Summary
Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli kaynaklı tümörlerde in vivo embriyonik öldürücü olan gen nakavtlarını gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz ve daha sonra nakavtın tümör büyümesi, proliferasyon, sağkalım, göç, invazyon ve transkriptom in vitro ve in vivo üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz.
Abstract
İnsan kanserlerinde anahtar proteinleri tam olarak hedef alan yeni ilaçların geliştirilmesi, kanser terapötiklerini temelden değiştirmektedir. Bununla birlikte, bu ilaçların kullanılabilmesi için önce, hedef proteinlerinin spesifik kanser türlerinde terapötik hedefler olarak doğrulanması gerekir. Bu doğrulama genellikle, genetiği değiştirilmiş bir fare (GEM) kanser modelinde aday terapötik hedefi kodlayan geni nakavt ederek ve bunun tümör büyümesi üzerindeki etkisinin ne olduğunu belirleyerek gerçekleştirilir. Ne yazık ki, geleneksel nakavtlarda embriyonik öldürücülük ve koşullu nakavtlarda mozaiklik gibi teknik konular genellikle bu yaklaşımı sınırlar. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, bir GEM modelinde üretilen malign periferik sinir kılıfı tümörlerinin (MPNST'ler) kısa süreli kültürlerinde ilgi çekici bir floks embriyonik ölümcül genin ablatasyonuna yönelik bir yaklaşım geliştirilmiştir.
Bu yazıda, uygun genotipe sahip bir fare modelinin nasıl oluşturulacağı, bu hayvanlardan kısa süreli tümör kültürlerinin nasıl türetileceği ve daha sonra Cre rekombinaz ve gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) eksprese eden adenoviral bir vektör kullanarak floklu embriyonik ölümcül genin nasıl ablate edileceği açıklanmaktadır. Daha sonra floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak adenovirüs ile dönüştürülen hücrelerin saflaştırılması ve gen ablasyonunun hücresel proliferasyon, canlılık, transkriptom ve ortotopik allogreft büyümesi üzerindeki etkilerinin ölçülmesi detaylandırılır. Bu metodolojiler, terapötik hedefleri in vitro ve in vivo olarak tanımlamak ve doğrulamak için etkili ve genellenebilir bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşımlar aynı zamanda in vitro büyüme artefaktları azalmış düşük pasajlı tümör türevi hücrelerin yenilenebilir bir kaynağını sağlar. Bu, hedeflenen genin biyolojik rolünün, sekretomun aracılık ettiği göç, istila, metastaz ve hücreler arası iletişim gibi çeşitli biyolojik süreçlerde incelenmesini sağlar.
Introduction
Son yirmi yıldan önce, insan kanserlerinin tedavisi, DNA'ya zarar vererek veya DNA sentezini inhibe ederek hızla çoğalan hücresel popülasyonları geniş ölçüde hedef alan radyoterapi ve kemoterapötik ajanlara dayanıyordu. Bu yaklaşımlar kanser hücresi büyümesini inhibe etmesine rağmen, bağırsak epitel hücreleri ve saç folikülü hücreleri gibi normal hızla çoğalan hücre tipleri üzerinde zararlı yan etkileri de vardı. Daha yakın zamanlarda, kanser tedavisi, bireysel bir hastanın neoplazmının büyümesi için kritik öneme sahip sinyal yolaklarındaki proteinleri tam olarak hedef alan kemoterapötik ajanları kullanmaya başlamıştır. Genellikle "Hassas Tıp" olarak adlandırılan bu yaklaşım, monoklonal antikorların ve küçük moleküler inhibitörlerin sürekli genişleyen bir repertuarının geliştirilmesine yol açmıştır. Bu ajanlar, tümör hücrelerinin proliferasyonunu ve sağkalımını etkili bir şekilde inhibe ederken, konvansiyonel kemoterapötik ajanlar ve radyoterapi ile görülen normal hücre tipleri üzerindeki zararlı yan etkilerden kaçınır. İnsan kanserlerinin tedavisinde kullanılan monoklonal antikorlar en yaygın olarak büyüme faktörü reseptörleri 1 (örneğin, membranı kapsayan reseptör tirozin kinazların geniş ailesi) ve immün yanıt modülatörleri2 (örneğin, programlanmış hücre ölüm proteini 1, programlanmış ölümligandı 1) gibi hücre yüzey moleküllerini hedef alır. Küçük moleküler inhibitörler, hücre yüzey proteinlerini veya hücre içinde bulunan sinyal proteinlerini inhibe edebilir3. Bununla birlikte, bu yeni terapötik ajanları etkili bir şekilde kullanmak için, belirli bir kanserin, aday bir terapötik ajan tarafından hedeflenen moleküle bağımlı olduğu tespit edilmelidir.
Bu yeni terapötik ajanların daha odaklanmış etkileri olmasına rağmen, birçoğu hala birden fazla proteinin etkisini inhibe etmektedir. Ek olarak, belirli bir proteini hedeflemek için değişen etkinlik ve özgüllüğe sahip çoklu ajanlar sıklıkla mevcuttur. Sonuç olarak, klinik öncesi araştırmalar sırasında, bir aday proteini terapötik bir hedef olarak doğrulamak için genetik ablasyon gibi ek yaklaşımlar kullanmak akıllıca olacaktır. Bir proteini terapötik bir hedef olarak doğrulamak için özellikle yararlı bir yaklaşım, aday proteini kodlayan geni, spesifik kanser türünü geliştiren genetiği değiştirilmiş bir hayvan modelinde ablatmaktır. Bu yaklaşım, boş mutasyona sahip fareler (doğal bir mutasyon, genetiği değiştirilmiş bir boş mutasyon [bir "nakavt"] veya bir gen tuzağı tarafından tanıtılan boş bir mutasyon) mevcutsa ve fareler yetişkinliğe kadar yaşayabilirse, nispeten basit olabilir. Ne yazık ki, bu kriterleri karşılayan null mutasyona sahip fareler genellikle mevcut değildir, çünkü tipik olarak null mutasyon embriyonik olarak veya doğum sonrası yaşamın ilk günlerinde ölümle sonuçlanır. Bu durumda, tümör tipini geliştirmeye eğilimli fareler, bunun yerine, ilgilenilen genin kilit segmentlerinin loxP bölgeleri ("floksed") tarafından kuşatıldığı farelere geçebilir; bu, genin tümör hücrelerine Cre rekombinazını ifade eden bir transgen (koşullu nakavt) sokularak ablatlanmasına izin verir. Bu yaklaşım çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, tümörde eksprese edilen, ancak geleneksel nakavtlarda ölüme yol açan hücre tipinde ifade edilmeyen bir Cre sürücüsü mevcutsa, bu yaklaşım potansiyel olarak aday terapötik hedefi doğrulayabilir. İkincisi, aday proteini tümör hücrelerinde kodlayan geni ablukaya almak, ancak tümörle ilişkili fibroblastlar veya bağışıklık hücreleri gibi diğer tümör içi elementlerde değil, araştırmacının terapötik hedefin hücre özerk ve hücre dışı özerk etkilerini ayırt etmesini sağlar. Son olarak, tamoksifen ile indüklenebilen bir Cre sürücüsü (CreERT2), araştırmacının tümör gelişiminde farklı aşamalarda ilgilendiği geni silmesine ve aday terapötik ajanın etkili olma ihtimalinin en yüksek olduğu pencereyi tanımlamasına izin verir.
Ne yazık ki, GEM modellerinde ortaya çıkan tümörlerde koşullu nakavt kullanımını sınırlayabilecek teknik sorunlar da vardır. Örneğin, tümör hücrelerinde eksprese edilen ve yaşam için gerekli olan normal hücrelerde gen delesyonunu önleyen bir Cre sürücüsü mevcut olmayabilir. Küçümsenebilecek bir başka konu, Cre ve CreERT2 sürücülerinin farelerde flokslu alelleri sıklıkla değişken bir şekilde ablate etmesi ve GEM kanserindeki boş mutasyon için mozaikçiliğe neden olmasıdır. Bu meydana geldiğinde, hedeflenen genin ablatlanmadığı tümör hücreleri hızla çoğalmaya devam edecek ve tümör hücrelerini ablatlanmış alellerle aşırı büyütecektir. Cre sürücü hatlarındaki mozaiklik, hedeflenen soyda her yerde bulunmayan Cre ekspresyonu ve Cre ekspresyonu4'ten bağımsız bireysel hücrelerde başarısız rekombinasyon nedeniyle ortaya çıkabilir. Bu, hücre tipine bağımlı olan ve deneysel tasarım ve veri yorumlama sırasında göz önünde bulundurulması gereken Cre sürücülerinin bilinen bir olgusudur. Mozaisizm, nakavtın etkisini maskeleyebilir ve bir araştırmacının, ilgilenilen genin tümör hücresi proliferasyonu ve / veya hayatta kalması için gerekli olmadığı ve dolayısıyla geçerli bir terapötik hedef olmadığı sonucuna varmasına neden olabilir.
