Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تحديد وظائف الجينات في تكوين الأورام عن طريق الاستئصال خارج الجسم الحي للأليلات المفلطحة في الخلايا السرطانية الخبيثة للغمد العصبي المحيطي

Published: August 25, 2021 doi: 10.3791/62740
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء الضربات القاضية الجينية القاتلة جنينيا في الجسم الحي في الأورام المشتقة من نموذج الفئران المهندسة وراثيا ، ثم تقييم تأثير الضربة القاضية على نمو الورم ، والانتشار ، والبقاء على قيد الحياة ، والهجرة ، والغزو ، والنسخ في المختبر وفي الجسم الحي.

Abstract

إن تطوير عقاقير جديدة تستهدف بدقة البروتينات الرئيسية في السرطانات البشرية يغير بشكل أساسي علاجات السرطان. ومع ذلك ، قبل استخدام هذه الأدوية ، يجب التحقق من صحة البروتينات المستهدفة كأهداف علاجية في أنواع محددة من السرطان. غالبا ما يتم إجراء هذا التحقق من الصحة عن طريق ضرب الجين الذي يشفر الهدف العلاجي المرشح في نموذج الفأر المعدل وراثيا (GEM) للسرطان وتحديد تأثير ذلك على نمو الورم. لسوء الحظ ، فإن القضايا التقنية مثل الفتك الجنيني في الضربات القاضية التقليدية والفسيفساء في الضربات القاضية المشروطة غالبا ما تحد من هذا النهج. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير نهج لاستئصال جين قاتل جنيني مفلطخ يهتم بالثقافات قصيرة الأجل لأورام غمد الأعصاب الطرفية الخبيثة (MPNSTs) المتولدة في نموذج GEM.

تصف هذه الورقة كيفية إنشاء نموذج فأر بالنمط الوراثي المناسب ، واشتقاق مزارع الورم قصيرة الأجل من هذه الحيوانات ، ثم القضاء على الجين القاتل الجنيني المفلطح باستخدام ناقل فيروسي غدي يعبر عن Cre recombinase وبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP). ثم يتم تفصيل تنقية الخلايا المحولة بالفيروس الغدي باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) وتحديد كمية التأثيرات التي يمارسها الاستئصال الجيني على الانتشار الخلوي ، والجدوى ، و transcriptome ، ونمو allograft التقويمي. توفر هذه المنهجيات نهجا فعالا وقابلا للتعميم لتحديد الأهداف العلاجية والتحقق من صحتها في المختبر وفي الجسم الحي. توفر هذه الأساليب أيضا مصدرا متجددا للخلايا المشتقة من الورم منخفض المرور مع انخفاض في القطع الأثرية للنمو في المختبر . وهذا يسمح بدراسة الدور البيولوجي للجين المستهدف في عمليات بيولوجية متنوعة مثل الهجرة والغزو والانبثاث والتواصل بين الخلايا بوساطة الإخفاق.

Introduction

قبل العقدين الماضيين، كان علاج السرطانات البشرية يعتمد بشكل كبير على العلاج الإشعاعي وعوامل العلاج الكيميائي التي استهدفت على نطاق واسع السكان الخلويين الذين ينتشرون بسرعة عن طريق إتلاف الحمض النووي أو تثبيط تخليق الحمض النووي. على الرغم من أن هذه الأساليب تمنع نمو الخلايا السرطانية ، إلا أنها كانت لها أيضا آثار جانبية ضارة على أنواع الخلايا الطبيعية سريعة التكاثر مثل الخلايا الظهارية المعوية وخلايا بصيلات الشعر. في الآونة الأخيرة ، بدأ علاج السرطان في استخدام عوامل العلاج الكيميائي التي تستهدف بدقة البروتينات ضمن مسارات الإشارات التي تعتبر مهمة للغاية لنمو أورام المريض الفردية. وقد أدى هذا النهج ، الذي يشار إليه عادة باسم "الطب الدقيق" ، إلى تطوير ذخيرة دائمة التوسع من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة والمثبطات الجزيئية الصغيرة. تمنع هذه العوامل بشكل فعال تكاثر الخلايا السرطانية وبقائها مع تجنب الآثار الجانبية الضارة على أنواع الخلايا الطبيعية التي شوهدت مع عوامل العلاج الكيميائي التقليدية والعلاج الإشعاعي. تستهدف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المستخدمة لعلاج السرطانات البشرية بشكل شائع جزيئات سطح الخلية مثل مستقبلات عامل النمو 1 (على سبيل المثال ، العائلة الكبيرة من كينازات التيروزين المستقبلة التي تمتد عبر الغشاء) ومعدلات الاستجابة المناعية2 (على سبيل المثال ، بروتين موت الخلايا المبرمج 1 ، رباط الموت المبرمج1). يمكن أن تمنع المثبطات الجزيئية الصغيرة إما بروتينات سطح الخلية أو بروتينات الإشارة الموجودة داخل الخلايا3. ومع ذلك ، من أجل توظيف هذه العوامل العلاجية الجديدة بشكل فعال ، يجب إثبات أن سرطانا معينا يعتمد على الجزيء الذي يستهدفه عامل علاجي مرشح.

على الرغم من أن هذه العوامل العلاجية الجديدة لها تأثيرات أكثر تركيزا ، إلا أن العديد منها لا يزال يمنع عمل أكثر من بروتين واحد. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تتوفر عوامل متعددة ذات فعالية وخصوصية متفاوتة لاستهداف بروتين معين. وبالتالي ، أثناء التحقيقات قبل السريرية ، من الحكمة استخدام طرق إضافية مثل الاستئصال الجيني للتحقق من صحة البروتين المرشح كهدف علاجي. أحد الأساليب المفيدة بشكل خاص للتحقق من صحة البروتين كهدف علاجي هو استئصال الجين الذي يشفر البروتين المرشح في نموذج حيواني معدل وراثيا يطور نوع السرطان المحدد للاهتمام. يمكن أن يكون هذا النهج مباشرا نسبيا إذا توفرت الفئران ذات الطفرة الصفرية (إما طفرة طبيعية أو طفرة فارغة معدلة وراثيا ["ضربة قاضية"] أو طفرة فارغة أدخلها مصيدة جينية) ، وكانت الفئران قابلة للحياة في مرحلة البلوغ. لسوء الحظ ، غالبا ما تكون الفئران ذات الطفرة الصفرية التي تلبي هذه المعايير غير متوفرة ، عادة لأن الطفرة الصفرية تؤدي إلى الموت جنينا أو في الأيام الأولى من حياة ما بعد الولادة. في هذه الحالة، يمكن بدلا من ذلك عبور الفئران المعرضة لتطوير نوع الورم محل الاهتمام إلى الفئران التي تحيط بها أجزاء رئيسية من الجين محل الاهتمام بمواقع loxP ("floxed")، والتي تسمح باستئصال الجين عن طريق إدخال جين متحول يعبر عن Cre recombinase في الخلايا السرطانية (ضربة قاضية مشروطة). يوفر هذا النهج العديد من المزايا. أولا ، إذا كان برنامج تشغيل Cre متاحا يتم التعبير عنه في الورم ولكن ليس في نوع الخلية التي أدت إلى الوفاة في الضربات القاضية التقليدية ، فمن المحتمل أن يؤدي هذا النهج إلى التحقق من صحة الهدف العلاجي المرشح. ثانيا، إن إزالة الجين الذي يشفر البروتين المرشح في الخلايا السرطانية ولكن ليس في العناصر الأخرى داخل الرحم مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالورم أو الخلايا المناعية يسمح للباحث بالتمييز بين التأثيرات المستقلة للخلية وغير المستقلة للخلية للهدف العلاجي. وأخيرا، يسمح برنامج تشغيل Cre المستحث بالتاموكسيفين (CreERT2) للباحث بحذف الجين محل الاهتمام في مراحل مختلفة من تطور الورم وتحديد النافذة التي من المرجح أن يكون فيها العامل العلاجي المرشح فعالا.

لسوء الحظ ، هناك أيضا مشكلات فنية يمكن أن تحد من استخدام الضربات القاضية الشرطية في الأورام الناشئة في نماذج GEM. على سبيل المثال ، قد لا يتوفر برنامج تشغيل Cre الذي يتم التعبير عنه في الخلايا السرطانية ويتجنب حذف الجينات في الخلايا الطبيعية الضرورية للحياة. هناك مشكلة أخرى ، والتي يمكن التقليل من شأنها ، وهي أن برامج تشغيل Cre و CreERT2 غالبا ما تقوم باستئصال الأليلات المفلطحة في الفئران ، مما يؤدي إلى الفسيفساء للطفرة الخالية في سرطان GEM. عندما يحدث هذا ، ستستمر الخلايا السرطانية التي لم يتم فيها استئصال الجين المستهدف في التكاثر بسرعة ، مما يؤدي إلى زيادة نمو الخلايا السرطانية مع الأليلات الممزقة. يمكن أن تحدث الفسيفساء في خطوط تشغيل Cre بسبب تعبير Cre غير المنتشر في كل مكان في السلالة المستهدفة وعن طريق إعادة التركيب الفاشلة في الخلايا الفردية المستقلة عن تعبير Cre4. هذه ظاهرة معروفة لبرامج تشغيل Cre تعتمد على نوع الخلية ويجب مراعاتها أثناء التصميم التجريبي وتفسير البيانات. يمكن للفسيفساء أن تخفي تأثير الضربة القاضية وتقود الباحث إلى استنتاج خاطئ بأن الجين محل الاهتمام ليس ضروريا لتكاثر الخلايا السرطانية و / أو البقاء على قيد الحياة ، وبالتالي فهو ليس هدفا علاجيا صالحا.

