Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Het definiëren van genfuncties in tumorigenese door ex vivo ablatie van gevlochten allelen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumorcellen

Published: August 25, 2021 doi: 10.3791/62740
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van gen knock-outs die embryonaal dodelijk zijn in vivo in genetisch gemanipuleerde muismodel-afgeleide tumoren en vervolgens het effect beoordelen dat de knock-out heeft op tumorgroei, proliferatie, overleving, migratie, invasie en het transcriptoom in vitro en in vivo.

Abstract

De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen die zich precies richten op belangrijke eiwitten in menselijke kankers, verandert fundamenteel de kankertherapieën. Voordat deze geneesmiddelen echter kunnen worden gebruikt, moeten hun doeleiwitten worden gevalideerd als therapeutische doelen in specifieke kankertypen. Deze validatie wordt vaak uitgevoerd door het gen dat codeert voor het kandidaat-therapeutische doelwit uit te schakelen in een genetisch gemanipuleerd muismodel (GEM) van kanker en te bepalen welk effect dit heeft op tumorgroei. Helaas beperken technische problemen zoals embryonale letaliteit in conventionele knock-outs en mozaïcisme in voorwaardelijke knock-outs deze aanpak vaak. Om deze beperkingen te overwinnen, werd een benadering ontwikkeld voor het aborteren van een gevlokt embryonaal dodelijk gen van belang in kortetermijnculturen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST's) gegenereerd in een GEM-model.

Dit artikel beschrijft hoe een muismodel met het juiste genotype kan worden vastgesteld, tumorculturen op korte termijn van deze dieren kunnen worden afgeleid en vervolgens het gevloste embryonale letale gen kan worden afgezwakt met behulp van een adenovirale vector die Cre-recombinase en verbeterd groen fluorescerend eiwit (eGFP) tot expressie brengt. Zuivering van cellen getransduceerd met adenovirus met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en de kwantificering van de effecten die genablatie uitoefent op cellulaire proliferatie, levensvatbaarheid, het transcriptoom en orthotopische allograftgroei wordt vervolgens gedetailleerd beschreven. Deze methodologieën bieden een effectieve en generaliseerbare benadering voor het identificeren en valideren van therapeutische doelen in vitro en in vivo. Deze benaderingen bieden ook een hernieuwbare bron van tumor-afgeleide cellen met een lage passage met verminderde in vitro groeiartefacten. Hierdoor kan de biologische rol van het beoogde gen worden bestudeerd in diverse biologische processen zoals migratie, invasie, metastase en intercellulaire communicatie gemedieerd door het secretoom.

Introduction

Vóór de laatste twee decennia was de behandeling van menselijke kankers sterk afhankelijk van radiotherapie en chemotherapeutische middelen die zich breed richtten op snel woekerende cellulaire populaties door DNA te beschadigen of DNA-synthese te remmen. Hoewel deze benaderingen de groei van kankercellen remden, hadden ze ook schadelijke bijwerkingen op normale snel prolifererende celtypen zoals intestinale epitheelcellen en haarfollikelcellen. Meer recent is kankertherapie begonnen met het gebruik van chemotherapeutische middelen die zich precies richten op eiwitten binnen signaalroutes die van cruciaal belang zijn voor de groei van het neoplasma van een individuele patiënt. Deze aanpak, gewoonlijk aangeduid als "Precision Medicine", heeft geleid tot de ontwikkeling van een steeds groter wordend repertoire van monoklonale antilichamen en kleine moleculaire remmers. Deze middelen remmen effectief de proliferatie en overleving van tumorcellen, terwijl ze de schadelijke bijwerkingen op normale celtypen vermijden die worden gezien met conventionele chemotherapeutische middelen en radiotherapie. Monoklonale antilichamen die worden gebruikt voor de behandeling van menselijke kankers richten zich meestal op celoppervlakmoleculen zoals groeifactorreceptoren1 (bijv. de grote familie van membraanoverspannende receptor tyrosinekinasen) en immuunresponsmodulatoren2 (bijv. geprogrammeerd celdoodeiwit 1, geprogrammeerd doodsligand 1). Kleine moleculaire remmers kunnen celoppervlakeiwitten of signaaleiwitten remmen die zich intracellulair bevinden3. Om deze nieuwe therapeutische middelen effectief te gebruiken, moet echter worden vastgesteld dat een bepaalde kanker afhankelijk is van het molecuul dat het doelwit is van een kandidaat-therapeutisch middel.

Hoewel deze nieuwe therapeutische middelen meer gerichte effecten hebben, remmen veel van hen nog steeds de werking van meer dan één eiwit. Bovendien zijn er vaak meerdere middelen met verschillende effectiviteit en specificiteit beschikbaar om zich op een specifiek eiwit te richten. Daarom is het tijdens preklinisch onderzoek verstandig om aanvullende benaderingen zoals genetische ablatie te gebruiken om een kandidaat-eiwit als therapeutisch doelwit te valideren. Een bijzonder nuttige benadering voor het valideren van een eiwit als een therapeutisch doelwit is om het gen dat codeert voor het kandidaat-eiwit af te breken in een genetisch gemanipuleerd diermodel dat het specifieke type kankerinteresse ontwikkelt. Deze aanpak kan relatief eenvoudig zijn als muizen met een nulmutatie (ofwel een natuurlijke mutatie, een genetisch gemanipuleerde nulmutatie [een "knock-out"], of een nulmutatie geïntroduceerd door een genenval) beschikbaar zijn en de muizen levensvatbaar zijn in de volwassenheid. Helaas zijn muizen met een nulmutatie die aan deze criteria voldoen vaak niet beschikbaar, meestal omdat de nulmutatie embryonaal of in de eerste dagen van het postnatale leven resulteert in de dood. In deze omstandigheid kunnen muizen die vatbaar zijn voor het ontwikkelen van het tumortype van interesse in plaats daarvan worden gekruist met muizen waarin belangrijke segmenten van het gen van belang worden geflankeerd door loxP-sites ("floxed"), waardoor het gen kan worden gelateld door een transgen te introduceren dat Cre-recombinase tot expressie brengt in de tumorcellen (een voorwaardelijke knock-out). Deze aanpak biedt verschillende voordelen. Ten eerste, als er een Cre-driver beschikbaar is die tot expressie komt in de tumor, maar niet in het celtype dat tot de dood heeft geleid in conventionele knock-outs, kan deze aanpak mogelijk het kandidaat-therapeutische doelwit valideren. Ten tweede stelt het aborteren van het gen dat codeert voor het kandidaat-eiwit in tumorcellen, maar niet in andere intratumorale elementen zoals tumor-geassocieerde fibroblasten of immuuncellen, de onderzoeker in staat om onderscheid te maken tussen cel-autonome en niet-cel-autonome effecten van het therapeutische doelwit. Ten slotte stelt een tamoxifen-induceerbare Cre-driver (CreERT2) de onderzoeker in staat om het gen van belang in verschillende stadia van tumorontwikkeling te verwijderen en het venster te definiëren waarin het kandidaat-therapeutische middel het meest waarschijnlijk effectief is.

Helaas zijn er ook technische problemen die het gebruik van voorwaardelijke knock-outs in tumoren die ontstaan in GEM-modellen kunnen beperken. Een Cre-driver die bijvoorbeeld tot expressie komt in tumorcellen en gendeletie in normale cellen die essentieel zijn voor het leven vermijdt, is mogelijk niet beschikbaar. Een ander probleem, dat misschien wordt onderschat, is dat Cre- en CreERT2-drivers vaak variabel floxed allelen bij muizen aborteren, wat resulteert in mozaïcisme voor de nulmutatie in een GEM-kanker. Wanneer dit gebeurt, zullen tumorcellen waarin het beoogde gen niet is geableerd, zich snel blijven vermenigvuldigen en de tumorcellen overwoekeren met geableerde allelen. Mozaïcisme in Cre-driverlijnen kan optreden als gevolg van niet-alomtegenwoordige Cre-expressie in de beoogde afstamming en door mislukte recombinatie in individuele cellen onafhankelijk van Cre-expressie4. Dit is een bekend fenomeen van Cre-drivers dat afhankelijk is van het celtype en waarmee rekening moet worden gehouden tijdens experimenteel ontwerp en gegevensinterpretatie. Mozaïcisme kan het effect van de knock-out maskeren en ertoe leiden dat een onderzoeker ten onrechte concludeert dat het gen van belang niet essentieel is voor de proliferatie en / of overleving van tumorcellen en dus geen geldig therapeutisch doelwit is.

