Summary

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Published: July 16, 2021
doi:

Summary

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Abstract

Vor der neuronalen Degeneration ist die Ursache für motorische und kognitive Defizite bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose (ALS) und/oder Frontotemporallappendemenz (FTLD) eine Dysfunktion der Kommunikation zwischen Neuronen und Motoneuronen und Muskeln. Der zugrunde liegende Prozess der synaptischen Übertragung beinhaltet die membrandepolarisationsabhängige synaptische Vesikelfusion und die Freisetzung von Neurotransmittern in die Synapse. Dieser Prozess geschieht durch lokalisierten Kalziumeinstrom in die präsynaptischen Terminals, in denen sich synaptische Vesikel befinden. Hier beschreibt das Protokoll fluoreszenzbasierte Live-Imaging-Methoden, die zuverlässig depolarisationsvermittelte synaptische Vesikelexozytose und präsynaptische terminale Kalziumeinflussdynamik in kultivierten Neuronen melden.

Mit einem Styrylfarbstoff, der in synaptische Vesikelmembranen eingearbeitet wird, wird die synaptische Vesikelfreisetzung aufgeklärt. Auf der anderen Seite, um den Eintritt von Kalzium zu untersuchen, wird Gcamp6m verwendet, ein genetisch kodierter fluoreszierender Reporter. Wir verwenden eine hohe Kaliumchlorid-vermittelte Depolarisation, um die neuronale Aktivität nachzuahmen. Um die synaptische Vesikelexozytose eindeutig zu quantifizieren, messen wir den Verlust der normalisierten Styrylfarbstofffluoreszenz als Funktion der Zeit. Unter ähnlichen Stimulationsbedingungen, im Falle eines Kalziumeinflusses, nimmt die Gcamp6m-Fluoreszenz zu. Die Normalisierung und Quantifizierung dieser Fluoreszenzänderung erfolgt ähnlich wie das Styrylfarbstoffprotokoll. Diese Methoden können mit transfektionsbasierter Überexpression fluoreszenzmarkierter mutierter Proteine gemultiplext werden. Diese Protokolle wurden ausgiebig verwendet, um synaptische Dysfunktion in Modellen von FUS-ALS und C9ORF72-ALS unter Verwendung von primären kortikalen und motorischen Neuronen von Nagetieren zu untersuchen. Diese Protokolle ermöglichen ein schnelles Screening von Verbindungen, die die neuronale Kommunikation verbessern können. Daher sind diese Methoden nicht nur für das Studium von ALS, sondern für alle Bereiche der neurodegenerativen und entwicklungsneurowissenschaftlichen Forschung wertvoll.

Introduction

Die Modellierung der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) im Labor ist aufgrund der überwiegend sporadischen Natur von über 80 % der Fälle1 in Verbindung mit der großen Anzahl genetischer Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie krankheitserregend sind2, eine einzigartige Herausforderung2. Trotzdem haben alle Fälle von ALS das verbindende Merkmal gemeinsam, dass es vor der vollständigen neuronalen Degeneration zu einer dysfunktionalen Kommunikation zwischen präsynaptischen Motoneuronen und postsynaptischen Muskelzellen kommt3,4. Klinisch, wenn Patienten die Konnektivität der verbleibenden oberen und unteren Motoneuronen verlieren, weisen sie während der gesamten Krankheit Merkmale der neuronalen Hyper- und Hypoerregbarkeit auf5,6,7,8,9, die komplexe zugrunde liegende molekulare Veränderungen dieser Synapsen widerspiegeln, die wir als ALS-Forscher zu verstehen versuchen.

Mehrere transgene Modelle haben gezeigt, dass Verschlechterung und Desorganisation der neuromuskulären Verbindung mit der Expression von ALS-verursachenden genetischen Mutationen auftreten, einschließlich SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 und TDP4317,18,19 durch morphologische Bewertungen, einschließlich der Bewertung von synaptischen Boutons, Wirbelsäulendichten und prä- / postsynaptischer Organisation. Mechanistisch war es seit den bahnbrechenden Arbeiten von Cole, Hodgkin und Huxley in den 1930er Jahren auch möglich, synaptische Reaktionen durch elektrophysiologische Techniken entweder in vitro-Zellkultur oder in Gewebeschnittpräparaten zu bewerten20. Durch diese Strategien haben viele ALS-Modelle synaptische Übertragungsdefizite gezeigt. Zum Beispiel verursacht eine mutierte Variante von TDP43 eine erhöhte Feuerfrequenz und verringert die Aktionspotentialschwelle in NSC-34 (Rückenmark x Neuroblastom Hybridzelllinie 34) motorisch-neuronenähnlichen Zellen21. Dieselbe Variante verursacht auch eine dysfunktionale synaptische Übertragung an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) vor dem Auftreten von verhaltensbedingten motorischen Defiziten in einem Mausmodell22. Es wurde zuvor gezeigt, dass die mutierte FUS-Expression in einem Drosophila-Modell von FUS-ALS vor lokomotorischen Defekten zu einer reduzierten synaptischen Übertragung am NMJ führt11. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht unter Verwendung induzierter pluripotenter Stammzellen, die aus C9orf72-Expansionsträgern gewonnen wurden, zeigte eine Verringerung des leicht freisetzbaren Pools synaptischer Vesikel23. Insgesamt unterstreichen diese und andere Studien, wie wichtig es ist, ein umfassenderes Verständnis der Mechanismen aufzubauen, die der synaptischen Signalübertragung in krankheitsrelevanten Modellen der ALS zugrunde liegen. Dies wird entscheidend sein, um die Pathobiologie von ALS zu verstehen und potenzielle therapeutische Ziele für Patienten zu entwickeln.

Methoden der Strom- und Spannungsspannzellen waren von unschätzbarem Wert bei der Bestimmung von Membraneigenschaften wie Leitwert, Ruhemembranpotential und Quantengehalt einzelner Synapsen20,24. Eine der wesentlichen Einschränkungen der Elektrophysiologie besteht jedoch darin, dass sie technisch anspruchsvoll ist und nur Erkenntnisse von einem einzelnen Neuron gleichzeitig liefert. Die konfokale Lebendzellmikroskopie, gekoppelt mit spezifischen fluoreszierenden Sonden, bietet die Möglichkeit, die synaptische Übertragung von Neuronen räumlich-zeitlich zu untersuchen25,26,27. Obwohl dieser Fluoreszenzansatz kein direktes Maß für die neuronale Erregbarkeit ist, kann er eine relative Messung von zwei molekularen Korrelationen der synaptischen Funktion liefern: synaptische Vesikelfreisetzung und Calciumtransienten an synaptischen Terminals.

Wenn ein Aktionspotential die präsynaptische terminale Region von Neuronen erreicht, werden Calciumtransienten ausgelöst, was den Übergang von einem elektrischen Signal zum Prozess der Neurotransmitterfreisetzung erleichtert28. Spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die in diesen Bereichen lokalisiert sind, regulieren die Kalziumsignalisierung streng, um die Kinetik der Neurotransmitterfreisetzung zu modulieren29. Die ersten berichteten fluoreszenzbasierten Aufzeichnungen von Calciumtransienten wurden entweder mit dem Zweiwellenlängenindikator Fura-2 AM oder dem Einzelwellenlängenfarbstoff Fluo-3 AM30,31,32 durchgeführt. Während diese Farbstoffe zu dieser Zeit großartige neue Erkenntnisse boten, leiden sie unter mehreren Einschränkungen wie unspezifischer Kompartimentierung innerhalb von Zellen, aktivem oder passivem Farbstoffverlust aus markierten Zellen, Photobleichen und Toxizität, wenn sie über längere Zeiträume abgebildet werden33. In den letzten zehn Jahren sind genetisch kodierte Kalziumindikatoren zu den Arbeitspferden für die Abbildung verschiedener Formen neuronaler Aktivität geworden. Diese Indikatoren kombinieren ein modifiziertes fluoreszierendes Protein mit einem Calciumchelatorprotein, das nach der Bindung von Ca2+-Ionen schnell die Fluoreszenzintensität wechselt34. Die Anwendung dieser neuen Indikatoren ist enorm und ermöglicht eine viel einfachere Visualisierung intrazellulärer Calciumtransienten sowohl in vitro- als auch in vivo-Umgebungen. Eine Familie dieser genetisch kodierten Reporter, bekannt als GCaMP, wird jetzt breit genutzt. Diese Indikatoren enthalten eine C-terminale Calmodulindomäne, gefolgt von grün fluoreszierendem Protein (GFP), und sind durch eine N-terminale Calmodulin-Bindungsregion begrenzt35,36. Die Calciumbindung an die Calmodulindomäne löst eine Wechselwirkung mit der Calmodulin-bindenden Region aus, was zu einer Konformationsänderung der gesamten Proteinstruktur und einer erheblichen Erhöhung der Fluoreszenz der GFP-Einheit führt35,36. Im Laufe der Jahre hat diese Reporterfamilie mehrere Entwicklungen durchlaufen, um unterschiedliche Auslesungen für bestimmte Kalziumtransienten mit spezifischer Kinetik (langsam, mittel und schnell) mit jeweils leicht unterschiedlichen Eigenschaften zu ermöglichen37,38. Hier wurde die Verwendung des Reporters GcaMP6 hervorgehoben, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er einzelne Aktionspotentiale und dendritische Calciumtransienten in Neuronen sowohl in vivo als auch in vitro nachweist37.