تمت مواجهة العديد من هذه المشاكل في دراسة سابقة حاولت تحديد ما إذا كان مستقبلات التيروزين كيناز erbB4 هدفا علاجيا محتملا في خلايا MPNST5. في هذه الدراسات ، تم استخدام الفئران التي تعبر عن جين متحول يشفر عامل النمو الدبقي متساوي الشكل neuregulin-1 (NRG1) -β3 (GGFβ3) تحت سيطرة بروتين المايلين الخاص بخلية Schwann صفر المروج (P 0-GGFβ3 الفئران). تطور الفئران P 0-GGFβ3 أورام ليفية عصبية متعددة الشكل تتقدم لتصبح MPNSTs من خلال عملية تلخص عمليات التسبب في الورم العصبي الليفي وتطور الورم الليفي العصبي الضفيري - MPNST الذي شوهد في المرضى الذين يعانون من متلازمة قابلية الورم الجسدي المهيمن الورم العصبي من النوع 1 (NF1)6. عند عبورها إلى الفئران ذات طفرة فارغة Trp53 ، فإن P 0-GGFβ3 الناتجة ؛ Trp53 +/- الفئران تطوير MPNSTs de novo كما هو موضح في cis-Nf1+/-; Trp53+/- الفئران.

تلخص هذه ال MPNSTs التقدم من الصف الثاني لمنظمة الصحة العالمية (WHO) إلى آفات منظمة الصحة العالمية من الدرجة الرابعة التي شوهدت في البشر7. في الفئران P 0-GGFβ3 ، تنشأ MPNSTs داخل الأورام الليفية العصبية الضفيرية الموجودة مسبقا في العصب الثلاثي التوائم (58٪) وجذور العصب الظهري الشوكي (68٪)7 ؛ MPNSTs الناشئة في P 0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران لديها توزيع مماثل للغاية. في البشر ، تنشأ MPNSTs بشكل شائع في العصب الوركي تليها الضفيرة العضدية ، جذور الأعصاب الشوكية ، المبهمة ، الفخذية ، المتوسطة ، الضفيرة العجزية ، الحاجز المأبضي ، والأعصاب الظنبوبية والزندية الخلفية8. يختلف توزيع الورم هذا في نماذج GEM هذه إلى حد ما عما يشاهد في البشر. ومع ذلك ، فإن MPNSTs التي تنشأ في P 0-GGFβ3 و P0-GGFβ3 ؛ الفئران Trp53 +/- متطابقة من الناحية النسيجية مع MPNSTs البشرية ، وتحمل العديد من الطفرات نفسها التي شوهدت في MPNSTs البشرية ، وتلخص عملية تطور الورم العصبي الليفي - MPNST التي شوهدت في مرضى NF1. توليد P 0-GGFβ3 أو P0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران التي كانت Erbb4-/- لم تكن مجدية لأن الفئران التي لديها أليلين فارغين من Erbb4 تموت في الرحم في اليوم الجنيني 10.5 الثانوي لعيوب القلب9. لأن إنقاذ تعبير Erbb4 في القلب عن طريق إدخال جين Erbb4 الترانسجين الخاص بالقلب (سلسلة ثقيلة α-myosin (MHC)-Erbb4) ينتج عنه فئران Erbb4-/- قابلة للحياة10 ، جيل الفئران مع P 0-GGFβ3 معقد ؛ Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- تمت محاولة النمط الوراثي.

ومع ذلك ، فإن التزاوج لم ينتج الفئران بالنسب المندلية المتوقعة ، مما يشير إلى أن النمط الوراثي المطلوب كان ضارا. لذلك ، فإن توليد P 0-GGFβ3 ؛ تمت محاولة Trp53 +/- الفئران ذات الأليلات Erbb411 المفلطحة وبرنامج تشغيل CreERT2 للسماح بحذف Erbb4 في MPNSTs الناشئة في هذه الفئران. في هذه الحيوانات ، كانت العديد من الخلايا السرطانية ذات أليلات Erbb4 السليمة لا تزال موجودة (الفسيفساء). يمكن أن تنتج الفسيفساء التي لوحظت عن تسليم تاموكسيفين غير الفعال ، مما أدى إلى اختلافات في كفاءة إعادة التركيب داخل الأنسجة. يمكن أن تسهم إمكانية وجود آليات تعويضية عفوية في زيادة مساهمة الفسيفساء في إعادة التركيب بوساطة تاموكسيفين عن طريق تجاوز شرط التعبير Erbb4. من الممكن أن يؤدي فقدان Trp53 إلى جعل الخلايا السرطانية عرضة لمزيد من الطفرات "المتساهلة" التلقائية التي يمكن أن تربك تفسير البيانات. نظرا لأنه بدا من المحتمل أن تخفي خلايا MPNST السليمة من Erbb4 عواقب إزالة Erbb4 في الخلايا السرطانية الأخرى ، فقد تم التخلي عن هذا النهج.

أدت هذه العقبات إلى تطوير منهجية لاستئصال Erbb4 في خلايا MPNST في وقت مبكر جدا باستخدام فيروس غدي يعبر عن Cre recombinase و eGFP. يمكن فصل هذه الخلايا عن الخلايا غير المصابة باستخدام FACS، مما يقلل بشكل ملحوظ من الفسيفساء لجين Erbb4 الذي تم إزالته. أدناه ، يتم وصف الطرق المستخدمة لتحقيق ذلك ، جنبا إلى جنب مع الطرق المستخدمة لتقييم آثار الاستئصال الجيني في المختبر وفي الجسم الحي. البروتوكول التالي هو مثال على كيفية إنتاج الفئران الحاملة للورم التي تنتج أورام تحمل أليلات مفلطخة من الجينات القاتلة الجنينية ذات الأهمية لاستئصال خارج الجسم الحي قبل تقييم نمو الورم في الجسم الحي . يتضمن ذلك وصفا للنهج المستخدمة لتحليل التأثير الذي يمارسه استئصال Erbb4 على انتشار الخلايا السرطانية ، والبقاء على قيد الحياة ، والتعبير الجيني في المختبر والانتشار ، والبقاء على قيد الحياة ، وتكوين الأوعية الدموية في اللوغاريتات التقويمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

قبل تنفيذ أي إجراءات مع الفئران ، يجب مراجعة جميع الإجراءات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. تمت الموافقة على البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية التابعة لجامعة ساوث كارولينا الطبية. تم تنفيذ هذا البروتوكول من قبل موظفين مدربين بشكل صحيح وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات في MUSC.

