कई प्रोटीन सेल सतह प्रोटीन हैं, यह दृष्टिकोण अक्सर संभव होना चाहिए। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि एफएसीएस के बाद ट्यूमर कोशिकाओं को कम से कम 2-3 दिनों तक ठीक होने देना महत्वपूर्ण है यदि आरएनए-सेक उन पर किया जाना है ताकि ट्रांसक्रिप्टोम पर जीन पृथक्करण के प्रभाव का आकलन किया जा सके। एफएसीएस के तुरंत बाद प्राप्त आरएनए-सेक डेटासेट अक्सर कुछ सेल प्रकारों में जैविक प्रतिकृतियों के बीच जीन अभिव्यक्ति में अधिक परिवर्तनशीलता दिखाते हैं। यह आघात का परिणाम हो सकता है जो एफएसीएस से गुजरने पर कोशिकाओं को भुगतना पड़ता है; इसलिए, कोशिकाओं को इस प्रक्रिया के बाद पुनर्प्राप्ति अवधि की अनुमति दी जानी चाहिए। आरएनए-सेक डेटासेट का विश्लेषण डीईएसईक्यू 2 का उपयोग करके किया जा सकता है, जो वितरण के विचरण के लिए नकारात्मक द्विपद वितरण और एक संकोचन अनुमानक का उपयोग करता है। इन विश्लेषणों में, नमूनों को उनके क्यू-वैल्यू के अनुसार क्रमबद्ध किया जाता है, जो सबसे छोटी झूठी खोज दर (एफडीआर) है जिस पर प्रतिलेख स्तरों में परिवर्तन महत्वपूर्ण हैं; एफडीआर की गणना बेंजामिनी-होचबर्ग मल्टीपल टेस्टिंग एडजस्टमेंट प्रक्रिया का उपयोग करके की जाती है। वैकल्पिक रूप से, डीईजी को आरएनए-सेक विश्लेषण वर्कफ़्लो में सक्षम अन्य उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पहचाना जा सकता है।

इस एमपीएनएसटी पशु मॉडल के लिए, प्रयोगात्मक समापन बिंदु की पहचान करने के लिए उपयोग किए जा रहे पशु मॉडल में नियोप्लाज्म के प्राकृतिक इतिहास की समझ की आवश्यकता होती है। इस जीईएम में एमपीएनएसटी का प्राकृतिक इतिहास 44 पी 0-जीजीएफβ3 चूहों6 और 19 पी0-जीजीएफβ3 की एक श्रृंखला के अस्तित्व का पालन करके निर्धारित किया गया था; टीआरपी 53 +/- चूहों7 और फिर इन सभी जानवरों पर पूर्ण नेक्रोप्सी का प्रदर्शन करते हैं जब वे अपने अस्तित्व के समापन बिंदु तक पहुंच जाते हैं। विशिष्ट अस्तित्व के समय और वह स्थान जहां एमपीएनएसटी आमतौर पर उत्पन्न होते थे, प्रत्येक पशु मॉडल में निर्धारित किए गए थे। इनमें से अधिकांश चूहों में, एमपीएनएसटी ट्राइजेमिनल तंत्रिका में उत्पन्न हुए। ट्राइजेमिनल तंत्रिका में उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी ने आमतौर पर कॉर्नियल बादल (पीटोसिस द्वारा उत्पादित आंसू वितरण के साथ समस्याओं का एक परिणाम) से जुड़े पीटोसिस का उत्पादन किया, जिसने ट्यूमर-असर वाले चूहों की पहचान करने के लिए नैदानिक रूप से उपयोगी संकेत प्रदान किया। ट्यूमर निदान एच एंड ई दाग और कई अतिरिक्त नैदानिक दाग (एस 100β, नेस्टिन सोक्स 10, एच एंड ई, मार्ट 1) एक योग्य पशु चिकित्सा या मानव रोगविज्ञानी द्वारा एक परीक्षा के बाद प्रदर्शन करके पुष्टि की जानी चाहिए। यह भी महत्वपूर्ण है क्योंकि इस मॉडल में टीआरपी 53 शून्य एलील चूहों को लिम्फोमा जैसे अन्य नियोप्लाज्म के विकास के लिए पूर्वनिर्धारित करता है, और इन ट्यूमर को एमपीएनएसटी से अलग किया जाना चाहिए।

