Summary
ここでは、遺伝子操作されたマウスモデル由来腫瘍において、インビボで胚致死性である遺伝子ノックアウトを行い、そのノックアウトが腫瘍の成長、増殖、生存、遊走、浸潤、およびトランスクリプトームに及ぼす影響をインビトロおよびインビボで評価するためのプロトコルを提示する。
Abstract
ヒトがんの主要タンパク質を正確に標的とする新薬の開発は、がん治療薬を根本的に変えています。しかし、これらの薬剤を使用する前に、それらの標的タンパク質を特定のがんタイプの治療標的として検証する必要があります。この検証は、多くの場合、がんの遺伝子操作マウス(GEM)モデルで治療標的候補をコードする遺伝子をノックアウトし、これが腫瘍増殖にどのような影響を与えるかを決定することによって行われます。残念なことに、従来のノックアウトにおける胚致死性や条件付きノックアウトにおけるモザイク性などの技術的問題により、このアプローチが制限されることがよくあります。これらの制限を克服するために、GEMモデルで生成された悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)の短期培養において、目的のフロックス胚致死遺伝子を切除するアプローチが開発された。
この論文では、適切な遺伝子型を持つマウスモデルを確立し、これらの動物から短期間の腫瘍培養物を導き出し、Creリコンビナーゼと増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するアデノウイルスベクターを使用して、フロックス胚致死遺伝子をアブレーションする方法を説明します。蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いたアデノウイルスを導入した細胞の精製、および遺伝子アブレーションが細胞増殖、生存率、トランスクリプトーム、および同所性同種移植片増殖に及ぼす影響の定量化が詳述される。これらの方法論は、イン ビトロおよびインビボで 治療標的を同定および検証するための効果的かつ一般化可能なアプローチを提供する 。 これらのアプローチはまた、 インビトロ 増殖アーチファクトを減少させた低継代腫瘍由来細胞の再生可能な供給源を提供する。これにより、セクレトームによって媒介される遊走、浸潤、転移、細胞間通信などの多様な生物学的プロセスにおける標的遺伝子の生物学的役割を研究することができる。
Introduction
過去20年以前、ヒトのがんの治療は、DNAを損傷したり、DNA合成を阻害したりすることによって急速に増殖する細胞集団を広く標的とする放射線療法および化学療法剤に大きく依存していました。これらのアプローチは癌細胞の増殖を阻害したが、腸上皮細胞や毛包細胞などの正常な急速に増殖する細胞型にも有害な副作用をもたらした。より最近では、がん治療は、個々の患者の新生物の増殖にとって決定的に重要なシグナル伝達経路内のタンパク質を正確に標的とする化学療法剤を利用し始めている。一般に「プレシジョンメディシン」と呼ばれるこのアプローチは、モノクローナル抗体と小分子阻害剤のレパートリーの拡大を続ける開発につながっています。これらの薬剤は、腫瘍細胞の増殖および生存を効果的に阻害する一方で、従来の化学療法剤および放射線療法で見られる正常な細胞型に対する有害な副作用を回避する。ヒト癌の治療に使用されるモノクローナル抗体は、最も一般的には、成長因子受容体1(例えば、膜貫通受容体チロシンキナーゼの大ファミリー)および免疫応答モジュレーター2(例えば、プログラム細胞死タンパク質1、プログラム死リガンド1)などの細胞表面分子を標的とする。小分子阻害剤は、細胞内に位置する細胞表面タンパク質またはシグナル伝達タンパク質のいずれかを阻害することができる3。しかしながら、これらの新しい治療薬を効果的に採用するためには、特定の癌が候補治療薬によって標的とされている分子に依存していることを確立しなければならない。
これらの新しい治療薬はより焦点を絞った効果を有するが、それらの多くは依然として複数のタンパク質の作用を阻害する。さらに、異なる有効性および特異性を有する複数の薬剤が、特定のタンパク質を標的とするためにしばしば利用可能である。したがって、前臨床研究中には、遺伝子アブレーションなどの追加のアプローチを使用して、候補タンパク質を治療標的として検証することが賢明です。治療標的としてのタンパク質を検証するための特に有用なアプローチの1つは、目的の特定の癌タイプを発症する遺伝子操作動物モデルにおいて候補タンパク質をコードする遺伝子をアブレーションすることである。このアプローチは、ヌル変異(自然突然変異、遺伝子操作されたヌル突然変異[ノックアウト]、または遺伝子トラップによって導入されたヌル突然変異のいずれか)を有するマウスが利用可能であり、マウスが成体期まで生存可能である場合、比較的単純であり得る。残念なことに、これらの基準を満たすヌル変異を有するマウスは、典型的には、ヌル突然変異が胚性または出生後の最初の日に死をもたらすため、しばしば利用できない。このような状況では、目的の腫瘍タイプを発症しやすいマウスを、目的の遺伝子の主要セグメントがloxPサイトによって隣接しているマウス(「floxed」)に交配することができ、これにより、Creリコンビナーゼを発現する導入遺伝子を腫瘍細胞に導入することによって遺伝子をアブレーションすることができる(条件付きノックアウト)。このアプローチには、いくつかの利点があります。第1に、従来のノックアウトで死をもたらした細胞型では発現しない腫瘍では発現するCreドライバーが利用可能な場合、このアプローチは候補治療標的を潜在的に検証することができる。第2に、腫瘍細胞では候補タンパク質をコードする遺伝子をアブレーションするが、腫瘍関連線維芽細胞や免疫細胞などの他の腫瘍内要素ではアブレーションしないことで、研究者は治療標的の細胞自律効果と非細胞自律効果を区別することができる。最後に、タモキシフェン誘導性Creドライバー(CreERT2)により、研究者は腫瘍発生のさまざまな段階で目的の遺伝子を削除し、候補治療薬が有効である可能性が最も高いウィンドウを定義することができます。
残念なことに、GEMモデルで生じる腫瘍における条件付きノックアウトの使用を制限する可能性のある技術的な問題もあります。例えば、腫瘍細胞で発現され、生命に不可欠な正常細胞における遺伝子欠失を回避するCreドライバは利用できない可能性がある。過小評価されるかもしれないもう一つの問題は、CreおよびCreERT2 ドライバーがしばしばマウスのフロックス対立遺伝子を可変的にアブレーションし、GEM癌におけるヌル変異のモザイク性をもたらすことである。これが起こると、標的遺伝子がアブレーションされていない腫瘍細胞は急速に増殖し続け、アブレーションされた対立遺伝子を有する腫瘍細胞を過剰増殖させる。Creドライバラインにおけるモザイク作用は、標的とする系統における非ユビキタスなCre発現、およびCre発現4とは無関係の個々の細胞における組換えの失敗によって起こり得る。これは、細胞型に依存するCreドライバの既知の現象であり、実験計画およびデータ解釈中に考慮されるべきである。モザイクはノックアウトの効果を隠し、目的の遺伝子が腫瘍細胞の増殖および/または生存に不可欠ではなく、したがって有効な治療標的ではないと誤って結論付ける研究者を導く可能性がある。
これらの問題のいくつかは、受容体型チロシンキナーゼerbB4がMPNST細胞における潜在的な治療標的であるかどうかを決定しようとした以前の研究で遭遇した5。これらの研究では、シュワン細胞特異的ミエリンタンパク質ゼロプロモーターの制御下でノイレグリン-1(NRG1)アイソフォームグリア増殖因子-β3(GGFβ3)をコードする導入遺伝子を発現するマウス(P0-GGFβ3マウス)を用いた。P0-GGFβ3マウスは、常染色体優性腫瘍感受性症候群神経線維腫1型(NF1)6の患者に見られる神経線維腫の病因および神経線維腫-MPNST進行の過程を反復するプロセスを介してMPNSTになるために進行する複数の神経線維腫を発症する。Trp53ヌル変異を有するマウスに交配すると、P0-GGFβ3を生じる;Trp53+/-マウスは、cis-Nf1+/-に見られるようにMPNSTをde novoで発症する。Trp53+/- マウス。
これらのMPNSTは、ヒトに見られる世界保健機関(WHO)グレードIIからWHOグレードIV病変への進行を要約する7。P0-GGFβ3マウスにおいて、MPNST(58%)は三叉神経(58%)および脊髄背側神経根(68%)の既存の叢状神経線維腫内で生じる7;P 0-GGFβ3において生じるMPNSTと;Trp53+/-マウスは非常によく似た分布を有する。ヒトでは、MPNSTは坐骨神経で最も一般的に発生し、続いて上腕神経叢、脊髄神経根、迷走神経、大腿骨、中央値、仙骨神経叢、膝窩閉塞器、および後脛骨および尺骨神経が続く8。これらのGEMモデルにおけるこの腫瘍分布は、ヒトで見られるものとは多少異なる。しかしながら、P0-GGFβ3およびP0-GGFβ3において生じるMPNST;Trp53+/-マウスは組織学的にヒトMPNSTと同一であり、ヒトMPNSTに見られるのと同じ変異の多くを有し、NF1患者に見られる神経線維腫-MPNST進行の過程を再現する。P0-GGFβ3またはP0-GGFβ3の生成;Erbb4-/-であったTrp53+/-マウスは、2つのErbb4ヌル対立遺伝子を有するマウスが胚発生日10.5で子宮内で死亡し、心臓欠損に続発したため、実現不可能であった9。心臓特異的Erbb4導入遺伝子(α-ミオシン重鎖(MHC)-Erbb4)を導入することによって心臓におけるErbb4発現を救出することは、生存可能なErbb4-/-マウス10をもたらすので、複雑なP0-GGFβ3を有するマウスの生成;Trp53+/-;α-MHC-Erbb4;Erbb4-/-遺伝子型が試みられた。
しかし、交配は期待されたメンデル比でマウスを産生せず、所望の遺伝子型が有害であったことを示している。したがって、P0-GGFβ3の生成;フロックス処理Erbb4対立遺伝子11およびCreERT2ドライバーを有するTrp53+/-マウスは、これらのマウスにおいて生じるMPNSTにおけるErbb4の欠失を可能にすることを試みた。これらの動物では、無傷のErbb4対立遺伝子を有する多数の腫瘍細胞が依然として存在していた(モザイクシズム)。観察されたモザイクは、非効率的なタモキシフェン送達に起因する可能性があり、その結果、組織内の組換え効率に差が生じた。自発的な代償機構の可能性は、Erbb4発現の要件をバイパスすることによって、タモキシフェン媒介性組換えにおけるモザイクズムにさらに寄与する可能性がある。Trp53の喪失は、腫瘍細胞を、データの解釈を混乱させる可能性のある追加の自発的な「許容的」突然変異の影響を受けやすくすることは可能である。Erbb4インタクトなMPNST細胞が他の腫瘍細胞でErbb4を切除することの結果を隠す可能性が高いと思われたので、このアプローチは放棄された。
これらの障害は、CreリコンビナーゼおよびeGFPを発現するアデノウイルスを用いてMPNST細胞の非常に初期の継代においてErbb4をアブレーションするための方法論の開発につながった。これらの細胞は、アブレーションされたErbb4遺伝子のモザイク性を著しく減少させるFACSを使用して非感染細胞から分離することができる。以下、これを達成するために用いられる方法を、インビトロおよびインビボでの遺伝子アブレーションの効果を評価するために使用される方法と共に、記載する。以下のプロトコールは、in vivo同種移植片腫瘍増殖評価の前に、エキソビボ切除のために目的の胚致死遺伝子のフロックス対立遺伝子を有する腫瘍を産生する担癌マウスを製造する方法の例である。これには、Erbb4アブレーションがインビトロでの腫瘍細胞の増殖、生存、および遺伝子発現に及ぼす効果、および同所性同種移植片における増殖、生存、および血管新生を分析するために使用されるアプローチの説明が含まれる。
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Protocol
マウスで処置を行う前に、すべての処置は、施設動物管理および使用委員会によって検討および承認されなければならない。この原稿に記載されているプロトコルは、サウスカロライナ医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。このプロトコルは、MUSCの施設動物ケアガイドラインに従って、適切に訓練された人員によって実施されました。
1. Erbb4 flox 対立遺伝子に対してホモ接合型のMPNSTを発育するマウスの作製
- P0-GGFβ3のF1世代を産生する;Trp53+/-;P0-GGFβ3を交配させることによるErbb4fl/+動物;Trp53+/-マウス7とErbb4 fl/flマウス11。Punnettの正方形(図1)を使用して、所望のP 0-GGFβ3で十分な雄および雌のF1子犬が生成されるように繁殖計画を導く。Trp53+/-;Erbb4fl/+ 遺伝子型。
- IACUCガイドラインに従って採取した尾部切り口からゲノムDNAを単離し、次いで前述のプライマーを用いてPCRを行い、P0-GGFβ3導入遺伝子12、Trp53野生型(+)およびヌル(-)対立遺伝子7、ならびにErbb4フロックスおよびErbb4野生型対立遺伝子13を検出することによって遺伝子型F1子孫。
- jacks-lab.mit.edu/protocols に詳述された方法を用いて尾部DNAを単離する。
- PCR 反応を 25 ng DNA、0.25 nM dNTP、0.02 U/μL Taq、0.5 μM の各プライマー、および 1x PCR バッファーと混合します。95°Cの単一のインキュベーション(ゲノムDNAを融解し、Taqを活性化する)で1分間PCR反応を行い、続いて94°C、10秒のPCRサイクルを35回(融解)します。55°C、30秒(アニーリング);72°C、40秒(伸長)に続いて72°C(伸長)を5分間1回行った。反応物を1.2〜1.5%アガロースゲル上で実行する準備ができるまで4°Cで保存する。
メモ: アニーリング温度は、使用する PCR バッファーシステムによって異なります。適切な焼鈍温度を決定するために、焼鈍温度勾配を実行することをお勧めします。
- P0-GGFβ3のF2世代を産生する;Trp53+/-;適切なF1子孫を交配させることによってErbb4fl/fl動物(P 0-GGFβ3;Trp53-/+;Erbb4fl/+) を互いに接続します。
注: 図 1 は、目的の遺伝子型を持つ F2 子孫の予想数を計算するために使用される Punnet の 2 乗予測を示しています。 - 所望のP0-GGFβ3を有する動物を同定する工程;Trp53-/+;ステップ1.2で説明したErbb4 fl/fl遺伝子型。
- F2子孫を互いにメイトしてP0-GGFβ3を維持し;Trp53-/+;Erbb4 fl/flコロニーと遺伝子型すべての子犬。新しく導入されたfloxed対立遺伝子が生存率または腫瘍潜伏時間を損なわないことを確認する。P 0-GGFβ3のコホート(20匹のマウス/コホート)を確立することによってこれを達成する;Trp53+/-およびP 0-GGFβ3;Trp53+/-;Erbb4 fl/flマウスおよびそれらの生存率および腫瘍発生頻度を追跡する。
- 実験エンドポイント(IACUCによって承認された最大許容腫瘍サイズ/人道的エンドポイント)に達するまで、週に数回動物を監視します。
- 毎週のモニタリング中に、体重、正常な社会的およびグルーミング行動、および腫瘍サイズの測定を評価する。体重の>10%の体重減少、社会的隔離、および直感の場合の獣医評価を手配する。
- 担がんマウスが同定され、その人道的なエンドポイントに達したら、二酸化炭素吸入に続いて子宮頸部脱臼を用いて動物を人道的に安楽死させ、メスナイフを用いて腫瘍を無菌的に除去する。ノギスと腫瘍の重量(質量と体積)を使用して長さ、幅、深さを測定して腫瘍を測定します。自己分解を避けるために迅速に作業してください。
- 無菌条件下でメスナイフでブレッドローフスタイルの切り傷を使用して腫瘍を3つの切片に切片し、ホルマリン固定/パラフィン包埋(FFPE)、早期継代培養生成、および急速凍結材料用の組織セグメントを生成します(図2A)。
- セクション1(早期継代培養生成の場合、ステップ1.7.2)が全腫瘍体積の約10%であり、セクション2(固定およびIHCの場合、ステップ1.7.3)が全腫瘍体積の70%であり、セクション3(フラッシュフリーズの場合、ステップ1.7.4)が全腫瘍体積の20%であることを確認する。
- 早期継代培養物の調製のために腫瘍のセクション1を取る(下記参照)。
- 腫瘍のセクション2を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで一晩固定し、次いでパラフィン(診断後処理のためのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)に包埋する。
- フラッシュフリーズセクション3は、分析分析(例えば、標的フロックス遺伝子によってコードされるタンパク質が適切に発現していることを確認するためのイムノブロット)のための。
- 5 μm厚のFFPE組織切片をヘマトキシリンとエオジン(H&E)で染色し、資格のある病理学者による腫瘍診断を確認します。必要に応じて、免疫組織化学染色(IHC)を行い、腫瘍診断を確認する。
- S100カルシウム結合タンパク質B(S100β)、ネスチン、および性決定領域Y(SRY)−ボックス転写因子10(Sox10)−MPNSTsおよびシュワン細胞(腫瘍細胞起源)の両方で発現される3つのマーカーについての免疫染色MPNSTs5、6、14、15。下流工程でアブレーションの標的となる遺伝子によってコードされるタンパク質であるerbB4を認識する抗体で腫瘍を染色する。
- 診断を確認するために、資格のある獣医またはヒト病理学者に、WHO診断およびグレーディング基準5、6、7、16に従って染色された腫瘍スライドをすべて評価させる。
2. MPNST細胞におけるフロックスErbb4対立遺伝子のエクスビボアブレーション
- セクション1の組織を氷上の氷冷滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)10mLに入れ、滅菌作業領域に移すことによって(ステップ1.7.3)、新たに採取したMPNST組織から早期継代培養を確立します(図2B)16。
注:その後のすべての手順は、滅菌組織培養フード内で実行する必要があります。 - 腫瘍組織を2〜4mm片に細かく刻み、10mLの増殖培地で10cm2処理した組織培養皿中で8〜10回トリチュレートする。これらの調製物を、10nMノイレグリン-1β(NRG1β)および2μMフォルスコリンを添加した高グルコースDMEM-10増殖培地(10%ウシ胎児血清、1%グルタミン、10μg/mLストレプトマイシン、および10IU/mLペニシリンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養する。この段階でフォルスコリンを追加して、線維芽細胞などの一般的な汚染細胞型の増殖を阻害する。
- 機械的に解離した組織および細胞を5%CO2 雰囲気中37°Cで最大3日間維持し、早期継代培養を確立した。この時点で、分散した細胞と残りの組織断片を分離しないでください。
- 3〜4日ごとに新しい培地で培養物をリフレッシュする。腫瘍細胞がコンフルエントになるまで増殖させる。
- コンフルエントな文化をいくつかの料理に分割することによって、初期の通過文化を拡大します。増殖培地を除去し、1x dPBSで細胞を洗浄する。次いで、1mLの0.25%トリプシンを、10cm2処理細胞培養皿あたり室温で2 〜5分間加える。培養物を穏やかにトリチュレートして剥離を促進し、単一細胞懸濁液を生成する。
- 2 mLのDMEM-10増殖培地を添加してトリプシン処理を終了させた。トリプシン処理した細胞混合物を回収し、5mLの滅菌遠沈管に移す。ペレットを室温で500× g で5分間遠心分離することにより細胞をペレット化する。
- 細胞ペレットを5mLのDMEM-10に再懸濁する。細胞を2~4枚の10 cm細胞培養皿に分割し、それぞれに10 mLの増殖培地(1皿あたり約1~106 個×細胞)を入れます。
- 5継代後(2.5の工程を繰り返す)、NRG1βおよびフォルスコリンを含まない増殖培地を使用する。培養物のサンプルを抗S100β抗体でイムノスタインし、培養物が腫瘍細胞のみで構成されていることを確認する。DMEM-10増殖培地中の細胞をその後の継代すべてにおいて維持する。
- 次の継代時に、細胞を数え、P0-GGFβ3の一部を凍結する。Trp53+/-;コンフルエント培養物から採取したErbb4fl/fl MPNST細胞(3×106細胞/バイアル)。
- プレートP 0-GGFβ3;Trp53+/-;Erbb4 fl/fl DMEM-10増殖培地中で処理した細胞培養皿あたり10cmあたり1.5×106細胞の密度でMPNST細胞を早期継代した。
- 0日目: (メッキ後約12~16時間)、付着培養物を2~4mLのdPBSで洗浄し、10mLの無血清DMEM中の約400プラーク形成単位(pfu)/細胞でAd5CMV-Cre/eGFPまたはAd5CMV-eGFPに感染させる(すなわち、10cmディッシュあたり2~1010pfuの ウイルスを30μL×)。経験的に決定されたように、最大許容ウイルス濃度(感染の多重度、MOI)でアデノウイルスを使用して、フロックス Erbb4 対立遺伝子をアブレートする。このアブレーションのワークフローの概略については、 図2C を参照してください。
- 1日目: 約16時間後、10mLのDMEM-10を感染カクテルに添加して培養物を救出する。
- 2日目 - 3日目: FACSは、コア施設からの推奨プロトコルに従って感染細胞を選別し、感染後約48時間でeGFP陽性細胞を選別します。FACSソーティングの前に、蛍光顕微鏡で細胞のeGFPシグナルを簡単にチェックし、培養物が効率的に感染していることを確認してください(〜50〜100%陽性細胞)。FACS後に回収した細胞を10cm組織培養皿に戻す;ゲノムDNA単離のために1皿を予約する。
- 4 - 5日目: FACSソーティング後、細胞を組織培養インキュベーター内で少なくとも24〜48時間回収させ、次いで 、in vitro 細胞ベースの分析またはin vivo 移植のために細胞を準備する。選別されたeGFP陽性細胞の一部から単離されたゲノムDNAを用いたPCRを介して Erbb4 欠失を確認する。eGFP陽性細胞がErbB4陰性であることを確認するには、PCRまたは培養物のサンプルを抗 erbB4抗体で免疫染色します。
- 標準的な酸-グアニジニウム-フェノールおよびクロロホルムベースのDNA単離法17を使用して、細胞からゲノムDNAを単離する。
- 標準 PCR を実行して、フロックス Erbb4 対立遺伝子とアブレーション Erbb4 対立遺伝子を区別します。2 ng DNA、20 μM プライマー 1 + 2 で 40 サイクルを実行し、250 bp の Erbb4-null 産物および 350 bp のフロックス化産物13 を生成します。PCR と抗体ベースのアプローチの両方を実行して、信頼できる抗体が入手できない場合にノックアウトを確認します。
注:細胞は、以下に説明するように、in vitro細胞ベースのアッセイの準備ができています。多くのタイプの下流分析は、このようにして調製された細胞を用いて行うことができる。以下に提示するプロトコールの目的は、Erbb4遺伝子のアブレーション後のこれらの腫瘍細胞のインビトロおよびインビボ適用のいくつかの例を提供することである。
3. アブレーションされた Erbb4 対立遺伝子を用いたMPNST細胞における増殖および生存率アッセイ
- 画像ベースの自動サイトメーターを使用して、マルチウェルプレートに播種した選別MPNST細胞について、次の7日間にわたって増殖アッセイを実行します。
- 6日目: 96ウェルプレートに150 μL(〜13,300細胞/mL)の増殖培地の最終容量で、1ウェルあたり2,000細胞のプレート。各実験コホートと4つの毎日のエンドポイント読み取り(3反復 x 2条件 x 4日)について3連で測定を実行します。
-
7日目、9日目、11日目、13日目:ヘキスト色素とヨウ化プロピジウム(PI)色素で細胞を染色し、自動プレートリーダーで画像化して、各ウェルの生細胞と死細胞の数をカウントします。これを達成するために、同時にヘキスト色素で細胞を染色して生細胞と死細胞の両方の核を染色し、ヨウ化プロピジウム(PI)で死細胞を標識します。毎日または1日おきにすべての読み取りを同時に実行します。
- その日に定量した各ウェルに4x PI/ヘキスト染色溶液(それぞれ4 μg/mL)を50 μL加え(例えば、7日目のみ)、組織培養インキュベーター内で37°Cで30分間インキュベートする。プレートを光から保護してください。
注:ヘキストの染色濃度は経験的に決定する必要があり、細胞タイプに応じて1〜10μg/mLの範囲であり得る。 - インキュベーション後に染色されたウェルを、自動細胞イメージャー上の適切な蛍光チャネルを用いて読み取ります。読み取り後、プレートをインキュベーターに戻して、次の日(つまり、9日目、11日目、13日目)に将来の読み取りを行います。
- 使用したイメージングシステムに基づいて染色強度を定量化し、次の設定を使用して死細胞、生細胞、および総細胞の数を計算します:青色チャネル(377/50nm、ヘキスト):総細胞(生および死)。赤色チャネル(531/40nm、PI):死細胞のみ;青 - 赤(合計 - 死んだ)=生細胞。
- その日に定量した各ウェルに4x PI/ヘキスト染色溶液(それぞれ4 μg/mL)を50 μL加え(例えば、7日目のみ)、組織培養インキュベーター内で37°Cで30分間インキュベートする。プレートを光から保護してください。
- 細胞生存率アッセイを3日間にわたって行い、所望により、アッセイ製造業者のプロトコールに従う。
注:生存率アッセイは、カルセインAM(488/32nm;緑色チャネル、特に生細胞を標識)、PI、およびヘキストを含むトリプル染色を行うことによって、増殖アッセイと組み合わせることができる。アポトーシスアッセイはまた、上記のようにセットアップされた培養物を用いて行われてもよい;特定のプロトコルは、イメージングシステムに依存します。- 6日目: 150 μLの最終容量で1ウェルあたり4,000個の細胞を3連の96ウェルプレートにプレートします。
- 7 - 9日目: 2,000倍の生物発光細胞生存率アッセイ試薬(材料表)を添加し、プレートをインキュベーターに戻し、1時間後にプレートを読み取る。後続の読み取りを毎日同じ時刻に実行します。生物発光(MTT)アッセイの場合、ルミノメータープレートリーダーを使用して、24時間ごとに72時間、製造元の指示書に記載されているとおりにアッセイを実行します。
4. RNA-Seq解析と Erbb4 損失により発現が変化する遺伝子の同定
- 6日目: 標準的な酸 - グアニジニウム - フェノールおよびクロロホルムベースの方法を使用して、選別されたMPNST細胞から総RNAを単離する。2つのコホート間のmRNAレベルの変化を検出するように設計された実験では、各コホート内の少なくとも3つの生物学的複製から総RNAを調製する。
- Erbb4損失ではなくアデノウイルスベクターまたはeGFP発現によって引き起こされる事象を排除するために、P0-GGFβ3の3つの生物学的複製からRNAを単離する;Trp53+/-;Ad5CMV-Cre/eGFPで形質導入されたErbb4fl/fl MPNST細胞およびAd5CMV-eGFPで形質導入された3つの生物学的複製。
注: 単離された RNA は、RNA-Seq 分析の場合、RNA 完全性番号 (RIN) スコアが 8 ≥ている必要があります。ライブラリを構築する前に、シーケンシングコアがすべてのサンプルのRINを決定することを確認してください。
- Erbb4損失ではなくアデノウイルスベクターまたはeGFP発現によって引き起こされる事象を排除するために、P0-GGFβ3の3つの生物学的複製からRNAを単離する;Trp53+/-;Ad5CMV-Cre/eGFPで形質導入されたErbb4fl/fl MPNST細胞およびAd5CMV-eGFPで形質導入された3つの生物学的複製。
- 各サンプルから 100 ~ 200 ng の高品質のトータル RNA を使用して RNA-Seq ライブラリを調製します (このステップでは、コアシーケンシング施設と連携します)。次世代DNAシークエンサーを用いたハイスループットシーケンシングを行います。mRNA 定量の場合は、シングルエンドシーケンシングを実行して Fastq ファイルを生成します。各サンプルに対して最低 5,000 万回の読み取りを行うようにします。
注:RNA-Seqデータの処理および発現差のある転写産物の発現の定量化に使用されるワークフローを示す概略図については、 図3 を参照してください。Fastqファイルの形式のシーケンスデータは、品質管理手順の対象となります。読み取りの >80% は、その後の分析に適切であると考えられる Phred スコア 30 を生成する必要があります。また、Trimmomatic18 を使用してシーケンスを前処理 (トリミング) し、アダプター配列を除去し、低品質の読み取りを除外します。 - 任意の可能なソフトウェアプログラム(例えば、DNAStar 19,20またはPartek21)を使用して、fastq生成されたファイルに対してRNA-Seqアライメントおよび分析を実行します。デフォルト設定を使用してプログラム固有の手順に従い、fastq ファイルをマウス参照ゲノム (GRCm38/mm10) にアライメントします。
メモ: DNAStar を例にとると、一般的なワークフローを以下に説明します(補足図 1)。- 解析方法として、 RNA-Seqを選択します。
- 参照ゲノム のマウスを選択します。
- BED ファイルがシーケンス コアによって提供されている場合は、BED ファイルをアップロードします。
- fastq シーケンス・ファイルをアップロードし、固有の複製名を割り当てます。
- fastqファイルをグループ・レプリケートし、レプリケート・セット( GFP、CRE)に指定する
メモ: 各アライメントプログラムには固有の手順があり、プログラム固有のプロトコルについては、プログラムユーザーズガイドに問い合わせる必要があります。プログラムは、これらのFastqファイルから遺伝子固有の生カウントデータを生成します。
- Ad5CMV-eGFPサンプルセットを対照データセットとして、Ad5CMV-Creセットをテストデータセットとして、4.3に記載されているように、任意の可能なソフトウェアプログラムを使用して、生カウントデータに対して統計的および正規化分析(DESeq2、EdgeR)を実行し、堅牢な統計的検出力22,23を有する差動遺伝子発現シグナルを同定する。
- GFP fastq ファイルを制御データ・セットとして選択します。
- 統計および正規化の方法として DESeq2 を選択します。
- アセンブリと解析を開始します。
メモ: 各アライメントプログラムには固有の手順があり、プログラム固有のプロトコルについては、プログラムユーザーズガイドに問い合わせる必要があります。プログラムは、これらのFastqファイルから遺伝子固有の生カウントデータを生成します。統計分析および正規化分析は、ここの例に示すように、配列アラインメントプロトコル内の多くのプログラムに組み込まれたステップです。この後続の組み込みステップを提供しない代替配列アラインメントソフトウェアプログラムを使用する場合は、Bioconductor.org で自由にダウンロードできるRで書かれたDESeq2またはEdgeRコーディングパッケージを使用して、端末レベルで生カウントデータに対して統計的および正規化分析を実行します。
- これらのアプローチを使用して、対照(この場合、Ad5CMV-eGFPウイルスで形質導入された細胞)に対して少なくとも1.5倍の増加または減少を表す変化を同定する。その後の機能エンリッチメント分析には、≥1.5倍の変化と p値0.05または0.1のpadjを示す統計的に有意であると判断された発現差遺伝子(DEG)のみを使用してください。
注:これにより、DEG遺伝子のリストと、機能的エンリッチメント解析のためのそれらの統計的検出力が生成されます。 - 4.4で同定された統計的に有意なErbb4媒介性DEGについて、自由に利用可能なWebベースのツールのいずれかを使用して、ランク付けされた遺伝子リストファイルを使用して機能エンリッチメント分析を実行します。これらのオープンアクセス機能濃縮解析ツール24、25、26、27に統合された遺伝子オントロジーデータセットを通じて、Erbb4遺伝子損失の生物学的および経路的意義を決定する(例については材料表を、Pantherを用いたワークフローの例については図3を参照)。
- 手順 4.4 で取得したデータをスプレッドシートとしてエクスポートします。
- log2 フォールド変更、p/padj 値、またはその両方によってデータをランク付けします。
- 統計的に有意でないデータはすべて削除してください。
- 遺伝子IDのみでランク付けされた遺伝子リストを.txtファイルとしてエクスポートし、ウェブサイトにアップロードします。
注: log2 倍の変化 (最高から最低へ)、p/padj 値 (最低から最高へ)、またはその両方 [(-log10(pval)*sign(log2FC)] を使用してランク付けされた入力遺伝子リストを生成するには、統計的に有意な DEG (それぞれ 0.05 または 0.1 <の p/padj 値) のみを使用します。ランク付けされた遺伝子リストを生成するにはいくつかのアプローチがあり、データセットと尋ねられる質問について経験的に決定されます。使用されている特定のタイプの機能的エンリッチメント解析ツールは、適切なタイプのランク遺伝子リストを決定するのにも役立ち得る。RNA-Seqに関するその他のリソースについては、以下の論文28、29、30を参照してください。
5. アブレーションErbb4対立遺伝子を有するMPNST細胞の同所性同種移植とErbb4アブレーションの効果の解析
- 選別されたMPNST細胞の同所性同種移植を行う前に、すべての手順が施設動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認され、すべての手順が適切に訓練された人員によって行われていることを確認してください。
- 注射の日に、非酵素細胞解離溶液(例えば、キレート剤の混合物; 材料表を参照)を用いて細胞培養プレートまたはフラスコから低継代細胞(約85%のコンフルエント)を除去し、血球計数器を用いて細胞を計数する。坐骨神経への同所性注射の場合、DMEM-10 31で細胞を16,667細胞/mL(各動物3μLあたり50,000細胞)で再構成する。細胞を氷の上に保ちます。
注:一部の培養物は、細胞が低成長因子基底膜マトリックスに注入されない限り、移植片を首尾よく確立しない。基底膜マトリックス(10〜50%)の要件は、経験的に決定されなければならない。 - 8〜10個の麻酔処理されたHsd:Athymic Nude-Foxn1 nuマウスのコホートあたり(4〜8週齢)の坐骨神経にMPNST細胞を注入することによって、感染後細胞におけるインビボ同種移植片増殖能を評価する 。腫瘍細胞の同所性注射については、Turkら31を参照されたい。ここでは、皮下注射が実証される。
注:統計的有意性に必要な実験動物の数を決定するには、生物統計学者に相談するか、無料で入手可能なソフトウェアであるG * Power3を使用することをお勧めします32。 - 注射後最初の1週間、1日2回、痛みの兆候がないか動物を注意深く監視してください。その後、ノギス測定のために週に3回移植マウスを監視し、前述のように体調スコア(BCSs)を評価する5、31。IACUCガイドラインに概説されているように、BCSが2以下の動物を安楽死させる。
- 移植された細胞が異なる速度で増殖するにつれて、このセクションで説明する実験を行う前に、対照(未修飾)細胞を用いて経験的に移植時間を決定する。実験エンドポイントで移植片を採取するには、二酸化炭素吸入に続いて頸部脱臼を二次的尺度として使用してマウスを人道的に安楽死させる。各移植片の最終的な体積および質量測定値を記録する。
注:未修飾のP0-GGFβ3として;Trp53+/-;Erbb4 fl/fl MPNST細胞は、典型的には、30〜45日以内にIACUCによって許容される最大サイズに達し、典型的なタイムラインは、注射後約30〜45日である。 - ステップ1.6〜1.8で説明したように組織を単離し、切片化する。移植片組織の一部を4%パラホルムアルデヒド(図2)で一晩固定し、パラフィンに埋め込む。FFPE組織から5μm切片を作製し、スライドにマウントする。H&E染色およびその他の必要な免疫染色を実行して、移植組織が1.8.1に記載されているように腫瘍細胞で構成されていることを確認します。Erbb4発現の喪失を検証し、他のErbbファミリーメンバーの発現に対するErbb4損失の影響を評価するなど、下流の分析のために腫瘍組織の残りをスナップフリーズする。
注:免疫不全マウスは新生物を発症しやすいため、移植組織中の腫瘍細胞の確認を行わなければならない。小さな移植片の場合、瘢痕組織または炎症が新生物と間違えられないようにすることが重要です。- FFPE組織に対して標準的なIHC染色を行い、Ad5CMV-eGFPおよびAd5CMV-Cre/eGFP処理細胞から増殖させた同種移植片における目的タンパク質の発現を比較します。erbB4特異的抗体を用いて摘出した移植片組織を染色し、2つの実験条件間の in vivo erbB4発現の違いを確認した。Ki67染色による増殖指数と、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンド標識(TUNEL)染色によるアポトーシスのレベルを決定します。
注:目的のタンパク質標的は、IHCを介して評価することもできます。例えば、同種移植片を抗CD31抗体(1:50希釈)で免疫染色して血管密度を評価し、遺伝子アブレーションによって媒介されるインビボ血管微小環境の違いを決定する。40xフィールドあたりの血管プロファイルの数は、定量化のためにカウントすることができます。これらのIHCベースのアッセイでは、染色手順については標準的なIHCプロトコル、TUNEL染色については製造元のプロトコルに従ってください。画像の定量化には、ImageJプラグイン「単色画像の自動カウント」を使用してください。
- FFPE組織に対して標準的なIHC染色を行い、Ad5CMV-eGFPおよびAd5CMV-Cre/eGFP処理細胞から増殖させた同種移植片における目的タンパク質の発現を比較します。erbB4特異的抗体を用いて摘出した移植片組織を染色し、2つの実験条件間の in vivo erbB4発現の違いを確認した。Ki67染色による増殖指数と、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンド標識(TUNEL)染色によるアポトーシスのレベルを決定します。
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Representative Results
図4は、P0-GGFβ3を形質導入するときに得られる典型的な結果を示す;Trp53-/+;Ad5CMV-eGFPアデノウイルスまたはAd5CMV-Cre/eGFPアデノウイルスのいずれかを有するErbb4fl/fl MPNST細胞(図4A)。培養物を蛍光顕微鏡で観察してeGFP発現細胞を同定し、位相差顕微鏡で10倍(上)と40倍(下)で同じフィールドに存在する細胞の総数を決定します。次に、eGFPを発現する細胞の割合を、所望により計算することができる。代表的なFACS出力データを補足図S2に示す。FACSに続いて、eGFP発現細胞の割合は著しく増加し、各分野の事実上すべての細胞がeGFPを発現します。Cre媒介遺伝子アブレーション後に期待される典型的なPCRジェノタイピング結果は、トランスフェクション効率に応じて、完全な遺伝子ノックアウト(100%効率)または誘導細胞と非誘導細胞の不均一な集団(<100%効率)であり、対照形質導入結果(GFPのみ、fl/fl)(図4B)。図4Cは、P0-GGFβ3の同所性同種移植片に見られる特徴的な組織病理学を示す;Trp53+/-;Erbb4 fl/fl MPNSTsは、元のGEM動物モデルに由来する腫瘍と比較した。
これらの実験において、Erbb4アブレーションは、インビトロおよびインビボでの細胞増殖および細胞密度の低下、インビボでのTUNEL標識指数の増加、およびインビボでの血管密度の低下をもたらした。図5は、Ad5CMV−Creアブレーション細胞対対照Ad5CMV−GFP形質導入細胞における細胞増殖の減少を示す画像ベースの自動サイトメーターで得られた代表的な結果を示す(図5A);これらの実験は、継代培養細胞を早期に用いて行った。P0-GGFβ3における免疫組織化学を介したErbB4の発現;Trp53+/-;Ad5CMV-CreまたはeGFPウイルスで形質導入されたErbb4fl/fl MPNST細胞は、得られたAd5CMV-Cre形質導入同種移植片において、対照のAd5CMV-eGFP処理同種移植片腫瘍と比較して減少した(図5B)。血管密度は、CD31の免疫反応性検出を介して評価した;血管密度は、Ad5CMV−Cre形質導入細胞の同種移植片において顕著に低下することがわかる(図5C)。シグナル強度は、必要に応じて、ImageJを使用して定量化することができます。
図1:P0-GGFβ3を生成して交差させる際の予想される遺伝子型の比率のパンネット二乗計算;Trp53+/- Erbb4fl/flマウス(F1)を有するマウス。P 0-GGFβ3を生成および維持する際の予想される遺伝子型の比率のパンネット二乗計算;Trp53-/+;Erbb4fl/+ を互いに (F2)。省略形: fl = フロックス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:P0-GGFβ3に由来するMPNST細胞の早期継代培養においてフロックスErbb4対立遺伝子をアブレーションするために使用されるプロセスのワークフロー;Trp53-/+;Erbb4 fl/flマウス。(a)フロックス遺伝子を発現する腫瘍を採取する。(B)摘出した腫瘍から早期継代培養物を作成する。(C)継代初期培養物に感染してフロックス遺伝子をアブレーションし、下流アッセイを行う。略語:MPNST=悪性末梢神経鞘腫瘍;IHC = 免疫組織化学;PFA = パラホルムアルデヒド;FFPE = ホルマリン固定パラフィン埋め込み;H&E = ヘマトキシリンおよびエオジン;FACS = 蛍光活性化細胞ソーティング;GFP = 緑色蛍光タンパク質;K / O = ノックアウト;PCR = ポリメラーゼ連鎖反応。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RNA-Seqワークフローを示す概略図。このワークフローは、コントロール細胞(GFP誘導)細胞とErbb4-null細胞(Cre誘導)の間で発現差のある転写産物と、結果として生じる生物学的意義を同定するために使用されます。略語:GFP=緑色蛍光タンパク質;RNA-Seq = RNAシーケンシング。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:P0-GGFβ3における顕微鏡検査により評価された代表的な形質導入効率結果;Trp53-/+;Erbb4 fl/fl MPNST 細胞。(A)Ad5CMV-eGFPアデノウイルスまたはAd5CMV-Cre/eGFPアデノウイルスのいずれかで形質導入された細胞。(b)Ad5CMV感染後の潜在的な遺伝子集団のPCR結果。(C)起源GEMモデルにおいて生成された腫瘍を同所同種移植P0-GGFβ3と比較する特徴的な組織病理学;Trp53-/+;H&E染色によるErbb4 fl/fl MPNST細胞。画像は40倍で撮影されました。アイソタイプマッチネガティブコントロール抗体をコントロール染色に使用した。スケールバー = 400 μm (A、上部パネル);100 μm (A、下部パネル)、20 μm (C)。略語:MPNST=悪性末梢神経鞘腫瘍;GFP = 緑色蛍光タンパク質;BF = 明視野;FACS = 蛍光活性化細胞ソーティング;ネグCtrl = ネガティブコントロール;PCR = ポリメラーゼ連鎖反応;GEM = 遺伝子操作マウス;fl = フロック。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Ad5CMV-eGFPまたはAd5CMV-Cre/eGFPのいずれかによる形質導入後の培養MPNST初期継代培養および同所同種移植MPNST細胞で得られた代表的な結果(A)Ad5CMV-Cre/eGFPで形質導入された細胞と比較してAd5CMV-Cre/eGFPで形質導入された細胞における細胞密度の低下を実証した培養MPNST細胞の増殖アッセイ。定量化されたデータは、1日目、3日目、および5日目(左)にグラフ化されます。画像ベースの自動サイトメーターで撮影した1日目と5日目のコンフルエンシー画像を右側に示します(明視野顕微鏡で倍率4倍で撮影した画像)。エラーバーは、少なくとも3つの異なる独立した実験の平均(SEM)の標準誤差を表す。(B)Ad5CMV-eGFPまたはAd5CMV-Cre/eGFPアデノウイルスで形質導入した同種移植腫瘍における代表的なErbB4染色を倍率20倍で撮影した。赤チャンネル(Alexa 564、CD31)、青チャンネル(ヘキスト、核)。(c)P0-GGFβ3の同種移植片における血管密度の代表的な画像;Trp53+/-;Ad5CMV-eGFPで形質導入されたErbb4fl/fl MPNST細胞とAd5CMV-Cre/eGFPウイルスを比較した。画像は40倍で撮影されました。アイソタイプマッチネガティブコントロール抗体をコントロール染色に使用した。スケールバー = 100 μm。略語:MPNST=悪性末梢神経鞘腫瘍;eGFP = 増強された緑色蛍光タンパク質;IgG = 免疫グロブリンG;NEG = 陰性コントロール;CD = 微分のクラスター。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:配列アラインメントおよび解析ワークフローを示す概略図。DNAStar で使用されるワークフローで、RNA シーケンシング ファイル (fastq ファイル) をアライメントおよび分析します。略語:GFP=緑色蛍光タンパク質;RNA-Seq=RNAシーケンシング、DEG=差次発現遺伝子。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:緑色蛍光タンパク質を用いた継代初期の培養物からの代表的なFACSデータ。 (a)GFP発現細胞は、非感染細胞由来の蛍光ゲートパラメータを設定した後にFACSにより選別する。(b)適切な検出ゲートが設定された後、GFP陽性(形質導入)細胞をGFP陰性(非形質導入)細胞から分離する。略語: SSC-A = ピークの側面散乱面積;FSC-H = ピークの前方散乱高さ;FSC-W = ピークの前方散乱幅;GFP = 緑色蛍光タンパク質;FACS = 蛍光活性化細胞ソーティング。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介する詳細な方法は、MPNSTのGEMモデルを使用して開発されました。しかしながら、目的の腫瘍組織を個々の細胞に分散させることができる場合、これらの方法論は、GEMSにおいて生じる様々な腫瘍タイプに容易に適応可能である。フロックス対立遺伝子が、i)腫瘍をスクリーニングするのに十分なマウスを得ることを困難にする生存率の低下、またはii)十分な担癌マウスを得ることを困難にする腫瘍潜伏時間の増加をもたらさないようにすることが重要である。フロックス対立遺伝子が生存に影響を及ぼさない場合、両方のコホートの生存率は同等になります。腫瘍潜伏期間に影響を及ぼさない場合、同様の時間経過を有する両方のコホートにおいて同等の数の担癌マウスが生じるはずである。
同様のアプローチが、誘導性条件付きノックアウト動物を生成するために条件付きノックアウトおよびタモキシフェン誘導性Cre動物を用いて神経線維腫およびMPNSTを研究するために使用されている33,34。これらの研究と今回の研究との違いは、前述のようにCre誘導にタモキシフェンを使用することは別として、これらの研究はNF1の組織特異的ノックアウトを伴う腫瘍発生に焦点を当てていることです。この研究と他の研究もGEMM生成腫瘍を使用しているため、違いは尋ねられている質問にあります。このプロトコルでは、NF1喪失がMPNSTの病因において果たす役割を研究しているのではなく、GEMM生成MPNSTの特定の遺伝子(Erbb4)がin vivo腫瘍増殖に及ぼす役割を研究しています。さらに、このプロトコルは、そのようなパラメータを必要とするそれらのアプローチのためのタモキシフェンの使用を回避する。
他の人たちは、異種移植片モデル35で確立されたヒトMPNST細胞株を研究している。この研究は、使用される移植細胞がよく研究されているが高継代ヒトMPNST細胞株であり、異種移植片における薬物応答の確立に焦点を当てているという点で、この研究と異なる。これらの研究者は、これらのMPNST細胞における特定の遺伝子がin vivo増殖に及ぼす役割や、遺伝子損失が薬物反応に及ぼす影響を研究していない。これに類似した別の研究は、アデノウイルスCreリコンビナーゼ(Ad−Cre)媒介性NF1損失を時間的および空間的依存的に使用して、MPNST翻訳努力を拡大するための強力な方法であるDoddらによって実施された36。この研究は、Ad-Cre注射による坐骨神経におけるNF1およびInk4a/Arf喪失(ヒトMPNSTにおいて非常に一般的に共欠失する2つの遺伝子)の役割に焦点を当てた。前記P0-GGFβ3;Trp53+/-;この研究で記載されたErbb4fl/flマウスは、Schwann細胞前駆系譜にAd-Creを注入することによって、この方法で使用することができる。しかし、この研究で尋ねられた質問は、MPNSTの開始におけるErbb4の進化的役割ではなく、MPNSTが腫瘍増殖の利点のためにErbb4シグナル伝達をどのようにハイジャックするかに焦点を当てている。
ここで説明するアプローチに代わる方法として、RNA干渉(RNAi)を介して遺伝子発現をノックダウンしたり、ヒトがん細胞株におけるCRISPRで目的の遺伝子を不活性化したりすることが含まれます。これらの代替アプローチは貴重であり、GEM腫瘍に由来する細胞における遺伝子アブレーションと提携して、マウス腫瘍細胞で観察された効果がヒトの対応物において反復されることを検証することができる。ただし、ここで説明する方法論にはいくつかの明確な利点があります。第一に、GEM癌細胞におけるフロックス遺伝子を遺伝的にアブレーションすることは迅速であり、標的遺伝子の完全な不活性化をもたらす。対照的に、短いヘアピンRNAの使用は、遺伝子発現の部分的なノックダウンしかもたらさないことがしばしば観察される。CRISPRは完全な遺伝子不活性化をもたらすことができるが、完全な不活性化を有するクローンの同定には、長期にわたる選択プロセスが必要である。
さらに、CRISPRアブレーションの結果生じる効果が異なるクローン間で異ならないことを確認するために、複数のクローンを調べる必要があります。第2に、早期継代GEM腫瘍培養物においてフロックス対立遺伝子を切除する能力は、培養物中で効果的に増殖する別個の腫瘍細胞亜集団を選択する可能性を最小限に抑えるので有利である。対照的に、通常、何年もの間培養物中で維持されてきたヒト細胞株は、しばしば培養によく適応し、このプロセス中にしばしば遺伝的浮動を受ける別個の亜集団に由来する。これにより、これらの細胞株は、親腫瘍には存在しなかった新しい変異を発症する。最後に、免疫不全マウスへのGEM腫瘍細胞の移植がこの原稿に記載されているが、近交系マウス系統で生じる腫瘍に由来するGEM腫瘍細胞は、同じ系統のマウスに同種移植され得ることに留意されたい。これにより、研究者らは、標的遺伝子の存在下または非存在下で無傷の免疫系を有する動物の腫瘍生物学を評価することができる。
ここで説明するプロトコルの重要なステップは、Ad5CMV-Cre/eGFPによるフロックス遺伝子のアブレーションと、遺伝子アブレーションとFACS後の腫瘍細胞の生存を保証することです。これは、floxed遺伝子をアブレーションするCreリコンビナーゼの能力に依存するプロセスであるため、フロックス遺伝子をインビボでアブレーションする際に遭遇する可能性のある同じ問題のいくつかにさらされる可能性があります。これらの問題は、標的対立遺伝子の不完全なアブレーションとして現れるであろう。eGFP発現アデノウイルスベクターで正常に形質導入された細胞を精製する能力は、CreERT2によるin vivo遺伝子アブレーションと比較してモザイク作用を最小限に抑えるように見えることに留意されたい。しかし、細胞表面に発現しているErbB4などのタンパク質をコードする標的遺伝子の場合、eGFPと目的タンパク質を認識する抗体の両方を利用してFACSを行うことで、標的遺伝子の消失をさらに確実にすることができるかもしれません(すなわち、eGFP陽性/erbB4陰性細胞を選別する)。
導入で述べたように、モノクローナル抗体によって治療的に標的とされるタンパク質の多くは細胞表面タンパク質であるため、このアプローチはしばしば実現可能であるはずである。また、遺伝子アブレーションがトランスクリプトームに与えた影響を評価するためにRNA-Seqを腫瘍細胞に対して行う場合は、FACS後少なくとも2〜3日間腫瘍細胞を回復させることが重要であることにも留意すべきである。FACSの直後に得られたRNA-Seqデータセットは、一部の細胞型において生物学的複製物間の遺伝子発現により多くの変動性を示すことが多い。これは、FACSを通過するときに細胞が苦しむ外傷の結果である可能性があります。したがって、細胞は、このプロセスの後に回復期間を許容されなければならない。RNA-Seqデータセットは、負の二項分布と分布の分散に対する収縮推定量を使用するDESeq2を使用して分析できます。これらの分析では、サンプルは、転写産物レベルの変化が有意である最小の誤発見率(FDR)である q値に従ってソートされます。FDRは、ベンジャミニ・ホッホベルク多重試験調整手順を使用して計算されます。あるいは、DEGは、RNA-Seq分析ワークフローが可能な他の利用可能なソフトウェアを使用して同定することができる。
このMPNST動物モデルについて、実験エンドポイントを同定するには、使用されている動物モデルにおける新生物の自然史の理解が必要である。このGEMにおけるMPNSTの自然史は、一連の44P0-GGFβ3マウス6および19P0-GGFβ3の生存を追跡することによって決定された。Trp53+/-マウス7は、生存エンドポイントに達したときに、これらの動物のすべてに対して完全な剖検を行った。典型的な生存時間とMPNSTが典型的に生じた場所は、各動物モデルにおいて決定された。これらのマウスのほとんどにおいて、MPNSTは三叉神経において生じた。三叉神経に生じるMPNSTは、典型的には角膜白濁(眼瞼下垂によって生じる涙液分布の問題の結果)に関連する眼瞼下垂を産生し、これは担癌マウスを同定するための臨床的に有用な徴候を提供した。腫瘍診断は、H&E染色剤およびいくつかの追加の診断染色剤(S100β、ネスチンソックス10、H&E、Mart1)を行い、その後、資格のある獣医またはヒト病理学者による検査を行うことによって確認されるべきである。このモデルのTrp53ヌル対立遺伝子は、マウスをリンパ腫などの他の新生物の発症の素因とし、これらの腫瘍をMPNSTと区別しなければならないため、これも重要である。
最後に、この方法論には、まだ検討されていないいくつかの潜在的なアプリケーションがありますが、将来の調査で実現可能になる可能性があります。例えば、erbB3とerbB4の両方を活性化するリガンドであるノイレグリン1(NRG1)は、走化性様式でMPNST細胞の遊走を促進する。erbB3およびerbB4の両方がMPNST細胞37の侵入足症に位置する。しかしながら、erbB3またはerbB4がNRG1に対する走化性応答を媒介するかどうかは明らかではない。したがって、erbB4がこの方法論でアブレーションされた細胞は、この質問に対処するために使用することができる。これらの実験に対する自然なフォローアップは、腫瘍細胞が尾静脈を介して注射され、肺転移の数が評価される一般的に利用されているアプローチを使用して、転移にerbB4が必要かどうかを評価することです。この方法論は、shRNA発現がしばらくすると細胞内でサイレンシングされることが多いため、shRNAを使用して erbB4 発現をノックダウンするなど、他のアプローチよりも明らかな利点を提供します。さらに、早期継代培養物は、転移を起こしやすい細胞の亜集団を含む腫瘍由来の亜集団の混合物を含むことが予想される。ここで説明する方法論を用いて調製した細胞を用いて転移アッセイを行うことで、確立された細胞株よりも親腫瘍をより代表する転移能の評価が可能になる。もちろん、これは、この方法論を利用できる将来のアプリケーションの一例にすぎません。他の研究者がこの方法論を特に関心のある問題と組み合わせて、ヒトがんにおける重要な治療標的であるタンパク質を同定する能力を高めることを期待しています。
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Disclosures
著者らは、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(R01 NS048353、R01 NS109655)、国立がん研究所(R01 CA122804)、国防総省(X81XWH-09-1-0086、W81XWH-11-1-0498、W81XWH-12-1-0164、W81XWH-14-1-0073、およびW81XWH-15-1-0193)、および小児腫瘍財団(2014-04-001および2015-05-007)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
References
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