Summary
Her presenterer vi en protokoll for å utføre gen knockouts som er embryonale dødelige in vivo i genetisk utviklede musemodellavledede svulster og deretter vurdere effekten som knockout har på tumorvekst, spredning, overlevelse, migrasjon, invasjon og transkriptomet in vitro og in vivo.
Abstract
Utviklingen av nye legemidler som nettopp retter seg mot nøkkelproteiner i humane kreftformer, endrer kreftbehandlingen fundamentalt. Men før disse stoffene kan brukes, må deres målproteiner valideres som terapeutiske mål i bestemte krefttyper. Denne valideringen utføres ofte ved å slå ut genet som koder for kandidatens terapeutiske mål i en genetisk konstruert musemodell (GEM) av kreft og bestemme hvilken effekt dette har på tumorvekst. Dessverre begrenser tekniske problemer som embryonal dødelighet i konvensjonelle knockouts og mosaikk i betingede knockouts ofte denne tilnærmingen. For å overvinne disse begrensningene ble det utviklet en tilnærming til å ablisere et floxed embryonalt dødelig gen av interesse for kortsiktige kulturer av ondartede perifere nerveskjedetumorer (MPNST) generert i en GEM-modell.
Dette papiret beskriver hvordan man etablerer en musemodell med riktig genotype, utleder kortsiktige tumorkulturer fra disse dyrene, og deretter ablate det floxed embryonale dødelige genet ved hjelp av en adenoviral vektor som uttrykker Cre recombinase og forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP). Rensing av celler transducert med adenovirus ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og kvantifisering av effektene som genablasjon utøver på cellulær proliferasjon, levedyktighet, transkriptom og ortotopisk allograftvekst blir deretter detaljert. Disse metodene gir en effektiv og generaliserbar tilnærming til å identifisere og validere terapeutiske mål in vitro og in vivo. Disse tilnærmingene gir også en fornybar kilde til lavpassasje tumoravledede celler med reduserte in vitro vekstartefakter. Dette gjør at den biologiske rollen til det målrettede genet kan studeres i ulike biologiske prosesser som migrasjon, invasjon, metastase og intercellulær kommunikasjon formidlet av sekretomet.
Introduction
Før de siste to tiårene var behandlingen av humane kreftformer avhengig av strålebehandling og kjemoterapeutiske midler som i stor grad målrettet raskt prolifererende cellulære populasjoner ved å skade DNA eller hemme DNA-syntese. Selv om disse tilnærmingene hemmet kreftcellevekst, hadde de også skadelige bivirkninger på normale raskt prolifererende celletyper som tarmepitelceller og hårsekkceller. Mer nylig har kreftbehandling begynt å bruke kjemoterapeutiske midler som nettopp retter seg mot proteiner i signalveier som er kritisk viktige for veksten av en enkelt pasients neoplasma. Denne tilnærmingen, ofte referert til som "presisjonsmedisin", har ført til utviklingen av et stadig voksende repertoar av monoklonale antistoffer og små molekylære hemmere. Disse midlene hemmer effektivt tumorcelleproliferasjon og overlevelse, samtidig som de unngår skadelige bivirkninger på normale celletyper sett med konvensjonelle kjemoterapeutiske midler og strålebehandling. Monoklonale antistoffer som brukes til behandling av humane kreftformer, retter seg oftest mot celleoverflatemolekyler som vekstfaktorreseptorer1 (f.eks. den store familien av membranspennende reseptortyrosinkinaser) og immunresponsmodulatorer2 (f.eks. programmert celledødsprotein 1, programmert dødligand 1). Små molekylære hemmere kan hemme enten celleoverflateproteiner eller signalproteiner som befinner seg intracellulært3. For å effektivt bruke disse nye terapeutiske midlene, må det imidlertid fastslås at en bestemt kreft er avhengig av molekylet som blir målrettet av et kandidat terapeutisk middel.
Selv om disse nye terapeutiske midlene har mer fokuserte effekter, hemmer mange av dem fortsatt virkningen av mer enn ett protein. I tillegg er flere midler med varierende effektivitet og spesifisitet ofte tilgjengelige for å målrette mot et bestemt protein. Derfor, under prekliniske undersøkelser, er det lurt å bruke flere tilnærminger som genetisk ablasjon for å validere et kandidatprotein som et terapeutisk mål. En spesielt nyttig tilnærming til å validere et protein som et terapeutisk mål er å ablate genet som koder kandidatproteinet i en genetisk konstruert dyremodell som utvikler den spesifikke krefttypen av interesse. Denne tilnærmingen kan være relativt enkel hvis mus med en nullmutasjon (enten en naturlig mutasjon, en genetisk konstruert nullmutasjon [en "knockout"] eller en nullmutasjon introdusert av en genfelle) er tilgjengelige, og musene er levedyktige i voksen alder. Dessverre er mus med en nullmutasjon som oppfyller disse kriteriene ofte ikke tilgjengelige, vanligvis fordi nullmutasjonen resulterer i død embryonalt eller i de første dagene av postnatallivet. I dette tilfellet kan mus som er utsatt for å utvikle tumortypen av interesse i stedet krysses til mus der nøkkelsegmenter av genet av interesse er flankert av loxP-steder ("floxed"), som gjør at genet kan ablated ved å introdusere et transgen som uttrykker Cre recombinase i tumorcellene (en betinget knockout). Denne tilnærmingen gir flere fordeler. For det første, hvis en Cre-driver er tilgjengelig som uttrykkes i svulsten, men ikke i celletypen som førte til døden i konvensjonelle knockouts, kan denne tilnærmingen potensielt validere kandidatens terapeutiske mål. For det andre, ved å ablisere genet som koder kandidatproteinet i tumorceller, men ikke i andre intratumorale elementer som tumorassosierte fibroblaster eller immunceller, kan etterforskeren skille mellom celleautonome og ikke-celle-autonome effekter av det terapeutiske målet. Til slutt tillater en tamoxifen-induserbar Cre-driver (CreERT2) etterforskeren å slette genet av interesse på forskjellige stadier i tumorutvikling og definere vinduet der kandidatens terapeutiske middel mest sannsynlig vil være effektivt.
Dessverre er det også tekniske problemer som kan begrense bruken av betingede knockouts i svulster som oppstår i GEM-modeller. For eksempel kan en Cre-driver som uttrykkes i tumorceller og unngår gensletting i normale celler som er essensielle for livet, ikke være tilgjengelig. Et annet problem, som kan undervurderes, er at Cre- og CreERT2-drivere ofte varierer floxed alleler hos mus, noe som resulterer i mosaikk for nullmutasjonen i en GEM-kreft. Når dette skjer, vil tumorceller der det målrettede genet ikke har blitt ablated fortsette å spre seg raskt, overgrowing tumorcellene med ablated alleler. Mosaicism i Cre driver linjer kan oppstå på grunn av ikke-allestedsnærværende Cre uttrykk i avstamningen målrettet og ved mislykket rekombinasjon i individuelle celler uavhengig av Cre uttrykk4. Dette er et kjent fenomen av Cre-drivere som er celletypeavhengige og bør vurderes under eksperimentell design og datatolkning. Mosaicism kan maskere effekten av knockout og føre en etterforsker til feilaktig å konkludere med at genet av interesse ikke er avgjørende for tumorcelleproliferasjon og / eller overlevelse og dermed ikke er et gyldig terapeutisk mål.
Flere av disse problemene ble oppdaget i en tidligere studie som forsøkte å avgjøre om reseptortyrosinkinase erbB4 var et potensielt terapeutisk mål i MPNST-celler5. I disse studiene ble mus brukt som uttrykker et transgen som koder for neuregulin-1 (NRG1) isoform glialvekstfaktor-β3 (GGFβ3) under kontroll av Schwann-cellespesifikt myelinprotein nullpromotor (P 0-GGFβ3 mus). P 0-GGFβ3 mus utvikler flere pleksiforme nevrofibromer som utvikler seg til å bli MPNT via en prosess som rekapitulerer prosessene for nevrofibroma patogenese og pleksiform nevrofibroma-MPNST progresjon sett hos pasienter med autosomal dominant tumor følsomhet syndrom nevrofibromatose type 1 (NF1)6. Når krysset til mus med en Trp53 null mutasjon, den resulterende P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus utvikler MPNSTs de novo som ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- mus.
Disse MPNST-ene rekapitulerer progresjonen fra lesjoner i Verdens helseorganisasjon (WHO) grad II til WHO grad IV sett hos mennesker7. Hos P 0-GGFβ3-mus oppstår MPNT i eksisterende pleksiforme nevrofibromer i trigeminusnerven (58 %) og spinale dorsale nerverøtter (68 %)7; MPNT-ene som oppstår i P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus har en svært lik fordeling. Hos mennesker oppstår MPNT oftest i isjiasnerven etterfulgt av plexus brachialis, spinalnerverøtter, vagus, femoral, median, sakral plexus, popliteal obturator og bakre tibial og ulnarnerve8. Denne tumorfordelingen i disse GEM-modellene er noe forskjellig fra det som ses hos mennesker. Imidlertid MPNT-ene som oppstår i P 0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- mus er histologisk identiske med humane MPNT-er, bærer mange av de samme mutasjonene som ses i humane MPNT-er, og rekapitulerer prosessen med nevrofibroma-MPNST-progresjon sett hos NF1-pasienter. Genereringen av P 0-GGFβ3 eller P0-GGFβ3; Trp53+/- mus som var Erbb4-/- var ikke gjennomførbare da mus med to Erbb4 null alleler dør in utero ved embryonal dag 10,5 sekundært til hjertefeil9. Fordi redning av Erbb4-uttrykk i hjertet ved å introdusere et hjertespesifikt Erbb4-transgen (α-myosin tung kjede (MHC)-Erbb4) resulterer i levedyktige Erbb4-/- mus10, generasjonen av mus med en komplisert P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotype ble forsøkt.
Parringene produserte imidlertid ikke mus i de forventede mendelske forholdene, noe som indikerer at den ønskede genotypen var skadelig. Derfor generasjonen av P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus med floxed Erbb4 alleler11 og en CreERT2 driver ble forsøkt å tillate sletting av Erbb4 i MPNSTene som oppstår i disse musene. I disse dyrene var mange tumorceller med intakte Erbb4-alleler fortsatt tilstede (mosaikk). Mosaikken som ble observert kunne skyldes ineffektiv tamoxifen-levering, noe som resulterte i forskjeller i rekombinasjonseffektivitet i vevet. Muligheten for spontane kompenserende mekanismer kan ytterligere bidra til mosaikk i tamoxifen-mediert rekombinasjon ved å omgå kravet til Erbb4-uttrykk. Det er mulig at tapet av Trp53 gjør tumorceller utsatt for ytterligere spontane "permissive" mutasjoner som kan forvirre tolkningen av dataene. Da det virket sannsynlig at Erbb4-intakte MPNST-celler ville maskere konsekvensene av å ablisere Erbb4 i andre tumorceller, ble denne tilnærmingen forlatt.
Disse hindringene førte til utviklingen av en metodikk for ablating Erbb4 i svært tidlig passasje MPNST celler ved hjelp av en adenovirus uttrykker Cre recombinase og eGFP. Disse cellene kan skilles fra ikke-infiserte celler ved hjelp av FACS, noe som markant reduserer mosaikk for det ablerte Erbb4-genet . Nedenfor beskrives metodene som brukes for å oppnå dette, sammen med metodene som brukes til å vurdere effekten av genablasjon in vitro og in vivo. Følgende protokoll er et eksempel på hvordan man produserer tumorbærende mus som gir svulster som bærer floxed alleler av embryonale dødelige gener av interesse for ex vivo eksisjon før in vivo allograft tumorvekstvurdering. Dette inkluderer en beskrivelse av tilnærmingene som brukes til å analysere effekten som Erbb4-ablasjon utøver på tumorcelleproliferasjon, overlevelse og genuttrykk in vitro og proliferasjon, overlevelse og angiogenese i ortotopiske allotransplantater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før du utfører noen prosedyrer med mus, må alle prosedyrer gjennomgås og godkjennes av Institutional Animal Care and Use Committee. Protokollen beskrevet i dette manuskriptet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Medical University of South Carolina. Denne protokollen ble utført av riktig opplært personell i henhold til MUSCs institusjonelle retningslinjer for dyrepleie.
1. Generering av mus som utvikler MPNT homozygot for Erbb4 flox alleler
- Produser F1-generasjonen av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ dyr ved parring P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus7 med Erbb4fl/fl mus11. Bruk en Punnett-firkant (figur 1) for å veilede avlsordningen for å sikre at nok mannlige og kvinnelige F1-valper genereres med ønsket P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ genotype.
- Genotype F1 avkom ved å isolere genomisk DNA fra en hale snip samlet i samsvar med IACUC retningslinjer og deretter utføre PCR ved hjelp av tidligere beskrevne primere for å oppdage P 0-GGFβ3 transgene12, Trp53 vill type (+) og null (-) alleler7, og Erbb4flox og Erbb4 villtype alleler13.
- Isoler hale-DNA ved hjelp av metoder som er beskrevet på jacks-lab.mit.edu/protocols.
- Få PCR-reaksjonen til å blande seg med 25 ng DNA, 0,25 nM dNTPs, 0,02 U/μL Taq, 0,5 μM av hver primer og 1x PCR-buffer. Utfør PCR-reaksjon med en enkelt 95 ° C inkubasjon (for å smelte genomisk DNA og aktivere Taq) i 1 min etterfulgt av 35 PCR-sykluser på 94 ° C, 10 s (smelting); 55 °C, 30 s (glødning); 72 °C, 40 s (forlengelse) etterfulgt av en enkelt 72 °C (forlengelse) i 5 minutter. Oppbevar reaksjonene ved 4 °C til de er klare til å kjøres på en 1,2-1,5 % agarosegel.
MERK: Glødetemperaturen avhenger av PCR-buffersystemet som brukes; det anbefales å utføre en glødende temperaturgradient for å bestemme riktig glødetemperatur.
- ProduserF2-generasjonen av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl dyr ved parring av passende F1 avkom (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) med hverandre.
MERK: Figur 1 illustrerer Punnet-kvadratprediksjonene som brukes til å beregne forventet antall F2-avkom med ønsket genotype. - Identifiser dyr med ønsket P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl genotype som beskrevet i trinn 1.2.
- Mate F2 avkom til hverandre for å opprettholde P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl koloni og genotype alle valpene. Bekreft at det nylig introduserte floxed allelet ikke kompromitterer overlevelse eller tumorforsinkelse. Oppnå dette ved å etablere kohorter (20 mus/kohort) av P 0-GGFβ3; Trp53+/- og P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl mus og følger deres overlevelse og hyppighet av tumorforekomst.
- Overvåk dyr flere ganger per uke til det eksperimentelle endepunktet er nådd (maksimalt tillatt tumorstørrelse/humant endepunkt godkjent av IACUC).
- Under den ukentlige overvåkingen, vurder kroppsvekt, normal sosial og pleieadferd og svulststørrelsesmålinger. Sørg for veterinær vurdering i tilfelle vekttap på >10% kroppsvekt, sosial tilbaketrukkethet og hunching.
- Når en tumorbærende mus er identifisert og har nådd sitt humane endepunkt, avliver dyret humant ved hjelp av karbondioksidinnånding etterfulgt av cervikal dislokasjon og fjerner svulsten sterilt ved hjelp av en skalpellkniv. Ta tumormålinger ved å måle lengde, bredde og dybde ved hjelp av en tykkelse og vekttumor (masse og volum). Arbeid raskt for å unngå autolyse.
- Del svulsten i tre seksjoner ved hjelp av brødbrødstilkutt med en skalpellkniv under sterile forhold for å generere vevssegmenter for formalinfiksering / parafininnbygging (FFPE), tidlig passasjekulturgenerering og flashfrosset materiale (figur 2A).
- Sørg for at avsnitt 1 (for generering av tidlig passasjekultur, trinn 1.7.2) er ca. 10 % av det totale tumorvolumet, avsnitt 2 (for fiksering og IHC, trinn 1.7.3) er 70 % av det totale tumorvolumet, og pkt. 3 (for flashfrysing, trinn 1.7.4) er 20 % av det totale tumorvolumet.
- Ta avsnitt 1 av svulsten for fremstilling av tidlig passasjekulturer (se nedenfor).
- Løs seksjon 2 av svulsten i 4% paraformaldehyd over natten ved 4 ° C og legg deretter inn i paraffin (formalinfast paraffin-embedded (FFPE) for diagnostisk utredning.
- Flash-freeze avsnitt 3 for analytiske analyser (f.eks. immunoblots for å verifisere at protein kodet av det målrettede floxed genet er riktig uttrykt).
- Flekk 5 μm-tykke FFPE-vevssnitt med hematoksylin og eosin (H&E) for å bekrefte tumordiagnosen av en kvalifisert patolog. Hvis det er hensiktsmessig, utfør immunhistokjemisk farging (IHC) for å bekrefte tumordiagnosen.
- Immunostain MPNSTs for S100 kalsiumbindende protein B (S100β), nestin og kjønnsbestemmende region Y (SRY) -Box transkripsjonsfaktor 10 (Sox10) - tre markører som uttrykkes i både MPNNT og Schwann-celler (tumorcelleopprinnelse) 5,6,14,15. Beis svulstene med antistoffer som gjenkjenner erbB4, proteinet kodet av genet målrettet for ablasjon i nedstrøms trinn.
- For å bekrefte diagnosen, la en kvalifisert veterinær eller human patolog vurdere alle fargede tumorbilder etter WHOs diagnostiske og graderingskriterier 5,6,7,16.
2. Ex vivo ablasjon av floxed Erbb4 alleler i MPNST celler
- Etablere tidlige passasjekulturer fra nyoppsamlet MPNST-vev ved å plassere vevet fra seksjon 1 (trinn 1.7.3) i 10 ml iskaldt sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) på is og deretter overføre det til et sterilt arbeidsområde (figur 2B)16.
MERK: Alle påfølgende prosedyrer skal utføres i en steril vevskulturhette. - Hakk tumorvevet i 2-4 mm stykker og triturat 8-10 ganger i en 10 cm2 behandlet vevskulturskål med 10 ml vekstmedium. Dyrk disse preparatene i høyt glukose DMEM-10 vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) som inneholder 10% føtal kalveserum, 1% glutamin, 10 μg / ml streptomycin og 10 IE / ml penicillin) supplert med 10 nM neuregulin-1β (NRG1β) og 2 μM forskolin. Legg forskolin på dette stadiet for å hemme veksten av vanlige forurensende celletyper som fibroblaster.
- Vedlikehold det mekanisk dissosierte vevet og cellene i opptil 3 dager ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære for å etablere en tidlig passasjekultur. Ikke separer dispergerte celler og gjenværende vevsfragmenter på dette punktet.
- Oppdater kulturene med nytt medium hver 3-4 dag. La tumorcellene spre seg til de er sammenflytende.
- Utvid de tidlige passasjekulturene ved å dele de sammenflytende kulturene i flere retter. Fjern vekstmediet og vask cellene med 1x dPBS. Tilsett deretter 1 ml 0,25% trypsin i 2-5 minutter ved romtemperatur per 10 cm2 behandlet cellekulturskål. Triturer kulturen forsiktig for å lette løsrivelse og generere en enkeltcellesuspensjon.
- Avslutt trypsiniseringen ved å tilsette 2 ml DMEM-10 vekstmedium. Samle den trypsiniserte celleblandingen og overfør den til et 5 ml sterilt sentrifugerør. Pellet cellene ved sentrifugering i 5 minutter ved 500 × g ved romtemperatur.
- Resuspender cellepelleten i 5 ml DMEM-10. Del cellene i to til fire 10 cm cellekulturskåler, som hver inneholder 10 ml vekstmedier (ca. 1 × 106 celler per tallerken).
- Etter 5 passasjer (gjentatte trinn i 2,5), bruk vekstmedium uten NRG1β og forskolin. Immunostain en prøve av kulturen med et anti-S100β antistoff for å verifisere at kulturen består utelukkende av tumorceller. Opprettholde cellene i DMEM-10 vekstmedium i alle påfølgende passasjer.
- Ved neste passasje teller du cellene og fryser ned en del av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler samlet fra konfluerende kulturer (3 × 106 celler/hetteglass).
- Plate P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl /fl tidlig passasje MPNST-celler med en tetthet på 1,5 × 106 celler per 10 cm behandlet cellekulturskål i DMEM-10 vekstmedium.
- Dag 0: (Ca. 12-16 timer etter plating), vask de adherente kulturene med 2-4 ml dPBS og infiser med Ad5CMV-Cre/eGFP eller Ad5CMV-eGFP ved ca. 400 plakkdannende enheter (pfu)/celle i 10 ml serumfri DMEM (dvs. 30 μL på 2 × 1010 pfu virus per 10 cm tallerken). Ablate de floxede Erbb4-allelene ved bruk av adenoviruset ved maksimal tolerert viruskonsentrasjon (mangfold av infeksjon, MOI), som bestemt empirisk. Se figur 2C for et skjema for arbeidsflyten for denne ablasjonen.
- Dag 1: Omtrent 16 timer senere, redd kulturene ved å legge til 10 ml DMEM-10 til infeksjonscocktailen.