1. جيل من الفئران التي تطور MPNSTs متماثلة الزيجوت لأليلات Erbb4 flox

  1. إنتاج جيل F1 من P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/-; Erbb4fl / + الحيوانات عن طريق التزاوج P 0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران7 مع الفئران Erbb4فلوريدا / فلوريدا 11. استخدم مربع Punnett (الشكل 1) لتوجيه مخطط التربية لضمان توليد ما يكفي من الجراء F1 الذكور والإناث مع P 0-GGFβ3 المطلوب ؛ Trp53+/-; Erbb4fl/+ النمط الوراثي.
  2. النمط الوراثي F1 النسل عن طريق عزل الحمض النووي الجينومي من قصاصة الذيل التي تم جمعها وفقا لإرشادات IACUC ثم إجراء PCR باستخدام الاشعال الموصوفة سابقا للكشف عن P 0-GGFβ3 transgene 12 ، Trp53 النوع البري (+) و null (-) الأليلات7 ، و Erbb4 flox و Erbb4 الأليلات البرية13.
    1. اعزل الحمض النووي للذيل باستخدام طرق مفصلة عن jacks-lab.mit.edu/protocols.
    2. اجعل تفاعل PCR مزيجا مع 25 نانوغرام من الحمض النووي ، و 0.25 نانومتر dNTPs ، و 0.02 U / μL Taq ، و 0.5 ميكرومتر من كل تمهيدي ، و 1x PCR المخزن المؤقت. إجراء تفاعل PCR مع حضانة واحدة 95 درجة مئوية (لإذابة الحمض النووي الجينومي وتنشيط Taq) لمدة 1 دقيقة تليها 35 دورة PCR من 94 درجة مئوية ، 10 ثانية (الذوبان) ؛ 55 درجة مئوية ، 30 ثانية (التلدين) ؛ 72 درجة مئوية ، 40 ثانية (تمديد) متبوعة ب 72 درجة مئوية واحدة (تمديد) لمدة 5 دقائق. قم بتخزين التفاعلات عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتشغيل على هلام الأغاروز بنسبة 1.2-1.5٪.
      ملاحظة: تعتمد درجة حرارة التلدين على نظام التخزين المؤقت PCR المستخدم ؛ يوصى بإجراء تدرج درجة حرارة التلدين لتحديد درجة حرارة التلدين المناسبة.
  3. إنتاج جيل F2 من P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/-; Erbb4fl / fl الحيوانات عن طريق التزاوج مع ذرية F1 المناسبة (P 0-GGFβ3; Trp53-/+ ؛ Erbb4fl/+) مع بعضها البعض.
    ملاحظة: يوضح الشكل 1 تنبؤات Punnet Square المستخدمة لحساب العدد المتوقع من ذرية F2 مع النمط الوراثي المطلوب.
  4. تحديد الحيوانات مع المطلوب P 0-GGFβ3 ؛ Trp53-/+ ؛ النمط الوراثي Erbb4fl/fl كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  5. رفيق F2 ذرية لبعضها البعض للحفاظ على P 0-GGFβ3 ؛ Trp53-/+ ؛ Erbb4fl / fl مستعمرة والنمط الوراثي جميع الجراء. تأكد من أن الأليل المفلطح الذي تم إدخاله حديثا لا يضر بالبقاء على قيد الحياة أو زمن انتقال الورم. تحقيق ذلك من خلال إنشاء أفواج (20 فئران / مجموعة) من P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/- و P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/-; Erbb4fl / fl الفئران ومتابعة بقائها على قيد الحياة وتواتر حدوث الورم.
  6. راقب الحيوانات عدة مرات في الأسبوع حتى يتم الوصول إلى نقطة النهاية التجريبية (الحد الأقصى المسموح به لحجم الورم / نقطة النهاية الإنسانية المعتمدة من قبل IACUC).
    1. أثناء المراقبة الأسبوعية ، قم بتقييم وزن الجسم ، والسلوك الاجتماعي الطبيعي والاستمالة ، وقياسات حجم الورم. الترتيب للتقييم البيطري في حالة فقدان الوزن بنسبة >10٪ من وزن الجسم ، والعزلة الاجتماعية ، والحدس.
    2. عندما يتم التعرف على فأر حامل للورم ووصل إلى نقطة نهايته الإنسانية ، قم بالقتل الرحيم للحيوان بشكل إنساني باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم وإزالة الورم بشكل معقم باستخدام سكين مشرط. قم بإجراء قياسات الورم عن طريق قياس الطول والعرض والعمق باستخدام ورم الفرجار والوزن (الكتلة والحجم). اعمل بسرعة لتجنب التحلل الذاتي.
  7. قسم الورم إلى ثلاثة أقسام باستخدام قطع على غرار رغيف الخبز بسكين مشرط تحت ظروف معقمة لتوليد شرائح الأنسجة لتثبيت الفورمالين / تضمين البارافين (FFPE) ، وتوليد ثقافة المرور المبكر ، والمواد المجمدة (الشكل 2A).
    1. تأكد من أن القسم الأول (لتوليد ثقافة المرور المبكر ، الخطوة 1.7.2) هو حوالي 10٪ من إجمالي حجم الورم ، والقسم 2 (للتثبيت و IHC ، الخطوة 1.7.3) هو 70٪ من إجمالي حجم الورم ، والقسم 3 (لتجميد الفلاش ، الخطوة 1.7.4) هو 20٪ من إجمالي حجم الورم.
    2. خذ القسم 1 من الورم لإعداد ثقافات المرور المبكر (انظر أدناه).
    3. إصلاح القسم 2 من الورم في 4٪ بارافورمالديهايد بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ثم تضمينه في البارافين (الفورمالين الثابت البارافين جزءا لا يتجزأ (FFPE) للعمل التشخيصي.
    4. قسم التجميد السريع 3 للتحليلات التحليلية (على سبيل المثال ، بقع مناعية للتحقق من أن البروتين المشفر بواسطة الجين المرن المستهدف يتم التعبير عنه بشكل مناسب).
  8. بقع 5 ميكرومتر أقسام الأنسجة FFPE سميكة مع الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) لتأكيد تشخيص الورم من قبل أخصائي علم الأمراض المؤهل. إذا كان ذلك مناسبا، قم بإجراء تلطيخ كيميائي نسيجي مناعي (IHC) لتأكيد تشخيص الورم.
    1. Immunostain MPNSTs لبروتين S100 المرتبط بالكالسيوم B (S100β) ، و nestin ، ومنطقة تحديد الجنس Y (SRY) - عامل نسخ Box 10 (Sox10) - ثلاث علامات يتم التعبير عنها في كل من MPNSTs وخلايا Schwann (أصل الخلايا السرطانية) 5،6،14،15. قم بتلطيخ الأورام بالأجسام المضادة التي تتعرف على erbB4 ، وهو البروتين المشفر بواسطة الجين المستهدف للاستئصال في خطوات المصب.
    2. ولتأكيد التشخيص، اطلب من طبيب بيطري أو أخصائي أمراض بشري مؤهل تقييم جميع شرائح الورم الملطخ باتباع معايير التشخيص والدرجات5 و6 و7 و16 التي وضعتها منظمة الصحة العالمية.

2. استئصال خارج الجسم الحي من الأليلات Erbb4 المفلطحة في خلايا MPNST

  1. إنشاء مزارع مرور مبكرة من أنسجة MPNST التي تم جمعها حديثا عن طريق وضع الأنسجة من القسم 1 (الخطوة 1.7.3) في 10 مل من المياه المالحة المعقمة العازلة بالفوسفات (PBS) على الجليد ثم نقلها إلى منطقة عمل معقمة (الشكل 2B)16.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات اللاحقة في غطاء زراعة الأنسجة المعقمة.
  2. افرم أنسجة الورم إلى قطع 2-4 مم و triturate 8-10 مرات في طبق زراعة الأنسجة المعالجة 10 سم2 مع 10 مل من وسط النمو. استزرع هذه المستحضرات في وسط نمو DMEM-10 عالي الجلوكوز (وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية ، و 1٪ جلوتامين ، و 10 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 10 وحدة دولية / مل بنسلين) مع 10 نانومتر نيوريجولين-1β (NRG1β) و 2 ميكرومتر فورسكولين. أضف فورسكولين في هذه المرحلة لمنع نمو أنواع الخلايا الملوثة الشائعة مثل الخلايا الليفية.
  3. الحفاظ على الأنسجة والخلايا المنفصلة ميكانيكيا لمدة تصل إلى 3 أيام عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لإنشاء ثقافة مرور مبكرة. لا تفصل الخلايا المشتتة وشظايا الأنسجة المتبقية في هذه المرحلة.
  4. قم بتحديث الثقافات بوسيط جديد كل 3-4 أيام. اسمح للخلايا السرطانية بالتكاثر حتى تلتقي.
  5. توسيع ثقافات المرور المبكر عن طريق تقسيم الثقافات المتقاربة إلى عدة أطباق. قم بإزالة وسط النمو واغسل الخلايا باستخدام 1x dPBS. ثم ، أضف 1 مل من 0.25٪ من التربسين لمدة 2-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لكل طبق زراعة الخلايا المعالجة 10 سم2 . قم بتعديل المزرعة بلطف لتسهيل الانفصال وإنشاء تعليق أحادي الخلية.
    1. إنهاء التربسين عن طريق إضافة 2 مل من وسط نمو DMEM-10. جمع خليط الخلايا التربسينية ونقله إلى أنبوب طرد مركزي معقم 5 مل. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    2. أعد تعليق بيليه الخلية في 5 مل من DMEM-10. قسم الخلايا إلى اثنين إلى أربعة أطباق زراعة الخلايا 10 سم ، يحتوي كل منها على 10 مل من وسائط النمو (حوالي 1 × 106 خلايا لكل طبق).
  6. بعد 5 مقاطع (خطوات متكررة في 2.5) ، استخدم وسط النمو بدون NRG1β و forskolin. Immunostain عينة من الثقافة مع الجسم المضاد المضاد S100β للتحقق من أن الثقافة تتكون فقط من الخلايا السرطانية. الحفاظ على الخلايا في وسط نمو DMEM-10 في جميع الممرات اللاحقة.
  7. في المقطع التالي ، عد الخلايا وقم بتجميد جزء من P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST الخلايا التي تم جمعها من الثقافات المتقاربة (3 × 106 خلايا / قارورة).
  8. لوحة P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/-; Erbb4fl / fl المرور المبكر خلايا MPNST بكثافة 1.5 × 106 خلايا لكل طبق زراعة الخلايا المعالجة 10 سم في وسط نمو DMEM-10.
  9.  اليوم 0: (حوالي 12-16 ساعة بعد الطلاء) ، اغسل الثقافات الملتصقة ب 2-4 مل من dPBS وأصاب ب Ad5CMV-Cre / eGFP أو Ad5CMV-eGFP عند حوالي 400 وحدة تشكيل لوحة (pfu) / خلية في 10 مل من DMEM الخالي من المصل (أي 30 ميكرولتر من 2 × 10 10 pfu من الفيروس لكل طبق10 سم). قم بإزالة أليلات Erbb4 المفلطحة باستخدام الفيروس الغدي عند الحد الأقصى لتركيز الفيروس المسموح به (تعدد العدوى ، MOI) ، كما هو محدد تجريبيا. ارجع إلى الشكل 2C للحصول على مخطط لسير العمل لهذا الاجتثاث.
  10. اليوم 1: بعد حوالي 16 ساعة ، أنقذ الثقافات بإضافة 10 مل من DMEM-10 إلى كوكتيل العدوى.
  11. اليوم 2 - 3: يقوم FACS بفرز الخلايا المصابة باتباع البروتوكول الموصى به من المنشأة الأساسية لفرز الخلايا الإيجابية eGFP بعد حوالي 48 ساعة من الإصابة. قبل فرز FACS ، تحقق لفترة وجيزة من الخلايا بحثا عن إشارة eGFP على مجهر التألق للتأكد من أن الثقافات قد أصيبت بكفاءة (~ 50-100٪ من الخلايا الإيجابية). إعادة الخلايا المستعادة بعد FACS إلى أطباق زراعة الأنسجة 10 سم ؛ حجز طبق واحد لعزل الحمض النووي الجينومي.
  12. اليوم 4 - 5: بعد فرز FACS ، دع الخلايا تتعافى في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 24-48 ساعة على الأقل ثم قم بإعداد الخلايا للتحليلات القائمة على الخلايا في المختبر أو في تطعيم الجسم الحي . تأكد من حذف Erbb4 عبر PCR باستخدام الحمض النووي الجيني المعزول من جزء من الخلايا الإيجابية eGFP المفروزة. تحقق من أن الخلايا الإيجابية eGFP سلبية ErbB4 عن طريق PCR أو عن طريق تلطيخ عينة من الثقافة بجسم مضاد ل erbB4.
    1. عزل الحمض النووي الجينومي عن الخلايا باستخدام طريقة عزل الحمض النووي القياسية - جوانيدينيوم - فينول والكلوروفورم القائمة على الحمض النووي17.
    2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي للتمييز بين أليلات Erbb4 المفلطحة وأليلات Erbb4 المسحوبة. قم بإجراء 40 دورة باستخدام الحمض النووي 2 نانوغرام ، و 20 ميكرومتر من الاشعال 1 + 2 لإنتاج منتج Erbb4-null بقوة 250 نقطة أساس ومنتج 350 bp floxed13. قم بإجراء كل من PCR والأساليب القائمة على الأجسام المضادة لتأكيد خروج المغلوب عند عدم توفر أجسام مضادة موثوقة.
      ملاحظة: الخلايا جاهزة للفحوصات المستندة إلى الخلايا في المختبر كما هو موضح أدناه. يمكن إجراء العديد من أنواع التحليلات النهائية باستخدام الخلايا المعدة بهذه الطريقة. الغرض من البروتوكولات المعروضة أدناه هو تقديم بعض الأمثلة على التطبيقات المختبرية والحيوية لهذه الخلايا السرطانية بعد استئصال جين Erbb4.