Bu sorunların birçoğu, reseptör tirozin kinaz erbB4'ün MPNST hücrelerinde potansiyel bir terapötik hedef olup olmadığını belirlemeye çalışan önceki bir çalışmada karşılaşılmıştır5. Bu çalışmalarda, Schwann hücresine özgü miyelin proteini sıfır promotörünün (P 0-GGFβ3 fareleri) kontrolü altında nötregülin-1 (NRG1) izoform glial büyüme faktörü-β3'ü (GGFβ3) kodlayan bir transgeni ifade eden fareler kullanılmıştır. P 0-GGFβ3 fareleri, otozomal dominant tümör duyarlılık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1)6 olan hastalarda görülen nörofibrom patogenezi ve pleksiform nörofibrom-MPNST progresyonu süreçlerini özetleyen bir süreçle MPNST olmaya ilerleyen multipleksiform nörofibromlar geliştirir. Trp53 null mutasyonlu farelere geçildiğinde, ortaya çıkan P 0-GGFβ3; Trp53+/- fareler, cis-Nf1+/-'de görüldüğü gibi MPNST'ler de novo geliştirir; Trp53+/- fareler.
Bu MPNST'ler, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) derece II'den insanlarda görülen DSÖ derece IV lezyonlarına ilerlemeyi özetlemektedir7. P 0-GGFβ3 farelerde, MPNST'ler trigeminal sinirde (% 58) ve spinal dorsal sinir köklerinde (% 68) önceden var olan pleksiform nörofibromlarda ortaya çıkar7; P 0-GGFβ3'te ortaya çıkan MPNST'ler; Trp53+/- fareler oldukça benzer bir dağılıma sahiptir. İnsanlarda, MPNST'ler en sık siyatik sinirde ortaya çıkar, bunu brakiyal pleksus, spinal sinir kökleri, vagus, femoral, medyan, sakral pleksus, popliteal obturator ve posterior tibial ve ulnar sinirlerizler 8. Bu GEM modellerindeki bu tümör dağılımı, insanlarda görülenlerden biraz farklıdır. Bununla birlikte, P 0-GGFβ3 ve P0-GGFβ3'te ortaya çıkan MPNST'ler; Trp53+/- fareler histolojik olarak insan MPNST'leri ile aynıdır, insan MPNST'lerinde görülen aynı mutasyonların çoğunu taşır ve NF1 hastalarında görülen nörofibrom-MPNST progresyon sürecini özetler. P 0-GGFβ3 veya P0-GGFβ3 üretimi; Trp53+/- Erbb4-/- olan fareler, iki Erbb4 null aleli olan fareler, kardiyak defektlere sekonder 10.5 embriyonik günde uteroda öldüğü için mümkün değildi9. Çünkü kalp-spesifik bir Erbb4 transgeni (α-miyozin ağır zinciri (MHC)-Erbb4) ekleyerek kalpteki Erbb4 ekspresyonunu kurtarmak, uygulanabilir Erbb4-/- fareler 10, karmaşık bir P 0-GGFβ3 ile farelerin oluşumu ile sonuçlanır; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotipi denendi.
Bununla birlikte, çiftleşmeler beklenen Mendel oranlarında fare üretmedi, bu da istenen genotipin zararlı olduğunu gösterdi. Bu nedenle, P 0-GGFβ3 üretimi; Trp53+/- Flokslanmış Erbb4 alelleri11 ve CreERT2 sürücüsü olan fareler, bu farelerde ortaya çıkan MPNST'lerde Erbb4'ün silinmesine izin vermeye çalışıldı. Bu hayvanlarda, bozulmamış Erbb4 alellerine sahip çok sayıda tümör hücresi hala mevcuttu (mozaiklik). Gözlenen mozaisizm, verimsiz tamoksifen dağıtımından kaynaklanabilir ve bu da doku içinde rekombinasyon etkinliğinde farklılıklara neden olabilir. Spontan kompansatör mekanizmaların olasılığı, Erbb4 ekspresyonu gereksinimini atlayarak tamoksifen aracılı rekombinasyonda mozaisizme daha fazla katkıda bulunabilir. Trp53 kaybının, tümör hücrelerini, verilerin yorumlanmasını karıştırabilecek ek spontan "izin verilen" mutasyonlara duyarlı hale getirmesi mümkündür. Erbb4-bozulmamış MPNST hücrelerinin diğer tümör hücrelerinde Erbb4'ün ablatlanmasının sonuçlarını maskelemesi muhtemel göründüğü için, bu yaklaşım terk edildi.
Bu engeller, Cre rekombinaz ve eGFP'yi eksprese eden bir adenovirüs kullanarak çok erken geçiş MPNST hücrelerinde Erbb4'ü ablatlamak için bir metodolojinin geliştirilmesine yol açtı. Bu hücreler, ablatlanmış Erbb4 geni için mozaisizmi belirgin şekilde azaltan FACS kullanılarak enfekte olmayan hücrelerden ayrılabilir. Aşağıda, bunu başarmak için kullanılan yöntemler, gen ablasyonunun in vitro ve in vivo etkilerini değerlendirmek için kullanılan yöntemlerle birlikte açıklanmaktadır. Aşağıdaki protokol, in vivo allogreft tümör büyüme değerlendirmesinden önce ex vivo eksizyon için ilgi çekici embriyonik ölümcül genlerin floklu alellerini taşıyan tümörleri veren tümör taşıyan farelerin nasıl üretileceğine bir örnektir. Bu, Erbb4 ablasyonunun tümör hücresi proliferasyonu, sağkalım ve gen ekspresyonu in vitro ve ortotopik allogreftlerde proliferasyon, sağkalım ve anjiyogenez üzerindeki etkisini analiz etmek için kullanılan yaklaşımların bir tanımını içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farelerle herhangi bir prosedür gerçekleştirmeden önce, tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmeli ve onaylanmalıdır. Bu makalede açıklanan protokol, Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, MUSC'nin kurumsal hayvan bakım yönergelerini izleyerek uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmiştir.
1. Erbb4 floks alelleri için MPNST'leri homozigot geliştiren farelerin üretimi
- F1 nesil P 0-GGFβ3'ü üretin; Trp53+/-; Erbb4fl/+ hayvanlar P 0-GGFβ3 çiftleşerek; Trp53+/- fareler7, Erbb4 fl/fl fareler11 ile. İstenilen P 0-GGFβ3 ile yeterli sayıda erkek ve dişi F1 yavrusu üretilmesini sağlamak için üreme şemasını yönlendirmek için bir Punnett karesi (Şekil 1) kullanın; Trp53+/-; Erbb4fl/+ genotip.
- Genotip F1 yavruları, IACUC kılavuzlarına uygun olarak toplanan bir kuyruk snipinden genomik DNA'yı izole ederek ve daha sonra P 0-GGFβ3 transgen 12, Trp53 vahşi tip (+) ve null (-) aleller7 ve Erbb4flox ve Erbb4 vahşi tip alelleri 13'ü tespit etmek için daha önce tarif edilen primerleri kullanarak PCR gerçekleştirir.
- jacks-lab.mit.edu/protocols ayrıntılı yöntemleri kullanarak kuyruk DNA'sını izole edin.
- PCR reaksiyonunu 25 ng DNA, 0,25 nM dNTP'ler, 0,02 U/μL Taq, her bir astarın 0,5 μM'si ve 1x PCR tamponu ile karıştırın. 1 dakika boyunca tek bir 95 °C inkübasyonla (genomik DNA'yı eritmek ve Taq'ı aktive etmek için) PCR reaksiyonunu gerçekleştirin ve ardından 94 °C, 10 s'lik 35 PCR döngüsü (erime); 55 °C, 30 s (tavlama); 72 °C, 40 s (uzatma) ve ardından 5 dakika boyunca tek bir 72 °C (uzatma). Reaksiyonları% 1.2-1.5'lik bir agaroz jeli üzerinde çalışmaya hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.
NOT: Tavlama sıcaklığı, kullanılan PCR tampon sistemine bağlıdır; uygun tavlama sıcaklığını belirlemek için bir tavlama sıcaklığı gradyanı yapılması önerilir.
- F2 nesil P 0-GGFβ3'ü üretin; Trp53+/-; Erbb4 fl/fl hayvanları uygun F1 soyunu çiftleştirerek (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) birbirleriyle.
NOT: Şekil 1 , istenen genotipe sahip beklenen F2 yavru sayısını hesaplamak için kullanılan Punnet kare tahminlerini göstermektedir. - İstenilen P 0-GGFβ3 ile hayvanları tanımlayın; Trp53-/+; Adım 1.2'de açıklandığı gibi Erbb4 fl/fl genotipi.
- P 0-GGFβ3'ü korumak için F2 soyunu birbirine eşleyin; Trp53-/+; Erbb4fl / fl kolonisi ve genotipi tüm yavrular. Yeni tanıtılan floksed alelin sağkalım veya tümör gecikmesinden ödün vermediğini onaylayın. Bunu, P 0-GGFβ3'ün kohortlarını (20 fare / kohort) oluşturarak elde edin; Trp53+/- ve P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl fareleri ve hayatta kalma ve tümör oluşum sıklığını takip eder.
- Deneysel bitiş noktasına ulaşılana kadar hayvanları haftada birkaç kez izleyin (IACUC tarafından onaylanan izin verilen maksimum tümör boyutu/insancıl son nokta).
- Haftalık izleme sırasında, vücut ağırlığını, normal sosyal ve tımar davranışını ve tümör boyutu ölçümlerini değerlendirin. Vücut ağırlığının% >10'unun kilo kaybı, sosyal inzivaya çekilme ve kamburluk durumunda veteriner değerlendirmesi yapın.
- Tümör taşıyan bir fare tanımlandığında ve insancıl son noktasına ulaştığında, karbondioksit inhalasyonunu kullanarak hayvanı insancıl bir şekilde ötenazi yapın, ardından servikal çıkık ve bir neşter bıçağı kullanarak tümörü steril olarak çıkarın. Bir kumpas ve ağırlık tümörü (kütle ve hacim) kullanarak uzunluk, genişlik ve derinliği ölçerek tümör ölçümleri yapın. Otolizi önlemek için hızlı çalışın.
- Formalin fiksasyonu/parafin gömme (FFPE), erken pasaj kültürü üretimi ve flaş dondurulmuş materyal için doku segmentleri oluşturmak üzere steril koşullar altında neşter bıçağı ile ekmek somunu tarzı kesimler kullanılarak tümörü üç bölüme ayırın (Şekil 2A).
- Bölüm 1'in (erken pasaj kültürü üretimi için, adım 1.7.2) toplam tümör hacminin yaklaşık% 10'u, Bölüm 2'nin (fiksasyon ve IHC için, adım 1.7.3) toplam tümör hacminin% 70'i ve Bölüm 3'ün (flaş dondurma için, adım 1.7.4) toplam tümör hacminin% 20'si olduğundan emin olun.
- Erken geçiş kültürlerinin hazırlanması için tümörün 1. bölümünü alın (aşağıya bakınız).
- Tümörün 2. bölümünü 4 °C'de gece boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve daha sonra tanısal inceleme için parafin (formalin-sabit parafin-gömülü (FFPE) içine gömülün.
- Analitik analizler için flaş-dondurma bölüm 3 (örneğin; hedeflenen floksed gen tarafından kodlanan proteinin uygun şekilde ifade edildiğini doğrulamak için immünoblotlar).
- Nitelikli bir patolog tarafından tümör tanısını doğrulamak için hematoksilin ve eozin (H & E) içeren 5 μm kalınlığında FFPE doku kesitleri. Uygunsa, tümör tanısını doğrulamak için immünohistokimyasal boyama (IHC) uygulayın.
- S100 kalsiyum bağlayıcı protein B (S100β), nestin ve cinsiyet belirleyici bölge Y (SRY)-Kutu transkripsiyon faktörü 10 (Sox10) için immünostain MPNST'ler-hem MPNST'lerde hem de Schwann hücrelerinde (tümör hücresi kökeni) eksprese edilen üç belirteç5,6,14,15. Tümörleri, aşağı akış adımlarında ablasyon için hedeflenen gen tarafından kodlanan protein olan erbB4'ü tanıyan antikorlarla lekeleyin.
- Tanıyı doğrulamak için, nitelikli bir veteriner veya insan patologunun DSÖ tanı ve derecelendirme kriterleri5,6,7,16'yı takiben tüm lekeli tümör slaytlarını değerlendirmesini sağlayın.
2. MPNST hücrelerinde flokslanmış Erbb4 alellerinin ex-vivo ablasyonu
- Bölüm 1'deki (adım 1.7.3) dokuyu buz üzerinde 10 mL buz soğukluğunda steril fosfat tamponlu salin (PBS) içine yerleştirerek ve daha sonra steril bir çalışma alanına aktararak taze toplanan MPNST dokusundan erken geçiş kültürleri oluşturun (Şekil 2B)16.
NOT: Sonraki tüm prosedürler steril doku kültürü başlığında gerçekleştirilmelidir. - Tümör dokusunu 2-4 mm parçalara ayırın ve 10 mL büyüme ortamı ile 10cm2 ile tedavi edilmiş bir doku kültürü kabında 8-10 kez tritüre edin. Bu preparatları, 10 nM neuregulin-1β (NRG1β) ve 2 μM forskolin ile desteklenmiş% 10 fetal buzağı serumu,% 10 glutamin, 10 μg / mL streptomisin ve 10 IU / mL penisilin içeren yüksek glikozlu DMEM-10 büyüme ortamında (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) kültürleyin. Fibroblastlar gibi yaygın kirletici hücre tiplerinin büyümesini engellemek için bu aşamada forskolin ekleyin.
- Erken geçiş kültürü oluşturmak için mekanik olarak ayrışmış doku ve hücreleri 37 ° C'de 3 güne kadar% 5 CO2 atmosferinde tutun. Bu noktada dağılmış hücreleri ve kalan doku parçalarını ayırmayın.
- Her 3-4 günde bir yeni ortamla kültürleri yenileyin. Tümör hücrelerinin birleşene kadar çoğalmasına izin verin.
- Akıcı kültürleri çeşitli yemeklere bölerek erken geçiş kültürlerini genişletin. Büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri 1x dPBS ile yıkayın. Daha sonra, 10 cm2 işlenmiş hücre kültürü kabı başına oda sıcaklığında 2-5 dakika boyunca 1 mL%0.25 tripsin ekleyin. Ayrılmayı kolaylaştırmak ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kültürü yavaşça tritüre edin.
- 2 mL DMEM-10 büyüme ortamı ekleyerek tripsinizasyonu sonlandırın. Tripsinizli hücre karışımını toplayın ve 5 mL steril santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 500 × g'da 5 dakika santrifüjleme ile toplayın.
- Hücre peletini 5 mL DMEM-10 içinde yeniden askıya alın. Hücreleri, her biri 10 mL büyüme ortamı içeren iki ila dört adet 10 cm'lik hücre kültürü kabına bölün (çanak başına yaklaşık 1 × 106 hücre).
- 5 pasajdan sonra (2.5'te tekrarlanan adımlar), NRG1β ve forskolin olmadan büyüme ortamı kullanın. Kültürün yalnızca tümör hücrelerinden oluştuğunu doğrulamak için bir anti-S100β antikoru ile kültürün bir örneğini immünostain. Hücreleri sonraki tüm pasajlarda DMEM-10 büyüme ortamında tutun.
- Bir sonraki pasajda, hücreleri sayın ve P 0-GGFβ3'ün bir kısmını dondurun; Trp53+/-; Akıcı kültürlerden toplanan Erbb4fl / fl MPNST hücreleri (3 × 106 hücre / şişe).
- Plaka P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl erken geçiş MPNST hücreleri, DMEM-10 büyüme ortamında 10 cm işlenmiş hücre kültürü kabı başına 1.5 × 106 hücre yoğunluğunda.
- 0. Gün: (Kaplamadan yaklaşık 12-16 saat sonra), yapışkan kültürleri 2-4 mL dPBS ile yıkayın ve 10 mL serumsuz DMEM'de yaklaşık 400 plak oluşturan birimde (pfu) / hücrede Ad5CMV-Cre / eGFP veya Ad5CMV-eGFP ile enfekte edin (yani, 10 cm kabında 2 × 10 10 pfu'nun30 μL'si). Adenovirüsü kullanarak flokslu Erbb4 alellerini, ampirik olarak belirlenen maksimum tolere edilen virüs konsantrasyonunda (enfeksiyon çokluğu, MOI) abartın. Bu ablasyon için iş akışının şeması için Şekil 2C'ye bakın.
- 1. Gün: Yaklaşık 16 saat sonra, enfeksiyon kokteyline 10 mL DMEM-10 ekleyerek kültürleri kurtarın.
- 2. Gün - 3: FACS, enfeksiyondan yaklaşık 48 saat sonra eGFP-pozitif hücreleri sıralamak için çekirdek tesisten önerilen protokolü izleyerek enfekte olmuş hücreleri sıralar. FACS sıralamadan önce, kültürlerin verimli bir şekilde enfekte olduğundan emin olmak için bir floresan mikroskobunda eGFP sinyali için hücreleri kısaca kontrol edin (~% 50-100 pozitif hücreler). FACS'tan sonra geri kazanılan hücreleri 10 cm'lik doku kültürü kaplarına geri döndürmek; genomik DNA izolasyonu için bir çanak ayırın.
- 4. - 5. Gün: FACS sıralamadan sonra, hücrelerin bir doku kültürü inkübatöründe en az 24-48 saat iyileşmesine izin verin ve daha sonra hücreleri in vitro hücre bazlı analizler veya in vivo aşılama için hazırlayın. Sıralanmış eGFP-pozitif hücrelerin bir kısmından izole edilen genomik DNA'yı kullanarak PCR yoluyla Erbb4 delesyonunu onaylayın. eGFP-pozitif hücrelerin PCR ile veya kültürün bir örneğini bir anti-erbB4 antikoru ile immünoboyayarak ErbB4-negatif olduğunu doğrulayın.
- Standart asit-guanidinyum-fenol ve kloroform bazlı DNA izolasyon yöntemi17 kullanarak genomik DNA'yı hücrelerden izole edin.
- Flokslanmış Erbb4 alellerini ve ablatlanmış Erbb4 alellerini ayırt etmek için standart PCR gerçekleştirin. 250 bp Erbb4-null ürün ve 350 bp flokslanmış ürün 13 üretmek için 2 ng DNA, 20 μM primer1 + 2 ile 40 döngü gerçekleştirin. Güvenilir bir antikor bulunmadığında nakavtı doğrulamak için hem PCR hem de antikor tabanlı yaklaşımlar uygulayın.
NOT: Hücreler aşağıda açıklandığı gibi in vitro hücre bazlı tahliller için hazırdır. Bu şekilde hazırlanan hücrelerle birçok aşağı akış analizi yapılabilir. Aşağıda sunulan protokollerin amacı, Erbb4 geninin ablasyonu sonrası bu tümör hücrelerinin in vitro ve in vivo uygulamalarına birkaç örnek sunmaktır.
3. Ablatlanmış Erbb4 alelleri olan MPNST hücrelerinde proliferasyon ve canlılık testleri
- Önümüzdeki yedi gün boyunca, görüntü tabanlı otomatik bir sitometre kullanarak çok kuyulu bir plakaya kaplanmış sıralanmış MPNST hücreleri üzerinde proliferasyon testleri yapın.
- 6. Gün: 96 kuyucuklu bir plakada 150 μL (~ 13.300 hücre / mL) büyüme ortamının son hacminde kuyu başına 2.000 hücre plakası. Her deneysel kohort ve 4 günlük son nokta okuması için üçlü ölçümler yapın (3 kopya x 2 koşul x 4 gün).
-
7, 9, 11, 13. günler: Hoechst ve propidium iyodür (PI) boyalı leke hücreleri ve her bir kuyucuktaki canlı ve ölü hücrelerin sayısını saymak için bunları otomatik bir plaka okuyucuda görüntüleyin. Bunu başarmak için, hücreleri aynı anda hem canlı hem de ölü hücrelerin çekirdeklerini boyamak için Hoechst boyasıyla ve ölü hücreleri etiketlemek için propidyum iyodür (PI) ile boyayın. Tüm okumaları her gün veya her gün aynı saatte gerçekleştirin.
- O gün nicelleştirilmiş her kuyuya 50 μL 4x PI/Hoechst boyama çözeltisi (her biri 4 μg/mL) ekleyin (örneğin, sadece 7. Gün) ve doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı ışıktan koruyun.
NOT: Hoechst'in boyama konsantrasyonunun ampirik olarak belirlenmesi gerekir ve hücre tipine bağlı olarak 1 ila 10 μg / mL arasında değişebilir. - Otomatik hücre görüntüleyici üzerindeki uygun floresan kanalı kullanarak inkübasyondan sonra lekeli kuyucukları okuyun. Okuduktan sonra, sonraki günlerde gelecekteki okumalar için plakayı inkübatöre iade edin (örneğin, Gün 9, 11, 13).
- Kullanılan görüntüleme sistemine dayanarak boyama yoğunluklarını ölçün ve aşağıdaki ayarları kullanarak ölü hücrelerin, canlı hücrelerin ve toplam hücrelerin sayısını hesaplayın: mavi kanal (377/50 nm, Hoechst): toplam hücreler (canlı ve ölü); kırmızı kanal (531/40 nm, PI): sadece ölü hücreler; mavi - kırmızı (toplam - ölü) = canlı hücreler.
- O gün nicelleştirilmiş her kuyuya 50 μL 4x PI/Hoechst boyama çözeltisi (her biri 4 μg/mL) ekleyin (örneğin, sadece 7. Gün) ve doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı ışıktan koruyun.
- İstenirse, tahlil üreticilerinin protokolünü izleyerek hücre canlılığı testini üç gün boyunca gerçekleştirin.
NOT: Canlılık testleri, kalsein (488/32 nm; yeşil kanal, özellikle canlı hücreleri etiketler), PI ve Hoechst dahil olmak üzere üçlü bir leke gerçekleştirilerek proliferasyon testleri ile birleştirilebilir. Bir apoptoz testi, yukarıda tarif edildiği gibi ayarlanmış kültürler kullanılarak da yapılabilir; spesifik protokol görüntüleme sistemine bağlı olacaktır.- 6. Gün: Üçlü olarak 96 delikli bir plakada 150 μL'lik son hacimde kuyu başına 4.000 hücre plakası.
- 7 - 9. Günler: 2.000x biyolüminesan hücre canlılığı testi reaktifleri (Malzeme Tablosu) ekleyin, plakayı inkübatöre geri döndürün ve plakayı 1 saat sonra okuyun. Sonraki okumaları her gün aynı saatte gerçekleştirin. Biyolüminesans (MTT) testleri için, bir luminometre plaka okuyucu kullanarak tahlili tam olarak üreticinin talimatlarında belirtildiği gibi 72 saat boyunca her 24 saatte bir yapın.
4. RNA-Seq analizleri ve ekspresyonu Erbb4 kaybı ile değiştirilen genlerin tanımlanması
- 6. Gün: Standart asit-guanidinyum-fenol ve kloroform bazlı yöntemler kullanarak toplam RNA'yı sıralanmış MPNST hücrelerinden izole edin. İki kohort arasındaki mRNA seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için tasarlanmış deneyler için, her kohorttaki en az üç biyolojik replikasyondan toplam RNA hazırlayın.
- Erbb4 kaybı yerine adenoviral vektör veya eGFP ekspresyonunun neden olduğu olayları ortadan kaldırmak için, RNA'yı P 0-GGFβ3'ün üç biyolojik replikasyonundan izole edin; Trp53+/-; Ad5CMV-Cre/eGFP ile dönüştürülen Erbb4fl/fl MPNST hücreleri ve Ad5CMV-eGFP ile dönüştürülen üç biyolojik replika.
NOT: İzole RNA, RNA-Seq analizi için 8 ≥ RNA bütünlük numarası (RIN) skoruna sahip olmalıdır. Kitaplıkları oluşturmadan önce sıralama çekirdeğinin tüm örneklerin RIN'ini belirlediğinden emin olun.
- Erbb4 kaybı yerine adenoviral vektör veya eGFP ekspresyonunun neden olduğu olayları ortadan kaldırmak için, RNA'yı P 0-GGFβ3'ün üç biyolojik replikasyonundan izole edin; Trp53+/-; Ad5CMV-Cre/eGFP ile dönüştürülen Erbb4fl/fl MPNST hücreleri ve Ad5CMV-eGFP ile dönüştürülen üç biyolojik replika.
- RNA-Seq kütüphanelerini hazırlamak için her numuneden 100-200 ng yüksek kaliteli toplam RNA kullanın (bu adım için çekirdek dizileme tesisi ile çalışın). Yeni nesil DNA sıralayıcısı kullanarak yüksek verimli dizileme gerçekleştirin. mRNA nicelemesi için, Fastq dosyaları oluşturmak üzere tek uçlu dizileme gerçekleştirin. Her numune için en az 50 milyon okuma yapıldığından emin olun.
NOT: RNA-Seq verilerini işlemek ve farklı şekilde ifade edilen transkriptlerin ekspresyonunu ölçmek için kullanılan iş akışını gösteren bir şematik için Şekil 3'e bakınız. Fastq dosyaları biçimindeki sıra verileri kalite kontrol prosedürlerine tabi tutulur; >80% 'i, sonraki analizler için uygun görülmesi için 30'luk bir Phred puanı vermelidir. Diziler ayrıca adaptör dizilerini kaldırmak ve düşük kaliteli okumaları filtrelemek için Trimmomatic18 kullanılarak önceden işlenir (kırpılır). - Herhangi bir yetenekli yazılım programını (örneğin, DNAStar 19,20 veya Partek21) kullanarak fastq tarafından oluşturulan dosyalar üzerinde RNA-Seq hizalaması ve analizi gerçekleştirin. Fastq dosyalarını fare referans genomuna (GRCm38/mm10) hizalamak için varsayılan ayarları kullanarak programa özgü adımları izleyin.
NOT: DNAStar'ı örnek olarak kullanarak, genel iş akışı aşağıda açıklanmıştır (Ek Şekil 1).- RNA-Seq analiz yöntemini seçin.
- Referans genomu seçin, Fare.
- Sıralama çekirdeği tarafından sağlanmışsa BED dosyasını yükleyin.
- Fastq sıralama dosyalarını karşıya yükleyin ve onlara benzersiz çoğaltma adları atayın.
- Fast q dosyalarını gruplayın ve bunları bir çoğaltma kümesine (örneğin, GFP, CRE) atayın.
NOT: Her hizalama programının kendine özgü adımları vardır ve kullanıcının programa özgü protokol için program kullanım kılavuzuna başvurması gerekir. Program daha sonra bu Fastq dosyalarından gene özgü ham sayım verileri üretecektir.
- Kontrol veri seti olarak Ad5CMV-eGFP örnek seti ve güçlü istatistiksel güç 22,23 ile diferansiyel gen ekspresyon sinyallerini tanımlamak için test veri seti olarak Ad5CMV-Cre seti ile 4.3'te açıklandığı gibi herhangi bir yetenekli yazılım programını kullanarak ham sayım verileri üzerinde istatistiksel ve normalizasyon analizi (DESeq2, EdgeR) gerçekleştirin.
- Kontrol veri kümesi olarak GFP fastq dosyalarını seçin.
- İstatistiksel ve normalleştirme yöntemi olarak DESeq2'yi seçin.
- Montaj ve analize başlayın.
NOT: Her hizalama programının kendine özgü adımları vardır ve kullanıcının programa özgü protokol için program kullanım kılavuzuna başvurması gerekir. Program daha sonra bu Fastq dosyalarından gene özgü ham sayım verileri üretecektir. İstatistiksel ve normalleştirme analizi, buradaki örnekte gösterildiği gibi, dizi hizalama protokolü içinde birçok programda yerleşik bir adımdır. Bu sonraki yerleşik adımı sunmayan alternatif bir dizi hizalama yazılımı programı kullanılıyorsa, Bioconductor.org ücretsiz olarak indirilebilen R ile yazılmış DESeq2 veya EdgeR kodlama paketlerini kullanarak terminal düzeyinde ham sayım verileri üzerinde istatistiksel ve normalleştirme analizi gerçekleştirin.
- Kontrole göre en az 1,5 kat artış veya azalmayı temsil eden değişiklikleri tanımlamak için bu yaklaşımları kullanın (bu durumda, Ad5CMV-eGFP virüsü ile dönüştürülen hücreler). Daha sonraki fonksiyonel zenginleştirme analizi için yalnızca istatistiksel olarak anlamlı olduğu belirlenen ve ≥1.5 kat değişiklik ve p-değeri 0.05 veya padj 0.1 gösteren diferansiyel olarak eksprese edilen genleri (DEG'ler) kullanın.
NOT: Bu, fonksiyonel zenginleştirme analizi için DEG genlerinin ve istatistiksel güçlerinin bir listesini oluşturacaktır. - Serbestçe kullanılabilen web tabanlı araçlardan herhangi birini kullanarak, 4.4'te tanımlanan istatistiksel olarak anlamlı Erbb4 aracılı DEG üzerinde, sıralanmış bir gen listesi dosyasıyla fonksiyonel zenginleştirme analizi yapın. Bu açık erişimli fonksiyonel zenginleştirme analiz araçlarına entegre edilmiş gen ontolojisi veri kümeleri aracılığıyla Erbb4 gen kaybının biyolojik ve yol önemini belirleyin24,25,26,27 (örnekler için Malzeme Tablosuna ve Panther kullanan örnek bir iş akışı için Şekil 3'e bakınız).
- Adım 4.4'te elde edilen verileri elektronik tablo olarak dışa aktarın.
- Verileri log2 kat değişimine, p/padj değerine veya her ikisine göre sıralayın.
- İstatistiksel olarak anlamlı olmayan tüm verileri kaldırdığınızdan emin olun.
- Sıralanmış gen listesini gen kimliği ile yalnızca .txt dosyası olarak dışa aktarın ve web sitesine yükleyin.
NOT: log2 kat değişiklikleri (en yüksekten en düşüğe), p/padj değerlerini (en düşükten en yükseğe) veya her ikisini birden [(-log10(pval)*sign(log2FC)] kullanarak sıralanmış bir giriş gen listesi oluşturmak için yalnızca istatistiksel olarak anlamlı DEG (sırasıyla 0,05 veya 0,1 < p/padj değerleri) kullanın. Sıralanmış bir gen listesi oluşturmak için çeşitli yaklaşımlar vardır ve veri kümesi ve sorulan soru için ampirik olarak belirlenir. Kullanılan spesifik fonksiyonel zenginleştirme analiz aracı türü, uygun rütbe gen listesinin belirlenmesinde de yardımcı olabilir. RNA-Seq hakkında ek kaynaklar için, aşağıdakimakalelere bakınız 28,29,30.
5. MPNST hücrelerinin ablatlanmış Erbb4 alelleri ile ortotopik allogreftlenmesi ve Erbb4 ablasyonunun etkilerinin analizi
- Sıralanmış MPNST hücrelerinin ortotopik tahsiftini yapmadan önce, tüm prosedürlerin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildiğinden ve onaylandığından ve tüm prosedürlerin uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirildiğinden emin olun.
- Enjeksiyon gününde, enzimatik olmayan bir hücre ayrışma çözeltisi (örneğin, şelatörlerin bir karışımı; Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücre kültürü plakalarından veya şişelerinden düşük geçişli hücreleri (yaklaşık% 85 akıcılık) çıkarın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Siyatik sinire ortopik enjeksiyonlar için, DMEM-1031'de hücreleri 16.667 hücre / mL'de (her hayvan için 3 μL başına 50.000 hücre) yeniden oluşturun. Hücreleri buz üzerinde tutun.
NOT: Bazı kültürler, hücreler düşük büyüme faktörlü bazal membran matrisine enjekte edilmedikçe greftleri başarılı bir şekilde oluşturamazlar. Bir bazal membran matrisi gereksinimi (% 10-50) ampirik olarak belirlenmelidir. - MPNST hücrelerini 8-10 anestezik Hsd'nin siyatik sinirine enjekte ederek enfekte sonrası hücrelerde in vivo allogreft büyüme potansiyelini değerlendirin: Kohort başına Atimik Çıplak-Foxn1nu fareler (4-8 haftalık). Tümör hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu için Turk ve ark. 31'e bakınız. Burada deri altı enjeksiyonu gösterilmiştir.
NOT: İstatistiksel anlamlılık için gereken deney hayvanlarının sayısını belirlemek için, bir biyoistatistikçiye danışın veya serbestçe kullanılabilen bir yazılım olan G*Power3'ün kullanılması önerilir32. - Herhangi bir ağrı belirtisi için enjeksiyondan sonraki ilk hafta boyunca hayvanları günde iki kez yakından izleyin. Bundan sonra, kumpas ölçümleri için aşılanmış fareleri haftada üç kez izleyin ve daha önce 5,31'de açıklandığı gibi vücut durumu skorlarını (BCS'ler) değerlendirin. IACUC kılavuzlarında belirtildiği gibi, BCS'si 2 veya daha az olan hayvanları ötenazi yapın.
- Aşılanmış hücreler farklı oranlarda büyüdükçe, bu bölümde açıklanan deneyleri yapmadan önce kontrol (değiştirilmemiş) hücreleri kullanarak greft sürelerini ampirik olarak belirleyin. Greftleri deneysel son noktada toplamak için, karbondioksit inhalasyonunu kullanarak fareleri insancıl bir şekilde ötenazi yapın ve ardından ikincil bir önlem olarak servikal çıkığı izleyin. Her greftin son hacim ve kütle ölçümlerini kaydedin.
NOT: Değiştirilmemiş P 0-GGFβ3 olarak; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST hücreleri tipik olarak 30-45 gün içinde IACUC tarafından izin verilen maksimum boyuta ulaşır, tipik bir zaman çizelgesi enjeksiyondan yaklaşık 30-45 gün sonradır. - Adım 1.6-1.8'de açıklandığı gibi dokuyu izole edin ve kesitleyin. Greft dokusunun bir kısmını gece boyunca% 4 paraformaldehit (Şekil 2) içinde sabitleyin ve daha sonra parafin içine yerleştirin. FFPE dokusundan 5 μm kesitler hazırlayın ve bunları slaytlara monte edin. Greft dokusunun 1.8.1'de açıklandığı gibi tümör hücrelerinden oluştuğunu doğrulamak için H & E boyama ve diğer gerekli immün boyama işlemlerini gerçekleştirin. Erbb4 ekspresyonunun kaybını doğrulamak ve Erbb4 kaybının diğer Erbb ailesi üyelerinin ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek gibi aşağı akış analizleri için tümör dokusunun geri kalanını anında dondurun.
NOT: Greft dokusundaki tümör hücrelerinin doğrulanması yapılmalıdır, çünkü immün yetmezlikli fareler neoplazmlar geliştirmeye eğilimlidir. Küçük greftler söz konusu olduğunda, skar dokusunun veya inflamasyonun bir neoplazm ile karıştırılmamasını sağlamak önemlidir.- Ad5CMV-eGFP ve Ad5CMV-Cre/eGFP ile tedavi edilen hücrelerden yetiştirilen allogreftlerde ilgi çekici proteinlerin ekspresyonunu karşılaştırmak için FFPE dokusunda standart IHC boyama işlemini gerçekleştirin. İki deney koşulu arasındaki in vivo erbB4 ekspresyonundaki farklılıkları doğrulamak için erbB4'e özgü antikorlar kullanarak eksize edilen greft dokusunu lekeleyin. Ki67 boyama yoluyla proliferatif indeksi ve terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı dUTP nick-end etiketleme (TUNEL) boyama yoluyla apoptoz seviyesini belirleyin.
NOT: İlgilenilen herhangi bir protein hedefi IHC ile de değerlendirilebilir. Örneğin, gen ablasyonunun aracılık ettiği in vivo vasküler mikroçevre farklılıklarını belirlemek için allogreftleri bir anti-CD31 antikoru (1:50 seyreltme) ile immün boyayarak vasküler yoğunluğu değerlendirin. 40x alan başına vasküler profil sayısı niceleme için sayılabilir. Bu IHC tabanlı testler için, boyama prosedürleri için standart IHC protokollerini ve üreticinin TUNEL boyama protokolünü izleyin. Görüntülerin niceliğini belirlemek için ImageJ eklentisi "tek renkli görüntünün otomatik sayımı" eklentisini kullanın.
- Ad5CMV-eGFP ve Ad5CMV-Cre/eGFP ile tedavi edilen hücrelerden yetiştirilen allogreftlerde ilgi çekici proteinlerin ekspresyonunu karşılaştırmak için FFPE dokusunda standart IHC boyama işlemini gerçekleştirin. İki deney koşulu arasındaki in vivo erbB4 ekspresyonundaki farklılıkları doğrulamak için erbB4'e özgü antikorlar kullanarak eksize edilen greft dokusunu lekeleyin. Ki67 boyama yoluyla proliferatif indeksi ve terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı dUTP nick-end etiketleme (TUNEL) boyama yoluyla apoptoz seviyesini belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 4, P 0-GGFβ3'ü dönüştürürken elde edilen tipik bir sonucu göstermektedir; Trp53-/+; Ad5CMV-eGFP adenovirüsü veya Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirüsü ile Erbb4fl/fl MPNST hücreleri (Şekil 4A). Kültürler, eGFP eksprese eden hücreleri tanımlamak için floresan mikroskobu ile ve aynı alanda bulunan toplam hücre sayısını 10x (üstte) ve 40x'te (altta) belirlemek için faz-kontrast mikroskobu ile incelenir. İstenirse, eGFP'yi eksprese eden hücrelerin yüzdesi hesaplanabilir. Temsili FACS çıkış verileri Ek Şekil S2'de gösterilmiştir. FACS'ı takiben, eGFP eksprese eden hücrelerin yüzdesi belirgin bir şekilde artacak ve her alandaki hemen hemen tüm hücreler eGFP'yi ifade edecektir. Cre-mediated gen ablasyonundan sonra beklenen tipik PCR genotipleme sonuçları, transfeksiyon etkinliğine bağlı olarak, kontrol transdüksiyon sonuçlarına (GFP sadece, fl / fl) kıyasla tam gen nakavtı (% 100 verimlilik) veya indüklenmiş ve indüklenmemiş hücrelerin heterojen bir popülasyonudur (<% 100 verimlilik) (Şekil 4B). Şekil 4C, P 0-GGFβ3'ün ortopik allogreftlerinde bulunan karakteristik histopatolojiyi göstermektedir; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST'ler, orijinal GEM hayvan modellerinden türetilen tümörlerle karşılaştırılmıştır.
Bu deneylerde, Erbb4 ablasyonu in vitro ve in vivo hücresel proliferasyon ve hücresel yoğunlukta azalmalara, in vivo TUNEL etiketleme indekslerinde artışa ve in vivo vasküler yoğunluğun azalmasına neden olmuştur. Şekil 5, Ad5CMV-Cre ablatlanmış hücrelerde azalmış hücresel proliferasyon ve kontrol Ad5CMV-GFP transdüke hücrelerinde azalmış hücresel proliferasyonu gösteren görüntü tabanlı otomatik bir sitometre ile elde edilen temsili sonuçları göstermektedir (Şekil 5A); Bu deneyler erken pasaj kültürlü hücrelerle gerçekleştirildi. ErbB4'ün P 0-GGFβ3'te immünohistokimya yoluyla ekspresyonu; Trp53+/-; Ad5CMV-Cre veya eGFP virüsü ile transdüe edilen Erbb4fl/fl MPNST hücreleri, sonuçta ortaya çıkan Ad5CMV-Cre transdüktif allogreftlerde, kontrol Ad5CMV-eGFP ile tedavi edilen allogreft tümörlere kıyasla azalmıştır (Şekil 5B). Vasküler yoğunluk CD31 için immünoreaktivite tespiti ile değerlendirildi; Ad5CMV-Cre transdüktif hücrelerin allogreftlerinde vasküler yoğunluğun belirgin şekilde azaldığı görülebilir (Şekil 5C). Sinyal yoğunluğu, istenirse ImageJ kullanılarak ölçülebilir.
Şekil 1: P 0-GGFβ3 üretilirken ve geçerken beklenen genotiplerin oranlarının Punnet kare hesaplamaları; Trp53+/- Erbb4fl/fl farelere sahip fareler (F1). Punnet kare hesaplamaları, P 0-GGFβ3 üretilirken ve korunurken beklenen genotiplerin oranları; Trp53-/+; Erbb4fl/+ birbirleri ile (F2). Kısaltma: fl = Floxed. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: P 0-GGFβ3'ten türetilen MPNST hücrelerinin erken geçiş kültürlerinde flokslanmış Erbb4 alellerini ablate etmek için kullanılan işlemin iş akışı; Trp53-/+; Erbb4 fl/fl fareler. (A) Flokslanmış geni ifade eden tümörü toplayın. (B) Eksize edilen tümörden erken geçiş kültürleri oluşturun. (C) Floksed geni ablate etmek ve aşağı akış tahlilleri yapmak için erken geçiş kültürlerini enfekte etmek. Kısaltmalar: MPNST = malign periferik sinir kılıfı tümörü; IHC = İmmünohistokimya; PFA = Paraformaldehit; FFPE = Formalin-sabit parafin-gömülü; H&E = Hematoksilin ve eozin; FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama; GFP = yeşil floresan protein; K/O = nakavt; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RNA-Seq iş akışını gösteren şematik. İş akışı, kontrol (GFP ile indüklenmiş) ve Erbb4-null (Cre-indüklenmiş) hücreler arasında farklı şekilde ifade edilen transkriptleri ve bunun sonucunda ortaya çıkan biyolojik önemi tanımlamak için kullanılır. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; RNA-Seq = RNA dizilimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: P 0-GGFβ3'te mikroskopi ile değerlendirilen temsili transdüksiyon verimliliği sonuçları; Trp53-/+; Erbb4 fl/fl MPNST hücreleri. (A) Ad5CMV-eGFP adenovirüsü veya Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirüsü ile transdüke edilen hücreler. (B) Ad5CMV enfeksiyonu sonrası potansiyel gen popülasyonlarının PCR sonuçları. (C) Orijin GEM modellerinde üretilen tümörleri ortopik olarak tahsis edilmiş P 0-GGFβ3 ile karşılaştıran karakteristik histopatoloji; Trp53-/+; H&E boyama yoluyla Erbb4fl/fl MPNST hücreleri. Görüntüler 40x'te çekildi. Kontrol boyaması için izotip uyumlu negatif kontrol antikorları kullanıldı. Ölçek çubukları = 400 μm (A, üst panel); 100 μm (A, alt panel), 20 μm (C). Kısaltmalar: MPNST = malign periferik sinir kılıfı tümörü; GFP = yeşil floresan protein; BF = parlak alan; FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama; Neg Ctrl = negatif kontrol; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu; GEM = genetiği değiştirilmiş fare; fl = floksed. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Ad5CMV-eGFP veya Ad5CMV-Cre/eGFP ile transdüksiyonu takiben kültürlenmiş MPNST erken geçiş kültürlerinde ve ortopik olarak tahsis edilmiş MPNST hücrelerinde elde edilen temsili sonuçlar. (A) Ad5CMV-Cre/eGFP ile transdüke edilen hücrelerde Ad5CMV-eGFP ile transdüke edilenlere kıyasla azalmış hücresel yoğunluğu gösteren kültürlenmiş MPNST hücrelerinin proliferasyon testi. Niceliksel veriler 1, 3 ve 5. günlerde (solda) grafiklendirilir. Görüntü tabanlı otomatik sitometrede çekilen 1. Gün ve 5. Gün akıcılık görüntüleri sağda gösterilir (Parlak alan mikroskobu ile 4x büyütmede çekilen görüntüler). Hata çubukları, en az 3 farklı bağımsız deneyin ortalamasının (SEM) standart hatasını temsil eder. (B) 20x büyütmede alınan Ad5CMV-eGFP veya Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirüsü ile transdüe edilen allogreft tümörlerde temsili ErbB4 boyaması. Kırmızı kanal (Alexa 564, CD31), mavi kanal (Hoechst, çekirdekler). (C) P 0-GGFβ3 allogreftlerinde vasküler yoğunluğun temsili görüntüleri; Trp53+/-; Erbb4 fl/fl MPNST hücreleri, Ad5CMV-Cre/eGFP virüsüne karşı Ad5CMV-eGFP ile transdüke edilir. Görüntüler 40x'te çekildi. Kontrol boyaması için izotip uyumlu negatif kontrol antikorları kullanıldı. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: MPNST = malign periferik sinir kılıfı tümörü; eGFP = gelişmiş yeşil floresan proteini; IgG = immünoglobulin G; NEG = negatif kontrol; CD = farklılaşma kümesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Bir dizi hizalama ve analiz iş akışını gösteren şematik. RNA dizileme dosyalarını (fastq dosyaları) hizalamak ve analiz etmek için DNAStar'da kullanılan iş akışı. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; RNA-Seq = RNA dizilimi., DEG = diferansiyel olarak eksprese edilen genler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: Yeşil floresan proteini kullanan erken geçiş kültürlerinden temsili FACS verileri. (A) GFP eksprese eden hücreler, enfekte olmayan hücrelerden floresan kapı parametreleri ayarlandıktan sonra FACS'a göre sıralanır. (B) Uygun algılama kapısı ayarlandıktan sonra, GFP-pozitif (dönüştürülmüş) hücreler GFP-negatif (dönüştürülmemiş) hücrelerden ayrılır. Kısaltmalar: SSC-A = tepe noktasının yan dağılım alanı; FSC-H = tepe noktasının ileri saçılma-yüksekliği; FSC-W = tepe noktasının ileri saçılma genişliği; GFP = yeşil floresan protein; FACS = Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan ayrıntılı yöntemler, MPNST'lerin GEM modeli kullanılarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, ilgilenilen tümör dokusu bireysel hücrelere dağılabilirse, bu metodolojiler GEM'lerde ortaya çıkan çeşitli tümör tipleri için kolayca uyarlanabilir. Floksed alelin i) tümörleri taramak için yeterli fareler elde etmeyi zorlaştırabilecek sağkalımın azalmasına veya ii) yeterli tümör taşıyan farelerin elde edilmesini zorlaştırabilecek tümör gecikmesinin artmasına neden olmadığından emin olmak önemlidir. Eğer floksed alel hayatta kalmayı etkilemiyorsa, her iki kohortun da hayatta kalması eşdeğer olacaktır. Tümör gecikmesi üzerinde hiçbir etkisi yoksa, benzer bir zaman seyrine sahip her iki kohortta da eşdeğer sayıda tümör taşıyan fare ortaya çıkmalıdır.
Benzer yaklaşımlar, indüklenebilir koşullu nakavt hayvanları üretmek için koşullu nakavtlar ve tamoksifen ile indüklenebilir Cre hayvanları kullanarak nörofibromları ve MPNST'leri incelemek için kullanılmıştır33,34. Bu çalışmalar ile bu çalışma arasındaki fark, daha önce tartışıldığı gibi Cre indüksiyonu için tamoksifen kullanımının yanı sıra, bu çalışmaların NF1'in dokuya özgü bir nakavtı ile tümör gelişimine odaklanmasıdır. Bu çalışma ve diğer çalışmalar da GEM'den üretilen tümörleri kullandığından, fark sorulan soruda yatmaktadır. Bu protokolde, NF1 kaybının MPNST patogenezinde oynadığı rolü inceliyoruz, bunun yerine GEMM tarafından üretilen MPNST'lerde spesifik bir genin (Erbb4) in vivo tümör büyümesi üzerinde uyguladığı rolü inceliyoruz, aksi takdirde embriyonik ölümcül olması nedeniyle imkansız olurdu. Ayrıca, bu protokol, bu tür parametreleri gerektiren yaklaşımlar için tamoksifen kullanımını önler.
Diğerleri, ksenograft modellerinde yerleşik insan MPNST hücre hatlarını incelemiştir35. Bu çalışma, kullanılan aşılanmış hücrelerin iyi çalışılmış ancak yüksek pasajlı insan MPNST hücre hatları olması ve ksenogreftlerde ilaç yanıtları oluşturmaya odaklanması nedeniyle bundan farklıdır. Bu araştırmacılar, in vivo büyüme için bu MPNST hücrelerinde belirli bir genin rolünü ve gen kaybının ilaç yanıtı üzerindeki etkilerini incelemiyorlar. Buna benzer bir başka çalışma, adenovirüs Cre rekombinaz (Ad-Cre) aracılı NF1 kaybını zamansal ve mekansal bağımlı bir şekilde kullanarak, yine MPNST translasyonel çabalarını genişletmek için güçlü bir yöntem olan Dodd ve ark. tarafından gerçekleştirilmiştir36. Çalışma, insan MPNST'lerinde çok yaygın olarak birlikte silinen iki gen olan NF1 ve Ink4a / Arf kaybının, Ad-Cre enjeksiyonu ile siyatik sinirdeki rolüne odaklandı. P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Bu çalışmada tanımlanan Erbb4fl / fl fareleri, Schwann hücre öncül soylarına Ad-Cre enjekte edilerek bu şekilde kullanılabilir. Bununla birlikte, bu çalışmada sorulan sorular, Erbb4'ün MPNST inisiyasyonundaki evrimsel rolüne değil, MPNST'lerin tümör büyüme avantajı için Erbb4 sinyalini nasıl ele geçirebileceğine odaklanmıştır.
RNA girişimi (RNAi) yoluyla gen ekspresyonunu yıkmak veya insan kanser hücresi hatlarında CRISPR ile ilgilenen geni inaktive etmek de dahil olmak üzere burada açıklanan yaklaşıma alternatifler vardır. Bu alternatif yaklaşımlar değerlidir ve fare tümörü hücrelerinde gözlenen etkilerin insan muadillerinde özetlendiğini doğrulamak için GEM tümörlerinden türetilen hücrelerde gen ablasyonu ile ilişkilendirilebilir. Bununla birlikte, burada açıklanan metodolojinin bazı açık avantajları vardır. İlk olarak, GEM kanser hücrelerinde genetik olarak ablating floks genleri hızlıdır ve hedeflenen genin tamamen inaktivasyonunu üretir. Buna karşılık, kısa saç tokası RNA'larının kullanılmasının, gen ekspresyonunun sadece kısmi bir şekilde yıkılmasıyla sonuçlandığı sıklıkla gözlenir. CRISPR tam gen inaktivasyonu üretebilse de, tam inaktivasyona sahip klonların tanımlanması uzun bir seçim süreci gerektirir.
Ayrıca, CRISPR ablasyonundan kaynaklanan etkilerin farklı klonlar arasında farklılık göstermediğinden emin olmak için birden fazla klon incelenmelidir. İkincisi, erken pasaj GEM tümör kültürlerinde floklu alelleri ablate etme yeteneği, kültürde etkili bir şekilde büyüyen farklı tümör hücresi alt popülasyonlarını seçme olasılığını en aza indirdiği için avantajlıdır. Buna karşılık, tipik olarak yıllardır kültürde tutulan insan hücre çizgileri, genellikle kültür için iyi adapte olmuş ve bu süreçte sıklıkla genetik sürüklenmeye maruz kalan farklı alt popülasyonlardan türetilir. Bu, bu hücre hatlarının ana tümörlerinde bulunmayan yeni mutasyonlar geliştirmesine neden olur. Son olarak, GEM tümör hücrelerinin immün yetmezlikli farelere aşılanması bu makalede tarif edilmesine rağmen, inbred fare suşlarında ortaya çıkan tümörlerden türetilen GEM tümör hücrelerinin aynı suştaki farelere tahsis edilebileceği belirtilmiştir. Bu, araştırmacının, hedeflenen genin varlığında veya yokluğunda sağlam bir bağışıklık sistemine sahip hayvanlarda tümör biyolojisini değerlendirmesine izin verecektir.
Burada tarif edilen protokoldeki kritik adım, flokslanmış genin Ad5CMV-Cre/eGFP ile ablasyonu ve gen ablasyonu ve FACS'ı takiben tümör hücrelerinin hayatta kalmasının sağlanmasıdır. Bu, Cre rekombinazının floklu geni ablate etme yeteneğine bağlı bir süreç olduğundan, potansiyel olarak floklu bir genin in vivo olarak ablatılmasında karşılaşılabilecek aynı sorunlardan bazılarına maruz kalır; bu sorunlar, hedeflenen alelin eksik bir ablasyonu olarak ortaya çıkacaktır. eGFP eksprese eden adenoviral vektör ile başarılı bir şekilde dönüştürülen hücreleri saflaştırma yeteneğinin, CreERT2 ile in vivo gen ablasyonuna kıyasla mozaisizmi en aza indirgediğini unutmayın. Bununla birlikte, hücre yüzeyinde eksprese edilen ErbB4 gibi proteinleri kodlayan hedeflenmiş genler söz konusu olduğunda, hem eGFP hem de ilgili proteini tanıyan bir antikor kullanarak FACS uygulayarak hedeflenen genin kaybını daha da sağlamak mümkün olabilir (yani, eGFP-pozitif / erbB4-negatif hücreleri sıralayın).
Girişte belirtildiği gibi, monoklonal antikorlar tarafından terapötik olarak hedeflenen proteinlerin çoğu hücre yüzey proteinleri olduğundan, bu yaklaşım sıklıkla uygulanabilir olmalıdır. Ayrıca, gen ablasyonunun transkriptom üzerindeki etkisini değerlendirmek için RNA-Seq uygulanacaksa, tümör hücrelerinin FACS'tan sonra en az 2-3 gün iyileşmesine izin vermenin önemli olduğu da belirtilmelidir. FACS'tan çok kısa bir süre sonra elde edilen RNA-Seq veri kümeleri, bazı hücre tiplerinde biyolojik replikasyonlar arasında gen ekspresyonunda daha fazla değişkenlik göstermektedir. Bu, FACS'den geçerken hücrelerin yaşadığı travmanın bir sonucu olabilir; Bu nedenle, hücrelere bu işlemden sonra bir iyileşme süresi verilmelidir. RNA-Seq veri kümeleri, negatif binom dağılımını ve dağılımın varyansı için bir büzülme tahmincisini kullanan DESeq2 kullanılarak analiz edilebilir. Bu analizlerde, numuneler, transkript seviyelerindeki değişikliklerin önemli olduğu en küçük yanlış keşif oranı (FDR) olan q-değerlerine göre sıralanır; FDR'ler Benjamini-Hochberg çoklu test ayarlama prosedürü kullanılarak hesaplanır. Alternatif olarak, DEG'ler RNA-Seq analiz iş akışlarına sahip diğer mevcut yazılımlar kullanılarak tanımlanabilir.
Bu MPNST hayvan modeli için, deneysel bitiş noktasının belirlenmesi, kullanılan hayvan modelindeki neoplazmların doğal tarihinin anlaşılmasını gerektirir. Bu GEM'deki MPNST'lerin doğal öyküsü, bir dizi 44 P 0-GGFβ3 fare6 ve 19 P0-GGFβ3'ün hayatta kalmasını takiben belirlendi; Trp53+/- fareler7 ve daha sonra hayatta kalma sonlanımlarına ulaştıklarında tüm bu hayvanlar üzerinde tam nekropsiler gerçekleştirirler. Tipik hayatta kalma süreleri ve MPNST'lerin tipik olarak ortaya çıktığı yer her hayvan modelinde belirlenmiştir. Bu farelerin çoğunda, MPNST'ler trigeminal sinirde ortaya çıktı. Trigeminal sinirde ortaya çıkan MPNST'ler tipik olarak kornea bulanıklığı ile ilişkili pitozis üretti (pitozis tarafından üretilen gözyaşı dağılımı ile ilgili sorunların bir sonucu), bu da tümör taşıyan fareleri tanımlamak için klinik olarak yararlı bir işaret sağladı. Tümör tanısı, H&E lekeleri ve birkaç ek tanısal leke (S100β, nestin Sox 10, H&E, Mart1) yapılarak doğrulanmalı ve ardından kalifiye bir veteriner veya insan patologu tarafından muayene edilmelidir. Bu aynı zamanda önemlidir, çünkü bu modeldeki Trp53 null alel, fareleri lenfomalar gibi diğer neoplazmların gelişimine yatkınlaştırır ve bu tümörler MPNST'lerden ayırt edilmelidir.
Son olarak, bu metodolojinin henüz araştırılmamış ancak gelecekteki araştırmalarda uygulanabilir olabilecek birkaç potansiyel uygulaması vardır. Örneğin, hem erbB3 hem de erbB4'ü aktive eden ligand olan neuregulin 1 (NRG1), MPNST hücrelerinin kemotaktik bir şekilde göçünü teşvik eder; Hem erbB3 hem de erbB4, MPNST hücrelerinin invazadopodiasında bulunur37. Bununla birlikte, erbB3 veya erbB4'ün NRG1'e kemotaktik yanıta aracılık edip etmediği açık değildir. Sonuç olarak, erbB4'ün bu metodoloji ile ablatlandığı hücreler bu soruyu ele almak için kullanılabilir. Bu deneylerin doğal bir takibi, tümör hücrelerinin kuyruk damarı yoluyla enjekte edildiği ve daha sonra değerlendirilen pulmoner metastaz sayısını kullanarak yaygın olarak kullanılan yaklaşımı kullanarak metastaz için erbB4'ün gerekli olup olmadığını değerlendirmektir. Bu metodoloji, erbB4 ekspresyonunu yıkmak için shRNA'ların kullanılması gibi diğer yaklaşımlara göre açık bir avantaj sunar, çünkü shRNA ekspresyonu genellikle bir süre sonra hücrelerde susturulur. Ayrıca, erken geçiş kültürlerinin, metastaza eğilimli hücrelerin alt popülasyonları da dahil olmak üzere tümör kaynaklı alt popülasyonların bir karışımını içermesi beklenmektedir. Burada açıklanan metodoloji kullanılarak hazırlanan hücrelerle metastaz tahlillerinin yapılması, ana tümörün yerleşik bir hücre hattından daha fazla temsil ettiği metastatik potansiyelin değerlendirilmesine izin verecektir. Bu, elbette, bu metodolojiyi kullanabilecek gelecekteki uygulamaların sadece bir örneğidir. Diğer araştırmacıların, insan kanserlerinde kilit terapötik hedefler olan proteinleri tanımlama yeteneğini geliştirmek için bu metodolojiyi özellikle ilgilendiren problemlerle birleştireceğini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü (R01 NS048353, R01 NS109655), Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA122804), Savunma Bakanlığı (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 ve W81XWH-15-1-0193) ve Çocuk Tümörü Vakfı (2014-04-001 ve 2015-05-007) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
References
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J.
- Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
- Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
- Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
- Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
- Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
- Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
- Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
- Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
- Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
- Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
- Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
- Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
- Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
- Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
- Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
- Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
- Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
- Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