Calciumtransienten in der präsynaptischen Region lösen synaptische Vesikelfusionsereignisse aus, die eine Freisetzung von Neurotransmittern in die Synapse und die Initiierung von Signalereignissen in der postsynaptischen Zelle verursachen28,39. Synaptische Vesikel werden sowohl schnell freigesetzt als auch recycelt, da die Zelle homöostatisch eine stabile Zellmembranoberfläche und einen leicht lösbaren Pool fusionsfähiger membrangebundener Vesikel beibehält40. Der hier verwendete Styrylfarbstoff hat eine Affinität zu Lipidmembranen und verändert seine Emissionseigenschaften spezifisch anhand der Ordnung der umgebenden Lipidumgebung41,42. Somit ist es ein ideales Werkzeug für die Markierung von synaptischen Recyclingvesikeln und die anschließende Verfolgung dieser Vesikel, da sie später nach neuronaler Stimulation freigesetzt werden41,42. Das Protokoll, das generiert und optimiert wurde, ist eine Adaption der ursprünglich von Gaffield und Kollegen beschriebenen Konzepte, die es uns ermöglicht, styrylfarbstoffmarkierte synaptische Vesikelpunkta im Laufe der Zeit kontinuierlich zu visualisieren41.

Hier werden zwei verwandte fluoreszenzbasierte Methoden beschrieben, die zuverlässig über spezifische zelluläre Ereignisse berichten, die an der synaptischen Übertragung beteiligt sind. Protokolle wurden definiert, um die Dynamik des depolarisationsvermittelten präsynaptischen terminalen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelexozytose in kultivierten Neuronen zu untersuchen. Hier konzentrieren sich Methoden und repräsentative Ergebnisse auf die Verwendung primärer kortikaler oder motorischer Neuronen von Nagetieren als In-vitro-Modellsystem, da es veröffentlichte Studien mit diesen Zelltypen gibt43,44. Diese Methoden sind jedoch auch auf differenzierte humane i3-kortikal-ähnliche Neuronen anwendbar45, da wir auch mit beiden Protokollen in derzeit laufenden Experimenten in unserem Labor erfolgreich waren. Das allgemeine Protokoll ist in einem schrittweisen linearen Format dargestellt (siehe Abbildung 1). Kurz gesagt, um die Kalziumdynamik in Neuriten zu untersuchen, werden reife Neuronen mit Plasmid-DNA transfiziert, um den fluoreszierenden Reporter GCaMP6m unter einem Cytomegalovirus (CMV) -Promotor zu exprimieren37,46. Transfizierte Zellen haben eine geringe basale grüne Fluoreszenz, die in Gegenwart von Kalzium zunimmt. Interessante Regionen werden angegeben, um Fluoreszenzänderungen während unserer Manipulation zu überwachen. Damit lassen sich stark räumlich und zeitlich begrenzte Schwankungen des Calciums messen37,46. Zur Beurteilung der synaptischen Vesikelfusion und -freisetzung werden reife Neuronen mit Styrylfarbstoff beladen, der in synaptische Vesikelmembranen eingebaut wird, während sie in präsynaptischen Zellen recycelt, reformiert und mit Neurotransmittern wieder geladen werden41,42,43,47,48. Die aktuellen Farbstoffe, die zu diesem Zweck verwendet werden, markieren synaptische Vesikel entlang von Neuriten und werden als Proxy für diese Regionen in Live-Imaging-Experimenten verwendet, wie die gemeinsame Färbung von Styrylfarbstoff und Synaptotagmin durch Kraszewski und Kollegen gezeigt wurde49. Hier sind repräsentative Bilder ähnlicher Färbungen enthalten, die ebenfalls durchgeführt wurden (Abbildung 2A). Frühere Forscher haben solche Farbstoffe ausgiebig verwendet, um die Dynamik synaptischer Vesikel an der neuromuskulären Verbindung und den Hippocampus-Neuronen zu melden48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Durch die Auswahl punktueller Regionen von farbstoffbeladenen Vesikeln und durch die Überwachung der Abnahme der Fluoreszenzintensität nach der Vesikelfreisetzung können die funktionelle synaptische Übertragungskapazität und die zeitliche Dynamik der Freisetzung nach Stimulation untersucht werden43. Für beide Methoden wird ein Medium verwendet, das eine hohe Konzentration an Kaliumchlorid enthält, um Zellen zu depolarisieren, um neuronale Aktivität nachzuahmen. Bildgebungsparameter werden angegeben, um Intervalle von unter einer Sekunde zu erfassen, die sich über eine Basisnormalisierung erstrecken, gefolgt von unserer Stimulationserfassungsperiode. Fluoreszenzmessungen zu jedem Zeitpunkt werden bestimmt, auf den Hintergrund normalisiert und über den experimentellen Zeitraum quantifiziert. Calcium-Influx-vermittelte GCaMP6m-Fluoreszenzerhöhung oder effektive synaptische Vesikel-Exozytose-Styryl-Farbstofffreisetzungsfluoreszenzabnahme kann durch diese Strategie nachgewiesen werden. Detaillierter methodischer Aufbau und Parameter für diese beiden Protokolle und eine Diskussion über ihre Vorteile und Grenzen werden im Folgenden beschrieben.

Figure 1
Abbildung 1: Visuelles Rendering des allgemeinen Protokollprozesses. (1) Isolieren und kultivieren Sie primäre Nagetierneuronen in vitro zum gewählten Reifungszeitpunkt. (2) Einführung von GCaMP-DNA oder Styrylfarbstoff als Reporter der synaptischen Aktivität. (3) Richten Sie das Bildgebungsparadigma mit einem mit Live-Imaging ausgestatteten Konfokalmikroskop und der zugehörigen Software ein. Beginnen Sie mit dem Baseline-Aufzeichnungszeitraum. (4) Während Zellen noch live aufgenommen werden, stimulieren sie Neuronen durch hohe KCl-Badperfusion. (5) Bewertung von Fluoreszenzintensitätsmessungen im Laufe der Zeit, um Calciumtransienten oder synaptische Vesikelfusion zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Jefferson University genehmigt. 1. Primärkultur von Neuronen aus dem embryonalen Rattenkortex HINWEIS: Primäre kortikale Neuronen werden aus E17.5-Rattenembryonen isoliert, wie zuvor beschrieben57,58. Mit dem Erfolg dieses Kultivierungsprotokolls scheint es keine Dehnungsverzerrung zu geben. Diese M…

Representative Results

Nach der erfolgreichen Implementierung des oben genannten Protokolls werden repräsentative Ergebnisse für ein typisches Synapikelfreisetzungsexperiment mit Styrylfarbstoff gezeigt. Kultivierte kortikale Neuronen von Ratten wurden mit der in Abschnitt 6 beschriebenen Methode mit Farbstoff beladen. Die Spezifität der Farbstoffbelastung wurde durch Co-Markierung mit dem synaptischen Vesikelmarker Synaptophysin bestimmt. Ein Großteil der Styrylfarbstoff-positiven Puncta ist für diesen Marker co-positiv (<strong class="x…

Discussion

Drei Schritte, die beiden beschriebenen Methoden gemeinsam sind, sind von entscheidender Bedeutung für den experimentellen Erfolg und quantifizierbare Ergebnisse. Erstens ist die Vorbereitung von frischem aCSF vor jeder Experimentierrunde unter Einhaltung der beigefügten Anweisungen unerlässlich. Andernfalls kann eine angemessene neuronale Depolarisation verhindert werden. Eine Probe unbehandelter Kontrollneuronen sollte vor der Stimulation von Versuchsgruppen ständig getestet werden, um eine ordnungsgemäße zellul?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den anwesenden und ehemaligen Mitgliedern des Jefferson Weinberg ALS Center für kritisches Feedback und Anregungen zur Optimierung dieser Techniken und deren Analysen. Diese Arbeit wurde durch Mittel des NIH (RF1-AG057882-01 und R21-NS0103118 bis D.T.), der NINDS (R56-NS092572 und R01-NS109150 bis P.P.), der Muscular Dystrophy Association (D.T.), des Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), der Family Strong 4 ALS Foundation und der Farber Family Foundation (B.K.J., K.K, und P.P.) unterstützt.

Materials

20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

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Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

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