Verschillende van deze problemen werden aangetroffen in een eerdere studie die probeerde te bepalen of de receptor tyrosinekinase erbB4 een potentieel therapeutisch doelwit was in MPNST-cellen5. In deze studies werden muizen gebruikt die een transgen tot expressie brengen dat codeert voor de neureguline-1 (NRG1) isoforme gliagroeifactor-β3 (GGFβ3) onder controle van de Schwann-celspecifieke myeline-eiwit nulpromotor (P 0-GGFβ3-muizen). P 0-GGFβ3-muizen ontwikkelen multipele plexiforme neurofibromen die zich ontwikkelen tot MPNT's via een proces dat de processen van neurofibromapathogenese en plexiforme neurofibroma-MPNST-progressie recapituuleert die wordt gezien bij patiënten met het autosomaal dominante tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1)6. Bij kruising met muizen met een Trp53 null-mutatie, de resulterende P 0-GGFβ3; Trp53+/- muizen ontwikkelen MPNSTs de novo zoals wordt gezien bij cis-Nf1+/-; Trp53+/- muizen.

Deze MPNT's recapituleren de progressie van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) graad II naar WHO graad IV laesies gezien bij mensen7. Bij P 0-GGFβ3-muizen ontstaan MPNST's binnen reeds bestaande plexiforme neurofibromen in de trigeminuszenuw (58%) en spinale dorsale zenuwwortels (68%)7; de MPNST's die in P 0-GGFβ3 voorkomen; Trp53+/- muizen hebben een zeer vergelijkbare verdeling. Bij mensen komen MPNST's meestal voor in de heupzenuw, gevolgd door de brachiale plexus, spinale zenuwwortels, vagus, femorale, mediane, sacrale plexus, popliteale obturator en achterste tibiale en ulnaire zenuwen8. Deze tumorverdeling in deze GEM-modellen is enigszins anders dan wat bij mensen wordt gezien. Echter, de MPNST's die ontstaan in P 0-GGFβ3 en P0-GGFβ3; Trp53+/- muizen zijn histologisch identiek aan menselijke MPNST's, dragen veel van dezelfde mutaties als in menselijke MPNST's en recapituleren het proces van neurofibroma-MPNST-progressie dat wordt gezien bij NF1-patiënten. De generatie van P 0-GGFβ3 of P0-GGFβ3; Trp53+/- muizen die Erbb4-/- waren, was niet haalbaar omdat muizen met twee Erbb4 nul-allelen sterven in utero op embryonale dag 10,5 secundair aan hartafwijkingen9. Omdat het redden van Erbb4-expressie in het hart door het introduceren van een hartspecifiek Erbb4-transgen (α-myosine zware keten (MHC)-Erbb4) resulteert in levensvatbare Erbb4-/- muizen10, de generatie muizen met een gecompliceerde P0-GGFβ3; Trp53+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4-/- genotype werd geprobeerd.

De paringen produceerden echter geen muizen in de verwachte Mendeliaanse verhoudingen, wat aangeeft dat het gewenste genotype schadelijk was. Daarom de generatie van P 0-GGFβ3; Trp53+/- muizen met gevlokte Erbb4-allelen 11 en een CreERT2-driver werd geprobeerd de deletie van Erbb4 in de MPNGT's die bij deze muizen ontstaan toe te staan. Bij deze dieren waren nog talrijke tumorcellen met intacte Erbb4-allelen aanwezig (mozaïcisme). Het waargenomen mozaïcisme kan het gevolg zijn van inefficiënte tamoxifenafgifte, wat resulteerde in verschillen in recombinatie-efficiëntie in het weefsel. De mogelijkheid van spontane compenserende mechanismen zou verder kunnen bijdragen aan mozaïcisme in tamoxifen-gemedieerde recombinatie door de vereiste voor Erbb4-expressie te omzeilen. Het is mogelijk dat het verlies van Trp53 tumorcellen vatbaar maakt voor extra spontane "permissieve" mutaties die de interpretatie van de gegevens kunnen verwarren. Omdat het waarschijnlijk leek dat de Erbb4-intacte MPNST-cellen de gevolgen van het aborteren van Erbb4 in andere tumorcellen zouden maskeren, werd deze aanpak verlaten.

Deze obstakels leidden tot de ontwikkeling van een methodologie voor het aborteren van Erbb4 in mpnst-cellen met een adenovirus dat Cre-recombinase en eGFP tot expressie brengt. Deze cellen kunnen worden gescheiden van niet-geïnfecteerde cellen met behulp van FACS, wat het mozaïcisme voor het ablated Erbb4-gen aanzienlijk vermindert. Hieronder worden de methoden beschreven die worden gebruikt om dit te bereiken, samen met de methoden die worden gebruikt om de effecten van genablatie in vitro en in vivo te beoordelen. Het volgende protocol is een voorbeeld van het produceren van tumordragende muizen die tumoren opleveren met gevlokte allelen van embryonale letale genen die van belang zijn voor ex vivo excisie voorafgaand aan in vivo allograft tumorgroeibeoordeling. Dit omvat een beschrijving van de benaderingen die worden gebruikt om het effect te analyseren dat Erbb4-ablatie uitoefent op tumorcelproliferatie, overleving en genexpressie in vitro en proliferatie, overleving en angiogenese bij orthotopische allografts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Voordat u procedures met muizen uitvoert, moeten alle procedures worden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee. Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Medical University of South Carolina. Dit protocol werd uitgevoerd door goed opgeleid personeel volgens de richtlijnen voor institutionele dierverzorging van MUSC.