3. اختبارات الانتشار والجدوى في خلايا MPNST مع أليلات Erbb4 المذبوحة

  1. قم بإجراء اختبارات الانتشار على مدى الأيام السبعة التالية على خلايا MPNST المفروزة المطلية في صفيحة متعددة الآبار باستخدام مقياس خلوي آلي قائم على الصور.
    1. اليوم 6: صفيحة 2000 خلية لكل بئر في حجم نهائي من 150 ميكرولتر (~ 13300 خلية / مل) من وسط النمو في صفيحة 96 بئرا. قم بإجراء قياسات ثلاثية لكل مجموعة تجريبية و 4 قراءات يومية لنقطة النهاية (3 نسخ متماثلة × 2 ظروف × 4 أيام).
    2. الأيام 7 و 9 و 11 و 13: الخلايا الملطخة مع صبغات يوديد Hoechst و propidium (PI) وصورتها على قارئ لوحة آلي لحساب عدد الخلايا الحية والميتة في كل بئر. لتحقيق ذلك ، قم في نفس الوقت بتلطيخ الخلايا بصبغة Hoechst لتلطيخ نوى كل من الخلايا الحية والميتة ومع يوديد البروبيديوم (PI) لتسمية الخلايا الميتة. قم بإجراء جميع القراءات في نفس الوقت كل يوم أو كل يومين.
      1. أضف 50 ميكرولتر من محلول تلطيخ PI / Hoechst 4x (4 ميكروغرام / مل لكل منهما) إلى كل كمية جيدة في ذلك اليوم (على سبيل المثال ، اليوم 7 فقط) ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. حافظ على اللوحة محمية من الضوء.
        ملاحظة: يجب تحديد تركيز تلطيخ Hoechst تجريبيا ويمكن أن يتراوح من 1 إلى 10 ميكروغرام / مل اعتمادا على نوع الخلية.
      2. اقرأ الآبار الملطخة بعد الحضانة باستخدام قناة الفلورسنت المناسبة على جهاز تصوير الخلايا الآلي. بعد القراءة ، أعد اللوحة إلى الحاضنة للقراءات المستقبلية في الأيام اللاحقة (أي الأيام 9 و 11 و 13).
      3. تحديد كثافة التلطيخ بناء على نظام التصوير المستخدم وحساب عدد الخلايا الميتة والخلايا الحية والخلايا الكلية باستخدام الإعدادات التالية: القناة الزرقاء (377/50 نانومتر ، Hoechst): إجمالي الخلايا (الحية والميتة) ؛ القناة الحمراء (531/40 نانومتر ، PI): الخلايا الميتة فقط ؛ أزرق - أحمر (إجمالي - ميت) = خلايا حية.
  2. قم بإجراء فحص صلاحية الخلية على مدار ثلاثة أيام ، إذا رغبت في ذلك ، باتباع بروتوكول الشركات المصنعة للفحص.
    ملاحظة: يمكن الجمع بين اختبارات الجدوى واختبارات الانتشار عن طريق إجراء وصمة عار ثلاثية بما في ذلك الكالسين AM (488/32 نانومتر ؛ القناة الخضراء ، وتحديدا تسميات الخلايا الحية) ، PI ، و Hoechst. يمكن أيضا إجراء فحص موت الخلايا المبرمج باستخدام الثقافات التي تم إعدادها كما هو موضح أعلاه ؛ يعتمد البروتوكول المحدد على نظام التصوير.
    1. اليوم 6: لوحة 4000 خلية لكل بئر في حجم نهائي من 150 ميكرولتر في صفيحة 96 بئر في ثلاثة أضعاف.
    2. الأيام 7 - 9: أضف 2000 مرة من كواشف فحص صلاحية الخلايا المضيئة بيولوجيا (جدول المواد) ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة ، واقرأ اللوحة بعد 1 ساعة. قم بإجراء قراءات لاحقة في نفس الوقت كل يوم. بالنسبة لفحوصات التلألؤ الحيوي (MTT) ، قم بإجراء الفحص تماما كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة كل 24 ساعة لمدة 72 ساعة باستخدام قارئ لوحة مقياس اللمعان.

4. تحليل الحمض النووي الريبي وتحديد الجينات التي يتغير تعبيرها بسبب فقدان Erbb4

  1. اليوم 6: عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن خلايا MPNST المفروزة باستخدام الطرق القياسية القائمة على حمض غوانيدينيوم والفينول والكلوروفورم. بالنسبة للتجارب المصممة للكشف عن التغيرات في مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال بين مجموعتين ، قم بإعداد إجمالي الحمض النووي الريبي من ثلاثة تكرارات بيولوجية على الأقل في كل مجموعة.
    1. للقضاء على الأحداث الناجمة عن ناقل الفيروسات الغدية أو تعبير eGFP بدلا من فقدان Erbb4 ، عزل الحمض النووي الريبي عن ثلاثة نسخ بيولوجية من P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/-; خلايا Erbb4 fl / fl MPNST المحولة باستخدام Ad5CMV-Cre / eGFP وثلاثة نسخ بيولوجية محولة مع Ad5CMV-eGFP.
      ملاحظة: يجب أن يكون للحمض النووي الريبي المعزول درجة رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) ≥ 8 لتحليل RNA-Seq. تأكد من أن نواة التسلسل تحدد RIN لجميع العينات قبل إنشاء المكتبات.
  2. استخدم 100-200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من كل عينة لإعداد مكتبات RNA-Seq (العمل مع مرفق التسلسل الأساسي لهذه الخطوة). قم بإجراء تسلسل عالي الإنتاجية باستخدام جهاز تسلسل الحمض النووي من الجيل التالي. لتحديد كمية mRNA، قم بإجراء تسلسل أحادي النهاية لإنشاء ملفات Fastq. ضمان ما لا يقل عن 50 مليون قراءة لكل عينة.
    ملاحظة: ارجع إلى الشكل 3 للحصول على مخطط يوضح سير العمل المستخدم لمعالجة بيانات RNA-Seq ولتحديد حجم التعبير عن النصوص المعبر عنها بشكل مختلف. تخضع بيانات التسلسل ، في شكل ملفات Fastq ، لإجراءات مراقبة الجودة ؛ >80٪ من القراءات يجب أن تسفر عن درجة Phred من 30 ليتم اعتبارها مناسبة للتحليل اللاحق. تتم أيضا معالجة التسلسلات مسبقا (قصها) باستخدام Trimmomatic18 لإزالة تسلسلات المحول وتصفية القراءات منخفضة الجودة.
  3. قم بإجراء محاذاة RNA-Seq وتحليلها على الملفات التي تم إنشاؤها بواسطة fastq باستخدام أي برنامج قادر (على سبيل المثال ، DNAStar19,20 أو Partek 21). اتبع الخطوات الخاصة بالبرنامج باستخدام الإعدادات الافتراضية لمحاذاة ملفات fastq إلى الجينوم المرجعي للماوس (GRCm38/mm10).
    ملاحظة: باستخدام DNAStar كمثال، يتم وصف سير العمل العام أدناه (الشكل التكميلي 1).
    1. حدد طريقة التحليل ، RNA-Seq.
    2. حدد الجينوم المرجعي، الماوس.
    3. قم بتحميل ملف BED إذا تم توفيره بواسطة نواة التسلسل.
    4. قم بتحميل ملفات تسلسل fastq ، وتعيين أسماء نسخ متماثلة فريدة لها.
    5. تجميع ملفات fastq وتعيينها إلى مجموعة نسخ متماثل (أي GFP و CRE)
      ملاحظة: لكل برنامج محاذاة خطواته المحددة، ويجب على المستخدم الرجوع إلى دليل مستخدم البرنامج للبروتوكول الخاص بالبرنامج. سيقوم البرنامج بعد ذلك بإنشاء بيانات العد الخام الخاصة بالجين من ملفات Fastq هذه.
  4. قم بإجراء التحليل الإحصائي والتطبيع (DESeq2 ، EdgeR) على بيانات العد الخام باستخدام أي برامج قادرة ، كما هو موضح في 4.3 ، مع تعيين عينة Ad5CMV-eGFP كمجموعة بيانات التحكم ومجموعة Ad5CMV-Cre كمجموعة بيانات اختبار لتحديد إشارات التعبير الجيني التفاضلي بقوة إحصائية قوية22,23.
    1. حدد ملفات GFP fastq كمجموعة بيانات التحكم.
    2. حدد DESeq2 كطريقة إحصائية وتطبيع .
    3. بدء التجميع والتحليل.
      ملاحظة: لكل برنامج محاذاة خطواته المحددة، ويجب على المستخدم الرجوع إلى دليل مستخدم البرنامج للبروتوكول الخاص بالبرنامج. سيقوم البرنامج بعد ذلك بإنشاء بيانات العد الخام الخاصة بالجين من ملفات Fastq هذه. يعد التحليل الإحصائي والتطبيع خطوة مضمنة في العديد من البرامج ، كما هو موضح في المثال هنا ، ضمن بروتوكول محاذاة التسلسل. إذا تم استخدام برنامج بديل لمحاذاة التسلسل لا يقدم هذه الخطوة المضمنة اللاحقة، فقم بإجراء التحليل الإحصائي والتطبيع على بيانات العد الخام على المستوى الطرفي باستخدام حزم ترميز DESeq2 أو EdgeR المكتوبة بلغة R، وهي متاحة مجانا للتنزيل على Bioconductor.org.
  5. استخدم هذه الأساليب لتحديد التغييرات التي تمثل زيادة أو نقصان بمقدار 1.5 ضعف على الأقل بالنسبة للتحكم (في هذه الحالة ، الخلايا المحولة باستخدام فيروس Ad5CMV-eGFP). استخدم فقط تلك الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) التي تم تحديدها على أنها ذات دلالة إحصائية والتي تظهر تغيرات ≥1.5 ضعف وقيمة p 0.05 أو padj من 0.1 لتحليل التخصيب الوظيفي اللاحق.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى إنشاء قائمة بجينات DEG وقوتها الإحصائية لتحليل التخصيب الوظيفي.
  6. قم بإجراء تحليل إثراء وظيفي على DEG بوساطة Erbb4 ذات دلالة إحصائية تم تحديدها في 4.4 مع ملف قائمة جينات مرتبة باستخدام أي من الأدوات المتاحة مجانا على شبكة الإنترنت. تحديد الأهمية البيولوجية والمسار لفقدان جين Erbb4 من خلال مجموعات بيانات أنطولوجيا الجينات المدمجة في أدوات تحليل الإثراء الوظيفي المفتوحة الوصول24،25،26،27 (انظر جدول المواد للحصول على أمثلة والشكل 3 للحصول على مثال سير العمل باستخدام النمر).
    1. تصدير البيانات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.4 كجدول بيانات.
    2. رتب البيانات حسب تغيير أضعاف log2 أو قيمة p/padj أو كليهما.
    3. تأكد من إزالة جميع البيانات غير ذات الأهمية الإحصائية.
    4. تصدير قائمة الجينات المرتبة مع معرف الجين فقط كملف .txt وتحميلها إلى موقع الويب.
      ملاحظة: استخدم فقط DEG ذات دلالة إحصائية (قيم p/padj < 0.05 أو 0.1 على التوالي) لإنشاء قائمة جينات إدخال مرتبة باستخدام تغييرات أضعاف log2 (الأعلى إلى الأدنى) أو قيم p/padj (الأدنى إلى الأعلى) أو كليهما [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. هناك العديد من الطرق لإنشاء قائمة جينات مرتبة ويتم تحديدها تجريبيا لمجموعة البيانات والسؤال المطروح. يمكن أن يساعد النوع المحدد من أداة تحليل التخصيب الوظيفي المستخدمة أيضا في تحديد النوع المناسب من قائمة الجينات الرتبة. للحصول على موارد إضافية حول RNA-Seq ، انظر الأوراق التالية28،29،30.

5. التجميع التقويمي لخلايا MPNST مع أليلات Erbb4 الممزقة وتحليل آثار استئصال Erbb4

  1. قبل إجراء التجميع التقويمي لخلايا MPNST المفروزة ، تأكد من مراجعة جميع الإجراءات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات ، وأن جميع الإجراءات يتم تنفيذها من قبل موظفين مدربين تدريبا مناسبا.
  2. في يوم الحقن ، قم بإزالة الخلايا منخفضة المرور (حوالي 85٪ من التقاء) من ألواح أو قوارير زراعة الخلايا باستخدام محلول تفكك الخلايا غير الأنزيمي (على سبيل المثال ، خليط من المخلبات ؛ انظر جدول المواد) وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. بالنسبة للحقن التقويمي في العصب الوركي ، أعد تكوين الخلايا عند 16,667 خلية / مل (50,000 خلية لكل 3 ميكرولتر لكل) في DMEM-1031. حافظ على الخلايا على الجليد.
    ملاحظة: لن تنجح بعض الثقافات في إنشاء الطعوم ما لم يتم حقن الخلايا في مصفوفة الغشاء السفلي لعامل النمو المنخفض. يجب تحديد متطلبات مصفوفة الغشاء السفلي (10-50٪) تجريبيا.
  3. تقييم إمكانات نمو الألوغراف في الجسم الحي في الخلايا ما بعد الإصابة عن طريق حقن خلايا MPNST في العصب الوركي ل 8-10 Hsd مخدر: الفئران Athymic Nude-Foxn1nu لكل مجموعة (تتراوح أعمارهم بين 4-8 أسابيع). للحقن التقويمي للخلايا السرطانية ، راجع Turk et al31. هنا ، يتم توضيح الحقن تحت الجلد.
    ملاحظة: لتحديد عدد التجارب اللازمة للدلالة الإحصائية، استشر أخصائي الإحصاء الحيوي أو يوصى باستخدام G*Power3، وهو برنامجمتاح مجانا 32.
  4. راقب الحيوانات عن كثب مرتين يوميا في الأسبوع الأول بعد الحقن بحثا عن أي علامات للألم. بعد ذلك ، راقب الفئران المطعمة ثلاث مرات في الأسبوع لقياسات الفرجار وتقييم درجات حالة الجسم (BCSs) كما هو موضح سابقا 5,31. كما هو موضح في المبادئ التوجيهية IACUC ، القتل الرحيم للحيوانات مع BCS من 2 أو أقل.
  5. مع نمو الخلايا المطعمة بمعدلات مختلفة ، حدد أوقات الكسب غير المشروع تجريبيا باستخدام خلايا التحكم (غير المعدلة) قبل إجراء التجارب الموضحة في هذا القسم. لجمع الطعوم عند نقطة النهاية التجريبية ، قم بالقتل الرحيم للفئران بشكل إنساني باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم كإجراء ثانوي. سجل قياسات الحجم والكتلة النهائية لكل طعم.
    ملاحظة: كما P 0-GGFβ3 غير المعدلة؛ Trp53+/-; عادة ما تصل خلايا Erbb4 fl / fl MPNST إلى الحد الأقصى للحجم المسموح به من قبل IACUC في غضون 30-45 يوما ، والجدول الزمني النموذجي حوالي 30-45 يوما بعد الحقن.
  6. عزل الأنسجة وتقسيمها كما هو موضح في الخطوات 1.6-1.8. إصلاح جزء من أنسجة الكسب غير المشروع بين عشية وضحاها في 4 ٪ paraformaldehyde (الشكل 2) ثم تضمينه في البارافين. قم بإعداد أقسام 5 ميكرومتر من أنسجة FFPE وقم بتركيبها على الشرائح. قم بإجراء تلطيخ H&E وغيره من التلطيخ المناعي الضروري للتأكد من أن أنسجة الكسب غير المشروع تتكون من خلايا سرطانية كما هو موضح في 1.8.1. قم بتجميد بقية أنسجة الورم لإجراء تحليلات في اتجاه مجرى النهر ، مثل التحقق من صحة فقدان تعبير Erbb4 وتقييم آثار فقدان Erbb4 على تعبير أفراد عائلة Erbb الآخرين.
    ملاحظة: يجب أن يتم تأكيد الخلايا السرطانية في أنسجة الكسب غير المشروع لأن الفئران التي تعاني من نقص المناعة عرضة للإصابة بالأورام. في حالة الطعوم الصغيرة ، من المهم التأكد من عدم الخلط بين النسيج الندبي أو الالتهاب والأورام.
    1. قم بإجراء تلطيخ IHC القياسي على أنسجة FFPE لمقارنة التعبير عن البروتينات ذات الأهمية في الطوافات المزروعة من الخلايا المعالجة Ad5CMV-eGFP و Ad5CMV-Cre / eGFP. قم بتلطيخ أنسجة الكسب غير المشروع المستأصل باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب erbB4 لتأكيد الاختلافات في تعبير erbB4 في الجسم الحي بين الحالتين التجريبيتين. حدد مؤشر التكاثر عبر تلطيخ Ki67 ومستوى موت الخلايا المبرمج عن طريق تلطيخ العلامات الطرفية بوساطة deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end (TUNEL).
      ملاحظة: يمكن أيضا تقييم أي بروتين مستهدف ذي أهمية عبر المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. على سبيل المثال، قم بتقييم كثافة الأوعية الدموية عن طريق تلطيخ اللوغرافيات المناعية باستخدام جسم مضاد مضاد ل CD31 (تخفيف بنسبة 1:50) لتحديد الاختلافات في البيئة الدقيقة للأوعية الدموية في الجسم الحي بوساطة الاستئصال الجيني. يمكن حساب عدد ملفات تعريف الأوعية الدموية لكل حقل 40x للقياس الكمي. بالنسبة لهذه الفحوصات المستندة إلى المدينة العالمية للخدمات الإنسانية، اتبع بروتوكولات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية القياسية لإجراءات التلطيخ وبروتوكول الشركة المصنعة لتلطيخ TUNEL. لتحديد كمية الصور، استخدم المكون الإضافي ImageJ "العد التلقائي للصورة أحادية اللون".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 4 نتيجة نموذجية تم الحصول عليها عند تحويل P 0-GGFβ3 ؛ Trp53-/+ ؛ خلايا Erbb4 fl / fl MPNST إما مع الفيروس الغدي Ad5CMV-eGFP أو الفيروس الغدي Ad5CMV-Cre / eGFP (الشكل 4A). يتم النظر إلى الثقافات باستخدام المجهر الفلوري لتحديد الخلايا المعبرة عن eGFP وبواسطة المجهر المتباين الطوري لتحديد العدد الإجمالي للخلايا الموجودة في نفس المجال عند 10x (أعلى) و 40x (أسفل). يمكن بعد ذلك حساب النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن eGFP إذا رغبت في ذلك. وترد بيانات مخرجات نظام مراقبة الأصول الميدانية التمثيلية في الشكل التكميلي S2. بعد FACS، سيتم زيادة النسبة المئوية للخلايا المعبرة عن eGFP بشكل ملحوظ، مع جميع الخلايا تقريبا في كل حقل تعبر عن eGFP. نتائج التنميط الجيني النموذجي ل PCR المتوقعة بعد الاستئصال الجيني بوساطة Cre ، اعتمادا على كفاءة النقل ، هي الضربة القاضية الكاملة للجين (كفاءة 100٪) أو مجموعة غير متجانسة من الخلايا المستحثة وغير المستحثة (كفاءة <100٪) مقارنة بنتائج نقل التحكم (GFP فقط ، fl / fl) (الشكل 4B). يوضح الشكل 4C علم الأنسجة المرضي المميز الموجود في اللوغاريتات العظمية ل P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNSTs مقارنة بالأورام المشتقة من النماذج الحيوانية الأصلية GEM.

في هذه التجارب ، أدى استئصال Erbb4 إلى انخفاض في الانتشار الخلوي والكثافة الخلوية في المختبر وفي الجسم الحي ، وزيادة في مؤشرات وضع العلامات TUNEL في الجسم الحي ، وانخفاض كثافة الأوعية الدموية في الجسم الحي. ويوضح الشكل 5 النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام مقياس خلوي آلي قائم على الصور يظهر انخفاض الانتشار الخلوي في الخلايا المحولة Ad5CMV-Cre مقابل الخلايا المحولة Ad5CMV-GFP (الشكل 5A)؛ تم إجراء هذه التجارب مع الخلايا المستزرعة في وقت مبكر. التعبير عن ErbB4 عبر الكيمياء النسيجية المناعية في P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/-; تم تقليل خلايا Erbb4fl / fl MPNST المحولة بفيروس Ad5CMV-Cre أو eGFP في الألوغرافات المحولة Ad5CMV-Cre الناتجة مقارنة بالتحكم في أورام اللوغراف المعالجة Ad5CMV-eGFP (الشكل 5B). تم تقييم كثافة الأوعية الدموية عن طريق الكشف عن التفاعل المناعي ل CD31. يمكن رؤية أن كثافة الأوعية الدموية تنخفض بشكل ملحوظ في مجموعات اللوغاريت من الخلايا المحولة Ad5CMV-Cre (الشكل 5C). يمكن تحديد شدة الإشارة كميا ، إذا رغبت في ذلك ، باستخدام ImageJ.

Figure 1
الشكل 1: حسابات Punnet المربعة لنسب الأنماط الجينية المتوقعة عند توليد وعبور P 0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران مع الفئران Erbb4 fl / fl (F1). حسابات Punnet المربعة لنسب الأنماط الجينية المتوقعة عند توليد والحفاظ على P 0-GGFβ3 ؛ Trp53-/+ ؛ Erbb4fl / + مع بعضها البعض (F2). اختصار: fl = Floxed. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: سير العمل في العمليةالمستخدمة لاستئصال أليلات Erbb4 المفلطحة في مزارع المرور المبكرة لخلايا MPNST المشتقة من P 0-GGFβ3 ؛ Trp53-/+ ؛ Erbb4 فلوريدا / فلوريدا الفئران. (أ) حصاد الورم الذي يعبر عن الجين المفلطح. (ب) إنشاء ثقافات مرور مبكرة من الورم الذي تم استئصاله. (ج) إصابة ثقافات المرور المبكر للقضاء على الجين المفلطح وإجراء فحوصات في اتجاه المصب. الاختصارات: MPNST = ورم غمد العصب المحيطي الخبيث. IHC = الكيمياء النسيجية المناعية; PFA = بارافورمالديهايد; FFPE = الفورمالين الثابت البارافين المدمجة. H & E = الهيماتوكسيلين والإيوزين; FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلور ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; K / O = الضربة القاضية. PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخطط يوضح سير عمل RNA-Seq. يستخدم سير العمل لتحديد النصوص المعبر عنها بشكل تفاضلي بين خلايا التحكم (GFP-induced) و Erbb4-null (المستحثة ب Cre) والأهمية البيولوجية الناتجة. الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. RNA-Seq = تسلسل الحمض النووي الريبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نتائج كفاءة النقل التمثيلية التي تم تقييمها بواسطة الفحص المجهري في P 0-GGFβ3؛ Trp53-/+ ؛ Erbb4fl / fl MPNST الخلايا. (أ) الخلايا المنقولة إما بالفيروس الغدي Ad5CMV-eGFP أو الفيروس الغدي Ad5CMV-Cre/eGFP. (ب) نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل لمجموعات الجينات المحتملة بعد عدوى Ad5CMV. (ج) علم الأمراض النسيجي المميز الذي يقارن الأورام المتولدة في نماذج GEM الناشئة ب P 0-GGFβ3 المسجل تقويميا ؛ Trp53-/+ ؛ Erbb4fl / fl MPNST الخلايا عن طريق تلطيخ H & E. تم التقاط الصور بمعدل 40 ضعفا. تم استخدام الأجسام المضادة للتحكم السلبي المتطابقة مع النمط المتماثل للتحكم في التلطيخ. أشرطة المقياس = 400 ميكرومتر (A ، اللوحة العلوية) ؛ 100 ميكرومتر (A ، اللوحة السفلية) ، 20 ميكرومتر (C). الاختصارات: MPNST = ورم غمد العصب المحيطي الخبيث. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; BF = برايتفيلد; FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلور ؛ Neg Ctrl = التحكم السلبي ؛ PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل. GEM = فأر معدل وراثيا ؛ fl = متخبط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها في مزارع المرور المبكر MPNST المستزرعة وخلايا MPNST المزروعة بشكل تقويمي بعد النقل إما باستخدام Ad5CMV-eGFP أو Ad5CMV-Cre / eGFP. (أ) فحص انتشار خلايا MPNST المستزرعة التي تظهر انخفاض الكثافة الخلوية في الخلايا المنقولة باستخدام Ad5CMV-Cre / eGFP مقارنة بتلك المحولة باستخدام Ad5CMV-eGFP. يتم رسم البيانات الكمية في الأيام 1 و 3 و 5 (يسار). يتم عرض صور التقاء في اليوم 1 واليوم 5 التي تم التقاطها على مقياس الخلايا التلقائي المستند إلى الصور على اليمين (الصور التي تم التقاطها بتكبير 4x باستخدام الفحص المجهري الساطع). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) لما لا يقل عن 3 تجارب مستقلة مختلفة. (ب) تلطيخ ErbB4 التمثيلي في أورام اللوغراف المحولة باستخدام الفيروس الغدي Ad5CMV-eGFP أو Ad5CMV-Cre/eGFP المأخوذ بتكبير 20x. القناة الحمراء (Alexa 564 ، CD31) ، القناة الزرقاء (Hoechst ، النوى). (ج) صور تمثيلية لكثافة الأوعية الدموية في اللوغاريت P 0-GGFβ3؛ Trp53+/-; خلايا Erbb4 fl / fl MPNST المحولة باستخدام Ad5CMV-eGFP مقابل فيروس Ad5CMV-Cre / eGFP. تم التقاط الصور بمعدل 40 ضعفا. تم استخدام الأجسام المضادة للتحكم السلبي المتطابقة مع النمط المتماثل للتحكم في التلطيخ. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: MPNST = ورم غمد العصب المحيطي الخبيث. eGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. IgG = الغلوبولين المناعي G; NEG = التحكم السلبي ؛ CD = مجموعة من التمايز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: مخطط يوضح محاذاة التسلسل وسير عمل التحليل. سير العمل المستخدم في DNAStar لمحاذاة وتحليل ملفات تسلسل الحمض النووي الريبي (ملفات fastq). الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. RNA-Seq = تسلسل الحمض النووي الريبي., DEG = الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: بيانات FACS التمثيلية من ثقافات المرور المبكر باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر. (أ) يتم فرز الخلايا المعبرة عن GFP بواسطة FACS بعد تعيين معلمات بوابة الفلورسنت من الخلايا غير المصابة. (ب) بعد تعيين بوابة الكشف المناسبة، يتم فصل الخلايا الموجبة GFP (المحولة) عن الخلايا GFP السالبة (غير المحولة). الاختصارات: SSC-A = منطقة التشتت الجانبية للذروة. FSC-H = ارتفاع التشتت الأمامي للذروة ؛ FSC-W = عرض التشتت الأمامي للذروة ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلور. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تطوير الطرق التفصيلية المعروضة هنا باستخدام نموذج GEM من MPNSTs. ومع ذلك ، إذا كان من الممكن تشتيت أنسجة الورم ذات الأهمية إلى خلايا فردية ، فإن هذه المنهجيات قابلة للتكيف بسهولة مع أنواع الأورام المختلفة الناشئة في GEMs. من المهم التأكد من أن الأليل المفلطح لا يؤدي إلى i) انخفاض البقاء على قيد الحياة الذي يمكن أن يجعل من الصعب الحصول على ما يكفي من الفئران للكشف عن الأورام ، أو ii) زيادة زمن انتقال الورم الذي يمكن أن يجعل من الصعب الحصول على ما يكفي من الفئران الحاملة للورم. إذا لم يؤثر الأليل المفلطح على البقاء على قيد الحياة ، فسيكون بقاء كلا الفئتين متساويا. إذا لم يكن له أي تأثير على زمن انتقال الورم ، فيجب أن تنشأ أعداد مكافئة من الفئران الحاملة للورم في كلا المجموعتين مع مسار زمني مماثل.