अंत में, इस पद्धति में कई संभावित अनुप्रयोग हैं जिनका अभी तक पता नहीं लगाया गया है, लेकिन भविष्य की जांच में संभव हो सकता है। उदाहरण के लिए, न्यूरेगुलिन 1 (एनआरजी 1), लिगैंड जो ईआरबीबी 3 और ईआरबीबी 4 दोनों को सक्रिय करता है, एक केमोटैक्टिक फैशन में एमपीएनएसटी कोशिकाओं के प्रवास को बढ़ावा देता है; ईआरबीबी 3 और ईआरबीबी 4 दोनों एमपीएनएसटी कोशिकाओं37 के आक्रमणकारी में स्थित हैं। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि ईआरबीबी 3 या ईआरबीबी 4 एनआरजी 1 के लिए केमोटैक्टिक प्रतिक्रिया की मध्यस्थता करता है या नहीं। नतीजतन, जिन कोशिकाओं में ईआरबीबी 4 को इस पद्धति के साथ जोड़ा जाता है, उनका उपयोग इस प्रश्न को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। इन प्रयोगों के लिए एक प्राकृतिक अनुवर्ती यह आकलन करना है कि क्या आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण का उपयोग करके मेटास्टेसिस के लिए ईआरबीबी 4 की आवश्यकता होती है जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं को पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है और फुफ्फुसीय मेटास्टेस की संख्या का मूल्यांकन किया जाता है। यह पद्धति अन्य दृष्टिकोणों पर एक स्पष्ट लाभ प्रदान करती है, जैसे कि ईआरबीबी 4 अभिव्यक्ति को खटखटाने के लिए एसएचआरएनए का उपयोग करना क्योंकि एसएचआरएनए अभिव्यक्ति अक्सर थोड़ी देर के बाद कोशिकाओं में चुप हो जाती है। इसके अलावा, प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों में ट्यूमर-व्युत्पन्न उप-जनसंख्या का मिश्रण होने का अनुमान है, जिसमें मेटास्टेसिस से ग्रस्त कोशिकाओं की उप-आबादी शामिल है। यहां वर्णित पद्धति का उपयोग करके तैयार कोशिकाओं के साथ मेटास्टेसिस परख करने से मेटास्टैटिक क्षमता का आकलन करने की अनुमति मिलेगी जो एक स्थापित सेल लाइन की तुलना में मूल ट्यूमर का अधिक प्रतिनिधि है। यह निश्चित रूप से, भविष्य के अनुप्रयोगों का सिर्फ एक उदाहरण है जो इस पद्धति का उपयोग कर सकता है। हमें उम्मीद है कि अन्य जांचकर्ता मानव कैंसर में प्रमुख चिकित्सीय लक्ष्यों वाले प्रोटीन की पहचान करने की क्षमता बढ़ाने के लिए विशेष रुचि की समस्याओं के साथ इस पद्धति को जोड़ देंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिजीज एंड स्ट्रोक (आर 01 एनएस 048353, आर 01 एनएस 10 9 655), नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट (आर 01 सीए 122804), रक्षा विभाग (एक्स 81 एक्सडब्ल्यूएच-09-1-0086, डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच -11-1-0498, डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच-12-1-0164, डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच-12-1-0164) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ad5CMV-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody Thermo/Fisher GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics Bioconductor http://www.bioconductor.org alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31 Abcam ab28364
Celigo Image Cytometer Nexcelom Bioscience N/A
Cell Stripper Corning 25-056-Cl mixture of chelators
DAB staining kit Vector Labs MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) DAVID https://david.ncifcrf.gov functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM Corning 15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) Thermo/Fisher EP0701 and K1072
erbB4 antibodies Santa Cruz sc-284
erbB4 antibodies Abcam ab35374
erbB4 antibodies Millipore HFR1: 05-1133
FACS Sorter BD Biosciences Aria II
Forskolin Sigma F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources GenomeSpace https://genomespace.org/support/tools/ general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine Corning 25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool Gorilla N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis Broad Institute N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice Envigo (Previously Harlan Labs) 69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) Illumina Hi Seq 2500 DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis DNAStar LaserGene software N/A software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly software alignment used for step 4.3 N/A software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix Corning 354230
NRG1-beta In house Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342 Thermo 62249
Panther Gene Ontology Classification System Panther http://pantherdb.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer) Partek, Ver 7 N/A software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep Corning 30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

 Eurofins Genomics Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine Fisher 51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays R&D Systems ARY003B
Real time glo Promega G9712 bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite ToppGene https://toppgene.cchmc.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) Invitrogen 15596026
Tyramide Signal Amplification Kit Perkin Elmer NEL721001EA

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 174 आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों सारकोमा क्रे-व्यक्त एडेनोवायरस प्रवाह साइटोमेट्री उत्तरजीविता परख प्रसार परख ज़ेनोग्राफ्टिंग आरएनए-सेक भ्रूण घातक नॉकआउट
घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर कोशिकाओं में फ्लोक्स्ड एलील के <em>पूर्व विवो</em> पृथक्करण द्वारा ट्यूमरजेनेसिस में जीन कार्यों को परिभाषित करना
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Longo, J. F., Brosius, S. N.,… More

Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells. J. Vis. Exp. (174), e62740, doi:10.3791/62740 (2021).

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