1. Generatie muizen die MPNSTs homozygoot ontwikkelen voor Erbb4 flox allelen

  1. Produceer de F1-generatie van P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ dieren door paring P 0-GGFβ3; Trp53+/- muizen7 met Erbb4fl/fl muizen11. Gebruik een Punnett-vierkant (figuur 1) om het fokschema te begeleiden om ervoor te zorgen dat voldoende mannelijke en vrouwelijke F1-pups worden gegenereerd met de gewenste P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ genotype.
  2. Genotype F1-nakomelingen door genomisch DNA te isoleren van een staartsnip verzameld in overeenstemming met de IACUC-richtlijnen en vervolgens PCR uit te voeren met behulp van eerder beschreven primers om het P 0-GGFβ3-transgen12, Trp53 wild type (+) en null (-) allelen7 en Erbb4flox en Erbb4 wild-type allelen13 te detecteren.
    1. Isoleer staart-DNA met behulp van methoden die op jacks-lab.mit.edu/protocols zijn beschreven.
    2. Maak de PCR-reactie gemengd met 25 ng DNA, 0,25 nM dNTPs, 0,02 U/μL Taq, 0,5 μM van elke primer en 1x PCR-buffer. Voer pcr-reactie uit met een enkele incubatie van 95 °C (om het genomische DNA te smelten en Taq te activeren) gedurende 1 minuut gevolgd door 35 PCR-cycli van 94 °C, 10 s (smelten); 55 °C, 30 s (gloeien); 72 °C, 40 s (extensie) gevolgd door een enkele 72 °C (extensie) gedurende 5 min. Bewaar de reacties bij 4 °C totdat ze klaar zijn om te draaien op een 1,2-1,5% agarose gel.
      OPMERKING: De gloeitemperatuur is afhankelijk van het gebruikte PCR-buffersysteem; het uitvoeren van een gloeitemperatuurgradiënt om de juiste gloeitemperatuur te bepalen, wordt aanbevolen.
  3. Produceer de F2-generatie van P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl-dieren door het paren van de juiste F1-nakomelingen (P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+) met elkaar.
    OPMERKING: Figuur 1 illustreert de Punnet-kwadratische voorspellingen die worden gebruikt om het verwachte aantal F2-nakomelingen met het gewenste genotype te berekenen.
  4. Identificeer dieren met de gewenste P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl genotype zoals beschreven in stap 1.2.
  5. Stuur F2-nakomelingen aan elkaar om de P 0-GGFβ3 te behouden; Trp53-/+; Erbb4fl/fl kolonie en genotype alle pups. Bevestig dat het nieuw geïntroduceerde gevlochten allel de overleving of tumorlatentie niet in gevaar brengt. Bereik dit door cohorten (20 muizen/cohort) van P 0-GGFβ3 vast te stellen; Trp53+/- en P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl muizen en volg hun overleving en frequentie van tumor optreden.
  6. Controleer dieren meerdere keren per week totdat het experimentele eindpunt is bereikt (maximaal toegestane tumorgrootte /humaan eindpunt goedgekeurd door IACUC).
    1. Beoordeel tijdens de wekelijkse monitoring het lichaamsgewicht, normaal sociaal en verzorgingsgedrag en metingen van de tumorgrootte. Zorg voor veterinaire beoordeling in geval van gewichtsverlies van >10% van het lichaamsgewicht, sociale afzondering en hangen.
    2. Wanneer een tumordragende muis wordt geïdentificeerd en zijn humane eindpunt heeft bereikt, euthanaseer het dier op humane wijze met behulp van kooldioxide-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie en verwijder de tumor steriel met een scalpelmes. Voer tumormetingen uit door lengte, breedte en diepte te meten met behulp van een remklauw en gewichtstumor (massa en volume). Werk snel om autolyse te voorkomen.
  7. Verdeel de tumor in drie secties met behulp van broodbroodachtige sneden met een scalpelmes onder steriele omstandigheden om weefselsegmenten te genereren voor formalinefixatie / paraffine-inbedding (FFPE), vroege passagecultuurgeneratie en flash-bevroren materiaal (figuur 2A).
    1. Zorg ervoor dat sectie 1 (voor vroege passagecultuurgeneratie, stap 1.7.2) ongeveer 10% van het totale tumorvolume is, sectie 2 (voor fixatie en IHC, stap 1.7.3) 70% van het totale tumorvolume en sectie 3 (voor flash freeze, stap 1.7.4) 20% van het totale tumorvolume.
    2. Neem rubriek 1 van de tumor voor de bereiding van vroege passageculturen (zie hieronder).
    3. Fixeer rubriek 2 van de tumor in 4% paraformaldehyde 's nachts bij 4 °C en integreer vervolgens paraffine (formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) voor diagnostische work-up.
    4. Flash-freeze rubriek 3 voor analytische analyses (bv. immunoblots om te controleren of eiwit gecodeerd door het beoogde gevlokte gen op de juiste manier tot expressie wordt gebracht).
  8. Kleur 5 μm dikke FFPE-weefselsecties met hematoxyline en eosine (H &E) om de tumordiagnose door een gekwalificeerde patholoog te bevestigen. Voer indien van toepassing immunohistochemische kleuring (IHC) uit om de tumordiagnose te bevestigen.
    1. Immunostain MPNSTs voor S100 calciumbindend eiwit B (S100β), nestine en geslachtsbepalend gebied Y (SRY)-Box transcriptiefactor 10 (Sox10)-drie markers die tot expressie komen in zowel MPNT's als Schwann-cellen (tumorceloorsprong)5,6,14,15. Kleur de tumoren met antilichamen die erbB4 herkennen, het eiwit gecodeerd door het gen dat is gericht op ablatie in stroomafwaartse stappen.
    2. Om de diagnose te bevestigen, laat een gekwalificeerde veterinaire of menselijke patholoog alle gekleurde tumordia's beoordelen volgens de diagnostische en beoordelingscriteria van de WHO 5,6,7,16.

2. Ex vivo ablatie van gevlochten Erbb4-allelen in MPNST-cellen

  1. Stel vroege passageculturen vast van vers verzameld MPNST-weefsel door het weefsel uit sectie 1 (stap 1.7.3) in 10 ml ijskoude steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs te plaatsen en vervolgens over te brengen naar een steriel werkgebied (figuur 2B) 16.
    OPMERKING: Alle volgende procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele weefselkweekkap.
  2. Gehakt het tumorweefsel in stukjes van 2-4 mm en triturate 8-10 keer in een 10 cm2 behandelde weefselkweekschaal met 10 ml groeimedium. Kweek deze preparaten in hoog glucose DMEM-10 groeimedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum, 1% glutamine, 10 μg/ml streptomycine en 10 IE/ml penicilline) aangevuld met 10 nM neureguline-1β (NRG1β) en 2 μM forskoline. Voeg forskoline toe in dit stadium om de groei van veel voorkomende verontreinigende celtypen zoals fibroblasten te remmen.
  3. Onderhoud het mechanisch gedissocieerde weefsel en de cellen gedurende maximaal 3 dagen bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer om een vroege passagecultuur tot stand te brengen. Scheid op dit punt geen gedispergeerde cellen en resterende weefselfragmenten.
  4. Verfris de culturen met een nieuw medium om de 3-4 dagen. Laat de tumorcellen prolifereren totdat ze confluent zijn.
  5. Breid de vroege passageculturen uit door de samenvloeiende culturen op te splitsen in verschillende gerechten. Verwijder het groeimedium en wascellen met 1x dPBS. Voeg vervolgens 1 ml 0,25% trypsine toe gedurende 2-5 minuten bij kamertemperatuur per 10 cm2 behandelde celkweekschaal. Trituur de cultuur voorzichtig om onthechting te vergemakkelijken en een eencellige suspensie te genereren.
    1. Beëindig de trypsinisatie door 2 ml DMEM-10 groeimedium toe te voegen. Verzamel het trypsinized celmengsel en breng het over naar een steriele centrifugebuis van 5 ml. Pelleteer de cellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 500 × g bij kamertemperatuur.
    2. Resuspendeer de celpellet in 5 ml DMEM-10. Splits de cellen in twee tot vier celkweekschalen van 10 cm, die elk 10 ml groeimedia bevatten (ongeveer 1 × 106 cellen per schotel).
  6. Gebruik na 5 passages (herhalende stappen in 2.5) groeimedium zonder NRG1β en forskoline. Immunostain een monster van de cultuur met een anti-S100β-antilichaam om te verifiëren dat de cultuur uitsluitend uit tumorcellen bestaat. Onderhoud de cellen in DMEM-10 groeimedium in alle volgende passages.
  7. Tel bij de volgende passage de cellen en vries een deel van P 0-GGFβ3 in; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-cellen verzameld uit confluentculturen (3 × 106 cellen/injectieflacon).
  8. Plaat P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl early passage MPNST-cellen met een dichtheid van 1,5 × 106 cellen per 10 cm behandeld celkweekschaal in DMEM-10 groeimedium.
  9.  Dag 0: (ongeveer 12-16 uur na plating), was de adherente culturen met 2-4 ml dPBS en infecteer met Ad5CMV-Cre / eGFP of Ad5CMV-eGFP op ongeveer 400 plaquevormende eenheden (pfu) / cel in 10 ml serumvrije DMEM (d.w.z. 30 μL van 2 × 1010 pfu virus per schaal van 10 cm). Ablateer de gevlochten Erbb4-allelen met behulp van het adenovirus bij de maximaal getolereerde virusconcentratie (multipliciteit van infectie, MOI), zoals empirisch bepaald. Raadpleeg figuur 2C voor een schema van de workflow voor deze ablatie.
  10. Dag 1: Ongeveer 16 uur later red je de culturen door 10 ml DMEM-10 aan de infectiecocktail toe te voegen.
  11. Dag 2 - 3: FACS sorteert geïnfecteerde cellen volgens het aanbevolen protocol van de kernfaciliteit om eGFP-positieve cellen ongeveer 48 uur na infectie te sorteren. Controleer voorafgaand aan FACS-sortering kort cellen op eGFP-signaal op een fluorescentiemicroscoop om ervoor te zorgen dat de culturen efficiënt zijn geïnfecteerd (~ 50-100% positieve cellen). Retourcellen hersteld na FACS tot 10 cm weefselkweekschalen; reserveer één gerecht voor genomische DNA-isolatie.
  12. Dag 4 - 5: Laat de cellen na FACS-sortering gedurende ten minste 24-48 uur herstellen in een weefselkweekincubator en bereid de cellen vervolgens voor op in vitro cel gebaseerde analyses of in vivo transplantatie. Bevestig Erbb4-deletie via PCR met behulp van genomisch DNA geïsoleerd uit een deel van de gesorteerde eGFP-positieve cellen. Controleer of eGFP-positieve cellen ErbB4-negatief zijn door PCR of door een monster van de cultuur te immunostainen met een anti-erbB4-antilichaam.
    1. Isoleer genomisch DNA uit de cellen met behulp van standaard zuur-guanidiniumfenol en op chloroform gebaseerde DNA-isolatiemethode17.
    2. Voer standaard PCR uit om gevlochten Erbb4-allelen en ablated Erbb4-allelen te onderscheiden. Voer 40 cycli uit met 2 ng DNA, 20 μM primers 1 + 2 om een 250 bp Erbb4-null product en een 350 bp gevlokt product13 te produceren. Voer zowel PCR- als antilichaamgebaseerde benaderingen uit om knock-out te bevestigen wanneer er geen betrouwbare antilichamen beschikbaar zijn.
      OPMERKING: Cellen zijn klaar voor in vitro celgebaseerde assays zoals hieronder beschreven. Veel soorten downstream analyses kunnen worden uitgevoerd met cellen die op deze manier zijn voorbereid. Het doel van de onderstaande protocollen is om enkele voorbeelden te geven van in vitro en in vivo toepassingen van deze tumorcellen na ablatie van het Erbb4-gen .

3. Proliferatie- en levensvatbaarheidstests in MPNST-cellen met geableerde Erbb4-allelen

  1. Voer proliferatietests uit in de komende zeven dagen op gesorteerde MPNST-cellen die in een multiwell-plaat zijn geplateerd met behulp van een op afbeeldingen gebaseerde geautomatiseerde cytometer.
    1. Dag 6: Plaat 2.000 cellen per put in een eindvolume van 150 μL (~13.300 cellen/ml) groeimedium in een 96-well plaat. Voer metingen uit in drievoud voor elk experimenteel cohort en 4 dagelijkse eindpuntmetingen (3 replicaties x 2 omstandigheden x 4 dagen).
    2. Dag 7, 9, 11, 13: Kleur cellen met Hoechst en propidiumjodide (PI) kleurstoffen en beeld ze af op een geautomatiseerde platenlezer om het aantal levende en dode cellen in elke put te tellen. Om dit te bereiken, kleurt u de cellen tegelijkertijd met Hoechst-kleurstof om de kernen van zowel levende als dode cellen te kleuren en met propidiumjodide (PI) om de dode cellen te labelen. Voer alle lezingen elke dag of om de andere dag op hetzelfde tijdstip uit.
      1. Voeg 50 μL van een 4x PI/Hoechst-kleuringsoplossing (elk 4 μg/ml) toe aan elke goed gekwantificeerde die dag (bijvoorbeeld alleen dag 7) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in de weefselkweekincubator. Houd de plaat beschermd tegen licht.
        OPMERKING: De kleuringsconcentratie van Hoechst moet empirisch worden bepaald en kan variëren van 1 tot 10 μg / ml, afhankelijk van het celtype.
      2. Lees de gekleurde putjes na incubatie met behulp van het juiste fluorescerende kanaal op de geautomatiseerde celbeeldcamera. Breng na het lezen de plaat terug naar de incubator voor toekomstige lezingen op volgende dagen (d.w.z. dagen 9, 11, 13).
      3. Kwantificeer de kleuringsintensiteiten op basis van het gebruikte beeldvormingssysteem en bereken het aantal dode cellen, levende cellen en totale cellen met behulp van de volgende instellingen: blauw kanaal (377/50 nm, Hoechst): totale cellen (levend en dood); rood kanaal (531/40 nm, PI): alleen dode cellen; blauw - rood (totaal - dood) = levende cellen.
  2. Voer de levensvatbaarheidstest van de cel gedurende drie dagen uit, indien gewenst, volgens het protocol van de testfabrikanten.
    OPMERKING: Levensvatbaarheidstests kunnen worden gecombineerd met proliferatietests door een drievoudige vlek uit te voeren, waaronder calceïne AM (488/32 nm; groen kanaal, specifiek labels levende cellen), PI en Hoechst. Een apoptosetest kan ook worden uitgevoerd met behulp van culturen die zijn opgezet zoals hierboven beschreven; het specifieke protocol is afhankelijk van het beeldvormingssysteem.
    1. Dag 6: Plaat 4.000 cellen per put in een eindvolume van 150 μL in een 96-well plaat in drievoud.
    2. Dag 7 - 9: Voeg 2.000x bioluminescente cel levensvatbaarheidstestagentia toe (tabel met materialen), breng de plaat terug naar de incubator en lees de plaat 1 uur later. Voer volgende lezingen elke dag op hetzelfde tijdstip uit. Voer voor de bioluminescentie (MTT) -testen de test precies uit zoals beschreven in de instructies van de fabrikant om de 24 uur gedurende 72 uur met behulp van een luminometerplaatlezer.

4. RNA-Seq analyseert en identificeert genen waarvan de expressie wordt veranderd door Erbb4-verlies

  1. Dag 6: Isoleer totaal RNA uit gesorteerde MPNST-cellen met behulp van standaard zuur-guanidinium-fenol en chloroform-gebaseerde methoden. Voor experimenten die zijn ontworpen om veranderingen in mRNA-niveaus tussen twee cohorten te detecteren, bereidt u totaal RNA voor van ten minste drie biologische replicaties in elk cohort.
    1. Om gebeurtenissen veroorzaakt door de adenovirale vector of eGFP-expressie in plaats van Erbb4-verlies te elimineren, isoleert u RNA uit drie biologische replicaties van P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-cellen getransduceerd met Ad5CMV-Cre/eGFP en drie biologische replicaties getransduceerd met Ad5CMV-eGFP.
      OPMERKING: Geïsoleerd RNA moet een RNA-integriteitsgetal (RIN) score hebben ≥ 8 voor RNA-Seq-analyse. Zorg ervoor dat de sequencingkern het RIN van alle samples bepaalt voordat bibliotheken worden gebouwd.
  2. Gebruik 100-200 ng hoogwaardig totaal RNA uit elk monster om RNA-Seq-bibliotheken voor te bereiden (werk met de kernsequencingfaciliteit voor deze stap). Voer high-throughput sequencing uit met behulp van een DNA-sequencer van de volgende generatie. Voer voor mRNA-kwantificering single-ended sequencing uit om Fastq-bestanden te genereren. Zorg voor minimaal 50 miljoen leesbewerkingen voor elk monster.
    OPMERKING: Raadpleeg figuur 3 voor een schema dat de workflow illustreert die wordt gebruikt om RNA-Seq-gegevens te verwerken en om de expressie van differentieel uitgedrukte transcripten te kwantificeren. Sequentiegegevens, in de vorm van Fastq-bestanden, worden onderworpen aan kwaliteitscontroleprocedures; >80% van de lezingen moet een Phred-score van 30 opleveren om geschikt te worden geacht voor latere analyse. De sequenties worden ook voorbewerkt (bijgesneden) met Trimmomatic18 om adaptersequenties te verwijderen en leesbewerkingen van lage kwaliteit uit te filteren.
  3. Voer RNA-Seq-uitlijning en -analyse uit op de fastq-gegenereerde bestanden met behulp van elk geschikt softwareprogramma (bijv. DNAStar19,20 of Partek21). Volg de programmaspecifieke stappen met behulp van de standaardinstellingen om de fastq-bestanden uit te lijnen met het referentiegenoom van de muis (GRCm38/mm10).
    OPMERKING: Met DNAStar als voorbeeld wordt de algemene workflow hieronder beschreven (aanvullende figuur 1).
    1. Selecteer de analysemethode, RNA-Seq.
    2. Selecteer het referentiegenoom , Muis.
    3. Upload het BED-bestand indien opgegeven door de sequencingkern.
    4. Upload de fastq-sequencingbestanden en wijs ze unieke replicatienamen toe.
    5. Groepeer de fastq-bestanden en wijs ze toe aan een replicatieset (d.w.z. GFP, CRE)
      OPMERKING: Elk uitlijningsprogramma heeft zijn specifieke stappen en de gebruiker moet de gebruikershandleiding van het programma voor het programmaspecifieke protocol raadplegen. Het programma genereert vervolgens genspecifieke onbewerkte tellingsgegevens uit deze Fastq-bestanden.
  4. Voer statistische en normalisatieanalyses (DESeq2, EdgeR) uit op de onbewerkte telgegevens met behulp van geschikte softwareprogramma's, zoals beschreven in 4.3, met de Ad5CMV-eGFP-steekproefset als de controlegegevensset en Ad5CMV-Cre als de testgegevensset om differentiële genexpressiesignalen te identificeren met robuust statistisch vermogen22,23.
    1. Selecteer GFP fastq-bestanden als de besturingsgegevensset.
    2. Selecteer DESeq2 als de statistische en normalisatiemethode .
    3. Start de montage en analyse.
      OPMERKING: Elk uitlijningsprogramma heeft zijn specifieke stappen en de gebruiker moet de gebruikershandleiding van het programma voor het programmaspecifieke protocol raadplegen. Het programma genereert vervolgens genspecifieke onbewerkte tellingsgegevens uit deze Fastq-bestanden. De statistische en normalisatie-analyse is een ingebouwde stap in veel programma's, zoals weergegeven in het voorbeeld hier, binnen het sequentie-uitlijningsprotocol. Als een alternatief softwareprogramma voor het uitlijnen van sequenties wordt gebruikt dat deze volgende ingebouwde stap niet biedt, voert u de statistische en normalisatie-analyse uit op de onbewerkte telgegevens op terminalniveau met behulp van de DESeq2- of EdgeR-coderingspakketten geschreven in R, vrij beschikbaar om te downloaden op Bioconductor.org.
  5. Gebruik deze benaderingen om veranderingen te identificeren die ten minste een 1,5-voudige toename of afname vertegenwoordigen ten opzichte van de controle (in dit geval cellen die zijn getransduceerd met het Ad5CMV-eGFP-virus). Gebruik alleen die differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) waarvan is vastgesteld dat ze statistisch significant zijn en die ≥1,5-voudige veranderingen en een p-waarde 0,05 of een padj van 0,1 laten zien voor daaropvolgende functionele verrijkingsanalyse.
    OPMERKING: Dit genereert een lijst met DEG-genen en hun statistische kracht voor functionele verrijkingsanalyse.
  6. Voer functionele verrijkingsanalyse uit op statistisch significante Erbb4-gemedieerde DEG geïdentificeerd in 4.4 met een gerangschikt genenlijstbestand met behulp van een van de vrij beschikbare webgebaseerde tools. Bepaal de biologische en pathway significantie van Erbb4 genverlies door middel van gen ontologie datasets geïntegreerd in deze open-access functionele verrijking analyse tools 24,25,26,27 (zie de Tabel van materialen voor voorbeelden en Figuur 3 voor een voorbeeld workflow met behulp van Panther).
    1. Exporteer de gegevens die in stap 4.4 zijn verkregen als een spreadsheet.
    2. Rangschik de gegevens op log2-vouwverandering, p / padj-waarde of beide.
    3. Zorg ervoor dat u alle niet-statistisch significante gegevens verwijdert.
    4. Exporteer de lijst met gerangschikte genen met gen-ID alleen als een .txt bestand en upload deze naar de website.
      OPMERKING: Gebruik alleen statistisch significante DEG (p/padj-waarden < respectievelijk 0,05 of 0,1) om een gerangschikte invoergenenlijst te genereren met behulp van log2-vouwveranderingen (van hoog naar laag), p/padj-waarden (van laag naar hoog) of beide [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Er zijn verschillende benaderingen om een gerangschikte genenlijst te genereren en wordt empirisch bepaald voor de dataset en de vraag die wordt gesteld. Het specifieke type functionele verrijkingsanalysetool dat wordt gebruikt, kan ook helpen bij het bepalen van het juiste type ranggenlijst. Voor aanvullende bronnen over RNA-Seq, zie de volgende artikelen 28,29,30.

5. Orthotopische allografering van MPNST-cellen met geableerde Erbb4-allelen en analyse van de effecten van Erbb4-ablatie

  1. Voordat u orthotopische allografenties van gesorteerde MPNST-cellen uitvoert, moet u ervoor zorgen dat alle procedures worden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee en dat alle procedures worden uitgevoerd door goed opgeleid personeel.
  2. Verwijder op de dag van injectie cellen met een lage doorgang (ongeveer 85% confluency) uit celkweekplaten of kolven met behulp van een niet-enzymatische celdissociatieoplossing (bijv. een mengsel van chelaatvormers; zie de tabel met materialen) en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Voor orthotopische injecties in de heupzenuw reconstitueert u de cellen op 16.667 cellen /ml (50.000 cellen per 3 μL voor elk dier) in DMEM-1031. Houd de cellen op ijs.
    OPMERKING: Sommige culturen zullen niet met succes transplantaten tot stand brengen tenzij de cellen worden geïnjecteerd in een keldermembraanmatrix met lage groeifactor. De behoefte aan een keldermembraanmatrix (10-50%) moet empirisch worden bepaald.
  3. Beoordeel in vivo allograft groeipotentieel in post-geïnfecteerde cellen door MPNST-cellen te injecteren in de heupzenuw van 8-10 verdoofde Hsd: Athymic Nude-Foxn1nu muizen per cohort (leeftijd 4-8 weken). Voor orthotopische injectie van tumorcellen, zie Turk et al31. Hier wordt een subcutane injectie gedemonstreerd.
    OPMERKING: Om het aantal proefdieren te bepalen dat nodig is voor statistische significantie, raadpleegt u een biostatisticus of wordt aanbevolen om G*Power3 te gebruiken, een vrij beschikbare software32.
  4. Controleer de dieren tweemaal daags gedurende de eerste week na de injectie nauwlettend op tekenen van pijn. Controleer daarna de geënte muizen drie keer per week op remklauwmetingen en beoordeel de lichaamsconditiescores (BCSs) zoals eerder beschreven 5,31. Zoals uiteengezet in de IACUC-richtlijnen, euthanaseer dieren met een BCS van 2 of minder.
  5. Aangezien getransplanteerde cellen met verschillende snelheden groeien, bepaalt u de transplantaattijden empirisch met behulp van controlecellen (ongewijzigde) cellen voordat u experimenten uitvoert die in deze sectie worden beschreven. Om de grafts op het experimentele eindpunt te verzamelen, euthanaseert u de muizen humaan met behulp van kooldioxide-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire maatregel. Noteer de uiteindelijke volume- en massametingen van elk transplantaat.
    OPMERKING: Als ongewijzigd P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-cellen bereiken doorgaans de maximale grootte die door IACUC is toegestaan binnen 30-45 dagen, een typische tijdlijn is ongeveer 30-45 dagen na injectie.
  6. Isoleer en sectie weefsel zoals beschreven in stap 1.6-1.8. Fixeer een deel van het transplantaatweefsel 's nachts in 4% paraformaldehyde (figuur 2) en integreer het vervolgens in paraffine. Bereid 5 μm secties van het FFPE-weefsel en monteer ze op dia's. Voer H&E-kleuring en andere noodzakelijke immunostaining uit om te bevestigen dat het transplantaatweefsel is samengesteld uit tumorcellen zoals beschreven in 1.8.1. Snap-freeze de rest van het tumorweefsel voor downstream-analyses, zoals het valideren van het verlies van Erbb4-expressie en het beoordelen van de effecten van Erbb4-verlies op de expressie van andere Erbb-familieleden .
    OPMERKING: Bevestiging van tumorcellen in het transplantaatweefsel moet worden gedaan omdat immunodeficiënte muizen vatbaar zijn voor het ontwikkelen van neoplasmata. In het geval van kleine transplantaten is het belangrijk om ervoor te zorgen dat littekenweefsel of ontsteking niet wordt aangezien voor een neoplasma.
    1. Voer standaard IHC-kleuring uit op het FFPE-weefsel om de expressie van eiwitten van belang te vergelijken in allografts gekweekt uit Ad5CMV-eGFP en Ad5CMV-Cre / eGFP behandelde cellen. Kleur het weggesneden transplantaatweefsel met behulp van erbB4-specifieke antilichamen om verschillen in in vivo erbB4-expressie tussen de twee experimentele omstandigheden te bevestigen. Bepaal de proliferatieve index via Ki67-kleuring en het niveau van apoptose via terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde dUTP nick-end labeling (TUNEL) kleuring.
      OPMERKING: Elk eiwitdoel van belang kan ook worden beoordeeld via IHC. Beoordeel bijvoorbeeld de vasculaire dichtheid door allografts te immunostainen met een anti-CD31-antilichaam (1:50-verdunning) om in vivo vasculaire micro-omgevingsverschillen te bepalen die worden gemedieerd door genablatie. Het aantal vasculaire profielen per 40x veld kan worden geteld voor kwantificering. Volg voor deze op IHC gebaseerde testen de standaard IHC-protocollen voor de kleuringsprocedures en het protocol van de fabrikant voor TUNEL-kleuring. Voor het kwantificeren van afbeeldingen gebruikt u de ImageJ-plug-in 'geautomatiseerd tellen van afbeeldingen in één kleur'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 4 illustreert een typisch resultaat dat wordt verkregen bij het transduceren van P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST-cellen met het Ad5CMV-eGFP adenovirus of Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus (figuur 4A). Culturen worden bekeken met fluorescentiemicroscopie om eGFP-expressiecellen te identificeren en door fasecontrastmicroscopie om het totale aantal cellen in hetzelfde veld te bepalen op 10x (boven) en 40x (onder). Het percentage cellen dat eGFP tot expressie brengt, kan vervolgens indien gewenst worden berekend. Representatieve FACS-uitvoergegevens worden weergegeven in aanvullende figuur S2. Na FACS zal het percentage eGFP-tot expressie brengende cellen aanzienlijk worden verhoogd, waarbij vrijwel alle cellen in elk veld eGFP tot expressie brengen. Typische PCR-genotyperingsresultaten die worden verwacht na Cre-gemedieerde genablatie, afhankelijk van de transfectie-efficiëntie, zijn volledige gen knock-out (100% efficiëntie) of een heterogene populatie van geïnduceerde en niet-geïnduceerde cellen (<100% efficiëntie) in vergelijking met controletransductieresultaten (alleen GFP, fl / fl) (figuur 4B). Figuur 4C illustreert de karakteristieke histopathologie gevonden in orthotopische allograften van P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNSTs vergeleken met de tumoren afgeleid van de originele GEM diermodellen.

In deze experimenten resulteerde Erbb4-ablatie in afnames in cellulaire proliferatie en cellulaire dichtheid in vitro en in vivo, toename van TUNEL-labelingsindices in vivo en verminderde vasculaire dichtheid in vivo. Figuur 5 illustreert representatieve resultaten verkregen met een op afbeeldingen gebaseerde geautomatiseerde cytometer die verminderde cellulaire proliferatie in Ad5CMV-Cre ablated cellen laat zien versus controle Ad5CMV-GFP getransduceerde cellen (figuur 5A); deze experimenten werden uitgevoerd met vroege passage gekweekte cellen. Expressie van ErbB4 via immunohistochemie in P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-cellen getransduceerd met Ad5CMV-Cre of eGFP-virus waren verminderd in de resulterende Ad5CMV-Cre getransduceerde allografts in vergelijking met controle Ad5CMV-eGFP behandelde allografttumoren (figuur 5B). Vasculaire dichtheid werd beoordeeld via immunoreactiviteitsdetectie voor CD31; de vasculaire dichtheid is aanzienlijk verminderd in allografts van Ad5CMV-Cre getransduceerde cellen (figuur 5C). De signaalintensiteit kan, indien gewenst, worden gekwantificeerd met behulp van ImageJ.

Figure 1
Figuur 1: Punnet kwadratische berekeningen van de verhoudingen van verwachte genotypen bij het genereren en kruisen van P 0-GGFβ3; Trp53+/- muizen met Erbb4fl/fl muizen (F1). Punnet kwadratische berekeningen van de verhoudingen van verwachte genotypen bij het genereren en onderhouden van P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/+ met elkaar (F2). Afkorting: fl = Floxed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Workflow van het proces dat wordt gebruikt om gevlochten Erbb4-allelen af te breken in vroege passageculturen van MPNST-cellen afgeleid van P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl muizen. (A) Oogst de tumor die het gevlokte gen tot expressie brengt. (B) Creëer vroege passageculturen van de weggesneden tumor. (C) Infecteer vroege passageculturen om het gevlokte gen af te breken en downstream-assays uit te voeren. Afkortingen: MPNST = kwaadaardige perifere zenuwschedetumor; IHC = Immunohistochemie; PFA = Paraformaldehyde; FFPE = Formaline-gefixeerde paraffine-embedded; H&E = Hematoxyline en eosine; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; GFP = groen fluorescerend eiwit; K/O = knock-out; PCR = polymerasekettingreactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Schematische illustratie van de RNA-Seq workflow. De workflow wordt gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte transcripties te identificeren tussen controle (GFP-geïnduceerde) en Erbb4-null (Cre-geïnduceerde) cellen en de resulterende biologische significantie. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; RNA-Seq = RNA-sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve transductie-efficiëntieresultaten beoordeeld door microscopie in P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST cellen. (A) Cellen getransduceerd met Ad5CMV-eGFP adenovirus of Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus. (B) PCR-resultaten van potentiële genpopulaties na Ad5CMV-infectie. (C) Karakteristieke histopathologie waarbij de tumoren die in de oorspronkelijke GEM-modellen worden gegenereerd, worden vergeleken met de orthotopisch gealgreplanteerde P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl/fl MPNST cellen via H&E kleuring. Foto's zijn gemaakt met 40x. Isotype-gematchte negatieve controle antilichamen werden gebruikt voor controle kleuring. Schaalstaven = 400 μm (A, bovenpaneel); 100 μm (A, onderste paneel), 20 μm (C). Afkortingen: MPNST = kwaadaardige perifere zenuwschedetumor; GFP = groen fluorescerend eiwit; BF = brightfield; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; Neg Ctrl = negatief besturingselement; PCR = polymerasekettingreactie; GEM = genetisch gemanipuleerde muis; fl = gefloxed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve resultaten verkregen in gekweekte MPNST early passage culturen en orthotopisch allografeerde MPNST cellen na transductie met Ad5CMV-eGFP of Ad5CMV-Cre/eGFP. (A) Proliferatietest van gekweekte MPNST-cellen die een verminderde cellulaire dichtheid aantonen in cellen getransduceerd met Ad5CMV-Cre/eGFP in vergelijking met die getransduceerd met Ad5CMV-eGFP. Gekwantificeerde gegevens worden weergegeven op dag 1, 3 en 5 (links). Dag 1 en dag 5 samenvloeiingsbeelden gemaakt op de op beeld gebaseerde automatische cytometer worden aan de rechterkant weergegeven (afbeeldingen gemaakt met 4x vergroting met brightfield-microscopie). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van ten minste 3 verschillende onafhankelijke experimenten. (B) Representatieve ErbB4-kleuring in allografttumoren getransduceerd met Ad5CMV-eGFP of Ad5CMV-Cre/eGFP adenovirus genomen bij 20x vergroting. Rood kanaal (Alexa 564, CD31), blauw kanaal (Hoechst, kernen). (C) Representatieve beelden van vasculaire dichtheid in allografts van P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl MPNST-cellen getransduceerd met Ad5CMV-eGFP versus Ad5CMV-Cre/eGFP-virus. Foto's zijn gemaakt met 40x. Isotype-gematchte negatieve controle antilichamen werden gebruikt voor controle kleuring. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: MPNST = kwaadaardige perifere zenuwschedetumor; eGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; IgG = immunoglobuline G; NEG = negatieve controle; CD = cluster van differentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Schematische illustratie van een workflow voor het uitlijnen en analyseren van de reeks. De workflow die in DNAStar wordt gebruikt om RNA-sequencing-bestanden (fastq-bestanden) uit te lijnen en te analyseren. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; RNA-Seq = RNA sequencing., DEG = differentieel tot expressie gebrachte genen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Representatieve FACS-gegevens van vroege passageculturen met behulp van groen fluorescerend eiwit. (A) GFP-expresserende cellen worden gesorteerd op FACS na het instellen van fluorescerende poortparameters van niet-geïnfecteerde cellen. (B) Nadat de juiste detectiepoort is ingesteld, worden GFP-positieve (getransduceerde) cellen gescheiden van GFP-negatieve (niet-getransduceerde) cellen. Afkortingen: SSC-A = zijstrooiingsgebied van de piek; FSC-H = voorwaartse strooihoogte van de piek; FSC-W = voorwaartse strooibreedte van de piek; GFP = groen fluorescerend eiwit; FACS = Fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier gepresenteerde gedetailleerde methoden zijn ontwikkeld met behulp van een GEM-model van MPNST's. Als het tumorweefsel van belang echter kan worden verspreid in individuele cellen, zijn deze methoden gemakkelijk aan te passen voor verschillende tumortypen die in GEMs ontstaan. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het gevlochten allel niet resulteert in i) verminderde overleving die het moeilijk kan maken om voldoende muizen te verkrijgen om te screenen op tumoren, of ii) verhoogde tumorlatentie die het moeilijk kan maken om voldoende tumordragende muizen te verkrijgen. Als het gevlochten allel de overleving niet beïnvloedt, zal de overleving van beide cohorten gelijkwaardig zijn. Als het geen effect heeft op tumorlatentie, moeten equivalente aantallen tumordragende muizen ontstaan in beide cohorten met een vergelijkbaar tijdsverloop.

Vergelijkbare benaderingen zijn gebruikt om neurofibromen en MPNST's te bestuderen met behulp van voorwaardelijke knock-outs en tamoxifen-induceerbare Cre-dieren om induceerbare voorwaardelijke knock-outdieren te genereren33,34. Het verschil tussen deze studies en deze, afgezien van het gebruik van tamoxifen voor Cre-inductie zoals eerder besproken, is dat deze studies zich richten op tumorontwikkeling met een weefselspecifieke knock-out van NF1. Omdat deze studie en deze andere studies ook gemm-gegenereerde tumoren gebruiken, ligt het verschil met de vraag die wordt gesteld. In dit protocol bestuderen we niet de rol die NF1-verlies speelt bij mpnst-pathogenese, maar bestuderen we in plaats daarvan de rol die een specifiek gen (Erbb4) in door GEMM gegenereerde MPNNT's uitoefent op in vivo tumorgroei, die anders onmogelijk zou zijn omdat het embryonaal dodelijk is. Bovendien vermijdt dit protocol het gebruik van tamoxifen voor die benaderingen die dergelijke parameters vereisen.

Anderen hebben gevestigde menselijke MPNST-cellijnen bestudeerd in xenograftmodellen35. Die studie verschilt van deze in die zin dat de gebruikte getransplanteerde cellen goed bestudeerde maar hoge passage menselijke MPNST-cellijnen zijn, en het richt zich op het vaststellen van medicijnresponsen in xenografts. Die onderzoekers bestuderen niet de rol van een specifiek gen in deze MPNST-cellen voor in vivo groei en de effecten van genverlies op de respons van geneesmiddelen. Een andere studie vergelijkbaar met deze werd uitgevoerd door Dodd et al., met behulp van adenovirus Cre recombinase (Ad-Cre) -gemedieerd NF1-verlies op een temporele en ruimtelijke afhankelijke manier, opnieuw een krachtige methode voor het uitbreiden van MPNST translationele inspanningen36. De studie richtte zich op de rol van NF1- en Ink4a/ Arf-verlies, twee zeer vaak co-verwijderde genen in menselijke MPNST's, in de heupzenuw door Ad-Cre-injectie. De P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl-muizen die in deze studie worden beschreven, kunnen op deze manier worden gebruikt door Ad-Cre te injecteren in Schwann-celvoorloperlijnen. De vragen die in deze studie worden gesteld, zijn echter niet gericht op de evolutionaire rol van Erbb4 op MPNST-initiatie, maar op hoe MPNST's Erbb4-signalering kunnen kapen voor tumorgroeivoordeel.

Er zijn alternatieven voor de hier beschreven aanpak, waaronder het neerhalen van genexpressie via RNA-interferentie (RNAi) of het inactiveren van het gen van belang met CRISPR in menselijke kankercellijnen. Deze alternatieve benaderingen zijn waardevol en kunnen worden gecombineerd met genablatie in cellen afgeleid van GEM-tumoren om te verifiëren dat de effecten die worden waargenomen in muizentumorcellen worden samengevat in hun menselijke tegenhangers. Er zijn echter enkele duidelijke voordelen aan de hier beschreven methodologie. Ten eerste is het genetisch aborteren van gevlochten genen in GEM-kankercellen snel en produceert het volledige inactivatie van het beoogde gen. Daarentegen wordt vaak waargenomen dat het gebruik van korte haarspeld-RNA's resulteert in slechts een gedeeltelijke knockdown van genexpressie. Hoewel CRISPR volledige geninactivatie kan produceren, vereist de identificatie van klonen met volledige inactivatie een langdurig selectieproces.

Verder moeten meerdere klonen worden onderzocht om ervoor te zorgen dat de effecten als gevolg van CRISPR-ablatie niet verschillen tussen verschillende klonen. Ten tweede is het vermogen om gevlochten allelen in vroege passage GEM-tumorculturen af te breken voordelig, omdat dit de mogelijkheid minimaliseert om te selecteren op verschillende tumorcelsubpopulaties die effectief groeien in cultuur. Ter vergelijking: menselijke cellijnen, die meestal al jaren in cultuur worden gehandhaafd, zijn vaak afgeleid van verschillende subpopulaties die goed zijn aangepast aan cultuur en vaak genetische drift ondergaan tijdens dit proces. Dit resulteert erin dat deze cellijnen nieuwe mutaties ontwikkelen die niet aanwezig waren in hun moedertumor. Ten slotte, hoewel het transplanteren van GEM-tumorcellen in immunodeficiënte muizen in dit manuscript wordt beschreven, wordt opgemerkt dat GEM-tumorcellen afgeleid van tumoren die ontstaan in inteeltmuisstammen kunnen worden alloctrocyten geënt in muizen van dezelfde stam. Dit zou de onderzoeker in staat stellen om tumorbiologie te beoordelen bij dieren met een intact immuunsysteem in de aan- of afwezigheid van het beoogde gen.

De kritieke stap in het hier beschreven protocol is de ablatie van het gefloxeerde gen met Ad5CMV-Cre/eGFP en het waarborgen van de overleving van de tumorcellen na genablatie en FACS. Omdat dit een proces is dat afhankelijk is van het vermogen van Cre-recombinase om het gevlochten gen af te breken, is het mogelijk onderhevig aan enkele van dezelfde problemen die kunnen optreden bij het in vivo aborteren van een gevlokt gen; deze problemen zouden zich manifesteren als een onvolledige ablatie van het beoogde allel. Merk op dat het vermogen om cellen te zuiveren die met succes zijn getransduceerd met de eGFP-expresserende adenovirale vector, het mozaïcisme lijkt te minimaliseren in vergelijking met in vivo genablatie met CreERT2. In het geval van gerichte genen die coderen voor eiwitten, zoals ErbB4 die op het celoppervlak tot expressie komen, kan het echter mogelijk zijn om het verlies van het beoogde gen verder te waarborgen door FACS uit te voeren met behulp van zowel eGFP als een antilichaam dat het eiwit van belang herkent (d.w.z. sorteer de eGFP-positieve / erbB4-negatieve cellen).

Omdat, zoals in de inleiding werd opgemerkt, veel van de eiwitten die therapeutisch worden gericht door monoklonale antilichamen celoppervlakeiwitten zijn, zou deze aanpak vaak haalbaar moeten zijn. Er moet ook worden opgemerkt dat het belangrijk is om de tumorcellen gedurende ten minste 2-3 dagen na FACS te laten herstellen als RNA-Seq op hen moet worden uitgevoerd om het effect te beoordelen dat genablatie op het transcriptoom heeft gehad. RNA-Seq datasets verkregen zeer kort na FACS tonen vaak meer variabiliteit in genexpressie tussen biologische replicaties in sommige celtypen. Dit kan een gevolg zijn van het trauma dat cellen oplopen bij het doorlopen van FACS; daarom moeten de cellen na dit proces een herstelperiode krijgen. RNA-Seq datasets kunnen worden geanalyseerd met behulp van DESeq2, die de negatieve binomiale verdeling en een krimpschatter gebruikt voor de variantie van de distributie. In deze analyses worden monsters gesorteerd op basis van hun q-waarde, de kleinste false discovery rate (FDR) waarbij veranderingen in transcriptieniveaus significant zijn; FDR's worden berekend met behulp van de Benjamini-Hochberg meervoudige testaanpassingsprocedure. Als alternatief kunnen DEG's worden geïdentificeerd met behulp van andere beschikbare software die geschikt is voor RNA-Seq-analyseworkflows.

Voor dit MPNST-diermodel vereist het identificeren van het experimentele eindpunt een goed begrip van de natuurlijke geschiedenis van de neoplasmata in het diermodel dat wordt gebruikt. De natuurlijke geschiedenis van MPNST's in dit GEM werd bepaald door de overleving van een reeks van 44 P 0-GGFβ3 muizen6 en 19 P0-GGFβ3 te volgen; Trp53+/- muizen7 en vervolgens volledige obducties uitvoeren op al deze dieren wanneer ze hun overlevingseindpunt bereikten. De typische overlevingstijden en de locatie waar MPNST's typisch ontstonden, werden in elk diermodel bepaald. Bij de meeste van deze muizen ontstonden MPNST's in de trigeminuszenuw. MPNST's die ontstonden in de nervus trigeminus produceerden meestal ptosis geassocieerd met cornea-troebelheid (een gevolg van problemen met de traanverdeling geproduceerd door de ptosis), wat een klinisch nuttig teken was om tumordragende muizen te identificeren. Tumordiagnose moet worden bevestigd door het uitvoeren van H &E-vlekken en verschillende aanvullende diagnostische vlekken (S100β, nestin Sox 10, H &E, Mart1), gevolgd door een onderzoek door een gekwalificeerde veterinaire of menselijke patholoog. Dit is ook belangrijk omdat het Trp53 nulallel in dit model de muizen vatbaar maakt voor de ontwikkeling van andere neoplasmata zoals lymfomen, en deze tumoren moeten worden onderscheiden van MPNSTs.

Ten slotte bevat deze methodologie verschillende potentiële toepassingen die nog niet zijn onderzocht, maar die mogelijk haalbaar zijn in toekomstige onderzoeken. Neureguline 1 (NRG1), het ligand dat zowel erbB3 als erbB4 activeert, bevordert bijvoorbeeld de migratie van MPNST-cellen op een chemotactische manier; zowel erbB3 als erbB4 bevinden zich in de invadopodia van MPNST-cellen37. Het is echter niet duidelijk of erbB3 of erbB4 de chemotactische respons op NRG1 bemiddelt. Bijgevolg kunnen cellen waarin erbB4 met deze methodologie is geableerd, worden gebruikt om deze vraag aan te pakken. Een natuurlijke follow-up van deze experimenten is om te beoordelen of erbB4 nodig is voor metastase met behulp van de veelgebruikte aanpak waarbij tumorcellen via de staartader worden geïnjecteerd en het aantal pulmonale metastasen vervolgens wordt beoordeeld. Deze methodologie biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van andere benaderingen, zoals het gebruik van shRNA's om erbB4-expressie neer te halen, omdat shRNA-expressie vaak na een tijdje in cellen tot zwijgen wordt gebracht. Verder wordt verwacht dat vroege passageculturen een mengsel van tumor-afgeleide subpopulaties bevatten, inclusief subpopulaties van cellen die vatbaar zijn voor metastase. Het uitvoeren van metastasetests met cellen die zijn voorbereid met behulp van de hier beschreven methodologie, zal een beoordeling van het gemetastaseerde potentieel mogelijk maken dat representatiever is voor de moedertumor dan een gevestigde cellijn. Dit is natuurlijk slechts één voorbeeld van de toekomstige toepassingen die deze methodologie zouden kunnen gebruiken. We hopen dat andere onderzoekers deze methodologie zullen combineren met problemen van bijzonder belang om het vermogen te verbeteren om eiwitten te identificeren die belangrijke therapeutische doelen zijn bij menselijke kankers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), het National Cancer Institute (R01 CA122804), het Ministerie van Defensie (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-1-1-0073 en W81XWH-15-1-0193) en The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 en 2015-05-007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ad5CMV-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody Thermo/Fisher GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics Bioconductor http://www.bioconductor.org alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31 Abcam ab28364
Celigo Image Cytometer Nexcelom Bioscience N/A
Cell Stripper Corning 25-056-Cl mixture of chelators
DAB staining kit Vector Labs MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) DAVID https://david.ncifcrf.gov functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM Corning 15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) Thermo/Fisher EP0701 and K1072
erbB4 antibodies Santa Cruz sc-284
erbB4 antibodies Abcam ab35374
erbB4 antibodies Millipore HFR1: 05-1133
FACS Sorter BD Biosciences Aria II
Forskolin Sigma F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources GenomeSpace https://genomespace.org/support/tools/ general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine Corning 25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool Gorilla N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis Broad Institute N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice Envigo (Previously Harlan Labs) 69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) Illumina Hi Seq 2500 DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis DNAStar LaserGene software N/A software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly software alignment used for step 4.3 N/A software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix Corning 354230
NRG1-beta In house Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342 Thermo 62249
Panther Gene Ontology Classification System Panther http://pantherdb.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer) Partek, Ver 7 N/A software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep Corning 30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		 Eurofins Genomics Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

 Eurofins Genomics Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine Fisher 51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays R&D Systems ARY003B
Real time glo Promega G9712 bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite ToppGene https://toppgene.cchmc.org functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) Invitrogen 15596026
Tyramide Signal Amplification Kit Perkin Elmer NEL721001EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
  2. Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
  3. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
  4. Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
  5. Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
  6. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  7. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
  8. Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
  9. Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
  10. Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
  11. Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
  12. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  13. Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
  14. Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
  15. Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
  16. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  17. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  18. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  19. Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
  20. Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
  21. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  23. Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
  24. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  25. Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
  26. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  27. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  28. Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
  29. Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
  30. Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
  31. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
  32. Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
  33. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  34. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
  35. Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
  36. Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
  37. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 174 Genetisch gemodificeerde muizen sarcoom Cre-expressing adenovirus flowcytometrie overlevingstests proliferatietests xenografting RNA-Seq embryonale dodelijke knock-out
Het definiëren van genfuncties in tumorigenese door <em>ex vivo</em> ablatie van gevlochten allelen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumorcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Longo, J. F., Brosius, S. N.,… More

Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells. J. Vis. Exp. (174), e62740, doi:10.3791/62740 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter