Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Definition af genfunktioner i tumorigenese ved Ex vivo Ablation af floxede alleler i maligne perifere nerveskede tumorceller

Published: August 25, 2021 doi: 10.3791/62740
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

Her præsenterer vi en protokol til udførelse af gen knockouts, der er embryonale dødelige in vivo i genetisk manipulerede musemodelafledte tumorer og derefter vurdere den effekt, som knockout har på tumorvækst, proliferation, overlevelse, migration, invasion og transkriptomet in vitro og in vivo.

Abstract

Udviklingen af nye lægemidler, der præcist er målrettet nøgleproteiner i humane kræftformer, ændrer grundlæggende kræftbehandling. Men før disse lægemidler kan anvendes, skal deres målproteiner valideres som terapeutiske mål i specifikke kræfttyper. Denne validering udføres ofte ved at slå genet ud, der koder for det kandidatterapeutiske mål i en genetisk manipuleret mus (GEM) kræftmodel og bestemme, hvilken effekt dette har på tumorvækst. Desværre begrænser tekniske problemer som embryonal dødelighed i konventionelle knockouts og mosaicisme i betingede knockouts ofte denne tilgang. For at overvinde disse begrænsninger blev der udviklet en tilgang til ablating af et floxet embryonalt dødeligt gen af interesse i kortvarige kulturer af maligne perifere nerveskedetumorer (MPNST'er) genereret i en GEM-model.

Dette papir beskriver, hvordan man etablerer en musemodel med den passende genotype, udleder kortvarige tumorkulturer fra disse dyr og derefter ablaterer det floxede embryonale dødelige gen ved hjælp af en adenoviral vektor, der udtrykker Cre-rekombinase og forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP). Oprensning af celler transduceret med adenovirus ved anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og kvantificeringen af de virkninger, som genablation udøver på cellulær proliferation, levedygtighed, transkriptomet og ortotopisk allograftvækst, beskrives derefter. Disse metoder giver en effektiv og generaliserbar tilgang til identifikation og validering af terapeutiske mål in vitro og in vivo. Disse tilgange giver også en vedvarende kilde til tumorafledte celler med lav passage med reducerede in vitro-vækstartefakter . Dette gør det muligt at studere den biologiske rolle af det målrettede gen i forskellige biologiske processer såsom migration, invasion, metastase og intercellulær kommunikation medieret af sekretomet.

Introduction

Før de sidste to årtier var behandlingen af kræft hos mennesker stærkt afhængig af strålebehandling og kemoterapeutiske midler, der bredt målrettede hurtigt prolifererende cellulære populationer ved at beskadige DNA eller hæmme DNA-syntese. Selvom disse tilgange hæmmede kræftcellevækst, havde de også skadelige bivirkninger på normale hurtigt prolifererende celletyper såsom tarmepitelceller og hårfollikelceller. For nylig er kræftbehandling begyndt at anvende kemoterapeutiske midler, der præcist målretter proteiner inden for signalveje, der er kritisk vigtige for væksten af en individuel patients neoplasma. Denne tilgang, der almindeligvis omtales som "Præcisionsmedicin", har ført til udviklingen af et stadigt voksende repertoire af monoklonale antistoffer og små molekylære hæmmere. Disse midler hæmmer effektivt tumorcelleproliferation og overlevelse, samtidig med at man undgår de skadelige bivirkninger på normale celletyper, der ses med konventionelle kemoterapeutiske midler og strålebehandling. Monoklonale antistoffer, der anvendes til behandling af humane kræftformer, er oftest målrettet mod celleoverflademolekyler, såsom vækstfaktorreceptorer1 (f.eks. den store familie af membranspændende receptortyrososinkinaser) og immunresponsmodulatorer2 (f.eks. programmeret celledødsprotein 1, programmeret dødsligand 1). Små molekylære hæmmere kan hæmme enten celleoverfladeproteiner eller signalproteiner, der er placeret intracellulært3. For effektivt at anvende disse nye terapeutiske midler skal det imidlertid fastslås, at en bestemt kræft er afhængig af det molekyle, der målrettes af et kandidatterapeutisk middel.

Selvom disse nye terapeutiske midler har mere fokuserede virkninger, hæmmer mange af dem stadig virkningen af mere end et protein. Derudover er flere midler med varierende effektivitet og specificitet ofte tilgængelige for at målrette mod et specifikt protein. Derfor er det under prækliniske undersøgelser klogt at bruge yderligere tilgange såsom genetisk ablation til at validere et kandidatprotein som et terapeutisk mål. En særlig nyttig tilgang til validering af et protein som et terapeutisk mål er at ablate genet, der koder for kandidatproteinet i en genetisk manipuleret dyremodel, der udvikler den specifikke kræfttype af interesse. Denne tilgang kan være relativt ligetil, hvis mus med en nulmutation (enten en naturlig mutation, en genetisk manipuleret nulmutation [en "knockout"] eller en nulmutation introduceret af en genfælde) er tilgængelige, og musene er levedygtige i voksenalderen. Desværre er mus med en nulmutation, der opfylder disse kriterier, ofte ikke tilgængelige, typisk fordi nulmutationen resulterer i død embryonalt eller i de første dage af postnatalt liv. Under disse omstændigheder kan mus, der er tilbøjelige til at udvikle tumortypen af interesse, i stedet krydses til mus, hvor nøglesegmenter af genet af interesse er flankeret af loxP-steder ("floxed"), som gør det muligt at opløse genet ved at indføre et transgen, der udtrykker Cre-rekombinase i tumorcellerne (en betinget knockout). Denne tilgang giver flere fordele. For det første, hvis der er en Cre-driver tilgængelig, der udtrykkes i tumoren, men ikke i den celletype, der førte til døden i konventionelle knockouts, kan denne tilgang potentielt validere det kandidatterapeutiske mål. For det andet giver ablating af genet, der koder for kandidatproteinet i tumorceller, men ikke i andre intratumorale elementer, såsom tumorassocierede fibroblaster eller immunceller, investigator mulighed for at skelne mellem celleautonome og ikke-celle-autonome virkninger af det terapeutiske mål. Endelig giver en tamoxifen-inducerbar Cre-driver (CreERT2) investigator mulighed for at slette genet af interesse på forskellige stadier i tumorudvikling og definere det vindue, hvor det kandidatterapeutiske middel mest sandsynligt vil være effektivt.

Desværre er der også tekniske problemer, der kan begrænse brugen af betingede knockouts i tumorer, der opstår i GEM-modeller. For eksempel er en Cre-driver, der udtrykkes i tumorceller og undgår gensletning i normale celler, der er afgørende for livet, muligvis ikke tilgængelig. Et andet problem, som kan undervurderes, er, at Cre- og CreERT2-drivere ofte varierer floxede alleler hos mus, hvilket resulterer i mosaik for nulmutationen i en GEM-kræft. Når dette sker, vil tumorceller, hvor det målrettede gen ikke er blevet ablated, fortsætte med at formere sig hurtigt og overgroe tumorcellerne med ablerede alleler. Mosaicisme i Cre-driverlinjer kan forekomme på grund af ikke-allestedsnærværende Cre-udtryk i den målrettede slægt og ved mislykket rekombination i individuelle celler uafhængigt af Cre-ekspression4. Dette er et kendt fænomen af Cre-drivere, der er celletypeafhængige og bør overvejes under eksperimentelt design og datafortolkning. Mosaicisme kan maskere effekten af knockout og få en efterforsker til fejlagtigt at konkludere, at genet af interesse ikke er afgørende for tumorcelleproliferation og / eller overlevelse og derfor ikke er et gyldigt terapeutisk mål.

Flere af disse problemer blev stødt på i en tidligere undersøgelse, der forsøgte at afgøre, om receptor tyrosinkinase erbB4 var et potentielt terapeutisk mål i MPNST-celler5. I disse undersøgelser blev der anvendt mus, der udtrykker et transgen, der koder for neuregulin-1 (NRG1) isoform glial vækstfaktor-β3 (GGFβ3) under kontrol af Schwann-cellespecifik myelinprotein nulpromotor (P 0-GGFβ3 mus). P 0-GGFβ3 mus udvikler flere plexiforme neurofibromer, der udvikler sig til at blive MPNST'er via en proces, der rekapitulerer processerne for neurofibrom patogenese og plexiform neurofibroma-MPNST-progression set hos patienter med autosomal dominant tumorfølsomhed syndrom neurofibromatose type 1 (NF1)6. Når krydset til mus med en Trp53 null mutation, den resulterende P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus udvikler MPNSTs de novo som det ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- mus.

Disse MPNST'er rekapitulerer progressionen fra Verdenssundhedsorganisationens (WHO) klasse II til WHO klasse IV læsioner set hos mennesker7. I P 0-GGFβ3-mus opstår MPNST'er inden for allerede eksisterende plexiforme neurofibromer i trigeminusnerven (58%) og spinal dorsale nerverødder (68%)7; MPNST'erne, der opstår i P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus har en meget lignende fordeling. Hos mennesker opstår MPNST'er oftest i iskiasnerven efterfulgt af brachial plexus, spinal nerverødder, vagus, lårben, median, sacral plexus, popliteal obturator og posterior tibial og ulnar nerver8. Denne tumorfordeling i disse GEM-modeller er noget anderledes end hvad der ses hos mennesker. Imidlertid er MPNST'erne, der opstår i P 0-GGFβ3 og P0-GGFβ3; Trp53+/- mus er histologisk identiske med humane MPNST'er, bærer mange af de samme mutationer, der ses i humane MPNST'er, og rekapitulerer processen med neurofibrom-MPNST-progression set hos NF1-patienter. Dannelsen af P 0-GGFβ3 eller P0-GGFβ3; Trp53+/- mus, der var Erbb4-/- var ikke mulige, da mus med to Erbb4 null alleler dør i utero på embryonal dag 10,5 sekundært til hjertefejl9. Fordi redning af Erbb4-ekspression i hjertet ved at indføre et hjertespecifikt Erbb4-transgen (α-myosin tung kæde (MHC)-Erbb4) resulterer i levedygtige Erbb4-/- mus10, generationen af mus med en kompliceret P 0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotype blev forsøgt.

Parringerne producerede imidlertid ikke mus i de forventede Mendelske forhold, hvilket indikerer, at den ønskede genotype var skadelig. Derfor er dannelsen af P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus med floxede Erbb4-alleler 11 og en CreERT2-driver blev forsøgt at tillade sletning af Erbb4 i MPNST'erne, der opstod i disse mus. I disse dyr var der stadig mange tumorceller med intakte Erbb4-alleler (mosaicisme). Den observerede mosaicisme kunne skyldes ineffektiv tamoxifenlevering, hvilket resulterede i forskelle i rekombinationseffektivitet i vævet. Muligheden for spontane kompenserende mekanismer kan yderligere bidrage til mosaicisme i tamoxifen-medieret rekombination ved at omgå kravet om Erbb4-udtryk. Det er muligt, at tabet af Trp53 gør tumorceller modtagelige for yderligere spontane "tilladende" mutationer, der kan forvirre fortolkningen af dataene. Da det syntes sandsynligt, at de Erbb4-intakte MPNST-celler ville maskere konsekvenserne af at afvaske Erbb4 i andre tumorceller, blev denne tilgang opgivet.

Disse hindringer førte til udviklingen af en metode til ablating Af Erbb4 i meget tidlig passage MPNST-celler ved hjælp af et adenovirus, der udtrykker Cre-rekombinase og eGFP. Disse celler kan adskilles fra ikke-inficerede celler ved hjælp af FACS, hvilket markant reducerer mosaicisme for det ablerede Erbb4-gen . Nedenfor beskrives de metoder, der anvendes til at opnå dette, sammen med de metoder, der anvendes til at vurdere virkningerne af genablation in vitro og in vivo. Følgende protokol er et eksempel på, hvordan man producerer tumorbærende mus, der giver tumorer, der bærer floxede alleler af embryonale dødelige gener af interesse for ex vivo excision inden in vivo allograft tumorvækstvurdering. Dette inkluderer en beskrivelse af de tilgange, der anvendes til at analysere den effekt, som Erbb4-ablation udøver på tumorcelleproliferation, overlevelse og genekspression in vitro og proliferation, overlevelse og angiogenese i ortopiske allotransplantater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Før der udføres procedurer med mus, skal alle procedurer gennemgås og godkendes af Institutional Animal Care and Use Committee. Protokollen beskrevet i dette manuskript blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Medical University of South Carolina. Denne protokol blev udført af korrekt uddannet personale efter MUSC's retningslinjer for institutionel dyrepleje.

1. Generation af mus, der udvikler MPNST'er homozygote til Erbb4 flox alleler

  1. Fremstil F1-generationen af P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ dyr ved parring P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus7 med Erbb4fl/fl mus11. Brug en Punnett-firkant (figur 1) til at styre avlsordningen for at sikre, at der genereres nok mandlige og kvindelige F1-hvalpe med den ønskede P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ genotype.
  2. Genotype F1 afkom ved at isolere genomisk DNA fra en hale snip indsamlet i overensstemmelse med IACUC retningslinjer og derefter udføre PCR ved hjælp af tidligere beskrevne primere til at detektere P 0-GGFβ3 transgene12, Trp53 vildtype (+) og null (-) alleler7 og Erbb4flox og Erbb4 vildtype alleler13.
    1. Isoler hale-DNA ved hjælp af metoder, der er beskrevet på jacks-lab.mit.edu/protocols.
    2. Lav PCR-reaktionsblandingen med 25 ng DNA, 0,25 nM dNTP'er, 0,02 U / μL Taq, 0,5 μM af hver primer og 1x PCR-buffer. Udfør PCR-reaktion med en enkelt 95 ° C inkubation (for at smelte det genomiske DNA og aktivere Taq) i 1 minut efterfulgt af 35 PCR-cyklusser på 94 ° C, 10 s (smeltning); 55 °C, 30 s (udglødning) 72 °C, 40 s (forlængelse) efterfulgt af en enkelt 72 °C (forlængelse) i 5 min. Reaktionerne opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til at køre på en 1,2-1,5 % agarosegel.
      BEMÆRK: Udglødningstemperaturen afhænger af det anvendte PCR-buffersystem; Det anbefales at udføre en udglødningstemperaturgradient for at bestemme den korrekte udglødningstemperatur.
  3. Fremstil F2-generationen af P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl dyr ved parring af det relevante F1-afkom (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) med hinanden.
    BEMÆRK: Figur 1 illustrerer punnet-kvadratforudsigelserne, der bruges til at beregne det forventede antal F2-afkom med den ønskede genotype.
  4. Identificer dyr med den ønskede P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl genotype som beskrevet i trin 1.2.
  5. Mate F2 afkom til hinanden for at opretholde P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl koloni og genotype alle hvalpene. Bekræft, at den nyligt introducerede floxede allel ikke kompromitterer overlevelse eller tumorlatens. Opnå dette ved at etablere kohorter (20 mus / kohorte) af P 0-GGFβ3; Trp53+/- og P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl mus og følg deres overlevelse og hyppighed af tumorforekomst.
  6. Overvåg dyr flere gange om ugen, indtil det eksperimentelle endepunkt er nået (maksimalt tilladt tumorstørrelse/humant endepunkt godkendt af IACUC).
    1. Under den ugentlige overvågning skal du vurdere kropsvægt, normal social og plejeadfærd og tumorstørrelsesmålinger. Arranger for veterinær vurdering i tilfælde af vægttab af >10% af kropsvægten, social afsondrethed og fornemmelse.
    2. Når en tumorbærende mus er identificeret og har nået sit humane endepunkt, aflives dyret humant ved hjælp af indånding af kuldioxid efterfulgt af cervikal dislokation og sterilt fjerner tumoren ved hjælp af en skalpelkniv. Tag tumormålinger ved at måle længde, bredde og dybde ved hjælp af en tykkelse og vægttumor (masse og volumen). Arbejd hurtigt for at undgå autolyse.
  7. Sektion tumoren i tre sektioner ved hjælp af brødbrødstilsnit med en skalpelkniv under sterile forhold for at generere vævssegmenter til formalinfiksering / paraffinindlejring (FFPE), tidlig passagekulturgenerering og flashfrosset materiale (figur 2A).
    1. Sørg for, at afsnit 1 (for tidlig generering af passagekultur, trin 1.7.2) er ca. 10% af det samlede tumorvolumen, afsnit 2 (for fiksering og IHC, trin 1.7.3) er 70% af det samlede tumorvolumen, og afsnit 3 (for flashfrysning, trin 1.7.4) er 20% af det samlede tumorvolumen.
    2. Tag tumorens punkt 1 til fremstilling af tidlige passagekulturer (se nedenfor).
    3. Afsnit 2 af tumoren anbringes i 4 % paraformaldehyd natten over ved 4 °C, og der indlejres derefter i paraffin (formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) til diagnostisk oparbejdning.
    4. Flash-freeze afsnit 3 til analytiske analyser (f.eks. immunblots for at verificere, at protein kodet af det målrettede floxede gen udtrykkes korrekt).
  8. Plet 5 μm tykke FFPE-vævsafsnit med hæmatoxylin og eosin (H&E) for at bekræfte tumordiagnosen af en kvalificeret patolog. Udfør eventuelt immunohistokemisk farvning (IHC) for at bekræfte tumordiagnosen.
    1. Immunostain MPNST'er til S100 calciumbindende protein B (S100β), nestin og kønsbestemmende region Y (SRY)-Box transkriptionsfaktor 10 (Sox10)-tre markører, der udtrykkes i både MPNST'er og Schwann-celler (tumorcelleoprindelse)5,6,14,15. Pletter tumorerne med antistoffer, der genkender erbB4, proteinet kodet af genet målrettet mod ablation i nedstrøms trin.
    2. For at bekræfte diagnosen skal du få en kvalificeret veterinær eller human patolog til at vurdere alle farvede tumordias efter WHO-diagnostiske og klassificeringskriterier 5,6,7,16.

2. Ex vivo ablation af floxede Erbb4 alleler i MPNST celler

  1. Der etableres tidlige passagekulturer fra friskopsamlet MPNST-væv ved at anbringe vævet fra punkt 1 (trin 1.7.3) i 10 ml iskoldt sterilt fosfatbufferet saltvand (PBS) på is og derefter overføre det til et sterilt arbejdsområde (figur 2B)16.
    BEMÆRK: Alle efterfølgende procedurer skal udføres i en steril vævskulturhætte.
  2. Hak tumorvævet i 2-4 mm stykker og triturat 8-10 gange i en 10 cm2 behandlet vævskulturskål med 10 ml vækstmedium. Disse præparater dyrkes i DMEM-10-vækstmedium med højt glucoseindhold (Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) indeholdende 10 % føtalt kalveserum, 1 % glutamin, 10 μg/ml streptomycin og 10 IE/ml penicillin) suppleret med 10 nm neuregulin-1β (NRG1β) og 2 μM forskolin. Tilsæt forskolin på dette stadium for at hæmme væksten af almindelige forurenende celletyper såsom fibroblaster.
  3. Det mekanisk dissocierede væv og celler vedligeholdes i op til 3 dage ved 37 °C i en 5 % CO2 -atmosfære for at etablere en tidlig overgangskultur. Adskil ikke dispergerede celler og resterende vævsfragmenter på dette tidspunkt.
  4. Opdater kulturerne med nyt medium hver 3-4 dage. Lad tumorcellerne formere sig, indtil de er sammenfaldende.
  5. Udvid de tidlige passagekulturer ved at opdele de sammenflydende kulturer i flere retter. Fjern vækstmediet og vask cellerne med 1x dPBS. Derefter tilsættes 1 ml 0,25% trypsin i 2-5 minutter ved stuetemperatur pr. 10 cm2 behandlet cellekulturskål. Triturer forsigtigt kulturen for at lette løsrivelse og generere en enkeltcelle suspension.
    1. Afslut trypsiniseringen ved at tilføje 2 ml DMEM-10 vækstmedium. Den trypsiniserede celleblanding opsamles, og den overføres til et 5 ml sterilt centrifugerør. Pellet cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 500 × g ved stuetemperatur.
    2. Resuspend cellepillen i 5 ml DMEM-10. Opdel cellerne i to til fire 10 cm cellekulturskåle, der hver indeholder 10 ml vækstmedier (ca. 1 × 106 celler pr. Skål).
  6. Efter 5 passager (gentagne trin i 2.5) anvendes vækstmedium uden NRG1β og forskolin. Immunostain en prøve af kulturen med et anti-S100β antistof for at verificere, at kulturen udelukkende består af tumorceller. Vedligehold cellerne i DMEM-10 vækstmedium i alle efterfølgende passager.
  7. Ved den næste passage skal du tælle cellerne og fryse en del af P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler indsamlet fra sammenløbskulturer (3 × 106 celler/hætteglas).
  8. Plade P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl tidlig passage MPNST-celler med en tæthed på 1,5 × 106 celler pr. 10 cm behandlet cellekulturskål i DMEM-10 vækstmedium.
  9.  Dag 0: (Ca. 12-16 timer efter plettering), vask de vedhæftede kulturer med 2-4 ml dPBS og inficer med Ad5CMV-Cre / eGFP eller Ad5CMV-eGFP ved ca. 400 plakdannende enheder (pfu) / celle i 10 ml serumfri DMEM (dvs. 30 μL 2 × 1010 10 pfu virus pr. 10 cm skål). Ablate de floxede Erbb4-alleler ved anvendelse af adenovirus ved den maksimalt tolererede viruskoncentration (multiplikation af infektion, MOI), som bestemt empirisk. Se figur 2C for en skematisk oversigt over arbejdsprocessen for denne ablation.
  10. Dag 1: Ca. 16 timer senere reddes kulturerne ved at tilføje 10 ml DMEM-10 til infektionscocktailen.
  11. Dag 2 - 3: FACS sorterer inficerede celler efter den anbefalede protokol fra kernefaciliteten for at sortere eGFP-positive celler ca. 48 timer efter infektion. Før FACS-sortering skal du kort kontrollere celler for eGFP-signal på et fluorescensmikroskop for at sikre, at kulturerne er blevet effektivt inficeret (~ 50-100% positive celler). Returceller, der er genvundet efter FACS til 10 cm vævskulturskåle; reserver en skål til genomisk DNA-isolering.
  12. Dag 4 - 5: Efter FACS-sortering skal cellerne komme sig i en vævskulturinkubator i mindst 24-48 timer og derefter forberede cellerne til in vitro-cellebaserede analyser eller in vivo-podning . Bekræft Erbb4-deletion via PCR ved hjælp af genomisk DNA isoleret fra en del af de sorterede eGFP-positive celler. Kontroller, at eGFP-positive celler er ErbB4-negative ved PCR eller ved at immunostainere en prøve af kulturen med et anti-erbB4-antistof.
    1. Genomisk DNA isoleres fra cellerne ved anvendelse af standard syre-guanidinium-phenol og chloroformbaseret DNA-isoleringsmetode17.
    2. Udfør standard PCR for at skelne floxede Erbb4-alleler og ablated Erbb4-alleler . Udfør 40 cyklusser med 2 ng DNA, 20 μM primere 1 + 2 for at producere et 250 bp Erbb4-null produkt og et 350 bp floxet produkt13. Udfør både PCR- og antistofbaserede tilgange for at bekræfte knockout, når der ikke er pålidelige antistoffer tilgængelige.
      BEMÆRK: Celler er klar til in vitro cellebaserede assays som beskrevet nedenfor. Mange typer downstream-analyser kan udføres med celler fremstillet på denne måde. Formålet med protokollerne præsenteret nedenfor er at give et par eksempler på in vitro og in vivo anvendelser af disse tumorceller efter ablation af Erbb4 genet.

