Продольная прижизненная визуализация через прозрачные силиконовые окна
Summary
Здесь представлен подход для долгосрочной прижизненной визуализации с использованием оптически чистых силиконовых окон, которые могут быть приклеены непосредственно к интересующей ткани / органу и коже. Эти окна дешевле и универсальнее, чем другие, используемые в настоящее время в полевых условиях, а хирургическое введение вызывает ограниченное воспаление и дистресс у животных.
Abstract
Прижизненная микроскопия (IVM) позволяет визуализировать движение, деление и гибель клеток при разрешении одной клетки. IVM через хирургически вставленные окна визуализации особенно мощный, потому что он позволяет продольное наблюдение за одной и той же тканью в течение нескольких дней до недель. Типичные окна для визуализации состоят из стеклянной крышки в биосовместимой металлической раме, пришитой к коже мыши. Эти окна могут мешать свободному движению мышей, вызывать сильную воспалительную реакцию и выходить из строя из-за разбитого стекла или разорванных швов, любой из которых может потребовать эвтаназии. Для решения этих проблем были разработаны окна для долгосрочной визуализации органов брюшной полости и молочных желез из тонкой пленки полидиметилсилоксана (PDMS), оптически прозрачного силиконового полимера, ранее использовавшегося для краниальных окон визуализации. Эти окна можно приклеивать непосредственно к тканям, сокращая время, необходимое для вставки. PDMS является гибким, что способствует его долговечности на мышах с течением времени — было протестировано до 35 дней. Продольная визуализация – это визуализация одной и той же области ткани во время отдельных сеансов. Сетка из нержавеющей стали была встроена в окна, чтобы локализовать одну и ту же область, что позволило визуализировать динамические процессы (например, инволюцию молочной железы) в одних и тех же местах, с интервалом в несколько дней. Это силиконовое окно также позволило контролировать одиночные диссеминированные раковые клетки, развивающиеся в микрометастазы с течением времени. Силиконовые окна, используемые в этом исследовании, проще вставить, чем стеклянные окна с металлическим каркасом, и вызывают ограниченное воспаление изображенных тканей. Кроме того, встроенные сетки позволяют легко отслеживать одну и ту же область ткани в повторных сеансах визуализации.
Introduction
Прижизненная микроскопия (IVM), визуализация тканей у анестезируемых животных, дает представление о динамике физиологических и патологических событий при клеточном разрешении в интактных тканях. Применение этого метода широко варьируется, но IVM сыграл важную роль в области биологии рака, чтобы помочь выяснить, как раковые клетки вторгаются в ткани и метастазируют, взаимодействуют с окружающей микросредой и реагируют на лекарства 1,2,3. Кроме того, IVM был ключом к углублению понимания сложных механизмов, регулирующих иммунные реакции, предоставляя понимание, дополняющее подходы профилирования ex vivo (например, проточная цитометрия). Например, эксперименты с прижизненной визуализацией выявили подробности об иммунных функциях, поскольку они связаны с миграцией клеток и контактом между клетками, и предложили платформу для количественной оценки пространственно-временной динамики в ответ на травму или инфекцию 4,5,6,7. Многие из этих процессов также могут быть изучены с помощью гистологического окрашивания, но только IVM позволяет отслеживать динамические изменения. Фактически, в то время как гистологический срез предлагает снимок ткани в данный момент времени, прижизненная визуализация может отслеживать межклеточные и субклеточные события в одной и той же ткани с течением времени. В частности, прогресс в флуоресцентной маркировке и разработка молекулярных репортеров позволили соотнести молекулярные события с клеточным поведением, таким как пролиферация, смерть, подвижность и взаимодействие с другими клетками или внеклеточным матриксом. Большинство методов IVM основаны на флуоресцентной микроскопии, которая из-за рассеяния света затрудняет визуализацию более глубоких тканей. Поэтому ткань, представляющая интерес, часто нуждается в хирургическом воздействии с помощью часто инвазивной и терминальной процедуры. Таким образом, в зависимости от участка органа, ткань может быть изображена непрерывно в течение периода, варьирующегося от нескольких до 40 ч8. В качестве альтернативы, хирургическое введение окна постоянной визуализации позволяет последовательно визуализировать одну и ту же ткань в течение периода от нескольких дней до недель 7,9.
Разработка новых окон визуализации была подчеркнута как технологическая необходимость дальнейшего совершенствования подходов к прижизненной визуализации10. Прототипное окно прижизненной визуализации представляет собой металлическое кольцо, содержащее стеклянную крышку, закрепленную на коже швами11. Вмешательство в свободное движение, накопление экссудата и повреждение стеклянной крышки являются общими проблемами, наблюдаемыми при использовании таких окон. Кроме того, прототип окна требует специализированного производства, а хирургическая процедура может потребовать обширной подготовки. Для решения этих проблем полидиметилсилоксан (PDMS), силиконовый полимер, который ранее использовался в черепных окнах для долгосрочной визуализации в мозге12, был адаптирован для использования в визуализации органов брюшной полости и молочных желез. Здесь представлен подробный метод создания силиконовых окон на основе PDMS, в том числе о том, как отлить окно вокруг сетки из нержавеющей стали, чтобы обеспечить ориентиры для повторного изображения одних и тех же областей ткани. Кроме того, описана простая, без швов хирургическая процедура введения окна над органами брюшной полости или молочной железой. Этот новый подход преодолевает некоторые из наиболее распространенных проблем с используемыми в настоящее время окнами визуализации и повышает доступность продольной прижизненной визуализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Окна прижизненной визуализации являются важными инструментами для непосредственной визуализации физиологических и патологических процессов с клеточным разрешением, поскольку они разворачиваются с течением времени. Новая процедура, описанная для литья и вставки гибких силиконовых …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Роба Эйферта за его помощь в разработке и оптимизации решеток из нержавеющей стали лазерной резки. Эта работа была поддержана Онкологическим центром CSHL (P30-CA045508) и средствами для M.E. от Национальных институтов здравоохранения (NIH) (1R01CA2374135 и 5P01CA013106-49); CSHL и Northwell Health; Фонд семьи Томпсон; Плавайте по Всей Америке; и грант Фонда Саймонса CSHL. M.S. был поддержан Национальным институтом общих медицинских наук Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) и Национальным институтом рака NIH под номером 1F30CA253993-01. L.M. поддерживается постдокторской стипендией Фонда Джеймса С. Макдоннелла. J.M.A. является получателем стипендии Института исследований рака / Ирвингтонской постдокторской стипендии (CRI Award #3435). D.A.T. поддерживается Специализированной лабораторией по исследованию рака поджелудочной железы Фонда Люстгартена и Фондом семьи Томпсон. Мультфильмы создавались с Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. . Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