- Dag 2 - 3: FACS sorterer infiserte celler etter anbefalt protokoll fra kjernefasiliteten for å sortere eGFP-positive celler ca. 48 timer etter infeksjon. Før FACS-sortering, sjekk kort celler for eGFP-signal på et fluorescensmikroskop for å sikre at kulturene har blitt effektivt infisert (~ 50-100% positive celler). Returceller gjenvunnet etter FACS til 10 cm vevskulturretter; reservere en tallerken for genomisk DNA-isolasjon.
- Dag 4 - 5: Etter FACS-sortering, la cellene komme seg i en vevskulturinkubator i minst 24-48 timer og forbered deretter cellene for in vitro cellebaserte analyser eller in vivo podning. Bekreft Erbb4-delesjon via PCR ved hjelp av genomisk DNA isolert fra en del av de sorterte eGFP-positive cellene. Kontroller at eGFP-positive celler er ErbB4-negative ved PCR eller ved å immunsette en prøve av kulturen med et anti-erbB4-antistoff.
- Isoler genomisk DNA fra cellene ved hjelp av standard syre-guanidinium-fenol og kloroformbasert DNA-isolasjonsmetode17.
- Utfør standard PCR for å skille floxed Erbb4 alleler og ablated Erbb4 alleler. Utfør 40 sykluser med 2 ng DNA, 20 μM primere 1 + 2 for å produsere et 250 bp Erbb4-null produkt og et 350 bp floxed produkt13. Utfør både PCR- og antistoffbaserte tilnærminger for å bekrefte knockout når ingen pålitelige antistoffer er tilgjengelige.
MERK: Cellene er klare for in vitro cellebaserte analyser som beskrevet nedenfor. Mange typer nedstrømsanalyser kan utføres med celler fremstilt på denne måten. Formålet med protokollene som presenteres nedenfor er å gi noen få eksempler på in vitro og in vivo anvendelser av disse tumorcellene etter ablasjon av Erbb4-genet .
3. Proliferasjons- og levedyktighetsanalyser i MPNST-celler med ablerte Erbb4-alleler
- Utfør spredningsanalyser i løpet av de neste syv dagene på sorterte MPNST-celler belagt i en multiwell-plate ved hjelp av et bildebasert automatisert cytometer.
- Dag 6: Plate 2,000 celler per brønn i et endelig volum på 150 μL (~ 13,300 celler / ml) vekstmedium i en 96-brønns plate. Utfør målinger i tre eksemplarer for hver eksperimentell kohort og 4 daglige endepunktavlesninger (3 replikerer x 2 forhold x 4 dager).
-
Dag 7, 9, 11, 13: Beis celler med Hoechst og propidiumjodid (PI) fargestoffer og avbilde dem på en automatisert plateleser for å telle antall levende og døde celler i hver brønn. For å oppnå dette, må du samtidig farge cellene med Hoechst-fargestoff for å flekke kjernene til både levende og døde celler og med propidiumjodid (PI) for å merke de døde cellene. Utfør alle avlesninger til samme tid hver dag eller annenhver dag.
- Tilsett 50 μL av en 4x PI/Hoechst fargeløsning (4 μg/ml hver) til hver brønn kvantifisert den dagen (f.eks. kun dag 7), og inkuber i 30 minutter ved 37 °C i vevskulturinkubatoren. Hold platen beskyttet mot lys.
MERK: Fargekonsentrasjonen av Hoechst må bestemmes empirisk og kan variere fra 1 til 10 μg / ml avhengig av celletype. - Les de fargede brønnene etter inkubering ved hjelp av riktig fluorescerende kanal på den automatiserte cellebildemaskinen. Etter å ha lest, returner platen til inkubatoren for fremtidige avlesninger på påfølgende dager (dvs. dag 9, 11, 13).
- Kvantifiser fargeintensitetene basert på bildebehandlingssystemet som brukes, og beregne antall døde celler, levende celler og totale celler ved hjelp av følgende innstillinger: blå kanal (377/50 nm, Hoechst): totale celler (levende og døde); rød kanal (531/40 nm, PI): bare døde celler; blå - rød (totalt - død) = levende celler.
- Tilsett 50 μL av en 4x PI/Hoechst fargeløsning (4 μg/ml hver) til hver brønn kvantifisert den dagen (f.eks. kun dag 7), og inkuber i 30 minutter ved 37 °C i vevskulturinkubatoren. Hold platen beskyttet mot lys.
- Utfør celle levedyktighetsanalysen over tre dager, om ønskelig, etter analyseprodusentens protokoll.
MERK: Levedyktighetsanalyser kan kombineres med spredningsanalyser ved å utføre en trippel flekk inkludert calcein AM (488/32 nm; grønn kanal, spesielt etiketter levende celler), PI og Hoechst. En apoptoseanalyse kan også utføres ved hjelp av kulturer satt opp som beskrevet ovenfor; den spesifikke protokollen vil avhenge av bildesystemet.- Dag 6: Plate 4,000 celler per brønn i et endelig volum på 150 μL i en 96-brønns plate i tre eksemplarer.
- Dag 7 - 9: Tilsett 2,000x bioluminescerende celle levedyktighetsanalyse reagenser (Tabell over materialer), returner platen til inkubatoren, og les platen 1 time senere. Utfør påfølgende avlesninger til samme tid hver dag. For bioluminescens (MTT) analyser, utfør analysen nøyaktig som beskrevet i produsentens instruksjoner hver 24. time i 72 timer ved hjelp av en luminometerplateleser.
4. RNA-Seq analyser og identifisering av gener hvis uttrykk er endret av Erbb4 tap
- Dag 6: Isoler totalt RNA fra sorterte MPNST-celler ved hjelp av standard syre-guanidinium-fenol og kloroformbaserte metoder. For eksperimenter designet for å oppdage endringer i mRNA-nivåer mellom to kohorter, må du forberede totalt RNA fra minst tre biologiske replikasjoner i hver kohorte.
- For å eliminere hendelser forårsaket av adenoviralvektoren eller eGFP-uttrykket i stedet for Erbb4-tap, isoler RNA fra tre biologiske replikasjoner av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST-celler transducert med Ad5CMV-Cre / eGFP og tre biologiske replikasjoner transducert med Ad5CMV-eGFP.
MERK: Isolert RNA må ha en RNA-integritetsnummer (RIN) score ≥ 8 for RNA-Seq-analyse. Kontroller at sekvenseringskjernen bestemmer RIN for alle prøver før du bygger biblioteker.
- For å eliminere hendelser forårsaket av adenoviralvektoren eller eGFP-uttrykket i stedet for Erbb4-tap, isoler RNA fra tre biologiske replikasjoner av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST-celler transducert med Ad5CMV-Cre / eGFP og tre biologiske replikasjoner transducert med Ad5CMV-eGFP.
- Bruk 100-200 ng av høy kvalitet totalt RNA fra hver prøve for å forberede RNA-Seq biblioteker (arbeid med kjernen sekvensering anlegget for dette trinnet). Utfør sekvensering med høy gjennomstrømning ved hjelp av en neste generasjons DNA-sequencer. For mRNA-kvantifisering, utfør single-ended sekvensering for å generere Fastq-filer. Sørg for minst 50 millioner avlesninger for hver prøve.
MERK: Se figur 3 for et skjema som illustrerer arbeidsflyten som brukes til å behandle RNA-Seq-data og kvantifisere uttrykket av differensielt uttrykte transkripsjoner. Sekvensdata, i form av Fastq-filer, blir utsatt for kvalitetskontrollprosedyrer; >80% av lesingene skal gi en Phred-poengsum på 30 for å bli ansett som passende for senere analyse. Sekvensene er også forhåndsbehandlet (trimmet) ved hjelp av Trimmomatic18 for å fjerne adaptersekvenser og filtrere ut avlesninger av lav kvalitet. - Utfør RNA-Seq justering og analyse på fastq genererte filer ved hjelp av alle dyktige program (f.eks DNAStar19,20 eller Partek21). Følg de programspesifikke trinnene ved å bruke standardinnstillingene for å justere fastq-filene til musereferansegenomet (GRCm38/mm10).
MERK: Ved å bruke DNAStar som eksempel, er den generelle arbeidsflyten beskrevet nedenfor (supplerende figur 1).- Velg analysemetode, RNA-Seq.
- Velg referansegenomet Mus.
- Last opp BED-filen hvis du får en av sekvenseringskjernen.
- Last opp hurtigsekvenseringsfilene, og tilordne dem unike replikasjonsnavn.
- Gruppereplisere fastq-filene og angi dem til et replikasjonssett (dvs. GFP, CRE)
MERK: Hvert justeringsprogram har sine spesifikke trinn, og brukeren må konsultere programmets brukerhåndbok for den programspesifikke protokollen. Programmet vil da generere genspesifikke rå telle data fra disse Fastq filer.
- Utfør statistisk og normaliseringsanalyse (DESeq2, EdgeR) på råtellingsdataene ved hjelp av alle dyktige programmer, som beskrevet i 4.3, med Ad5CMV-eGFP-prøvesettet som kontrolldatasett og Ad5CMV-Cre-settet som testdatasett for å identifisere differensielle genuttrykkssignaler med robust statistisk styrke22,23.
- Velg GFP fastq-filer som kontrolldatasett.
- Velg DESeq2 som statistisk og normaliseringsmetode .
- Start montering og analyse.
MERK: Hvert justeringsprogram har sine spesifikke trinn, og brukeren må konsultere programmets brukerhåndbok for den programspesifikke protokollen. Programmet vil da generere genspesifikke rå telle data fra disse Fastq filer. Den statistiske og normaliseringsanalysen er et innebygd trinn i mange programmer, som vist i eksemplet her, i sekvensjusteringsprotokollen. Hvis det brukes et alternativt sekvensjusteringsprogram som ikke tilbyr dette påfølgende innebygde trinnet, kan du utføre statistisk og normaliseringsanalyse på råtellingsdataene på terminalnivå ved hjelp av DESeq2- eller EdgeR-kodepakkene skrevet i R, fritt tilgjengelig for nedlasting på Bioconductor.org.
- Bruk disse tilnærmingene til å identifisere endringer som representerer minst 1,5 ganger økning eller reduksjon i forhold til kontrollen (i dette tilfellet celler transducert med Ad5CMV-eGFP-viruset). Bruk bare de differensielt uttrykte gener (DEGs) bestemt til å være statistisk signifikante som viser ≥1,5 ganger endringer og en p-verdi 0,05 eller en padj på 0,1 for påfølgende funksjonell anrikningsanalyse.
MERK: Dette vil generere en liste over DEG-gener og deres statistiske kraft for funksjonell anrikningsanalyse. - Utfør funksjonell berikelsesanalyse på statistisk signifikant Erbb4-mediert DEG identifisert i 4.4 med en rangert genlistefil ved hjelp av et av de fritt tilgjengelige nettbaserte verktøyene. Bestem biologisk og veibetydning av Erbb4-gentap gjennom genontologiske datasett integrert i disse open access funksjonelle anrikningsanalyseverktøyene 24,25,26,27 (se Materialtabell for eksempler og figur 3 for et eksempel arbeidsflyt ved bruk av Panther).
- Eksporter dataene som ble innhentet i trinn 4.4, som et regneark.
- Ranger dataene etter log2 foldeendring, p/padj-verdi eller begge deler.
- Sørg for å fjerne alle ikke-statistisk signifikante data.
- Eksporter den rangerte genlisten med gen-ID bare som en .txt fil og last den opp til nettstedet.
MERK: Bruk bare statistisk signifikant DEG (p/padj-verdier < henholdsvis 0,05 eller 0,1) for å generere en rangert inndatagenliste ved hjelp av log2 foldeendringer (høyest til lavest), p/padj-verdier (lavest til høyest) eller begge [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Det er flere tilnærminger for å generere en rangert genliste og er empirisk bestemt for datasettet og spørsmålet som stilles. Den spesifikke typen funksjonelt berikelsesanalyseverktøy som brukes, kan også hjelpe til med å bestemme riktig type ranggenliste. For ytterligere ressurser på RNA-Seq, se følgende papirer 28,29,30.
5. Ortotopisk allografering av MPNST-celler med ablerte Erbb4-alleler og analyse av effekten av Erbb4-ablasjon
- Før du utfører ortotopisk allografting av sorterte MPNST-celler, må du sørge for at alle prosedyrer blir gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee, og at alle prosedyrer utføres av riktig opplært personell.
- På injeksjonsdagen fjerner du celler med lav passasje (ca. 85 % vekselstrøm) fra cellekulturplater eller kolber ved hjelp av en ikke-enzymatisk celledissosiasjonsløsning (f.eks. en blanding av chelater, se materialtabellen) og teller cellene ved hjelp av et hemocytometer. For ortotopiske injeksjoner i isjiasnerven, rekonstituer cellene ved 16 667 celler / ml (50 000 celler per 3 μL for hvert dyr) i DMEM-1031. Hold cellene på is.
MERK: Noen kulturer vil ikke lykkes med å etablere transplantater med mindre cellene injiseres i kjellermembranmatrise med lav vekstfaktor. Kravet til en kjellermembranmatrise (10-50%) må bestemmes empirisk. - Vurder in vivo allograft vekstpotensial i postinfiserte celler ved å injisere MPNST-celler i isjiasnerven til 8-10 bedøvet Hsd: Athymic Nude-Foxn1nu mus per kohort (i alderen 4-8 uker). For ortotopisk injeksjon av tumorceller, se Turk et al31. Her demonstreres en subkutan injeksjon.
MERK: For å bestemme antall eksperimentelle dyr som trengs for statistisk signifikans, ta kontakt med en biostatistiker, eller det anbefales å bruke G * Power3, en fritt tilgjengelig programvare32. - Overvåk dyrene nøye to ganger daglig den første uken etter injeksjonen for tegn på smerte. Deretter overvåkes de podede musene tre ganger per uke for tykkelsesmålinger og vurderer kroppstilstandspoeng (BCS) som tidligere beskrevet 5,31. Som beskrevet i IACUC-retningslinjene, avliv dyr med en BCS på 2 eller mindre.
- Etter hvert som podede celler vokser med forskjellige hastigheter, bestemmer du podetider empirisk ved hjelp av kontrollceller (umodifiserte) celler før du utfører eksperimenter beskrevet i denne delen. For å samle transplantatene ved det eksperimentelle endepunktet, avliv musene humant ved hjelp av karbondioksidinnånding etterfulgt av cervikal dislokasjon som et sekundært tiltak. Registrer det endelige volumet og massemålingene av hvert transplantat.
MERK: Som umodifisert P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST-celler når vanligvis den maksimale størrelsen som er tillatt av IACUC innen 30-45 dager, en typisk tidslinje er rundt 30-45 dager etter injeksjon. - Isoler og snitt vev som beskrevet i trinn 1.6-1.8. Fest en del av transplantatvevet over natten i 4% paraformaldehyd (figur 2) og legg det deretter inn i paraffin. Forbered 5 μm seksjoner fra FFPE-vevet og monter dem på lysbilder. Utfør H&E-farging og annen nødvendig immunostaining for å bekrefte at transplantatvevet består av tumorceller som beskrevet i 1.8.1. Snap-frys resten av tumorvevet for nedstrømsanalyser, for eksempel å validere tapet av Erbb4-ekspresjon og vurdere effekten av Erbb4-tap på uttrykket til andre Erbb-familiemedlemmer .
MERK: Bekreftelse av tumorceller i transplantatvevet må gjøres fordi immunsviktmus er tilbøyelige til å utvikle neoplasmer. Når det gjelder små transplantater, er det viktig å sikre at arrvæv eller betennelse ikke forveksles med en neoplasma.- Utfør standard IHC-farging på FFPE-vevet for å sammenligne ekspresjonen av proteiner av interesse for allotransplantater dyrket fra Ad5CMV-eGFP og Ad5CMV-Cre / eGFP-behandlede celler. Beis det utskårne transplantatvevet ved hjelp av erbB4-spesifikke antistoffer for å bekrefte forskjeller i in vivo erbB4-ekspresjon mellom de to eksperimentelle forholdene. Bestem proliferativ indeks via Ki67-farging og nivået av apoptose via terminal deoksynukleotidyltransferasemediert dUTP nick-end merking (TUNEL) farging.
MERK: Ethvert proteinmål av interesse kan også vurderes via IHC. For eksempel vurdere vaskulær tetthet ved immunostaining allografts med et anti-CD31 antistoff (1:50 fortynning) for å bestemme in vivo vaskulære mikromiljøforskjeller mediert av genablasjon. Antall karprofiler per 40x felt kan telles for kvantifisering. For disse IHC-baserte analysene, følg standard IHC-protokoller for fargeprosedyrene og produsentens protokoll for TUNEL-farging. For kvantifisering av bilder, bruk ImageJ-plugin-modulen "automatisert telling av ensfarget bilde."
- Utfør standard IHC-farging på FFPE-vevet for å sammenligne ekspresjonen av proteiner av interesse for allotransplantater dyrket fra Ad5CMV-eGFP og Ad5CMV-Cre / eGFP-behandlede celler. Beis det utskårne transplantatvevet ved hjelp av erbB4-spesifikke antistoffer for å bekrefte forskjeller i in vivo erbB4-ekspresjon mellom de to eksperimentelle forholdene. Bestem proliferativ indeks via Ki67-farging og nivået av apoptose via terminal deoksynukleotidyltransferasemediert dUTP nick-end merking (TUNEL) farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 illustrerer et typisk resultat oppnådd ved transdusering av P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-celler med enten Ad5CMV-eGFP-adenovirus eller Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus (figur 4A). Kulturer ses med fluorescensmikroskopi for å identifisere eGFP-uttrykkende celler og ved fasekontrastmikroskopi for å bestemme totalt antall celler tilstede i samme felt ved 10x (topp) og 40x (bunn). Prosentandelen av celler som uttrykker eGFP kan deretter beregnes om ønskelig. Representative FACS-utgangsdata er vist i tillegg figur S2. Etter FACS vil prosentandelen av eGFP-uttrykkende celler økes markant, med nesten alle cellene i hvert felt som uttrykker eGFP. Typiske PCR-genotypingsresultater som forventes etter Cre-mediert genablasjon, avhengig av transfeksjonseffektiviteten, er fullstendig gen knockout (100% effektivitet) eller en heterogen populasjon av induserte og uinduserte celler (<100% effektivitet) sammenlignet med kontrolltransduksjonsresultater (kun GFP, fl / fl) (figur 4B). Figur 4C illustrerer den karakteristiske histopatologien som finnes i ortotopiske allotransplantater av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl /fl MPNSTs sammenlignet med svulstene avledet fra de opprinnelige GEM dyremodellene.
I disse eksperimentene resulterte Erbb4-ablasjon i reduksjon i cellulær proliferasjon og cellulær tetthet in vitro og in vivo, økning i TUNEL-merkingsindekser in vivo og redusert vaskulær tetthet in vivo. Figur 5 illustrerer representative resultater oppnådd med et bildebasert automatisert cytometer som viser redusert cellulær proliferasjon i Ad5CMV-Cre-ablerte celler vs. kontroll Ad5CMV-GFP-transducerte celler (figur 5A); disse eksperimentene ble utført med tidlige passasjekulturerte celler. Ekspresjon av ErbB4 via immunhistokjemi i P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler transdusert med Ad5CMV-Cre- eller eGFP-virus ble redusert i de resulterende Ad5CMV-Cre-transinduserte allotransplantater sammenlignet med kontroll Ad5CMV-eGFP-behandlede allotransplantattumorer (figur 5B). Vaskulær tetthet ble vurdert via immunoreaktivitetsdeteksjon for CD31; vaskulær tetthet kan ses å være markant redusert i allotransplantater av Ad5CMV-Cre-transducerte celler (figur 5C). Signalintensiteten kan kvantifiseres, om ønskelig, ved hjelp av ImageJ.
Figur 1: Punnet kvadratberegninger av forholdet mellom forventede genotyper ved generering og kryssing av P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus med Erbb4fl/fl mus (F1). Punnet kvadrat beregninger av forholdet mellom forventede genotyper ved generering og vedlikehold av P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+ med hverandre (F2). Forkortelse: fl = Floxed. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt av prosessenbrukes til ablate floxed Erbb4-alleler i tidlige passasjekulturer av MPNST-celler avledet fra P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl mus. (A) Høst svulsten som uttrykker floxed genet. (B) Lag tidlige passasjekulturer fra den utskårne svulsten. (C) Infisere tidlige passasjekulturer for å ablate det floxed genet og utføre nedstrøms analyser. Forkortelser: MPNST = ondartet perifer nerveskjede tumor; IHC = Immunhistokjemi; PFA = Paraformaldehyd; FFPE = Formalin-fast parafin-innebygd; H&E = Hematoxylin og eosin; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; GFP = grønt fluorescerende protein; K/O = knockout; PCR = polymerasekjedereaksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk illustrasjon av arbeidsflyten RNA-Seq. Arbeidsflyten brukes til å identifisere differensielt uttrykte transkripsjoner mellom kontrollceller (GFP-indusert) og Erbb4-null (Cre-indusert) og den resulterende biologiske signifikansen. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; RNA-Seq = RNA-sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative transduksjonseffektivitetsresultater vurdert ved mikroskopi i P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST celler. (A) Celler transducert med enten Ad5CMV-eGFP adenovirus eller Ad5CMV-Cre / eGFP adenovirus. (B) PCR-resultater av potensielle genpopulasjoner etter Ad5CMV-infeksjon. (C) Karakteristisk histopatologi som sammenligner svulstene generert i de opprinnelige GEM-modellene med den ortotopisk allotransplanterte P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-celler via H&E-farging. Bildene ble tatt på 40x. Isotype-matchede negative kontrollantistoffer ble brukt til kontrollfarging. Skala barer = 400 μm (A, øvre panel); 100 μm (A, nedre panel), 20 μm (C). Forkortelser: MPNST = ondartet perifer nerveskjede tumor; GFP = grønt fluorescerende protein; BF = brightfield; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; Neg Ctrl = negativ kontroll; PCR = polymerasekjedereaksjon; GEM = genetisk konstruert mus; fl = floxed. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater oppnådd i dyrkede MPNST-kulturer med tidlig passasje og ortopisk allotransplanterte MPNST-celler etter transduksjon med enten Ad5CMV-eGFP eller Ad5CMV-Cre/eGFP. (A) Proliferasjonsanalyse av dyrkede MPNST-celler som viser redusert celletetthet i celler transducert med Ad5CMV-Cre/eGFP sammenlignet med de som ble transdusert med Ad5CMV-eGFP. Kvantifiserte data tegnes på dag 1, 3 og 5 (venstre). Konfluensbilder fra dag 1 og dag 5 tatt på det bildebaserte automatiske cytometeret vises til høyre (Bilder tatt med 4x forstørrelse med lysfeltmikroskopi). Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) for minst 3 forskjellige uavhengige eksperimenter. (B) Representativ ErbB4-farging i allografttumorer transducert med Ad5CMV-eGFP eller Ad5CMV-Cre / eGFP adenovirus tatt ved 20x forstørrelse. Rød kanal (Alexa 564, CD31), blå kanal (Hoechst, kjerner). (C) Representative bilder av vaskulær tetthet i allotransplantater av P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler transdusert med Ad5CMV-eGFP versus Ad5CMV-Cre/eGFP-virus. Bildene ble tatt på 40x. Isotype-matchede negative kontrollantistoffer ble brukt til kontrollfarging. Skala barer = 100 μm. Forkortelser: MPNST = ondartet perifer nerveskjede tumor; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; IgG = immunoglobulin G; NEG = negativ kontroll; CD = klynge av differensiering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Skjematisk illustrasjon av en arbeidsflyt for sekvensjustering og analyse. Arbeidsflyten som brukes i DNAStar til å justere og analysere RNA-sekvenseringsfiler (fastq-filer). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; RNA-Seq = RNA-sekvensering., DEG = differensielt uttrykte gener. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Representative FACS-data fra tidlige passasjekulturer ved bruk av grønt fluorescerende protein. (A) GFP-uttrykkende celler sorteres av FACS etter innstilling av fluorescerende portparametere fra ikke-infiserte celler. (B) Etter at den aktuelle deteksjonsporten er satt, separeres GFP-positive (transducerte) celler fra GFP-negative (ikke-transducerte) celler. Forkortelser: SSC-A = sidespredningsområde av topp; FSC-H = fremover spredningshøyde på toppen; FSC-W = fremover spredningsbredde av topp; GFP = grønt fluorescerende protein; FACS = Fluorescensaktivert cellesortering. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De detaljerte metodene som presenteres her ble utviklet ved hjelp av en GEM-modell av MPNST-er. Men hvis tumorvevet av interesse kan spres i individuelle celler, er disse metodene lett tilpasningsdyktige for ulike tumortyper som oppstår i GEMs. Det er viktig å sikre at floxed allelet ikke resulterer i i) redusert overlevelse som kan gjøre det vanskelig å oppnå tilstrekkelige mus til å screene for svulster, eller ii) økt tumorforsinkelse som kan gjøre det vanskelig å oppnå nok tumorbærende mus. Hvis floxed allelet ikke påvirker overlevelsen, vil overlevelsen til begge kohortene være likeverdig. Hvis det ikke har noen effekt på tumorlatens, bør tilsvarende antall tumorbærende mus oppstå i begge kohorter med et lignende tidsforløp.
Lignende tilnærminger har blitt brukt til å studere nevrofibromer og MPNST-er ved hjelp av betingede knockouts og tamoxifen-induserbare Cre-dyr for å generere induserbare betingede knockout-dyr33,34. Forskjellen mellom disse studiene og denne, bortsett fra bruk av tamoxifen for Cre-induksjon som tidligere diskutert, er at disse studiene fokuserer på tumorutvikling med en vevsspesifikk knockout av NF1. Siden denne studien og disse andre studiene også bruker GEMM-genererte svulster, ligger forskjellen i spørsmålet som stilles. I denne protokollen studerer vi ikke rollen som NF1-tap spiller i MPNST-patogenesen, men studerer i stedet rollen som et bestemt gen (Erbb4) i GEMM-genererte MPNST-er utøver på in vivo tumorvekst, noe som ellers ville være umulig på grunn av å være embryonalt dødelig. Videre unngår denne protokollen bruk av tamoxifen for de tilnærmingene som krever slike parametere.
Andre har studert etablerte humane MPNST-cellelinjer i xenograftmodeller35. Den studien skiller seg fra denne ved at de podede cellene som brukes er godt studerte, men høypassasje humane MPNST-cellelinjer, og den fokuserer på å etablere legemiddelresponser i xenotransplantater. Disse forskerne studerer ikke rollen som et bestemt gen i disse MPNST-cellene for in vivo vekst og effekten av gentap på narkotikarespons. En annen studie som ligner på denne ble utført av Dodd et al., ved hjelp av adenovirus Cre recombinase (Ad-Cre) -mediert NF1-tap på en tidsmessig og romlig avhengig måte, igjen en kraftig metode for å utvide MPNST-translasjonsinnsats36. Studien fokuserte på rollen som NF1 og Ink4a / Arf-tap, to svært ofte medslettede gener i humane MPNST-er, i isjiasnerven ved Ad-Cre-injeksjon. P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl mus beskrevet i denne studien kan brukes på denne måten ved å injisere Ad-Cre i Schwann celleforløper linjer. Spørsmålene i denne studien er imidlertid ikke fokusert på Erbb4s evolusjonære rolle ved MPNST-initiering, men på hvordan MPNNT-er kan kapre Erbb4-signalering for tumorvekstfordel.
Det finnes alternativer til tilnærmingen beskrevet her, inkludert å slå ned genuttrykk via RNA-interferens (RNAi) eller inaktivere genet av interesse med CRISPR i humane kreftcellelinjer. Disse alternative tilnærmingene er verdifulle og kan samarbeide med genablasjon i celler avledet fra GEM-svulster for å verifisere at effektene observert i musetumorceller rekapituleres i deres menneskelige kolleger. Det er imidlertid noen klare fordeler med metodikken som er beskrevet her. For det første er genetisk ablating floxed gener i GEM kreftceller rask og produserer fullstendig inaktivering av det målrettede genet. I motsetning til dette observeres det ofte at bruk av korte hårnålsRNA resulterer i bare en delvis knockdown av genuttrykk. Selv om CRISPR kan produsere fullstendig geninaktivering, krever identifisering av kloner som har fullstendig inaktivering en langvarig seleksjonsprosess.
Videre må flere kloner undersøkes for å sikre at effektene som følge av CRISPR-ablasjon ikke er forskjellige mellom forskjellige kloner. For det andre er evnen til å ablate floxed alleler i tidlig passasje GEM tumorkulturer fordelaktig, da dette minimerer muligheten for å velge for forskjellige tumorcelleunderpopulasjoner som vokser effektivt i kultur. Til sammenligning er menneskelige cellelinjer, som vanligvis har blitt opprettholdt i kultur i årevis, ofte avledet fra forskjellige underpopulasjoner som er godt tilpasset kultur og ofte gjennomgår genetisk drift under denne prosessen. Dette resulterer i at disse cellelinjene utvikler nye mutasjoner som ikke var tilstede i foreldresvulsten. Til slutt, selv om podningen av GEM-tumorceller til immunsviktende mus er beskrevet i dette manuskriptet, bemerkes det at GEM-tumorceller avledet fra svulster som oppstår i innavlede musestammer, kan allotransplanteres til mus av samme stamme. Dette vil tillate etterforskeren å vurdere tumorbiologi hos dyr med et intakt immunsystem i nærvær eller fravær av det målrettede genet.
Det kritiske trinnet i protokollen beskrevet her er ablasjon av floxed genet med Ad5CMV-Cre / eGFP og sikre overlevelse av tumorcellene etter genablasjon og FACS. Siden dette er en prosess som er avhengig av Cre recombinases evne til å ablate det floxed genet, er det potensielt utsatt for noen av de samme problemene som kan oppstå ved ablating av et floxed gen in vivo; disse problemene ville manifestere seg som en ufullstendig ablasjon av det målrettede allelet. Merk at evnen til å rense celler som har blitt vellykket transducert med den eGFP-uttrykkende adenoviralvektoren, ser ut til å minimere mosaikk sammenlignet med in vivo genablasjon med CreERT2. Men når det gjelder målrettede gener som koder for proteiner, som ErbB4 som uttrykkes på celleoverflaten, kan det være mulig å ytterligere sikre tapet av det målrettede genet ved å utføre FACS ved å bruke både eGFP og et antistoff som gjenkjenner proteinet av interesse (dvs. sortere de eGFP-positive / erbB4-negative cellene).
Fordi, som nevnt i innledningen, mange av proteinene som er målrettet terapeutisk av monoklonale antistoffer, er celleoverflateproteiner, bør denne tilnærmingen ofte være mulig. Det skal også bemerkes at det er viktig å la tumorcellene komme seg i minst 2-3 dager etter FACS hvis RNA-Seq skal utføres på dem for å vurdere effekten som genablasjon har hatt på transkriptomet. RNA-Seq datasett oppnådd veldig snart etter FACS viser ofte mer variasjon i genuttrykk mellom biologiske replikasjoner i enkelte celletyper. Dette kan være en konsekvens av traumer som celler lider når de går gjennom FACS; derfor må cellene tillates en gjenopprettingsperiode etter denne prosessen. RNA-Seq datasett kan analyseres ved hjelp av DESeq2, som bruker den negative binomiske fordelingen og en krympingsestimator for fordelingens varians. I disse analysene sorteres prøvene i henhold til deres q-verdi, som er den minste falske oppdagelsesraten (FDR) der endringer i transkripsjonsnivåer er signifikante; FDR beregnes ved hjelp av Benjamini-Hochberg multiple testing justeringsprosedyre. Alternativt kan DEGs identifiseres ved hjelp av annen tilgjengelig programvare som er i stand til RNA-Seq-analysearbeidsflyter.
For denne MPNST-dyremodellen krever identifisering av det eksperimentelle endepunktet en forståelse av neoplasmenes naturlige historie i dyremodellen som brukes. Den naturlige historien til MPNT-er i denne GEM ble bestemt ved å følge overlevelsen av en serie på 44 P 0-GGFβ3 mus6 og 19 P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus7 og deretter utføre komplette nekropsier på alle disse dyrene når de nådde overlevelsesendepunktet. De typiske overlevelsestidene og stedet der MPNNT-er vanligvis oppsto, ble bestemt i hver dyremodell. I de fleste av disse musene oppsto MPNT i trigeminusnerven. MPNT-er som oppstår i trigeminusnerven produserte vanligvis ptose assosiert med hornhindeskyhet (et resultat av problemer med tårefordeling produsert av ptosen), noe som ga et klinisk nyttig tegn for å identifisere tumorbærende mus. Tumordiagnose bør bekreftes ved å utføre H&E-flekker og flere andre diagnostiske flekker (S100β, nestin Sox 10, H&E, Mart1) etterfulgt av en undersøkelse av en kvalifisert veterinær eller humanpatolog. Dette er også viktig fordi Trp53-nullallelen i denne modellen predisponerer musene for utvikling av andre neoplasmer som lymfomer, og disse svulstene må skilles fra MPNT-er.
Endelig har denne metoden flere potensielle applikasjoner som ennå ikke er utforsket, men kan være gjennomførbare i fremtidige undersøkelser. For eksempel fremmer neuregulin 1 (NRG1), liganden som aktiverer både erbB3 og erbB4, migrasjonen av MPNST-celler på en kjemotaktisk måte; både erbB3 og erbB4 ligger i invadopodia av MPNST-celler37. Det er imidlertid ikke klart om erbB3 eller erbB4 formidler den kjemotaktiske responsen på NRG1. Følgelig kan celler der erbB4 er ablated med denne metoden brukes til å løse dette spørsmålet. En naturlig oppfølging av disse forsøkene er å vurdere om erbB4 er nødvendig for metastase ved hjelp av den vanlige tilnærmingen der tumorceller injiseres via halevenen og antall lungemetastaser som deretter vurderes. Denne metoden gir en klar fordel i forhold til andre tilnærminger, for eksempel å bruke shRNA-er for å slå ned erbB4-uttrykk fordi shRNA-uttrykk ofte blir stille i celler etter en stund. Videre forventes tidlige passasjekulturer å inneholde en blanding av tumoravledede underpopulasjoner, inkludert underpopulasjoner av celler utsatt for metastase. Å utføre metastaseanalyser med celler fremstilt ved hjelp av metoden beskrevet her, vil tillate en vurdering av metastatisk potensial som er mer representativt for foreldretumoren enn en etablert cellelinje. Dette er selvfølgelig bare ett eksempel på fremtidige applikasjoner som kan bruke denne metoden. Vi håper at andre etterforskere vil kombinere denne metoden med problemer av spesiell interesse for å forbedre evnen til å identifisere proteiner som er viktige terapeutiske mål i humane kreftformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), National Cancer Institute (R01 CA122804), Forsvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 og W81XWH-15-1-0193), og The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 og 2015-05-007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
References
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
- Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
- Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
- Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
- Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
- Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
- Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
- Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
- Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
- Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
- Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
- Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
- Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
- Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
- Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
- Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
- Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
- Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
- Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