3. Proliferations- og levedygtighedsassays i MPNST-celler med ablerede Erbb4-alleler

  1. Udfør proliferationsassays i løbet af de næste syv dage på sorterede MPNST-celler belagt i en multiwell-plade ved hjælp af et billedbaseret automatiseret cytometer.
    1. Dag 6: Plade 2.000 celler pr. brønd i et endeligt volumen på 150 μL (~ 13.300 celler / ml) vækstmedium i en 96-brøndplade. Udfør målinger i tre eksemplarer for hver eksperimentel kohorte og 4 daglige endepunktslæsninger (3 replikater x 2 betingelser x 4 dage).
    2. Dage 7, 9, 11, 13: Pletceller med Hoechst- og propidiumiodidfarvestoffer (PI), og afbild dem på en automatiseret pladelæser for at tælle antallet af levende og døde celler i hver brønd. For at opnå dette skal du samtidig plette cellerne med Hoechst-farvestof for at plette kernerne i både levende og døde celler og med propidiumiodid (PI) for at mærke de døde celler. Udfør alle læsninger på samme tid hver dag eller hver anden dag.
      1. Der tilsættes 50 μL af en 4x PI/Hoechst-farvningsopløsning (4 μg/ml hver) til hver brønd, der er kvantificeret den pågældende dag (f.eks. kun dag 7), og der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C i vævskulturinkubatoren. Hold pladen beskyttet mod lys.
        BEMÆRK: Hoechsts farvningskoncentration skal bestemmes empirisk og kan variere fra 1 til 10 μg/ml afhængigt af celletypen.
      2. Aflæs de farvede brønde efter inkubation ved hjælp af den passende fluorescerende kanal på det automatiserede cellebillede. Efter læsning skal du returnere pladen til inkubatoren for fremtidige læsninger på efterfølgende dage (dvs. dag 9, 11, 13).
      3. Kvantificer farvningsintensiteten baseret på det anvendte billeddannelsessystem, og beregn antallet af døde celler, levende celler og samlede celler ved hjælp af følgende indstillinger: blå kanal (377/50 nm, Hoechst): samlede celler (levende og døde); rød kanal (531/40 nm, PI): kun døde celler; blå - rød (total - død) = levende celler.
  2. Udfør cellelevedygtighedsassayet over tre dage, hvis det ønskes, efter analyseproducenternes protokol.
    BEMÆRK: Levedygtighedsassays kan kombineres med proliferationsassays ved at udføre en tredobbelt plet inklusive calcein AM (488/32 nm; grøn kanal, specifikt etiketter levende celler), PI og Hoechst. Et apoptoseassay kan også udføres ved hjælp af kulturer oprettet som beskrevet ovenfor; den specifikke protokol afhænger af billedbehandlingssystemet.
    1. Dag 6: Plade 4.000 celler pr. brønd i et endeligt volumen på 150 μL i en 96-brøndplade i tre eksemplarer.
    2. Dage 7 - 9: Tilsæt 2.000x bioluminescerende cellelevedygtighedsassayreagenser (materialetabel), returner pladen til inkubatoren, og aflæs pladen 1 time senere. Udfør efterfølgende læsninger på samme tid hver dag. For bioluminescens (MTT) assays udføres assayet nøjagtigt som beskrevet i producentens instruktioner hver 24. time i 72 timer ved hjælp af en luminometerpladelæser.

4. RNA-Seq analyser og identifikation af gener, hvis ekspression ændres af Erbb4 tab

  1. Dag 6: Isoler total RNA fra sorterede MPNST-celler ved hjælp af standard syre-guanidinium-phenol og chloroformbaserede metoder. For eksperimenter designet til at detektere ændringer i mRNA-niveauer mellem to kohorter skal du forberede total RNA fra mindst tre biologiske replikater i hver kohorte.
    1. For at eliminere begivenheder forårsaget af den adenovirale vektor eller eGFP-ekspression snarere end Erbb4-tab, isoler RNA fra tre biologiske replikater af P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler transduceret med Ad5CMV-Cre/eGFP og tre biologiske replikater transduceret med Ad5CMV-eGFP.
      BEMÆRK: Isoleret RNA skal have en RNA-integritetsnummer (RIN) score ≥ 8 til RNA-Seq-analyse. Sørg for, at sekventeringskernen bestemmer RIN'et for alle prøver, før der konstrueres biblioteker.
  2. Brug 100-200 ng total RNA af høj kvalitet fra hver prøve til at forberede RNA-Seq-biblioteker (arbejde med kernesekventeringsfaciliteten til dette trin). Udfør high-throughput sekventering ved hjælp af en næste generations DNA-sequencer. Til mRNA-kvantificering skal du udføre single-ended sekventering for at generere Fastq-filer. Sørg for mindst 50 millioner læsninger for hver prøve.
    BEMÆRK: Se figur 3 for en skematisk illustration af den arbejdsgang, der bruges til at behandle RNA-Seq-data og til at kvantificere ekspressionen af differentielt udtrykte transkripter. Sekvensdata i form af Fastq-filer underkastes kvalitetskontrolprocedurer; >80% af læsningerne skal give en phred score på 30 for at blive anset for passende til efterfølgende analyse. Sekvenserne forbehandles (trimmes) også ved hjælp af Trimmomatic18 for at fjerne adaptersekvenser og filtrere læsninger af lav kvalitet.
  3. Udfør RNA-Seq-justering og analyse på de fastq-genererede filer ved hjælp af et hvilket som helst kompatibelt softwareprogram (f.eks. DNAStar19,20 eller Partek21). Følg de programspecifikke trin ved hjælp af standardindstillingerne for at justere fastq-filerne til musens referencegenom (GRCm38/mm10).
    BEMÆRK: Ved at bruge DNAStar som eksempel er den generelle arbejdsgang beskrevet nedenfor (supplerende figur 1).
    1. Vælg analysemetoden, RNA-Seq.
    2. Vælg referencegenomet Mus.
    3. Upload BED-filen, hvis den leveres af sekventeringskernen.
    4. Upload fastq-sekventeringsfilerne, og tildel dem unikke replikatnavne.
    5. Gruppier fastq-filerne og udpeg dem til et replikatsæt (dvs. GFP, CRE)
      BEMÆRK: Hvert justeringsprogram har sine specifikke trin, og brugeren skal konsultere programmets brugervejledning til den programspecifikke protokol. Programmet genererer derefter genspecifikke rådtællingsdata fra disse Fastq-filer.
  4. Udfør statistisk og normaliseringsanalyse (DESeq2, EdgeR) på rådtællingsdata ved hjælp af alle kompatible softwareprogrammer, som beskrevet i 4.3, med Ad5CMV-eGFP-prøvesættet som kontroldatasæt og Ad5CMV-Cre-sæt som testdatasæt til identifikation af differentielle genekspressionssignaler med robust statistisk effekt22,23.
    1. Vælg GFP fastq-filer som kontroldatasæt.
    2. Vælg DESeq2 som statistisk og normaliseringsmetode .
    3. Start montering og analyse.
      BEMÆRK: Hvert justeringsprogram har sine specifikke trin, og brugeren skal konsultere programmets brugervejledning til den programspecifikke protokol. Programmet genererer derefter genspecifikke rådtællingsdata fra disse Fastq-filer. Den statistiske og normaliseringsanalyse er et indbygget trin i mange programmer, som vist i eksemplet her, inden for sekvensjusteringsprotokollen. Hvis der anvendes et alternativt sekvensjusteringssoftwareprogram, der ikke tilbyder dette efterfølgende indbyggede trin, skal du udføre den statistiske og normaliseringsanalyse på de råtællingsdata på terminalniveau ved hjælp af DESeq2- eller EdgeR-kodningspakkerne skrevet i R, frit tilgængelige til download på Bioconductor.org.
  5. Brug disse metoder til at identificere ændringer, der repræsenterer mindst 1,5 gange stigning eller fald i forhold til kontrolelementet (i dette tilfælde celler transduceret med Ad5CMV-eGFP-virus). Brug kun de differentielt udtrykte gener (DEG'er), der er bestemt til at være statistisk signifikante, der viser ≥1,5 gange ændringer og en p-værdi 0,05 eller en padj på 0,1 til efterfølgende funktionel berigelsesanalyse.
    BEMÆRK: Dette vil generere en liste over DEG-gener og deres statistiske kraft til funktionel berigelsesanalyse.
  6. Udfør funktionel berigelsesanalyse på statistisk signifikant Erbb4-medieret DEG identificeret i 4.4 med en rangeret genlistefil ved hjælp af et af de frit tilgængelige webbaserede værktøjer. Bestem biologisk og vejbetydning af Erbb4-gentab gennem genontologiske datasæt integreret i disse open-access funktionelle berigelsesanalyseværktøjer 24,25,26,27 (se materialetabellen for eksempler og figur 3 for et eksempel på arbejdsgang ved hjælp af Panther).
    1. Eksporter de data, der er hentet i trin 4.4, som et regneark.
    2. Ranger dataene efter log2 foldændring, p /padj-værdi eller begge dele.
    3. Sørg for at fjerne alle ikke-statistisk signifikante data.
    4. Eksporter den rangerede genliste med gen-id kun som en .txt fil og upload den til hjemmesiden.
      BEMÆRK: Brug kun statistisk signifikant DEG (p/padj-værdier < henholdsvis 0,05 eller 0,1) til at generere en rangeret inputgenliste ved hjælp af log2 foldændringer (højeste til laveste), p/padj-værdier (laveste til højeste) eller begge [(-log10(pval)*tegn(log2FC)]. Der er flere tilgange til at generere en rangeret genliste og bestemmes empirisk for datasættet og det spørgsmål, der stilles. Den specifikke type funktionel berigelsesanalyseværktøj, der bruges, kan også hjælpe med at bestemme den passende type ranggenliste. For yderligere ressourcer om RNA-Seq, se følgende papirer 28,29,30.

5. Ortopisk allogpodning af MPNST-celler med ablerede Erbb4-alleler og analyse af virkningerne af Erbb4-ablation

  1. Før du udfører ortopisk allografting af sorterede MPNST-celler, skal du sikre dig, at alle procedurer gennemgås og godkendes af Institutional Animal Care and Use Committee, og at alle procedurer udføres af korrekt uddannet personale.
  2. På injektionsdagen fjernes celler med lav passage (ca. 85% sammenløb) fra cellekulturplader eller kolber ved hjælp af en ikke-enzymatisk celledissociationsopløsning (f.eks. En blanding af chelatatorer; se materialetabellen) og tælle cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Ved ortotopiske injektioner i iskiasnerven rekonstitueres cellerne ved 16.667 celler/ml (50.000 celler pr. 3 μL for hvert dyr) i DMEM-1031. Hold cellerne på is.
    BEMÆRK: Nogle kulturer vil ikke med succes etablere transplantater, medmindre cellerne injiceres i lavvækstfaktor kældermembranmatrix. Kravet til en kældermembranmatrix (10-50%) skal bestemmes empirisk.
  3. Vurder in vivo allograft vækstpotentiale i postinficerede celler ved at injicere MPNST-celler i iskiasnerven i 8-10 bedøvede Hsd: Athymic Nude-Foxn1nu mus pr. Kohorte (i alderen 4-8 uger). For ortopisk injektion af tumorceller henvises til Turk et al31. Her demonstreres en subkutan injektion.
    BEMÆRK: For at bestemme antallet af forsøgsdyr, der er nødvendige for statistisk signifikans, skal du kontakte en biostatistiker, eller det anbefales at bruge G * Power3, en frit tilgængelig software32.
  4. Overvåg dyrene nøje to gange dagligt i den første uge efter injektionen for tegn på smerte. Derefter skal du overvåge de podede mus tre gange om ugen for kalibermålinger og vurdere kropstilstandsresultater (BCS'er) som tidligere beskrevet 5,31. Som beskrevet i IACUC-retningslinjerne skal du aflive dyr med en BCS på 2 eller mindre.
  5. Da podede celler vokser med forskellige hastigheder, skal du bestemme transplantattider empirisk ved hjælp af kontrolceller (umodificerede), før du udfører eksperimenter beskrevet i dette afsnit. For at indsamle transplantaterne ved det eksperimentelle endepunkt skal musene aflives humant ved hjælp af indånding af kuldioxid efterfulgt af cervikal dislokation som en sekundær foranstaltning. Registrer de endelige volumen- og massemålinger af hvert transplantat.
    BEMÆRK: Som umodificeret P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl MPNST-celler når typisk den maksimale størrelse, der er tilladt af IACUC inden for 30-45 dage, en typisk tidslinje er omkring 30-45 dage efter injektion.
  6. Isoler og sektionsvæv som beskrevet i trin 1.6-1.8. Fastgør en del af transplantatvævet natten over i 4% paraformaldehyd (figur 2) og integrer det derefter i paraffin. Forbered 5 μm sektioner fra FFPE-vævet og monter dem på dias. H&E-farvning og anden nødvendig immunstaining udføres for at bekræfte, at transplantatvævet består af tumorceller som beskrevet i punkt 1.8.1. Snap-frys resten af tumorvævet til downstream-analyser, såsom validering af tabet af Erbb4-ekspression og vurdering af virkningerne af Erbb4-tab på ekspressionen af andre Erbb-familiemedlemmer .
    BEMÆRK: Bekræftelse af tumorceller i transplantatvævet skal ske, fordi immundefekte mus er tilbøjelige til at udvikle neoplasmer. I tilfælde af små transplantater er det vigtigt at sikre, at arvæv eller betændelse ikke forveksles med en neoplasma.
    1. Udfør standard IHC-farvning på FFPE-vævet for at sammenligne ekspressionen af proteiner af interesse i allotransplantater dyrket af Ad5CMV-eGFP og Ad5CMV-Cre / eGFP-behandlede celler. Pletter det udskårne transplantatvæv ved hjælp af erbB4-specifikke antistoffer for at bekræfte forskelle i in vivo erbB4-ekspression mellem de to eksperimentelle tilstande. Bestem det proliferative indeks via Ki67-farvning og niveauet af apoptose via terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-end-mærkning (TUNEL) farvning.
      BEMÆRK: Ethvert proteinmål af interesse kan også vurderes via IHC. Vurder for eksempel vaskulær densitet ved immunostaining allotransplantater med et anti-CD31-antistof (1:50 fortynding) for at bestemme in vivo vaskulære mikromiljøforskelle medieret ved genablation. Antallet af vaskulære profiler pr. 40x felt kan tælles til kvantificering. For disse IHC-baserede assays skal du følge standard IHC-protokoller for farvningsprocedurerne og producentens protokol for TUNEL-farvning. Til kvantificering af billeder skal du bruge ImageJ-plug-in'en "automatiseret optælling af enkeltfarvet billede."

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 illustrerer et typisk resultat opnået ved transducering af P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-celler med enten Ad5CMV-eGFP adenovirus eller Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus (figur 4A). Kulturer ses med fluorescensmikroskopi for at identificere eGFP-ekspressive celler og ved fasekontrastmikroskopi for at bestemme det samlede antal celler, der er til stede i samme felt ved 10x (øverst) og 40x (nederst). Procentdelen af celler, der udtrykker eGFP, kan derefter beregnes, hvis det ønskes. Repræsentative FACS-outputdata er vist i supplerende figur S2. Efter FACS øges procentdelen af eGFP-ekspressive celler markant, hvor stort set alle cellerne i hvert felt udtrykker eGFP. Typiske PCR-genotypningsresultater, der forventes efter Cre-medieret genablation, afhængigt af transfektionseffektiviteten, er komplet gen knockout (100% effektivitet) eller en heterogen population af inducerede og uinducerede celler (<100% effektivitet) sammenlignet med kontroltransduktionsresultater (kun GFP, fl / fl) (figur 4B). Figur 4C illustrerer den karakteristiske histopatologi, der findes i ortotopiske allotransplantater af P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST'er sammenlignet med tumorerne afledt af de originale GEM-dyremodeller.

I disse eksperimenter resulterede Erbb4-ablation i fald i cellulær proliferation og cellulær densitet in vitro og in vivo, stigninger i TUNEL-mærkningsindekser in vivo og nedsat vaskulær densitet in vivo. Figur 5 illustrerer repræsentative resultater opnået med et billedbaseret automatiseret cytometer, der viser nedsat cellulær proliferation i Ad5CMV-Cre-ablerede celler vs. kontrol Ad5CMV-GFP transducerede celler (figur 5A); disse eksperimenter blev udført med tidlige passage dyrkede celler. Ekspression af ErbB4 via immunhistokemi i P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler transduceret med Ad5CMV-Cre- eller eGFP-virus blev nedsat i de resulterende Ad5CMV-Cre-transducerede allotranstrates sammenlignet med kontrol Ad5CMV-eGFP-behandlede allotransplanttumorer (figur 5B). Vaskulær densitet blev vurderet via immunreaktivitetsdetektion for CD31; vaskulær tæthed kan ses at være markant reduceret i allotransplantater af Ad5CMV-Cre transducerede celler (figur 5C). Signalintensitet kan kvantificeres, hvis det ønskes, ved hjælp af ImageJ.

Figure 1
Figur 1: Punnet kvadrat beregninger af forholdet mellem forventede genotyper ved generering og krydsning af P 0-GGFβ3; Trp53+/- mus med Erbb4fl/fl mus (F1). Punnet kvadrat beregninger af forholdet mellem forventede genotyper ved generering og vedligeholdelse af P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+ med hinanden (F2). Forkortelse: fl = Floxed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgang for den proces, der anvendes til at ablate floxede Erbb4-alleler i tidlige passagekulturer af MPNST-celler afledt af P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl mus. (A) Høst tumoren, der udtrykker det floxede gen. (B) Opret tidlige passagekulturer fra den udskårne tumor. (C) Inficere tidlige passagekulturer for at ablate det floxede gen og udføre nedstrøms assays. Forkortelser: MPNST = malign perifer nerveskede tumor; IHC = Immunhistokemi; PFA = Paraformaldehyd; FFPE = Formalinfikseret paraffin-indlejret; H&E = Hæmatoxylin og eosin; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; GFP = grønt fluorescerende protein; K/O = knockout; PCR = polymerasekædereaktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematisk illustration af RNA-Seq-arbejdsgangen. Arbejdsgangen bruges til at identificere differentielt udtrykte transkripter mellem kontrolceller (GFP-induceret) og Erbb4-null (Cre-induceret) celler og den resulterende biologiske betydning. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; RNA-Seq = RNA-sekventering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative transduktionseffektivitetsresultater vurderet ved mikroskopi i P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-celler. (A) Celler transduceret med enten Ad5CMV-eGFP adenovirus eller Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus. (B) PCR-resultater af potentielle genpopulationer efter Ad5CMV-infektion. (C) Karakteristisk histopatologi, der sammenligner de tumorer, der genereres i de oprindelige GEM-modeller, med den ortopisk allografterede P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-celler via H&E-farvning. Billeder blev taget på 40x. Isotype-matchede negative kontrolantistoffer blev anvendt til kontrolfarvning. Skalastænger = 400 μm (A, øverste panel); 100 μm (A, nederste panel), 20 μm (C). Forkortelser: MPNST = malign perifer nerveskede tumor; GFP = grønt fluorescerende protein; BF = lysfelt; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; Neg Ctrl = negativ kontrol; PCR = polymerasekædereaktion; GEM = genetisk manipuleret mus; fl = floxet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative resultater opnået i dyrkede MPNST tidlige passagekulturer og ortopisk allografterede MPNST-celler efter transduktion med enten Ad5CMV-eGFP eller Ad5CMV-Cre/eGFP. (A) Proliferationsassay af dyrkede MPNST-celler, der viser nedsat cellulær tæthed i celler transduceret med Ad5CMV-Cre/eGFP sammenlignet med dem, der transduceres med Ad5CMV-eGFP. Kvantificerede data er graferet på dag 1, 3 og 5 (venstre). Dag 1 og dag 5 sammenløbsbilleder taget på det billedbaserede automatiske cytometer vises til højre (Billeder taget ved 4x forstørrelse med brightfield mikroskopi). Fejllinjer repræsenterer standardfejlen i middelværdien (SEM) af mindst 3 forskellige uafhængige eksperimenter. (B) Repræsentativ ErbB4-farvning i allografttumorer transduceret med Ad5CMV-eGFP eller Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus taget ved 20x forstørrelse. Rød kanal (Alexa 564, CD31), blå kanal (Hoechst, kerner). (C) Repræsentative billeder af vaskulær tæthed i allotransplantater af P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-celler transduceret med Ad5CMV-eGFP versus Ad5CMV-Cre/eGFP-virus. Billeder blev taget på 40x. Isotype-matchede negative kontrolantistoffer blev anvendt til kontrolfarvning. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: MPNST = malign perifer nerveskede tumor; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; IgG = immunglobulin G; NEG = negativ kontrol; CD = klynge af differentiering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Skematisk illustration af en sekvensjusterings- og analysearbejdsgang. Arbejdsgangen, der bruges i DNAStar til at justere og analysere RNA-sekventeringsfiler (fastq-filer). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; RNA-Seq = RNA-sekventering., DEG = differentielt udtrykte gener. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Repræsentative FACS-data fra tidlige passagekulturer ved hjælp af grønt fluorescerende protein. (A) GFP-ekspressive celler sorteres efter FACS efter indstilling af fluorescerende gateparametre fra ikke-inficerede celler. (B) Når den relevante detektionsport er indstillet, adskilles GFP-positive (transducerede) celler fra GFP-negative (ikke-transducerede) celler. Forkortelser: SSC-A = sidespredningsområde af top; FSC-H = fremadgående spredningshøjde af top; FSC-W = fremadgående spredningsbredde af toppen; GFP = grønt fluorescerende protein; FACS = Fluorescensaktiveret cellesortering. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De detaljerede metoder, der præsenteres her, blev udviklet ved hjælp af en GEM-model af MPNST'er. Men hvis tumorvævet af interesse kan spredes i individuelle celler, kan disse metoder let tilpasses til forskellige tumortyper, der opstår i GEM'er. Det er vigtigt at sikre, at den floxede allel ikke resulterer i i) nedsat overlevelse, der kan gøre det vanskeligt at få tilstrækkelige mus til at screene for tumorer, eller ii) øget tumorlatens, der kan gøre det vanskeligt at opnå nok tumorbærende mus. Hvis den floxede allel ikke påvirker overlevelsen, vil overlevelsen af begge kohorter være ækvivalent. Hvis det ikke har nogen effekt på tumorlatens, bør der opstå tilsvarende antal tumorbærende mus i begge kohorter med et lignende tidsforløb.

Lignende tilgange er blevet brugt til at studere neurofibromer og MPNST'er ved hjælp af betingede knockouts og tamoxifen-inducerbare Cre-dyr for at generere inducerbare betingede knockout-dyr33,34. Forskellen mellem disse undersøgelser og denne, bortset fra brugen af tamoxifen til Cre-induktion som tidligere diskuteret, er, at disse undersøgelser fokuserer på tumorudvikling med en vævsspecifik knockout af NF1. Da denne undersøgelse og disse andre undersøgelser også bruger GEMM-genererede tumorer, ligger forskellen i det spørgsmål, der stilles. I denne protokol studerer vi ikke den rolle, som NF1-tab spiller i MPNST-patogenese, men studerer i stedet den rolle, som et specifikt gen (Erbb4) i GEMM-genererede MPNST'er udøver på in vivo tumorvækst, hvilket ellers ville være umuligt på grund af at være embryonal dødelig. Desuden undgår denne protokol brugen af tamoxifen til de tilgange, der kræver sådanne parametre.

Andre har studeret etablerede humane MPNST-cellelinjer i xenograftmodeller35. Denne undersøgelse adskiller sig fra denne ved, at de anvendte podede celler er velundersøgte, men humane MPNST-cellelinjer med høj passage, og den fokuserer på at etablere lægemiddelresponser i xenotransplantater. Disse forskere studerer ikke rollen som et specifikt gen i disse MPNST-celler for in vivo-vækst og virkningerne af gentab på lægemiddelrespons. En anden undersøgelse svarende til denne blev udført af Dodd et al., ved hjælp af adenovirus Cre rekombinase (Ad-Cre) -medieret NF1-tab på en tidsmæssig og rumlig afhængig måde, igen en kraftfuld metode til udvidelse af MPNST translationel indsats36. Undersøgelsen fokuserede på rollen som NF1 og Ink4a / ARF-tab, to meget almindeligt co-slettede gener i humane MPNST'er, i iskiasnerven ved Ad-Cre-injektion. P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl mus beskrevet i denne undersøgelse kunne anvendes på denne måde ved at injicere Ad-Cre i Schwann celle forløbere slægter. De spørgsmål, der stilles i denne undersøgelse, er imidlertid ikke fokuseret på Erbb4's evolutionære rolle på MPNST-initiering, men på hvordan MPNST'er kan kapre Erbb4-signalering til fordel for tumorvækst.

Der er alternativer til den tilgang, der er beskrevet her, herunder at slå genekspression ned via RNA-interferens (RNAi) eller inaktivere genet af interesse med CRISPR i humane kræftcellelinjer. Disse alternative tilgange er værdifulde og kan samarbejdes med genablation i celler afledt af GEM-tumorer for at verificere, at de virkninger, der observeres i musetumorceller, rekapituleres i deres humane modstykker. Der er dog nogle klare fordele ved den metode, der er beskrevet her. For det første er genetisk ablating floxede gener i GEM-kræftceller hurtig og producerer fuldstændig inaktivering af det målrettede gen. I modsætning hertil observeres det ofte, at brugen af korte hårnåle RNA'er kun resulterer i en delvis knockdown af genekspression. Selvom CRISPR kan producere fuldstændig geninaktivering, kræver identifikation af kloner, der har fuldstændig inaktivering, en langvarig udvælgelsesproces.

Desuden skal flere kloner undersøges for at sikre, at virkningerne af CRISPR-ablation ikke adskiller sig mellem forskellige kloner. For det andet er evnen til at ablate floxede alleler i tidlig passage GEM-tumorkulturer fordelagtig, da dette minimerer muligheden for at vælge forskellige tumorcelleunderpopulationer, der vokser effektivt i kultur. Til sammenligning er humane cellelinjer, som typisk er blevet opretholdt i kultur i årevis, ofte afledt af forskellige underpopulationer, der er velegnede til kultur og ofte gennemgår genetisk drift under denne proces. Dette resulterer i, at disse cellelinjer udvikler nye mutationer, der ikke var til stede i deres modertumor. Endelig, selvom podning af GEM-tumorceller i immundefekte mus er beskrevet i dette manuskript, bemærkes det, at GEM-tumorceller afledt af tumorer, der opstår i indavlede musestammer, kan allografteres til mus af samme stamme. Dette ville gøre det muligt for forskeren at vurdere tumorbiologi hos dyr med et intakt immunsystem i nærvær eller fravær af det målrettede gen.

Det kritiske trin i protokollen beskrevet her er ablationen af det floxede gen med Ad5CMV-Cre / eGFP og sikring af tumorcellernes overlevelse efter genablation og FACS. Da dette er en proces, der er afhængig af Cre-rekombinasens evne til at ablatere det floxede gen, er det potentielt underlagt nogle af de samme problemer, der kan opstå ved ablating af et floxet gen in vivo; disse spørgsmål ville manifestere sig som en ufuldstændig ablation af den målrettede allel. Bemærk, at evnen til at rense celler, der med succes er blevet transduceret med den eGFP-ekspressive adenovirale vektor, ser ud til at minimere mosaicisme sammenlignet med in vivo-genablation med CreERT2. I tilfælde af målrettede gener, der koder for proteiner, såsom ErbB4, der udtrykkes på celleoverfladen, kan det imidlertid være muligt yderligere at sikre tabet af det målrettede gen ved at udføre FACS ved hjælp af både eGFP og et antistof, der genkender proteinet af interesse (dvs. sortere de eGFP-positive / erbB4-negative celler).