وقد استخدمت أساليب مماثلة لدراسة الأورام الليفية العصبية و MPNSTs باستخدام الضربات القاضية المشروطة Cre المستحثة بالتاموكسيفين لتوليد الضربة القاضية المشروطة القابلة للحث33,34. الفرق بين هذه الدراسات وهذه الدراسة ، بصرف النظر عن استخدام تاموكسيفين لتحريض كري كما نوقش سابقا ، هو أن هذه الدراسات تركز على تطور الورم مع ضربة قاضية خاصة بالأنسجة من NF1. نظرا لأن هذه الدراسة وهذه الدراسات الأخرى تستخدم أيضا الأورام التي تم إنشاؤها بواسطة GEMM ، فإن الفرق يكمن في السؤال المطروح. في هذا البروتوكول ، نحن لا ندرس الدور الذي يلعبه فقدان NF1 في إمراض MPNST ، ولكننا بدلا من ذلك ندرس الدور الذي يمارسه جين معين (Erbb4) في MPNSTs الناتجة عن GEMM في نمو الورم الحي ، والذي سيكون مستحيلا بسبب كونه قاتلا جنينيا. علاوة على ذلك ، يتجنب هذا البروتوكول استخدام تاموكسيفين لتلك النهج التي تتطلب مثل هذه المعلمات.

وقد درس آخرون خطوط خلايا MPNST البشرية الراسخة في نماذج xenograft35. تختلف هذه الدراسة عن هذه الدراسة في أن الخلايا المطعمة المستخدمة هي خطوط خلايا MPNST بشرية مدروسة جيدا ولكنها عالية المرور ، وتركز على إنشاء استجابات دوائية في xenografts. هؤلاء الباحثون لا يدرسون دور جين معين في خلايا MPNST هذه للنمو في الجسم الحي وآثار فقدان الجينات على الاستجابة للدواء. تم إجراء دراسة أخرى مماثلة لهذه الدراسة من قبل دود وآخرون ، باستخدام الفيروس الغدي Cre recombinase (Ad-Cre) بوساطة NF1 الخسارة بطريقة تعتمد الزمانية والمكانية ، مرة أخرى طريقة قوية لتوسيع الجهود الانتقالية MPNST36. ركزت الدراسة على دور فقدان NF1 و Ink4a / Arf ، وهما جينان شائعان جدا في MPNSTs البشرية ، في العصب الوركي عن طريق حقن Ad-Cre. P 0-GGFβ3; Trp53+/-; يمكن استخدام الفئران Erbb4fl / fl الموصوفة في هذه الدراسة بهذه الطريقة عن طريق حقن Ad-Cre في سلالات سلائف خلايا Schwann. ومع ذلك ، فإن الأسئلة المطروحة في هذه الدراسة لا تركز على الدور التطوري ل Erbb4 في بدء MPNST ولكن على كيفية اختطاف MPNSTs لإشارات Erbb4 للحصول على ميزة نمو الورم.

هناك بدائل للنهج الموصوف هنا، بما في ذلك هدم التعبير الجيني عن طريق تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) أو تعطيل الجين محل الاهتمام باستخدام كريسبر في خطوط الخلايا السرطانية البشرية. هذه الأساليب البديلة قيمة ويمكن أن تكون شريكة مع الاستئصال الجيني في الخلايا المشتقة من أورام GEM للتحقق من أن الآثار التي لوحظت في خلايا ورم الفئران يتم تلخيصها في نظيراتها البشرية. ومع ذلك ، هناك بعض المزايا الواضحة للمنهجية الموضحة هنا. أولا ، إن إزالة الجينات المفلطحة وراثيا في الخلايا السرطانية GEM سريعة وتنتج تعطيلا كاملا للجين المستهدف. في المقابل، غالبا ما يلاحظ أن استخدام الحمض النووي الريبي قصير الشعر يؤدي فقط إلى ضربة قاضية جزئية للتعبير الجيني. على الرغم من أن كريسبر يمكن أن تنتج تعطيلا كاملا للجينات، إلا أن تحديد الحيوانات المستنسخة التي لديها تعطيل كامل يتطلب عملية اختيار طويلة.

علاوة على ذلك، يجب فحص العديد من المستنسخات للتأكد من أن التأثيرات الناتجة عن استئصال كريسبر لا تختلف بين المستنسخات المختلفة. ثانيا ، تعد القدرة على إزالة الأليلات المفلطحة في مزارع أورام GEM المبكرة مفيدة لأن هذا يقلل من إمكانية اختيار مجموعات فرعية متميزة من الخلايا السرطانية التي تنمو بفعالية في الثقافة. وبالمقارنة، غالبا ما تستمد خطوط الخلايا البشرية، التي عادة ما يتم الحفاظ عليها في الثقافة لسنوات، من مجموعات فرعية متميزة يتم تكييفها بشكل جيد للزراعة وكثيرا ما تخضع للانحراف الجيني خلال هذه العملية. وهذا يؤدي إلى تطوير خطوط الخلايا هذه طفرات جديدة لم تكن موجودة في الورم الأم. وأخيرا، على الرغم من أن تطعيم الخلايا السرطانية GEM في الفئران التي تعاني من نقص المناعة موصوف في هذه المخطوطة، إلا أنه يلاحظ أن الخلايا السرطانية GEM المشتقة من الأورام الناشئة في سلالات الفئران المولودة يمكن أن توضع في الفئران من نفس السلالة. وهذا من شأنه أن يسمح للباحث بتقييم بيولوجيا الورم في الحيوانات ذات الجهاز المناعي السليم في وجود أو عدم وجود الجين المستهدف.

الخطوة الحاسمة في البروتوكول الموصوف هنا هي استئصال الجين المفلطح باستخدام Ad5CMV-Cre / eGFP وضمان بقاء الخلايا السرطانية بعد استئصال الجينات و FACS. نظرا لأن هذه عملية تعتمد على قدرة Cre recombinase على استئصال الجين المفلطح ، فمن المحتمل أن تخضع لبعض المشاكل نفسها التي يمكن مواجهتها عند إزالة جين مفلطح في الجسم الحي ؛ ستظهر هذه القضايا على أنها استئصال غير كامل للأليل المستهدف. لاحظ أن القدرة على تنقية الخلايا التي تم نقلها بنجاح باستخدام ناقل الفيروسات الغدية المعبر عن eGFP يبدو أنها تقلل من الفسيفساء مقارنة بالاستئصال الجيني في الجسم الحي باستخدام CreERT2. ومع ذلك ، في حالة الجينات المستهدفة التي تشفر البروتينات ، مثل ErbB4 التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية ، قد يكون من الممكن ضمان فقدان الجين المستهدف عن طريق إجراء FACS باستخدام كل من eGFP والجسم المضاد الذي يتعرف على البروتين محل الاهتمام (أي فرز الخلايا الإيجابية / erbB4 السالبة eGFP).

نظرا لأن العديد من البروتينات المستهدفة علاجيا بواسطة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، كما لوحظ في المقدمة ، هي بروتينات سطح الخلية ، يجب أن يكون هذا النهج ممكنا في كثير من الأحيان. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه من المهم السماح للخلايا السرطانية بالتعافي لمدة 2-3 أيام على الأقل بعد FACS إذا كان سيتم إجراء RNA-Seq عليها لتقييم تأثير الاستئصال الجيني على النسخ. غالبا ما تظهر مجموعات بيانات RNA-Seq التي تم الحصول عليها بعد فترة وجيزة جدا من FACS مزيدا من التباين في التعبير الجيني بين النسخ المتماثلة البيولوجية في بعض أنواع الخلايا. قد يكون هذا نتيجة للصدمة التي تعاني منها الخلايا عند المرور عبر FACS. وبالتالي ، يجب السماح للخلايا بفترة نقاهة بعد هذه العملية. يمكن تحليل مجموعات بيانات RNA-Seq باستخدام DESeq2 ، والذي يستخدم التوزيع السلبي ذي الحدين ومقدر الانكماش لتباين التوزيع. في هذه التحليلات، يتم فرز العينات وفقا لقيمتها Q، وهي أصغر معدل اكتشاف خاطئ (FDR) تكون فيه التغيرات في مستويات النسخ كبيرة؛ يتم حساب FDRs باستخدام إجراء تعديل الاختبار المتعدد Benjamini-Hochberg. بدلا من ذلك ، يمكن تحديد DEGs باستخدام برامج أخرى متاحة قادرة على سير عمل تحليل RNA-Seq.

بالنسبة لهذا النموذج الحيواني MPNST ، يتطلب تحديد نقطة النهاية التجريبية فهما للتاريخ الطبيعي للأورام في النموذج الحيواني المستخدم. تم تحديد التاريخ الطبيعي ل MPNSTs في هذا GEM من خلال اتباع بقاء سلسلة من 44 P 0-GGFβ3 الفئران6 و 19 P0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران7 ثم إجراء عمليات نفوق كاملة على كل هذه الحيوانات عندما وصلت إلى نقطة نهاية بقائها على قيد الحياة. تم تحديد أوقات البقاء النموذجية والموقع الذي نشأت فيه MPNSTs عادة في كل نموذج حيواني. في معظم هذه الفئران ، نشأت MPNSTs في العصب الثلاثي التوائم. عادة ما تنتج MPNSTs الناشئة في العصب الثلاثي التوائم تدلي الجفون المرتبط بغيوم القرنية (نتيجة لمشاكل في توزيع الدموع الناتجة عن تدلي الجفون) ، والتي قدمت علامة مفيدة سريريا لتحديد الفئران الحاملة للورم. يجب تأكيد تشخيص الورم عن طريق إجراء بقع H & E والعديد من البقع التشخيصية الإضافية (S100β ، nestin Sox 10 ، H & E ، Mart1) تليها فحص من قبل طبيب بيطري أو بشري مؤهل. هذا مهم أيضا لأن أليل Trp53 null في هذا النموذج يهيئ الفئران لتطوير أورام أخرى مثل الأورام اللمفاوية ، ويجب تمييز هذه الأورام عن MPNSTs.

وأخيرا، فإن لهذه المنهجية العديد من التطبيقات المحتملة التي لم يتم استكشافها بعد، ولكنها قد تكون مجدية في التحقيقات المستقبلية. على سبيل المثال ، نيوريجولين 1 (NRG1) ، الليغاند الذي ينشط كل من erbB3 و erbB4 ، يعزز هجرة خلايا MPNST بطريقة كيميائية ؛ يقع كل من erbB3 و erbB4 في invadopodia من خلايا MPNST37. ومع ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كان erbB3 أو erbB4 يتوسط الاستجابة الكيميائية ل NRG1. وبالتالي ، يمكن استخدام الخلايا التي يتم فيها حذف erbB4 بهذه المنهجية لمعالجة هذا السؤال. تتمثل المتابعة الطبيعية لهذه التجارب في تقييم ما إذا كان erbB4 مطلوبا للنقائل باستخدام النهج الشائع الاستخدام الذي يتم فيه حقن الخلايا السرطانية عبر الوريد الذيل وعدد النقائل الرئوية ثم تقييمها. توفر هذه المنهجية ميزة واضحة على الأساليب الأخرى ، مثل استخدام shRNAs لهدم تعبير erbB4 لأن تعبير shRNA غالبا ما يتم إسكاته في الخلايا بعد فترة. علاوة على ذلك ، من المتوقع أن تحتوي مزارع المرور المبكر على مزيج من المجموعات الفرعية المشتقة من الورم ، بما في ذلك المجموعات الفرعية من الخلايا المعرضة للنقائل. سيسمح إجراء اختبارات الانبثاث مع الخلايا المعدة باستخدام المنهجية الموضحة هنا بإجراء تقييم للإمكانات النقيلية التي تمثل الورم الأم أكثر تمثيلا للورم الأم من خط الخلية الثابت. هذا ، بالطبع ، مجرد مثال واحد على التطبيقات المستقبلية التي يمكن أن تستخدم هذه المنهجية. نأمل أن يجمع الباحثون الآخرون بين هذه المنهجية والمشاكل ذات الأهمية الخاصة لتعزيز القدرة على تحديد البروتينات التي تعد أهدافا علاجية رئيسية في السرطانات البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 ، R01 NS109655) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804) ، ووزارة الدفاع (X81XWH-09-1-0086 ، W81XWH-11-1-0498 ، W81XWH-12-1-0164 ، W81XWH-14-1-0073 ، و W81XWH-15-1-0193) ، ومؤسسة أورام الأطفال (2014-04-001 و 2015-05-007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ad5CMV-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody Thermo/Fisher GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics Bioconductor http://www.bioconductor.org alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31 Abcam ab28364
Celigo Image Cytometer Nexcelom Bioscience N/A
Cell Stripper Corning 25-056-Cl mixture of chelators
DAB staining kit Vector Labs MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) DAVID https://david.ncifcrf.gov functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM Corning 15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) Thermo/Fisher EP0701 and K1072
erbB4 antibodies Santa Cruz sc-284
erbB4 antibodies Abcam ab35374
erbB4 antibodies Millipore HFR1: 05-1133
FACS Sorter BD Biosciences Aria II
Forskolin Sigma F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources GenomeSpace https://genomespace.org/support/tools/ general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine Corning 25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool Gorilla N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis Broad Institute N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice Envigo (Previously Harlan Labs) 69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) Illumina Hi Seq 2500 DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis DNAStar LaserGene software N/A software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly software alignment used for step 4.3 N/A software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix Corning 354230
NRG1-beta In house Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342 Thermo 62249
Panther Gene Ontology Classification System Panther http://pantherdb.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer) Partek, Ver 7 N/A software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep Corning 30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

 Eurofins Genomics Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine Fisher 51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays R&D Systems ARY003B
Real time glo Promega G9712 bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite ToppGene https://toppgene.cchmc.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) Invitrogen 15596026
Tyramide Signal Amplification Kit Perkin Elmer NEL721001EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
  2. Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
  3. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
  4. Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
  5. Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
  6. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  7. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
  8. Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
  9. Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
  10. Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
  11. Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
  12. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  13. Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
  14. Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
  15. Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
  16. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  17. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  18. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  19. Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
  20. Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
  21. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  23. Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
  24. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  25. Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
  26. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  27. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  28. Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
  29. Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
  30. Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
  31. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
  32. Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
  33. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  34. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
  35. Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
  36. Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
  37. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 174 ، الفئران المعدلة وراثيا ، الساركوما ، الفيروس الغدي المعبر عن Cre ، قياس التدفق الخلوي ، اختبارات البقاء على قيد الحياة ، اختبارات الانتشار ، xenografting ، RNA-Seq ، الضربة القاضية القاتلة الجنينية
تحديد وظائف الجينات في تكوين الأورام عن طريق الاستئصال <em>خارج الجسم الحي</em> للأليلات المفلطحة في الخلايا السرطانية الخبيثة للغمد العصبي المحيطي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Longo, J. F., Brosius, S. N.,… More

Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells. J. Vis. Exp. (174), e62740, doi:10.3791/62740 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter