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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Définition des fonctions géniques dans la tumorigenèse par ablation ex vivo d’allèles floxés dans des cellules tumorales malignes de la gaine nerveuse périphérique

Published: August 25, 2021 doi: 10.3791/62740
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer des knockouts génétiques qui sont létaux embryonnaires in vivo dans des tumeurs génétiquement modifiées dérivées de modèles murins, puis évaluer l’effet que le knockout a sur la croissance tumorale, la prolifération, la survie, la migration, l’invasion et le transcriptome in vitro et in vivo.

Abstract

Le développement de nouveaux médicaments qui ciblent précisément les protéines clés dans les cancers humains modifie fondamentalement les thérapies anticancéreuses. Cependant, avant que ces médicaments puissent être utilisés, leurs protéines cibles doivent être validées en tant que cibles thérapeutiques dans des types de cancer spécifiques. Cette validation est souvent effectuée en éliminant le gène codant pour la cible thérapeutique candidate dans un modèle de cancer de souris génétiquement modifiée (GEM) et en déterminant l’effet que cela a sur la croissance tumorale. Malheureusement, des problèmes techniques tels que la létalité embryonnaire dans les knockouts conventionnels et le mosaïcisme dans les knockouts conditionnels limitent souvent cette approche. Pour surmonter ces limites, une approche d’ablation d’un gène létal embryonnaire floxé d’intérêt dans des cultures à court terme de tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST) générées dans un modèle GEM a été développée.

Cet article décrit comment établir un modèle murin avec le génotype approprié, dériver des cultures tumorales à court terme de ces animaux, puis ablation du gène létal embryonnaire floxé à l’aide d’un vecteur adénoviral qui exprime la Cre recombinase et la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). La purification des cellules transduites avec l’adénovirus à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la quantification des effets que l’ablation génique exerce sur la prolifération cellulaire, la viabilité, le transcriptome et la croissance de l’allogreffe orthotopique sont ensuite détaillées. Ces méthodologies fournissent une approche efficace et généralisable pour identifier et valider des cibles thérapeutiques in vitro et in vivo. Ces approches fournissent également une source renouvelable de cellules dérivées de tumeurs à faible passage avec des artefacts de croissance in vitro réduits. Cela permet d’étudier le rôle biologique du gène ciblé dans divers processus biologiques tels que la migration, l’invasion, les métastases et la communication intercellulaire médiée par le sécrétome.

Introduction

Avant les deux dernières décennies, le traitement des cancers humains reposait fortement sur la radiothérapie et les agents chimiothérapeutiques qui ciblaient largement les populations cellulaires proliférant rapidement en endommageant l’ADN ou en inhibant la synthèse de l’ADN. Bien que ces approches aient inhibé la croissance des cellules cancéreuses, elles ont également eu des effets secondaires délétères sur des types cellulaires normaux qui prolifèrent rapidement, tels que les cellules épithéliales intestinales et les cellules du follicule pileux. Plus récemment, le traitement du cancer a commencé à utiliser des agents chimiothérapeutiques qui ciblent précisément les protéines dans les voies de signalisation qui sont d’une importance cruciale pour la croissance du néoplasme d’un patient individuel. Cette approche, communément appelée « médecine de précision », a conduit au développement d’un répertoire sans cesse croissant d’anticorps monoclonaux et de petits inhibiteurs moléculaires. Ces agents inhibent efficacement la prolifération et la survie des cellules tumorales tout en évitant les effets secondaires délétères sur les types de cellules normales observés avec les agents chimiothérapeutiques conventionnels et la radiothérapie. Les anticorps monoclonaux utilisés pour le traitement des cancers humains ciblent le plus souvent des molécules de surface cellulaire telles que les récepteurs du facteur de croissance1 (p. ex., la grande famille des tyrosine kinases du récepteur membranaire) et les modulateurs de la réponse immunitaire2 (p. ex., protéine de mort cellulaire programmée 1, ligand de mort programmé 1). Les petits inhibiteurs moléculaires peuvent inhiber soit les protéines de surface cellulaire, soit les protéines de signalisation situées intracellulairement3. Cependant, pour utiliser efficacement ces nouveaux agents thérapeutiques, il faut établir qu’un cancer particulier dépend de la molécule ciblée par un agent thérapeutique candidat.

Bien que ces nouveaux agents thérapeutiques aient des effets plus ciblés, beaucoup d’entre eux inhibent encore l’action de plus d’une protéine. De plus, plusieurs agents avec une efficacité et une spécificité variables sont souvent disponibles pour cibler une protéine spécifique. Par conséquent, lors des investigations précliniques, il est judicieux d’utiliser des approches supplémentaires telles que l’ablation génétique pour valider une protéine candidate comme cible thérapeutique. Une approche particulièrement utile pour valider une protéine en tant que cible thérapeutique consiste à ablation du gène codant pour la protéine candidate dans un modèle animal génétiquement modifié qui développe le type de cancer spécifique d’intérêt. Cette approche peut être relativement simple si des souris porteuses d’une mutation nulle (soit une mutation naturelle, une mutation nulle génétiquement modifiée [un « knockout»], ou une mutation nulle introduite par un piège génétique) sont disponibles et que les souris sont viables à l’âge adulte. Malheureusement, les souris avec une mutation nulle qui répondent à ces critères ne sont souvent pas disponibles, généralement parce que la mutation nulle entraîne la mort embryonnaire ou dans les premiers jours de la vie postnatale. Dans cette circonstance, les souris sujettes à développer le type de tumeur d’intérêt peuvent plutôt être croisées avec des souris dans lesquelles des segments clés du gène d’intérêt sont flanqués de sites loxP (« floxed »), ce qui permet au gène d’être ablée en introduisant un transgène exprimant la Cre recombinase dans les cellules tumorales (un knockout conditionnel). Cette approche offre plusieurs avantages. Tout d’abord, si un pilote de Cre est disponible qui est exprimé dans la tumeur mais pas dans le type de cellule qui a conduit à la mort dans les knockouts conventionnels, cette approche peut potentiellement valider la cible thérapeutique candidate. Deuxièmement, l’ablation du gène codant pour la protéine candidate dans les cellules tumorales mais pas dans d’autres éléments intratumoraux tels que les fibroblastes associés à la tumeur ou les cellules immunitaires permet à l’investigateur de distinguer les effets autonomes cellulaires et non autonomes de la cible thérapeutique. Enfin, un pilote cre inductible au tamoxifène (CreERT2) permet à l’investigateur de supprimer le gène d’intérêt à différents stades du développement tumoral et de définir la fenêtre dans laquelle l’agent thérapeutique candidat est le plus susceptible d’être efficace.

Malheureusement, il existe également des problèmes techniques qui peuvent limiter l’utilisation de knockouts conditionnels dans les tumeurs survenant dans les modèles GEM. Par exemple, un facteur cre qui est exprimé dans les cellules tumorales et évite la délétion de gènes dans les cellules normales essentielles à la vie peut ne pas être disponible. Un autre problème, qui peut être sous-estimé, est que les pilotes Cre et CreERT2 ablatent souvent de manière variable les allèles floxés chez la souris, ce qui entraîne un mosaïcisme pour la mutation nulle dans un cancer GEM. Lorsque cela se produit, les cellules tumorales dans lesquelles le gène ciblé n’a pas été ablation continueront à proliférer rapidement, envahissant les cellules tumorales avec des allèles ablés. Le mosaïcisme dans les lignes pilotes de Cre peut se produire en raison de l’expression non omniprésente de Cre dans la lignée ciblée et par l’échec de la recombinaison dans des cellules individuelles indépendantes de l’expression de Cre4. Il s’agit d’un phénomène connu des facteurs de Cre qui dépend du type cellulaire et doit être pris en compte lors de la conception expérimentale et de l’interprétation des données. Le mosaïcisme peut masquer l’effet de l’assommage et amener un chercheur à conclure à tort que le gène d’intérêt n’est pas essentiel à la prolifération et/ou à la survie des cellules tumorales et n’est donc pas une cible thérapeutique valide.

Plusieurs de ces problèmes ont été rencontrés dans une étude précédente qui tentait de déterminer si le récepteur tyrosine kinase erbB4 était une cible thérapeutique potentielle dans les cellules MPNST5. Dans ces études, des souris ont été utilisées qui expriment un transgène codant pour le facteur de croissance gliale isoforme neuréguline-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) sous le contrôle du promoteur zéro de la protéine de myéline spécifique à la cellule de Schwann (souris P 0-GGFβ3). Les souris P 0-GGFβ3 développent plusieurs neurofibromes plexiformes qui progressent pour devenir des MPNST via un processus qui récapitule les processus de pathogenèse du neurofibrome et de progression du neurofibrome plexiforme-MPNST observé chez les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale autosomique dominante neurofibromatose de type 1 (NF1)6. Lorsqu’il est croisé avec des souris avec une mutation nulle Trp53, le P 0-GGFβ3 résultant; Les souris Trp53+/- développent des MPNST de novo comme on le voit dans cis-Nf1+/-; Trp53+/- souris.

Ces MPNST récapitulent la progression des lésions de grade II de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) aux lésions de grade IV de l’OMS observées chez l’homme7. Chez les souris P 0-GGFβ3, les MPNST apparaissent dans les neurofibromes plexiformes préexistants dans le nerf trijumeau (58%) et les racines du nerf dorsal spinal (68%)7; les MPNST apparaissant dans P 0-GGFβ3; Les souris Trp53+/- ont une distribution très similaire. Chez l’homme, les MPNST surviennent le plus souvent dans le nerf sciatique, suivi du plexus brachial, des racines du nerf spinal, du vagus, du fémur, de la médiane, du plexus sacré, de l’obturateur poplité et des nerfs tibia et ulnaire postérieurs8. Cette distribution tumorale dans ces modèles GEM est quelque peu différente de ce qui est vu chez l’homme. Cependant, les MPNST qui apparaissent dans P 0-GGFβ3 et P0-GGFβ3; Les souris Trp53+/- sont histologiquement identiques aux MPNST humains, portent bon nombre des mêmes mutations observées chez les MPNST humains et récapitulent le processus de progression du neurofibrome-MPNST observé chez les patients NF1. La génération de P 0-GGFβ3 ou P0-GGFβ3; Trp53+/- souris qui étaient Erbb4-/- n’était pas faisable car les souris avec deux allèles nuls Erbb4 meurent in utero au jour embryonnaire 10,5 secondaire à des malformations cardiaques9. Parce que sauver l’expression d’Erbb4 dans le cœur en introduisant un transgène Erbb4 spécifique au cœur (chaîne lourde α-myosine (CMH)-Erbb4) donne des souris Erbb4-/- viables 10, la génération de souris avec un P 0-GGFβ3 compliqué; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Le génotype Erbb4-/- a été tenté.

Cependant, les accouplements n’ont pas produit de souris dans les rapports mendéliens attendus, ce qui indique que le génotype souhaité était délétère. Par conséquent, la génération de P 0-GGFβ3; Des souris Trp53+/- avec des allèles Erbb4 floxés 11 et un pilote CreERT2 ont été tentées pour permettre la suppression d’Erbb4 dans les MPNST survenant chez ces souris. Chez ces animaux, de nombreuses cellules tumorales avec des allèles Erbb4 intacts étaient encore présentes (mosaïcisme). Le mosaïcisme observé pourrait résulter d’un apport inefficace de tamoxifène, ce qui a entraîné des différences dans l’efficacité de la recombinaison dans le tissu. La possibilité de mécanismes compensatoires spontanés pourrait contribuer davantage au mosaïcisme dans la recombinaison médiée par le tamoxifène en contournant l’exigence d’expression d’Erbb4. Il est possible que la perte de Trp53 rende les cellules tumorales sensibles à d’autres mutations spontanées « permissives » qui pourraient confondre l’interprétation des données. Comme il semblait probable que les cellules MPNST intactes d’Erbb4 masqueraient les conséquences de l’ablation d’Erbb4 dans d’autres cellules tumorales, cette approche a été abandonnée.

Ces obstacles ont conduit au développement d’une méthodologie pour ablation d’Erbb4 dans les cellules MPNST à passage très précoce à l’aide d’un adénovirus exprimant la Cre recombinase et l’eGFP. Ces cellules peuvent être séparées des cellules non infectées à l’aide de FACS, ce qui réduit considérablement le mosaïcisme du gène Erbb4 ablée. Ci-dessous, les méthodes utilisées pour y parvenir, ainsi que les méthodes utilisées pour évaluer les effets de l’ablation génique in vitro et in vivo, sont décrites. Le protocole suivant est un exemple de la façon de produire des souris porteuses de tumeurs qui produisent des tumeurs portant des allèles floxés de gènes létaux embryonnaires d’intérêt pour l’excision ex vivo avant l’évaluation de la croissance tumorale par allogreffe in vivo . Cela comprend une description des approches utilisées pour analyser l’effet que l’ablation d’Erbb4 exerce sur la prolifération des cellules tumorales, la survie et l’expression des gènes in vitro et la prolifération, la survie et l’angiogenèse dans les allogreffes orthotopiques.

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Protocol

Avant d’effectuer des procédures avec des souris, toutes les procédures doivent être examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement. Le protocole décrit dans ce manuscrit a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud. Ce protocole a été exécuté par du personnel dûment formé conformément aux directives de soins aux animaux en établissement du MUSC.

1. Génération de souris qui développent des MPNST homozygotes pour les allèles Erbb4 flox

  1. Produire la génération F1 de P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ animaux par accouplement P 0-GGFβ3; Trp53+/- souris7 avec Erbb4fl/fl souris11. Utiliser un carré de Punnett (Figure 1) pour guider le schéma de reproduction afin de s’assurer qu’un nombre suffisant de petits F1 mâles et femelles sont générés avec le P 0-GGFβ3 souhaité; Trp53+/-; Génotype Erbb4fl/+.
  2. La progéniture du génotype F1 en isolant l’ADN génomique d’une souche de queue recueillie conformément aux directives de l’IACUC, puis en effectuant une PCR à l’aide d’amorces décrites précédemment pour détecter le transgène P 0-GGFβ312, les allèles de type sauvage Trp53 (+) et nuls (-)7, et les allèles de type sauvage Erbb4flox et Erbb4 13.
    1. Isolez l’ADN de la queue à l’aide de méthodes détaillées sur jacks-lab.mit.edu/protocols.
    2. Faites le mélange de réaction PCR avec 25 ng d’ADN, 0,25 nM dNTPs, 0,02 U/μL Taq, 0,5 μM de chaque amorce et 1x tampon PCR. Effectuer une réaction pcR avec une seule incubation à 95 °C (pour faire fondre l’ADN génomique et activer Taq) pendant 1 min suivie de 35 cycles pcR de 94 °C, 10 s (fusion); 55 °C, 30 s (recuit); 72 °C, 40 s (extension) suivie d’un seul 72 °C (extension) pendant 5 min. Conservez les réactions à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à fonctionner sur un gel d’agarose à 1,2-1,5 %.
      REMARQUE: La température de recuit dépend du système tampon PCR utilisé; il est recommandé d’effectuer un gradient de température de recuit pour déterminer la température de recuit appropriée.
  3. Produire la génération F2 de P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl animaux en accoupant la descendance F1 appropriée (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) les uns avec les autres.
    REMARQUE: La figure 1 illustre les prédictions carrées de Punnet utilisées pour calculer le nombre attendu de descendants F2 avec le génotype souhaité.
  4. Identifier les animaux avec le P 0-GGFβ3 souhaité; Trp53-/+; Génotype Erbb4fl/fl tel que décrit à l’étape 1.2.
  5. Mate F2 descendance l’un à l’autre pour maintenir le P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl colonie et génotype tous les chiots. Confirmez que l’allèle floxé nouvellement introduit ne compromet pas la survie ou la latence tumorale. Atteindre cet objectif en établissant des cohortes (20 souris/cohorte) de P 0-GGFβ3; Trp53+/- et P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl souris et suivent leur survie et la fréquence d’apparition de la tumeur.
  6. Surveiller les animaux plusieurs fois par semaine jusqu’à ce que le critère d’évaluation expérimental soit atteint (taille maximale admissible de la tumeur/critère d’évaluation sans cruauté approuvé par l’IACUC).
    1. Au cours de la surveillance hebdomadaire, évaluez le poids corporel, le comportement social et de toilettage normal et les mesures de la taille de la tumeur. Organisez une évaluation vétérinaire en cas de perte de poids de >10% du poids corporel, d’isolement social et de intuition.
    2. Lorsqu’une souris porteuse de tumeur est identifiée et a atteint son point d’extrémité sans cruauté, euthanasier humainement l’animal en utilisant l’inhalation de dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale et enlever stérilement la tumeur à l’aide d’un couteau à scalpel. Prenez des mesures tumorales en mesurant la longueur, la largeur et la profondeur à l’aide d’un étrier et d’une tumeur de poids (masse et volume). Travaillez rapidement pour éviter l’autolyse.
  7. Découpez la tumeur en trois sections à l’aide de coupes de type pain avec un couteau à scalpel dans des conditions stériles afin de générer des segments tissulaires pour la fixation du formol / incorporation de paraffine (FFPE), la génération de culture de passage précoce et le matériel surgelé (Figure 2A).
    1. Assurez-vous que la section 1 (pour la génération précoce de culture de passage, étape 1.7.2) représente environ 10% du volume total de la tumeur, la section 2 (pour la fixation et l’IHC, étape 1.7.3) représente 70% du volume total de la tumeur et la section 3 (pour le gel éclair, étape 1.7.4) représente 20% du volume total de la tumeur.
    2. Prendre la rubrique 1 de la tumeur pour la préparation de cultures à passage précoce (voir ci-dessous).
    3. Fixer la section 2 de la tumeur dans du paraformaldéhyde à 4% pendant la nuit à 4 ° C, puis incorporer dans de la paraffine (incorporée de paraffine fixée au formol (FFPE) pour le bilan diagnostique.
    4. Flash-freeze section 3 pour les analyses analytiques (p. ex., immunoblots pour vérifier que la protéine codée par le gène floxé ciblé est correctement exprimée).
  8. Colorez des coupes de tissu FFPE de 5 μm d’épaisseur avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) pour confirmer le diagnostic de tumeur par un pathologiste qualifié. Le cas échéant, effectuer une coloration immunohistochimique (IHC) pour confirmer le diagnostic de la tumeur.
    1. Les MPNST immunotachés pour la protéine B (S100β) de liaison au calcium S100, la nestine et le facteur de transcription 10 (Sox10) de la région déterminante du sexe Y (SRY) - trois marqueurs qui sont exprimés dans les MPNST et les cellules de Schwann (origine des cellules tumorales)5,6,14,15. Colorez les tumeurs avec des anticorps reconnaissant erbB4, la protéine codée par le gène ciblé pour l’ablation par étapes en aval.
    2. Pour confirmer le diagnostic, demandez à un vétérinaire ou à un pathologiste humain qualifié d’évaluer toutes les lames tumorales colorées conformément aux critères de diagnostic et de classement 5,6,7,16 de l’OMS.

2. Ablation ex vivo des allèles Erbb4 floxés dans les cellules MPNST

  1. Établir des cultures à passage précoce à partir de tissus MPNST fraîchement prélevés en plaçant le tissu de la section 1 (étape 1.7.3) dans 10 mL de solution saline saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) glacée sur de la glace, puis en le transférant dans une zone de travail stérile (Figure 2B)16.
    REMARQUE: Toutes les procédures ultérieures doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire stérile.
  2. Hacher le tissu tumoral en morceaux de 2 à 4 mm et triturer 8 à 10 fois dans un plat de culture tissulaire traité de 10 cm2 avec 10 mL de milieu de croissance. Cultiver ces préparations dans un milieu de croissance DMEM-10 à haute teneur en glucose (milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de glutamine, 10 μg/mL de streptomycine et 10 UI/mL de pénicilline) complétée par 10 nM de neuréguline-1β (NRG1β) et 2 μM de forskoline. Ajouter de la forskoline à ce stade pour inhiber la croissance des types de cellules contaminantes courantes telles que les fibroblastes.
  3. Maintenir les tissus et cellules dissociés mécaniquement jusqu’à 3 jours à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % pour établir une culture de passage précoce. Ne séparez pas les cellules dispersées et les fragments de tissu restants à ce stade.
  4. Rafraîchissez les cultures avec un nouveau médium tous les 3-4 jours. Laissez les cellules tumorales proliférer jusqu’à ce qu’elles soient confluentes.
  5. Élargissez les cultures de passage précoce en divisant les cultures confluentes en plusieurs plats. Retirez le milieu de croissance et lavez les cellules avec 1x dPBS. Ensuite, ajoutez 1 mL de 0,25% de trypsine pendant 2-5 min à température ambiante par plat de culture cellulaire traité de 10 cm2 . Triturez doucement la culture pour faciliter le détachement et générer une suspension unicellulaire.
    1. Terminez la trypsinisation en ajoutant 2 mL de milieu de croissance DMEM-10. Recueillir le mélange de cellules trypsinisées et le transférer dans un tube de centrifugeuse stérile de 5 mL. Granulés les cellules par centrifugation pendant 5 min à 500 × g à température ambiante.
    2. Remettre en suspension la pastille de la cellule dans 5 mL de DMEM-10. Divisez les cellules en deux à quatre boîtes de culture cellulaire de 10 cm, chacune contenant 10 mL de milieu de croissance (environ 1 × 10à 6 cellules par plat).
  6. Après 5 passages (étapes répétées en 2.5), utilisez un milieu de croissance sans NRG1β et forskoline. Immunostain un échantillon de la culture avec un anticorps anti-S100β pour vérifier que la culture est composée uniquement de cellules tumorales. Maintenir les cellules dans le milieu de croissance DMEM-10 dans tous les passages suivants.
  7. Au passage suivant, comptez les cellules et congelez une portion de P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Cellules MPNST Erbb4fl/fl prélevées à partir de cultures confluentes (3 × 106 cellules/flacon).
  8. Plaque P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Cellules MPNST à passage précoce Erbb4fl/fl à une densité de 1,5 × 106 cellules par boîte de culture cellulaire traitée de 10 cm dans un milieu de croissance DMEM-10.
  9.  Jour 0 : (environ 12 à 16 h après le placage), laver les cultures adhérentes avec 2 à 4 mL de dPBS et infecter avec Ad5CMV-Cre/eGFP ou Ad5CMV-eGFP à environ 400 unités formant de la plaque (pfu)/cellule dans 10 mL de DMEM sans sérum (c.-à-d. 30 μL de 2 × 1010 pfu de virus par plat de 10 cm). Ablation des allèles Erbb4 floxés à l’aide de l’adénovirus à la concentration virale maximale tolérée (multiplicité de l’infection, MOI), déterminée empiriquement. Reportez-vous à la Figure 2C pour un schéma du flux de travail pour cette ablation.
  10. Jour 1 : Environ 16 h plus tard, sauvez les cultures en ajoutant 10 mL de DMEM-10 au cocktail d’infection.
  11. Jour 2 - 3: Le FACS trie les cellules infectées en suivant le protocole recommandé depuis l’installation centrale pour trier les cellules eGFP positives environ 48 h après l’infection. Avant le tri FACS, vérifiez brièvement les cellules pour le signal eGFP sur un microscope à fluorescence pour vous assurer que les cultures ont été infectées efficacement (~ 50-100% de cellules positives). Renvoyer les cellules récupérées après FACS dans des boîtes de culture tissulaire de 10 cm; réserver une antenne pour l’isolement de l’ADN génomique.
  12. Jour 4 - 5: Après le tri FACS, laissez les cellules récupérer dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins 24 à 48 h, puis préparez les cellules pour des analyses cellulaires in vitro ou une greffe in vivo . Confirmer la délétion d’Erbb4 par PCR à l’aide d’ADN génomique isolé d’une partie des cellules eGFP-positives triées. Vérifier que les cellules eGFP-positives sont ErbB4-négatives par PCR ou en immunocolorant un échantillon de la culture avec un anticorps anti-erbB4.
    1. Isoler l’ADN génomique des cellules à l’aide de la méthode standard d’isolement de l’ADN à base d’acide-guanidinium-phénol et de chloroforme17.
    2. Effectuer une PCR standard pour distinguer les allèles Erbb4 floxés et les allèles Erbb4 ablés. Effectuer 40 cycles avec 2 ng d’ADN, 20 amorces μM 1 + 2 pour produire un produit Erbb4-null de 250 bp et un produit floxé de 350 bp13. Effectuer des approches à base de PCR et d’anticorps pour confirmer l’élimination lorsqu’aucun anticorps fiable n’est disponible.
      REMARQUE: Les cellules sont prêtes pour les tests cellulaires in vitro comme décrit ci-dessous. De nombreux types d’analyses en aval peuvent être effectués avec des cellules préparées de cette manière. Le but des protocoles présentés ci-dessous est de fournir quelques exemples d’applications in vitro et in vivo de ces cellules tumorales post-ablation du gène Erbb4 .

3. Essais de prolifération et de viabilité dans les cellules MPNST avec allèles Erbb4 ablés

  1. Effectuer des tests de prolifération au cours des sept prochains jours sur des cellules MPNST triées plaquées dans une plaque multipuits à l’aide d’un cytomètre automatisé basé sur l’image.
    1. Jour 6: Plaque 2 000 cellules par puits dans un volume final de 150 μL (~13 300 cellules/mL) de milieu de croissance dans une plaque de 96 puits. Effectuer des mesures en trois exemplaires pour chaque cohorte expérimentale et 4 lectures quotidiennes des critères d’évaluation (3 réplique x 2 conditions x 4 jours).
    2. Jours 7, 9, 11, 13: Colorez les cellules avec des colorants Hoechst et à l’iodure de propidium (PI) et imagez-les sur un lecteur de plaques automatisé pour compter le nombre de cellules vivantes et mortes dans chaque puits. Pour ce faire, colorez simultanément les cellules avec le colorant Hoechst pour colorer les noyaux des cellules vivantes et mortes et avec de l’iodure de propidium (PI) pour marquer les cellules mortes. Effectuez toutes les lectures à la même heure tous les jours ou tous les deux jours.
      1. Ajouter 50 μL d’une solution de coloration 4x PI/Hoechst (4 μg/mL chacune) à chaque puits quantifié ce jour-là (p. ex., jour 7 seulement) et incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’incubateur de culture tissulaire. Gardez la plaque à l’abri de la lumière.
        REMARQUE: La concentration de coloration de Hoechst doit être déterminée empiriquement et peut varier de 1 à 10 μg / mL selon le type de cellule.
      2. Lisez les puits colorés après l’incubation en utilisant le canal fluorescent approprié sur l’imageur cellulaire automatisé. Après la lecture, retournez la plaque à l’incubateur pour les lectures futures les jours suivants (c.-à-d. les jours 9, 11, 13).
      3. Quantifier les intensités de coloration en fonction du système d’imagerie utilisé et calculer le nombre de cellules mortes, de cellules vivantes et de cellules totales en utilisant les paramètres suivants: canal bleu (377/50 nm, Hoechst): nombre total de cellules (vivantes et mortes); canal rouge (531/40 nm, PI) : cellules mortes seulement ; bleu - rouge (total - mort) = cellules vivantes.
  2. Effectuer le test de viabilité cellulaire sur trois jours, si vous le souhaitez, en suivant le protocole des fabricants du test.
    REMARQUE: Les tests de viabilité peuvent être combinés avec des tests de prolifération en effectuant une triple coloration, y compris la calcéine AM (488/32 nm; canal vert, en particulier les étiquettes des cellules vivantes), PI et Hoechst. Un test d’apoptose peut également être effectué à l’aide de cultures mises en place comme décrit ci-dessus; le protocole spécifique dépendra du système d’imagerie.
    1. Jour 6: Plaque 4 000 cellules par puits dans un volume final de 150 μL dans une plaque de 96 puits en triple.
    2. Jours 7 - 9: Ajouter 2 000 fois les réactifs de test de viabilité des cellules bioluminescentes (table des matériaux), retourner la plaque à l’incubateur et lire la plaque 1 h plus tard. Effectuez les lectures suivantes à la même heure tous les jours. Pour les essais de bioluminescence (MTT), effectuez le test exactement comme indiqué dans les instructions du fabricant toutes les 24 h pendant 72 h à l’aide d’un lecteur de plaque luminométrique.

4. Analyses ARN-Seq et identification des gènes dont l’expression est altérée par la perte d’Erbb4

  1. Jour 6: Isoler l’ARN total à partir de cellules MPNST triées à l’aide de méthodes standard à base d’acide-guanidinium-phénol et de chloroforme. Pour les expériences conçues pour détecter les changements dans les niveaux d’ARNm entre deux cohortes, préparez l’ARN total à partir d’au moins trois répliques biologiques dans chaque cohorte.
    1. Pour éliminer les événements causés par le vecteur adénoviral ou l’expression eGFP plutôt que par la perte d’Erbb4, isoler l’ARN de trois répliques biologiques de P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Cellules MPNST Erbb4fl/fl transduites avec Ad5CMV-Cre/eGFP et trois répliques biologiques transduites avec Ad5CMV-eGFP.
      REMARQUE: L’ARN isolé doit avoir un score de nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) ≥ 8 pour l’analyse ARN-Seq. Assurez-vous que le noyau de séquençage détermine le RIN de tous les échantillons avant de construire des bibliothèques.
  2. Utilisez 100 à 200 ng d’ARN total de haute qualité de chaque échantillon pour préparer les bibliothèques d’ARN-Seq (travaillez avec l’installation de séquençage du noyau pour cette étape). Effectuez un séquençage à haut débit à l’aide d’un séquenceur d’ADN de nouvelle génération. Pour la quantification de l’ARNm, effectuez un séquençage à extrémité unique pour générer des fichiers Fastq. Assurez-vous d’avoir au moins 50 millions de lectures pour chaque échantillon.
    REMARQUE : Reportez-vous à la figure 3 pour obtenir un schéma illustrant le flux de travail utilisé pour traiter les données RNA-Seq et pour quantifier l’expression des transcriptions exprimées différemment. Les données de séquence, sous la forme de fichiers Fastq, sont soumises à des procédures de contrôle de la qualité; >80% des lectures devraient donner un score Phred de 30 pour être considéré comme approprié pour une analyse ultérieure. Les séquences sont également prétraitées (découpées) à l’aide de Trimmomatic18 pour supprimer les séquences d’adaptateurs et filtrer les lectures de mauvaise qualité.
  3. Effectuez l’alignement et l’analyse ARN-Seq sur les fichiers générés par fastq à l’aide de n’importe quel logiciel compatible (par exemple, DNAStar19,20 ou Partek21). Suivez les étapes spécifiques au programme en utilisant les paramètres par défaut pour aligner les fichiers fastq sur le génome de référence de la souris (GRCm38/mm10).
    REMARQUE : En utilisant DNAStar comme exemple, le flux de travail général est décrit ci-dessous (figure supplémentaire 1).
    1. Sélectionnez la méthode d’analyse, RNA-Seq.
    2. Sélectionnez le génome de référence, Souris.
    3. Téléchargez le fichier BED s’il en fournit un par le noyau de séquençage.
    4. Téléchargez les fichiers de séquençage fastq en leur attribuant des noms de réplication uniques.
    5. Répliquez les fichiers fastq de groupe et désignez-les dans un ensemble de réplication (c.-à-d. GFP, CRE)
      REMARQUE: Chaque programme d’alignement a ses étapes spécifiques, et l’utilisateur doit consulter le guide de l’utilisateur du programme pour le protocole spécifique au programme. Le programme générera ensuite des données de comptage brutes spécifiques au gène à partir de ces fichiers Fastq.
  4. Effectuer une analyse statistique et de normalisation (DESeq2, EdgeR) sur les données de comptage brutes à l’aide de tout logiciel capable, comme décrit dans 4.3, avec l’ensemble d’échantillons Ad5CMV-eGFP comme ensemble de données de contrôle et l’ensemble Ad5CMV-Cre comme ensemble de données de test pour identifier les signaux d’expression génique différentielle avec une puissance statistique robuste22,23.
    1. Sélectionnez les fichiers GFP fastq comme ensemble de données de contrôle.
    2. Sélectionnez DESeq2 comme méthode statistique et de normalisation.
    3. Démarrez l’assemblage et l’analyse.
      REMARQUE: Chaque programme d’alignement a ses étapes spécifiques, et l’utilisateur doit consulter le guide de l’utilisateur du programme pour le protocole spécifique au programme. Le programme générera ensuite des données de comptage brutes spécifiques au gène à partir de ces fichiers Fastq. L’analyse statistique et de normalisation est une étape intégrée dans de nombreux programmes, comme indiqué dans l’exemple ici, dans le protocole d’alignement de séquence. Si un autre logiciel d’alignement de séquences est utilisé qui n’offre pas cette étape intégrée ultérieure, effectuez l’analyse statistique et de normalisation sur les données de comptage brutes au niveau du terminal à l’aide des packages de codage DESeq2 ou EdgeR écrits en R, disponibles gratuitement en téléchargement sur Bioconductor.org.
  5. Utilisez ces approches pour identifier les changements représentant au moins une augmentation ou une diminution d’au moins 1,5 fois par rapport au témoin (dans ce cas, les cellules transduites avec le virus Ad5CMV-eGFP). N’utilisez que les gènes exprimés différentiellement (DEG) jugés statistiquement significatifs qui montrent des changements de ≥1,5 fois et une valeur de p de 0,05 ou un padj de 0,1 pour une analyse ultérieure de l’enrichissement fonctionnel.
    REMARQUE: Cela générera une liste des gènes DEG et leur puissance statistique pour l’analyse de l’enrichissement fonctionnel.
  6. Effectuer une analyse d’enrichissement fonctionnel sur des DEG à médiation Erbb4 statistiquement significatifs identifiés dans 4.4 avec un fichier de liste de gènes classés à l’aide de l’un des outils Web disponibles gratuitement. Déterminer l’importance biologique et de voie de la perte de gène Erbb4 grâce à des ensembles de données d’ontologie génique intégrés dans ces outils d’analyse de l’enrichissement fonctionnel en libre accès 24,25,26,27 (voir la Table des matériaux pour des exemples et la Figure 3 pour un exemple de flux de travail utilisant Panther).
    1. Exportez les données obtenues à l’étape 4.4 sous forme de feuille de calcul.
    2. Classez les données par changement de pli log2, valeur p/padj ou les deux.
    3. Assurez-vous de supprimer toutes les données non statistiquement significatives.
    4. Exportez la liste des gènes classés avec l’ID du gène uniquement en tant que fichier .txt et téléchargez-la sur le site Web.
      REMARQUE: Utilisez uniquement des DEG statistiquement significatifs (valeurs p / padj < 0,05 ou 0,1, respectivement) pour générer une liste de gènes d’entrée classés en utilisant les changements de pli log2 (du plus haut au plus bas), les valeurs p / padj (du plus bas au plus élevé) ou les deux [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Il existe plusieurs approches pour générer une liste de gènes classés et est déterminée empiriquement pour l’ensemble de données et la question posée. Le type spécifique d’outil d’analyse de l’enrichissement fonctionnel utilisé peut également aider à déterminer le type approprié de liste de gènes de rang. Pour des ressources supplémentaires sur RNA-Seq, voir les articles suivants 28,29,30.

5. Allogreffe orthotopique de cellules MPNST avec allèles Erbb4 ablés et analyse des effets de l’ablation Erbb4

  1. Avant d’effectuer l’allogreffe orthotopique de cellules MPNST triées, assurez-vous que toutes les procédures sont examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement, et que toutes les procédures sont effectuées par un personnel dûment formé.
  2. Le jour de l’injection, prélever les cellules à faible passage (environ 85 % de confluence) des plaques ou des flacons de culture cellulaire à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire non enzymatique (p. ex., un mélange de chélateurs; voir le Tableau des matériaux) et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour les injections orthotopiques dans le nerf sciatique, reconstituer les cellules à 16 667 cellules/mL (50 000 cellules pour 3 μL pour chaque animal) dans DMEM-1031. Gardez les cellules sur la glace.
    REMARQUE: Certaines cultures n’établiront pas avec succès les greffons à moins que les cellules ne soient injectées dans une matrice de membrane basale à faible facteur de croissance. L’exigence d’une matrice de membrane basale (10-50%) doit être déterminée empiriquement.
  3. Évaluer le potentiel de croissance de l’allogreffe in vivo dans les cellules post-infectées en injectant des cellules MPNST dans le nerf sciatique de 8 à 10 souris Hsd: Athymic Nude-Foxn1 anesthésiées par cohorte (âgées de 4 à 8 semaines). Pour l’injection orthotopique de cellules tumorales, se référer à Turk et al31. Ici, une injection sous-cutanée est démontrée.
    REMARQUE: Pour déterminer le nombre d’animaux de laboratoire nécessaires à la signification statistique, consultez un biostatisticien ou il est recommandé d’utiliser G*Power3, un logiciel disponible gratuitement32.
  4. Surveillez les animaux de près deux fois par jour pendant la première semaine après l’injection pour détecter tout signe de douleur. Par la suite, surveillez les souris greffées trois fois par semaine pour les mesures d’étrier et évaluez les scores d’état corporel (BCS) comme décrit précédemment 5,31. Comme indiqué dans les lignes directrices de l’IACUC, euthanasier les animaux avec un BCS de 2 ou moins.
  5. Comme les cellules greffées se développent à des vitesses différentes, déterminez empiriquement les temps de greffon à l’aide de cellules témoins (non modifiées) avant d’effectuer les expériences décrites dans cette section. Pour recueillir les greffons au critère d’évaluation expérimental, euthanasier les souris sans cruauté en utilisant l’inhalation de dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale comme mesure secondaire. Enregistrez les mesures finales de volume et de masse de chaque greffe.
    NOTE: Comme non modifié P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Les cellules MPNST Erbb4fl / fl atteignent généralement la taille maximale autorisée par l’IACUC dans les 30 à 45 jours, un délai typique est d’environ 30 à 45 jours après l’injection.
  6. Isoler et couper le tissu comme décrit aux étapes 1.6-1.8. Fixez une partie du tissu greffé pendant la nuit dans du paraformaldéhyde à 4 % (Figure 2), puis incorporez-le dans de la paraffine. Préparez des sections de 5 μm à partir du tissu FFPE et montez-les sur des lames. Effectuer une coloration H&E et d’autres immunocolorations nécessaires pour confirmer que le tissu du greffon est composé de cellules tumorales comme décrit au point 1.8.1. Gelez le reste du tissu tumoral pour des analyses en aval, telles que la validation de la perte d’expression d’Erbb4 et l’évaluation des effets de la perte d’Erbb4 sur l’expression d’autres membres de la famille Erbb .
    REMARQUE: La confirmation des cellules tumorales dans le tissu du greffon doit être faite parce que les souris immunodéficientes sont sujettes à développer des néoplasmes. Dans le cas de petits greffons, il est important de s’assurer que le tissu cicatriciel ou l’inflammation n’est pas confondu avec un néoplasme.
    1. Effectuer une coloration IHC standard sur le tissu FFPE pour comparer l’expression des protéines d’intérêt dans les allogreffes cultivées à partir de cellules traitées Ad5CMV-eGFP et Ad5CMV-Cre/eGFP. Colorer le tissu du greffon excisé à l’aide d’anticorps spécifiques à erbB4 pour confirmer les différences d’expression in vivo d’erbB4 entre les deux conditions expérimentales. Déterminer l’indice prolifératif via la coloration Ki67 et le niveau d’apoptose via la coloration dUTP (TUNEL) médiée par la désoxynucléotidyl transférase terminale.
      REMARQUE: Toute cible protéique d’intérêt peut également être évaluée via IHC. Par exemple, évaluer la densité vasculaire en colorant immunocolorant les allogreffes avec un anticorps anti-CD31 (dilution 1:50) pour déterminer les différences in vivo de microenvironnement vasculaire médiées par l’ablation génique. Le nombre de profils vasculaires par champ 40x peut être compté pour la quantification. Pour ces tests à base d’IHC, suivez les protocoles IHC standard pour les procédures de coloration et le protocole du fabricant pour la coloration TUNEL. Pour la quantification des images, utilisez le plug-in ImageJ « comptage automatisé d’images monochromes ».

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Representative Results

La figure 4 illustre un résultat typique obtenu lors de la transduction de P 0-GGFβ3 ; Trp53-/+; Cellules MPNST Erbb4fl/fl avec l’adénovirus Ad5CMV-eGFP ou l’adénovirus Ad5CMV-Cre/eGFP (Figure 4A). Les cultures sont visualisées par microscopie à fluorescence pour identifier les cellules exprimant l’eGFP et par microscopie à contraste de phase pour déterminer le nombre total de cellules présentes dans le même champ à 10x (en haut) et 40x (en bas). Le pourcentage de cellules exprimant l’eGFP peut alors être calculé si vous le souhaitez. Les données représentatives des extrants du FACS sont présentées à la figure supplémentaire S2. Après FACS, le pourcentage de cellules exprimant l’eGFP sera nettement augmenté, pratiquement toutes les cellules de chaque champ exprimant l’eGFP. Les résultats typiques du génotypage par PCR attendus après l’ablation du gène à médiation Cre, en fonction de l’efficacité de la transfection, sont l’élimination complète du gène (efficacité de 100 %) ou une population hétérogène de cellules induites et non induites (efficacité <100 %) par rapport aux résultats de transduction de contrôle (GFP uniquement, fl/fl) (Figure 4B). La figure 4C illustre l’histopathologie caractéristique que l’on trouve dans les allogreffes orthotopiques de P 0-GGFβ3 ; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNSTs comparés aux tumeurs dérivées des modèles animaux GEM originaux.

Dans ces expériences, l’ablation d’Erbb4 a entraîné une diminution de la prolifération cellulaire et de la densité cellulaire in vitro et in vivo, une augmentation des indices de marquage TUNEL in vivo et une diminution de la densité vasculaire in vivo. La figure 5 illustre des résultats représentatifs obtenus avec un cytomètre automatisé basé sur l’image montrant une diminution de la prolifération cellulaire dans les cellules ablées Ad5CMV-Cre par rapport aux cellules transduites Ad5CMV-GFP témoins (figure 5A); ces expériences ont été réalisées avec des cellules cultivées à passage précoce. Expression d’ErbB4 par immunohistochimie dans P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Les cellules MPNST Erbb4fl/fl transduites avec le virus Ad5CMV-Cre ou eGFP ont diminué dans les allogreffes transduites Ad5CMV-Cre résultantes par rapport aux tumeurs d’allogreffe traitées par Ad5CMV-eGFP de contrôle (Figure 5B). La densité vasculaire a été évaluée par détection immunoréactivité pour CD31; la densité vasculaire peut être observée comme étant nettement réduite dans les allogreffes de cellules transduites Ad5CMV-Cre (Figure 5C). L’intensité du signal peut être quantifiée, si vous le souhaitez, à l’aide d’ImageJ.

Figure 1
Figure 1 : Calculs au carré de Punnet des rapports des génotypes attendus lors de la génération et du croisement de P 0-GGFβ3 ; Souris Trp53+/- avec souris Erbb4fl/fl (F1). Calculs au carré de Punnet des rapports des génotypes attendus lors de la génération et du maintien de P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+ les uns avec les autres (F2). Abréviation : fl = Floxed. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Flux de travail des allèles Erbb4 traités pour ablation floxés dans les cultures à passage précoce de cellules MPNST dérivées de P 0-GGFβ3 ; Trp53-/+; Erbb4fl/fl souris. (A) Récoltez la tumeur exprimant le gène floxé. (B) Créer des cultures de passage précoce à partir de la tumeur excisée. (C) Infecter les cultures à passage précoce pour ablation du gène floxé et effectuer des essais en aval. Abréviations: MPNST = tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique; IHC = Immunohistochimie; PFA = Paraformaldéhyde; FFPE = Paraffine fixée au formol; H&E = hématoxyline et éosine; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; GFP = protéine fluorescente verte; K/O = KNOCKOUT; PCR = réaction en chaîne par polymérase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schéma illustrant le flux de travail RNA-Seq. Le flux de travail est utilisé pour identifier les transcriptions exprimées différemment entre les cellules témoins (induites par la GFP) et Erbb4-null (induites par cre) et la signification biologique résultante. Abréviations: GFP = protéine fluorescente verte; Séquençage de l’ARN = séquençage de l’ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs de l’efficacité de transduction évalués par microscopie dans P 0-GGFβ3 ; Trp53-/+; Cellules MPNST Erbb4fl/fl. (A) Cellules transduites avec l’adénovirus Ad5CMV-eGFP ou l’adénovirus Ad5CMV-Cre/eGFP. (B) Résultats de la PCR des populations potentielles de gènes après l’infection par le CMV Ad5. (C) Histopathologie caractéristique comparant les tumeurs générées dans les modèles GEM d’origine au P 0-GGFβ3 orthotopiquement allogreffé; Trp53-/+; Cellules MPNST Erbb4fl/fl via coloration H&E. Les images ont été prises à 40x. Des anticorps témoins négatifs appariés à l’isotype ont été utilisés pour la coloration de contrôle. Barres d’échelle = 400 μm (A, panneau supérieur); 100 μm (A, panneau inférieur), 20 μm (C). Abréviations: MPNST = tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique; GFP = protéine fluorescente verte; BF = champ lumineux; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; Neg Ctrl = contrôle négatif; PCR = réaction en chaîne par polymérase; GEM = souris génétiquement modifiée; fl = floxé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résultats représentatifs obtenus dans des cultures à passage précoce de MPNST en culture et des cellules MPNST allogreffées orthotopiquement après transduction avec Ad5CMV-eGFP ou Ad5CMV-Cre/eGFP. (A) Essai de prolifération de cellules MPNST en culture démontrant une diminution de la densité cellulaire dans les cellules transduites avec Ad5CMV-Cre/eGFP par rapport à celles transduites avec Ad5CMV-eGFP. Les données quantifiées sont représentées graphiquement aux jours 1, 3 et 5 (à gauche). Les images de confluence des jours 1 et 5 prises sur le cytomètre automatique basé sur l’image sont montrées à droite (images prises à grossissement 4x avec microscopie en champ clair). Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (MEB) d’au moins 3 expériences indépendantes différentes. (B) Coloration représentative de l’ErbB4 dans les tumeurs allogreffes transduites par adénovirus Ad5CMV-eGFP ou Ad5CMV-Cre/eGFP pris à un grossissement de 20x. Canal rouge (Alexa 564, CD31), canal bleu (Hoechst, noyaux). (C) Images représentatives de la densité vasculaire dans les allogreffes de P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Cellules MPNST Erbb4fl/fl transduites avec le virus Ad5CMV-eGFP par rapport au virus Ad5CMV-Cre/eGFP. Les images ont été prises à 40x. Des anticorps témoins négatifs appariés à l’isotype ont été utilisés pour la coloration de contrôle. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations: MPNST = tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique; eGFP = protéine fluorescente verte améliorée; IgG = immunoglobuline G; NEG = contrôle négatif; CD = groupe de différenciation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Schéma illustrant un flux de travail d’alignement et d’analyse de séquence. Le flux de travail utilisé dans DNAStar pour aligner et analyser les fichiers de séquençage d’ARN (fichiers fastq). Abréviations: GFP = protéine fluorescente verte; SÉQUENÇAGE DE L’ARN = séquençage de l’ARN., DEG = gènes exprimés différentiellement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Données FACS représentatives provenant de cultures à passage précoce utilisant une protéine fluorescente verte. (A) Les cellules exprimant la GFP sont triées par FACS après avoir défini les paramètres de la grille fluorescente à partir de cellules non infectées. (B) Une fois que la porte de détection appropriée est définie, les cellules GFP positives (transduites) sont séparées des cellules GFP négatives (non transduites). Abréviations : SSC-A = zone de dispersion latérale du pic; FSC-H = hauteur de dispersion vers l’avant du pic; FSC-W = largeur de diffusion vers l’avant du pic; GFP = protéine fluorescente verte; FACS = Tri cellulaire activé par fluorescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Les méthodes détaillées présentées ici ont été développées à l’aide d’un modèle GEM de MPNST. Cependant, si le tissu tumoral d’intérêt peut être dispersé dans des cellules individuelles, ces méthodologies sont facilement adaptables à divers types de tumeurs survenant dans les GEM. Il est important de s’assurer que l’allèle floxé n’entraîne pas i) une diminution de la survie qui peut rendre difficile l’obtention de suffisamment de souris pour dépister les tumeurs, ou ii) une latence tumorale accrue qui peut rendre difficile l’obtention d’un nombre suffisant de souris porteuses de tumeurs. Si l’allèle floxé n’affecte pas la survie, la survie des deux cohortes sera équivalente. Si cela n’a aucun effet sur la latence tumorale, un nombre équivalent de souris porteuses de tumeurs devrait apparaître dans les deux cohortes ayant une évolution temporelle similaire.

Des approches similaires ont été utilisées pour étudier les neurofibromes et les MPNST en utilisant des knockouts conditionnels et des animaux Cre inductibles au tamoxifène pour générer des animaux knockout conditionnels inductibles33,34. La différence entre ces études et celle-ci, mis à part l’utilisation du tamoxifène pour l’induction de la Cre comme discuté précédemment, est que ces études se concentrent sur le développement de tumeurs avec un knockout tissulaire spécifique de NF1. Comme cette étude et ces autres études utilisent également des tumeurs générées par GEMM, la différence réside dans la question posée. Dans ce protocole, nous n’étudions pas le rôle que joue la perte de NF1 dans la pathogenèse du MPNST, mais nous étudions plutôt le rôle qu’un gène spécifique (Erbb4) dans les MPNST générés par GEMM exerce sur la croissance tumorale in vivo, ce qui serait autrement impossible en raison de sa létalité embryonnaire. De plus, ce protocole évite l’utilisation du tamoxifène pour les approches nécessitant de tels paramètres.

D’autres ont étudié des lignées cellulaires MPNST humaines établies dans des modèles dexénogreffe 35. Cette étude diffère de celle-ci en ce que les cellules greffées utilisées sont des lignées cellulaires MPNST humaines bien étudiées mais à haut passage, et elle se concentre sur l’établissement des réponses médicamenteuses dans les xénogreffes. Ces chercheurs n’étudient pas le rôle d’un gène spécifique dans ces cellules MPNST pour la croissance in vivo et les effets de la perte de gènes sur la réponse aux médicaments. Une autre étude similaire à celle-ci a été réalisée par Dodd et al., en utilisant la perte nf1 médiée par l’adénovirus Cre recombinase (Ad-Cre) d’une manière dépendante temporelle et spatiale, encore une fois une méthode puissante pour étendre les efforts translationnels MPNST36. L’étude s’est concentrée sur le rôle de la perte nf1 et Ink4a / Arf, deux gènes très souvent co-supprimés dans les MPNST humains, dans le nerf sciatique par injection d’Ad-Cre. Le P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Les souris Erbb4fl/fl décrites dans cette étude pourraient être utilisées de cette manière en injectant Ad-Cre dans des lignées de précurseurs cellulaires de Schwann. Cependant, les questions posées dans cette étude ne sont pas axées sur le rôle évolutif d’Erbb4 sur l’initiation du MPNST, mais sur la façon dont les MPNST peuvent détourner la signalisation Erbb4 pour un avantage de croissance tumorale.

Il existe des alternatives à l’approche décrite ici, y compris la réduction de l’expression des gènes via l’interférence ARN (ARNi) ou l’inactivation du gène d’intérêt avec CRISPR dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines. Ces approches alternatives sont précieuses et peuvent être associées à l’ablation génique dans les cellules dérivées de tumeurs GEM pour vérifier que les effets observés dans les cellules tumorales de souris sont récapitulés dans leurs homologues humains. Cependant, la méthodologie décrite ici présente des avantages évidents. Tout d’abord, l’ablation génétique des gènes floxés dans les cellules cancéreuses GEM est rapide et produit une inactivation complète du gène ciblé. En revanche, on observe souvent que l’utilisation d’ARN courts en épingle à cheveux n’entraîne qu’une chute partielle de l’expression des gènes. Bien que CRISPR puisse produire une inactivation complète des gènes, l’identification des clones qui ont une inactivation complète nécessite un processus de sélection prolongé.

De plus, plusieurs clones doivent être examinés pour s’assurer que les effets résultant de l’ablation CRISPR ne diffèrent pas entre les différents clones. Deuxièmement, la capacité d’ablation des allèles floxés dans les cultures tumorales GEM à passage précoce est avantageuse car cela minimise la possibilité de sélectionner des sous-populations de cellules tumorales distinctes qui se développent efficacement en culture. En comparaison, les lignées cellulaires humaines, qui ont généralement été maintenues en culture pendant des années, sont souvent dérivées de sous-populations distinctes qui sont bien adaptées à la culture et subissent fréquemment une dérive génétique au cours de ce processus. Il en résulte que ces lignées cellulaires développent de nouvelles mutations qui n’étaient pas présentes dans leur tumeur mère. Enfin, bien que la greffe de cellules tumorales GEM sur des souris immunodéficientes soit décrite dans ce manuscrit, il est à noter que les cellules tumorales GEM dérivées de tumeurs survenant dans des souches de souris consanguines peuvent être allogreffées chez des souris de la même souche. Cela permettrait à l’investigateur d’évaluer la biologie tumorale chez les animaux dont le système immunitaire est intact en présence ou en l’absence du gène ciblé.

L’étape critique du protocole décrit ici est l’ablation du gène floxé avec Ad5CMV-Cre/eGFP et assurant la survie des cellules tumorales après l’ablation du gène et FACS. Comme il s’agit d’un processus qui dépend de la capacité de la Cre recombinase à ablation du gène floxé, il est potentiellement sujet à certains des mêmes problèmes que ceux qui peuvent être rencontrés lors de l’ablation d’un gène floxé in vivo; ces problèmes se manifesteraient par une ablation incomplète de l’allèle ciblé. Notez que la capacité de purifier les cellules qui ont été transduites avec succès avec le vecteur adénoviral exprimant l’eGFP semble minimiser le mosaïcisme par rapport à l’ablation génique in vivo avec CreERT2. Cependant, dans le cas de gènes ciblés codant pour des protéines, telles que ErbB4 qui sont exprimées à la surface de la cellule, il peut être possible d’assurer davantage la perte du gène ciblé en effectuant facS en utilisant à la fois eGFP et un anticorps reconnaissant la protéine d’intérêt (c’est-à-dire trier les cellules eGFP-positives/erbB4-négatives).

Étant donné que, comme il a été noté dans l’introduction, de nombreuses protéines ciblées thérapeutiquement par des anticorps monoclonaux sont des protéines de surface cellulaire, cette approche devrait souvent être réalisable. Il convient également de noter qu’il est important de laisser les cellules tumorales récupérer pendant au moins 2-3 jours après FACS si RNA-Seq doit être effectué sur eux pour évaluer l’effet que l’ablation génique a eu sur le transcriptome. Les ensembles de données ARN-Seq obtenus très peu de temps après FACS montrent souvent plus de variabilité dans l’expression des gènes entre les répliques biologiques dans certains types de cellules. Cela peut être une conséquence du traumatisme que subissent les cellules lorsqu’elles passent par FACS; par conséquent, les cellules doivent avoir une période de récupération après ce processus. Les ensembles de données RNA-Seq peuvent être analysés à l’aide de DESeq2, qui utilise la distribution binomiale négative et un estimateur de retrait pour la variance de la distribution. Dans ces analyses, les échantillons sont triés en fonction de leur valeur q, qui est le plus petit taux de fausse découverte (FDR) auquel les changements dans les niveaux de transcription sont significatifs; Les FDR sont calculés à l’aide de la procédure d’ajustement des tests multiples Benjamini-Hochberg. Alternativement, les DEG peuvent être identifiés à l’aide d’autres logiciels disponibles capables de flux de travail d’analyse ARN-Seq.

Pour ce modèle animal MPNST, l’identification du critère d’évaluation expérimental nécessite une compréhension de l’histoire naturelle des néoplasmes dans le modèle animal utilisé. L’histoire naturelle des MPNST dans ce GEM a été déterminée en suivant la survie d’une série de 44 souris P 0-GGFβ36 et 19 P0-GGFβ3; Trp53+/- souris7, puis effectuer des nécropsies complètes sur tous ces animaux lorsqu’ils ont atteint leur point de survie. Les temps de survie typiques et l’endroit où les MPNST sont généralement apparus ont été déterminés dans chaque modèle animal. Chez la plupart de ces souris, des MPNST sont apparus dans le nerf trijumeau. Les MPNST survenant dans le nerf trijumeau produisaient généralement une ptose associée à une nébulosité cornéenne (résultat de problèmes de distribution des larmes produits par la ptose), ce qui fournissait un signe cliniquement utile pour identifier les souris porteuses de tumeurs. Le diagnostic tumoral doit être confirmé en effectuant des colorations H & E et plusieurs colorations diagnostiques supplémentaires (S100β, nestin Sox 10, H & E, Mart1) suivies d’un examen par un vétérinaire qualifié ou un pathologiste humain. Ceci est également important car l’allèle nul Trp53 dans ce modèle prédispose les souris au développement d’autres néoplasmes tels que les lymphomes, et ces tumeurs doivent être distinguées des MPNST.

Enfin, cette méthodologie a plusieurs applications potentielles qui n’ont pas encore été explorées, mais qui pourraient être réalisables dans de futures enquêtes. Par exemple, la neuréguline 1 (NRG1), le ligand qui active à la fois erbB3 et erbB4, favorise la migration des cellules MPNST de manière chimiotactique; erbB3 et erbB4 sont tous deux situés dans les invadopodies des cellules MPNST37. Cependant, il n’est pas clair si erbB3 ou erbB4 sert de médiateur dans la réponse chimiotactique à NRG1. Par conséquent, les cellules dans lesquelles erbB4 est ablée avec cette méthodologie peuvent être utilisées pour répondre à cette question. Un suivi naturel de ces expériences consiste à évaluer si erbB4 est nécessaire pour les métastases en utilisant l’approche couramment utilisée dans laquelle les cellules tumorales sont injectées via la veine caudale et le nombre de métastases pulmonaires ensuite évaluées. Cette méthodologie offre un net avantage par rapport à d’autres approches, telles que l’utilisation d’ARNs pour éliminer l’expression d’erbB4 , car l’expression de shRNA est souvent réduite au silence dans les cellules après un certain temps. En outre, les cultures à passage précoce devraient contenir un mélange de sous-populations dérivées de tumeurs, y compris des sous-populations de cellules sujettes aux métastases. Effectuer des tests de métastases avec des cellules préparées à l’aide de la méthodologie décrite ici permettra une évaluation du potentiel métastatique plus représentative de la tumeur mère qu’une lignée cellulaire établie. Ce n’est, bien sûr, qu’un exemple des applications futures qui pourraient utiliser cette méthodologie. Nous espérons que d’autres chercheurs combineront cette méthodologie avec des problèmes d’intérêt particulier pour améliorer la capacité d’identifier les protéines qui sont des cibles thérapeutiques clés dans les cancers humains.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (R01 NS048353, R01 NS109655), du National Cancer Institute (R01 CA122804), du ministère de la Défense (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 et W81XWH-15-1-0193) et de la Children’s Tumor Foundation (2014-04-001 et 2015-05-007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ad5CMV-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody Thermo/Fisher GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics Bioconductor http://www.bioconductor.org alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31 Abcam ab28364
Celigo Image Cytometer Nexcelom Bioscience N/A
Cell Stripper Corning 25-056-Cl mixture of chelators
DAB staining kit Vector Labs MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) DAVID https://david.ncifcrf.gov functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM Corning 15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) Thermo/Fisher EP0701 and K1072
erbB4 antibodies Santa Cruz sc-284
erbB4 antibodies Abcam ab35374
erbB4 antibodies Millipore HFR1: 05-1133
FACS Sorter BD Biosciences Aria II
Forskolin Sigma F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources GenomeSpace https://genomespace.org/support/tools/ general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine Corning 25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool Gorilla N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis Broad Institute N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice Envigo (Previously Harlan Labs) 69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) Illumina Hi Seq 2500 DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis DNAStar LaserGene software N/A software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly software alignment used for step 4.3 N/A software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix Corning 354230
NRG1-beta In house Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342 Thermo 62249
Panther Gene Ontology Classification System Panther http://pantherdb.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer) Partek, Ver 7 N/A software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep Corning 30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

 Eurofins Genomics Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine Fisher 51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays R&D Systems ARY003B
Real time glo Promega G9712 bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite ToppGene https://toppgene.cchmc.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) Invitrogen 15596026
Tyramide Signal Amplification Kit Perkin Elmer NEL721001EA

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References

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Définition des fonctions géniques dans la tumorigenèse par ablation <em>ex vivo</em> d’allèles floxés dans des cellules tumorales malignes de la gaine nerveuse périphérique
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Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells. J. Vis. Exp. (174), e62740, doi:10.3791/62740 (2021).

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