Fordi, som det blev bemærket i indledningen, mange af de proteiner, der er målrettet terapeutisk af monoklonale antistoffer, er celleoverfladeproteiner, bør denne tilgang ofte være mulig. Det skal også bemærkes, at det er vigtigt at lade tumorcellerne komme sig i mindst 2-3 dage efter FACS, hvis RNA-Seq skal udføres på dem for at vurdere den effekt, som genablation har haft på transkriptomet. RNA-Seq datasæt opnået meget kort efter FACS viser ofte mere variation i genekspression mellem biologiske replikater i nogle celletyper. Dette kan være en konsekvens af det traume, som celler lider under, når de går gennem FACS; derfor skal cellerne have en restitutionsperiode efter denne proces. RNA-Seq datasæt kan analyseres ved hjælp af DESeq2, som bruger den negative binomiale fordeling og en krympningsestimator for fordelingens varians. I disse analyser sorteres prøver efter deres q-værdi, som er den mindste falske opdagelseshastighed (FDR), hvor ændringer i transkriptionsniveauer er signifikante; FDR'er beregnes ved hjælp af Benjamini-Hochberg multiple testjusteringsproceduren. Alternativt kan DEG'er identificeres ved hjælp af anden tilgængelig software, der er i stand til RNA-Seq-analysearbejdsgange.

For denne MPNST-dyremodel kræver identifikation af det eksperimentelle endepunkt en forståelse af den naturlige historie af neoplasmerne i den dyremodel, der anvendes. MPNST'ernes naturlige historie i denne GEM blev bestemt ved at følge overlevelsen af en serie på 44 P 0-GGFβ3 mus6 og 19 P0-GGFβ3; Trp53+/- mus7 og derefter udføre komplette obduktioner på alle disse dyr, når de nåede deres overlevelsesendepunkt. De typiske overlevelsestider og det sted, hvor MPNST'er typisk opstod, blev bestemt i hver dyremodel. I de fleste af disse mus opstod MPNST'er i trigeminusnerven. MPNST'er, der opstod i trigeminusnerven, producerede typisk ptose forbundet med hornhindeskyhed (et resultat af problemer med tårefordeling produceret af ptosis), hvilket gav et klinisk nyttigt tegn til at identificere tumorbærende mus. Tumordiagnose bør bekræftes ved at udføre H&E-pletter og flere yderligere diagnostiske pletter (S100β, nestin Sox 10, H&E, Mart1) efterfulgt af en undersøgelse foretaget af en kvalificeret veterinær eller human patolog. Dette er også vigtigt, fordi Trp53 null allel i denne model prædisponerer musene for udviklingen af andre neoplasmer såsom lymfomer, og disse tumorer skal skelnes fra MPNST'er.

Endelig har denne metode flere potentielle anvendelser, der endnu ikke er undersøgt, men som kan være mulige i fremtidige undersøgelser. For eksempel fremmer neuregulin 1 (NRG1), liganden, der aktiverer både erbB3 og erbB4, migrationen af MPNST-celler på en kemotaktisk måde; både erbB3 og erbB4 er placeret i invadopodia af MPNST-celler37. Det er imidlertid ikke klart, om erbB3 eller erbB4 formidler det kemotaktiske svar på NRG1. Derfor kan celler, hvor erbB4 er ablated med denne metode, bruges til at løse dette spørgsmål. En naturlig opfølgning på disse eksperimenter er at vurdere, om erbB4 er nødvendig for metastase ved hjælp af den almindeligt anvendte tilgang, hvor tumorceller injiceres via halevenen, og antallet af lungemetastaser derefter vurderes. Denne metode giver en klar fordel i forhold til andre tilgange, såsom at bruge shRNA'er til at slå erbB4-ekspression ned, fordi shRNA-ekspression ofte dæmpes i celler efter et stykke tid. Endvidere forventes tidlige passagekulturer at indeholde en blanding af tumorafledte subpopulationer, herunder underpopulationer af celler, der er tilbøjelige til metastase. Udførelse af metastaseassays med celler fremstillet ved hjælp af den metode, der er beskrevet her, vil muliggøre en vurdering af metastatisk potentiale, der er mere repræsentativt for modertumoren end en etableret cellelinje. Dette er selvfølgelig kun et eksempel på de fremtidige applikationer, der kunne bruge denne metode. Vi håber, at andre forskere vil kombinere denne metode med problemer af særlig interesse for at forbedre evnen til at identificere proteiner, der er vigtige terapeutiske mål i humane kræftformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), National Cancer Institute (R01 CA122804), Forsvarsministeriet (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 og W81XWH-15-1-0193) og The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 og 2015-05-007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ad5CMV-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody Thermo/Fisher GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics Bioconductor http://www.bioconductor.org alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31 Abcam ab28364
Celigo Image Cytometer Nexcelom Bioscience N/A
Cell Stripper Corning 25-056-Cl mixture of chelators
DAB staining kit Vector Labs MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) DAVID https://david.ncifcrf.gov functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM Corning 15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) Thermo/Fisher EP0701 and K1072
erbB4 antibodies Santa Cruz sc-284
erbB4 antibodies Abcam ab35374
erbB4 antibodies Millipore HFR1: 05-1133
FACS Sorter BD Biosciences Aria II
Forskolin Sigma F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources GenomeSpace https://genomespace.org/support/tools/ general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine Corning 25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool Gorilla N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis Broad Institute N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice Envigo (Previously Harlan Labs) 69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) Illumina Hi Seq 2500 DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis DNAStar LaserGene software N/A software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly software alignment used for step 4.3 N/A software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix Corning 354230
NRG1-beta In house Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342 Thermo 62249
Panther Gene Ontology Classification System Panther http://pantherdb.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer) Partek, Ver 7 N/A software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep Corning 30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

 Eurofins Genomics Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine Fisher 51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays R&D Systems ARY003B
Real time glo Promega G9712 bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite ToppGene https://toppgene.cchmc.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) Invitrogen 15596026
Tyramide Signal Amplification Kit Perkin Elmer NEL721001EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
  2. Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
  3. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
  4. Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
  5. Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
  6. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  7. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
  8. Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
  9. Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
  10. Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
  11. Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
  12. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  13. Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
  14. Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
  15. Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
  16. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  17. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  18. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  19. Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
  20. Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
  21. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  23. Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
  24. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  25. Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
  26. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  27. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  28. Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
  29. Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
  30. Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
  31. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
  32. Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
  33. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  34. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
  35. Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
  36. Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
  37. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).

Tags

Kræftforskning udgave 174 Genetisk modificerede mus sarkom cre-ekspressiv adenovirus flowcytometri overlevelsesassays proliferationsassays xenografting RNA-Seq embryonal dødelig knockout
Definition af genfunktioner i tumorigenese ved <em>Ex vivo</em> Ablation af floxede alleler i maligne perifere nerveskede tumorceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Longo, J. F., Brosius, S. N.,… More

Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells. J. Vis. Exp. (174), e62740, doi:10.3791/62740 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter