Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Флуоресцентное измерение синаптических функций в реальном времени в моделях бокового амиотрофического склероза

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

Описаны два связанных метода для визуализации субклеточных событий, необходимых для синаптической передачи. Эти протоколы позволяют в режиме реального времени отслеживать динамику пресинаптического притока кальция и слияния синаптических везикулных мембран с использованием визуализации живых клеток культивируемых нейронов in vitro .

Abstract

До дегенерации нейронов причиной двигательного и когнитивного дефицита у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС) и/или деменцией лобно-височной доли (FTLD) является нарушение связи между нейронами и двигательными нейронами и мышцами. Основной процесс синаптической передачи включает мембранно-деполяризационно-зависимое синаптическое слияние везикул и высвобождение нейротрансмиттеров в синапс. Этот процесс происходит через локализованный приток кальция в пресинаптические терминали, где находятся синаптические везикулы. Здесь протокол описывает флуоресцентные методологии визуализации в реальном времени, которые надежно сообщают о деполяризационно-опосредованном синаптическом экзоцитозе везикул и динамике притока пресинаптического терминального кальция в культивируемых нейронах.

Используя стириловый краситель, который включен в синаптические пузырьковые мембраны, выясняется высвобождение синаптических пузырьков. С другой стороны, для изучения поступления кальция используется Gcamp6m, генетически закодированный флуоресцентный репортер. Мы используем высокую деполяризацию, опосредованную хлоридом калия, для имитации активности нейронов. Чтобы однозначно количественно оценить экзоцитоз синаптических пузырьков, мы измеряем потерю нормализованной флуоресценции стирилового красителя как функцию времени. При аналогичных условиях стимуляции, в случае притока кальция, флуоресценция Gcamp6m увеличивается. Нормализация и количественная оценка этого изменения флуоресценции выполняются аналогично протоколу стирилового красителя. Эти методы могут быть мультиплексированы с трансфекционной сверхэкспрессией флуоресцентно помеченных мутантных белков. Эти протоколы широко использовались для изучения синаптической дисфункции в моделях FUS-ALS и C9ORF72-ALS, используя первичные корковые и двигательные нейроны грызунов. Эти протоколы легко позволяют проводить быстрый скрининг соединений, которые могут улучшить нейронную связь. Таким образом, эти методы ценны не только для изучения БАС, но и для всех областей исследований нейродегенеративной и развивающей нейробиологии.

Introduction

Моделирование бокового амиотрофического склероза (БАС) в лаборатории становится уникально сложным из-за чрезвычайно спорадического характера более 80% случаев1 в сочетании с огромным количеством генетических мутаций, которые, как известно, являются причинами заболеваний2. Несмотря на это, все случаи БАС объединяет та особенность, что до прямой нейрональной дегенерации существует дисфункциональная связь между пресинаптическими двигательными нейронами и постсинаптическими мышечными клетками3,4. Клинически, поскольку пациенты теряют связность оставшихся верхних и нижних двигательных нейронов, у них проявляются особенности гипер- и гиповозбудимости нейронов на протяжении всего заболевания5,6,7,8,9, отражающие сложные молекулярные изменения этих синапсов, которые мы, как исследователи БАС, стремимся понять.

Многочисленные трансгенные модели показали, что ухудшение и дезорганизация нервно-мышечного соединения происходит с экспрессией БАС-причинных генетических мутаций, включая SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 и TDP4317,18,19 посредством морфологических оценок, включая оценку синаптических бутонов, плотности позвоночника и пред/постсинаптической организации. Механически, начиная с знаковых работ Коула, Ходжкина и Хаксли в 1930-х годах, также стало возможным оценивать синаптические реакции с помощью электрофизиологических методов либо в культуре клеток in vitro, либо в препаратах среза ткани20. Благодаря этим стратегиям многие модели БАС продемонстрировали дефицит синаптической передачи. Например, мутантный вариант TDP43 вызывает повышенную частоту срабатывания и снижает порог потенциального действия в NSC-34 (спинной мозг x гибридная клеточная линия 34 нейробластомы) моторно-нейроноподобных клетках21. Этот же вариант также вызывает дисфункциональную синаптическую передачу в нервно-мышечном соединении (NMJ) до начала поведенческого двигательного дефицита у мышиной модели22. Ранее было показано, что мутантная экспрессия FUS приводит к снижению синаптической передачи в NMJ в модели дрозофилы FUS-ALS до дефектов опорно-двигательного аппарата11. Недавний отчет с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из носителей расширения C9orf72, показал уменьшение легко высвобождаемого пула синаптических везикул23. В целом, эти и другие исследования подчеркивают важность построения более полного понимания механизмов, лежащих в основе синаптической сигнализации в моделях БАС, связанных с заболеванием. Это будет иметь решающее значение для понимания патобиологии БАС и разработки потенциальных терапевтических целей для пациентов.

Методы зажимных ячеек тока и напряжения были неоценимы при определении свойств мембраны, таких как проводимость, мембранный потенциал покоя и квантовое содержание отдельных синапсов20,24. Тем не менее, одним из существенных ограничений электрофизиологии является то, что она технически сложна и дает представление только от одного нейрона за раз. Конфокальная микроскопия живых клеток в сочетании со специфическими флуоресцентными зондами дает возможность исследовать синаптическую передачу нейронов пространственно-временным способом25,26,27. Хотя этот флуоресцентный подход не является прямой мерой возбудимости нейронов, он может обеспечить относительное измерение двух молекулярных корреляций синаптической функции: высвобождения синаптических пузырьков и переходных процессов кальция на синаптических терминалях.

Когда потенциал действия достигает пресинаптической терминальной области нейронов, запускаются переходные процессы кальция, облегчающие переход от электрического сигнала к процессу высвобождения нейромедиатора28. Кальциевые каналы с напряжением, локализованные в этих областях, жестко регулируют передачу сигналов кальция для модуляции кинетики высвобождения нейротрансмиттера29. Первые зарегистрированные флуоресцентные записи переходных процессов кальция были выполнены с использованием либо двухволнового индикатора Fura-2 AM, либо одноволнового красителя Fluo-3 AM30,31,32. Хотя эти красители предлагали большое новое понимание в то время, они страдают от нескольких ограничений, таких как неспецифическая компартментализация внутри клеток, активная или пассивная потеря красителя из меченых клеток, фотоотбеливание и токсичность при изображении в течение длительных периодов времени33. В последнее десятилетие генетически закодированные показатели кальция стали рабочими лошадками для визуализации различных форм нейронной активности. Эти показатели объединяют модифицированный флуоресцентный белок с белком хелатора кальция, который быстро переключает интенсивность флуоресценции после связывания ионов Ca2+34. Применение этих новых показателей обширно, что позволяет значительно упростить визуализацию внутриклеточных переходных процессов кальция как in vitro, так и in vivo. Одно семейство этих генетически закодированных репортеров, известное как GCaMP, в настоящее время широко используется. Эти индикаторы содержат С-концевой кальмодулиновый домен, за которым следует зеленый флуоресцентный белок (GFP), и ограничены N-концевой аллодулин-связывающей областью35,36. Связывание кальция с кальмодулиновой областью вызывает взаимодействие с кальмодулин-связывающей областью, что приводит к конформационному изменению общей структуры белка и существенному увеличению флуоресценции фрагмента GFP35,36. За прошедшие годы это семейство репортеров претерпело несколько эволюций, чтобы обеспечить четкое считывание для определенных переходных процессов кальция с определенной кинетикой (медленной, средней и быстрой), каждая из которых имеет немного разные свойства37,38. Здесь было подчеркнуто использование репортера GcaMP6, который, как было ранее показано, обнаруживает потенциалы одиночного действия и дендритные переходные процессы кальция в нейронах как in vivo, так и in vitro37.

Переходные процессы кальция в пресинаптической области вызывают события слияния синаптических пузырьков, вызывая высвобождение нейротрансмиттера в синапс и инициирование сигнальных событий в постсинаптической клетке28,39. Синаптические везикулы быстро высвобождаются и рециркулируются, так как клетка гомеостатически поддерживает стабильную площадь поверхности клеточной мембраны и легко высвобождаемый пул везикул, способных к слиянию, связанных с мембраной40. Используемый здесь стириловый краситель имеет сродство к липидным мембранам и специфически изменяет свои эмиссионные свойства в зависимости от упорядочения окружающей липидной среды41,42. Таким образом, это идеальный инструмент для маркировки рециркуляции синаптических везикул и последующего отслеживания этих везикул, поскольку они позже высвобождаются после стимуляции нейронов41,42. Протокол, который был сгенерирован и оптимизирован, является адаптацией концепций, первоначально описанных Гаффилдом и его коллегами, что позволяет нам визуализировать меченую стириловым красителем синаптикальную пузырьковую пункту с течением времени непрерывно41.

Здесь описаны две связанные флуоресцентные методологии, надежно сообщающие о конкретных клеточных событиях, участвующих в синаптической передаче. Были определены протоколы для исследования динамики деполяризационно-опосредованного пресинаптического терминального притока кальция и экзоцитоза синаптических везикул в культивируемых нейронах. Здесь методы и репрезентативные результаты сосредоточены на использовании первичных кортикальных или моторных нейронов грызунов в качестве модельной системы in vitro, поскольку опубликованы исследования с использованием этих типов клеток43,44. Тем не менее, эти методы также применимы к дифференцированным человеческим i3 кортикоподобным нейронам45, поскольку мы также добились успеха с обоими протоколами в текущих экспериментах в нашей лаборатории. Общий протокол описан в пошаговом линейном формате, показанном на рисунке 1. Короче говоря, для изучения динамики кальция в нейритах зрелые нейроны трансфектируют плазмидной ДНК для экспрессии флуоресцентного репортера GCaMP6m под промотором цитомегаловируса (ЦМВ)37,46. Трансфектированные клетки имеют низкий уровень базальной зеленой флуоресценции, которая увеличивается в присутствии кальция. Области, представляющие интерес, задаются для мониторинга изменений флуоресценции во время наших манипуляций. Это позволяет измерять высоко пространственно и временно локализованные колебания кальция37,46. Для оценки слияния и высвобождения синаптических пузырьков зрелые нейроны нагружают стириловым красителем, включенным в синаптические везикулярные мембраны, поскольку они рециркулируются, реформируются и перезаряжаются нейротрансмиттерами в пресинаптических клетках41,42,43,47,48. Современные красители, используемые для этой цели, маркируют синаптические везикулы вдоль нейритов и используются в качестве прокси для этих областей в экспериментах с живой визуализацией, как было показано совместным окрашиванием стирилового красителя и синаптотагмина Крашевским и его коллегами49. Сюда включены репрезентативные изображения аналогичного окрашивания, которые также были выполнены (рисунок 2А). Предыдущие исследователи широко использовали такие красители, чтобы сообщить о динамике синаптических пузырьков в нервно-мышечном соединении и нейронах гиппокампа48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Путем выбора пунктатных областей везикул, нагруженных красителем, и мониторинга снижения интенсивности флуоресценции после высвобождения везикул можно изучить функциональную синаптическую пропускную способность и временную динамику высвобождения после стимуляции43. Для обоих способов среда, содержащая высокую концентрацию хлорида калия, используется для деполяризации клеток для имитации активности нейронов. Параметры визуализации задаются для захвата интервалов менее секунды, охватывающих базовую нормализацию, за которой следует наш период захвата стимуляции. Измерения флуоресценции в каждой точке времени определяются, нормализуются на заднем плане и количественно оцениваются в течение экспериментального периода времени. С помощью этой стратегии можно обнаружить опосредованное притоком кальция флуоресценцию GCaMP6m или эффективное снижение флуоресценции высвобождения синаптических везикул экзоцитоза стириловых красителей. Ниже описываются подробные методологические настройки и параметры этих двух протоколов, а также обсуждение их преимуществ и ограничений.

Figure 1
Рисунок 1: Визуальный рендеринг всего процесса общего протокола. (1) Изолировать и культивировать первичные нейроны грызунов in vitro до выбранной временной точки созревания. (2) Ввести ДНК GCaMP или стириловый краситель в качестве репортеров синаптической активности. (3) Настройка парадигмы визуализации с использованием конфокального микроскопа, оснащенного живой визуализацией, и связанного с ним программного обеспечения. Начните базовый период записи. (4) В то время как клетки все еще подвергаются захвату живого изображения, стимулируйте нейроны с помощью перфузии ванны с высоким KCl. (5) Оценка измерений интенсивности флуоресценции с течением времени для измерения переходных процессов кальция или синаптического слияния пузырьков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры для животных, выполненные в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Джефферсона.

1. Первичная культура нейронов из эмбриональной коры головного мозга крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные корковые нейроны выделены из эмбрионов крыс E17.5, как описано ранее57,58. С успехом этого протокола культивирования, по-видимому, не существует предвзятости деформации. Этот метод кратко описан ниже. На предыдущие указанные статьи следует ссылаться для получения полной информации.

  1. Усыпляют беременных самок крыс путем вдыхания CO2 с последующим вторичным подтверждением вывиха шейки матки.
  2. Собирайте эмбрионы и изолируйте мозг в ледяном 20 мМ hePES-буферизованном сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS). От внешней оболочки коры отделите, а затем отбросьте полосатое тело и гиппокамп. Соберите кору.
  3. Используйте тонкие щипцы для удаления мозговых оболочек из коры. Для этого удерживайте кору на месте одной парой закрытых щипцов, используя мягкое давление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Со второй парой щипцов во второй руке ущипните мозговые оболочки. Снимите мозговые оболочки с помощью скользящих движений с зажатой парой. Переставьте с закрытыми щипцами и повторяйте по мере необходимости до тех пор, пока мозговые оболочки не будут полностью удалены.
  4. Инкубировать кору с 10 мкг/мл папаина в HBSS в течение 4 мин при 37 °C.
  5. Трижды промыть в HBSS, а затем аккуратно тритурировать 5-10 раз огнеполированной стеклянной пипеткой Пастера для получения однородной клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков; поддерживать пипетку внутри клеточной суспензии.
  6. Пластинчатые нейроны на 100 мкг/мл поли-D-лизина покрыты 35 мм стеклянными нижними тарелками при плотности 75 000 клеток/тарелка в нейробазальной среде с добавкой B27 (2%) и пенициллин-стрептомицином.

2. Первичная культура двигательных нейронов из эмбрионального спинного мозга крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные двигательные нейроны получают из эмбрионов крыс E13.5, как описано ранее, с небольшими модификациями59,60. С успехом этого протокола культивирования, по-видимому, не существует предвзятости деформации. Этот метод кратко описан ниже. На указанные выше статьи следует ссылаться для получения полной информации.

  1. Усыплите беременных самок крыс, как на шаге 1.1.
  2. Рассекайте 10-20 спинных мозгов из эмбрионов и разбивайтесь на мелкие фрагменты механически с помощью двух пар щипцов для защемления и вытягивания соответственно.
  3. Инкубировать в 0,025% трипсина в течение 8 мин с последующим добавлением ДНКазы по 1 мг/мл.
  4. Центрифуга через 4% мас./об подушку BSA при 470 x g в течение 5 мин при 4 °C без перерыва.
  5. Центрифужные гранулированные ячейки в течение 55 мин при 830 х г при 4 °C без торможения через подушку 10,4% (v/v) градиентной среды плотности (см. Таблицу материалов). Перенесите вперед полосу двигательных нейронов на визуальном интерфейсе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить захват всех клеток, используйте свободные от фенола среды для стадии градиента плотности и фенолсодержащие среды для всех других стадий. Интерфейс градиента плотности и среды диссоциации легко идентифицируется на основе разницы цветов.
  6. Отжимайте собранные полосы через еще 4% мас./об подушку BSA при 470 x g в течение 5 мин при 4 °C без перерыва.
  7. Повторное суспендирование очищенных двигательных нейронов в полной нейробазальной среде с добавкой B27 (2%), глютамином (0,25%), 2-меркаптоэтанолом (0,1%), конской сывороткой (2%) и пенициллин-стрептомицином.
  8. Пластинчатые нейроны на 100 мкг/мл полилизина и 3 мкг/мл покрытых ламинином покровных пластин при плотности 50 000 клеток/35 мм стеклянной нижней тарелки.

3. Трансфекция нейронов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап проводится для нейронов, которые будут проходить визуализацию кальция GCaMP и / или нейронов, в которые экзогенная плазмида ДНК или РНК, представляющая интерес, вводится до синаптической оценки. Напротив, стириловый краситель загружается непосредственно перед сеансом визуализации и рассматривается в разделе 6. Приведенное ниже резюме представляет собой протокол трансфекции, используемый для первичных нейронов грызунов в представленных примерах, но он может быть легко адаптирован и оптимизирован для потребностей пользователя.

  1. Трансфекции для культивируемых первичных корковых нейронов происходят на 12-й день in vitro (DIV 12), тогда как моторные нейроны трансфектируются на 7-й день in vitro (DIV 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги происходят в асептическом шкафу биобезопасности.
  2. Трансфектировать 500 нг GCaMP6m с помощью трансфекционного реагента в соотношении 1:2 по объему. Для котрансфекции добавьте в общей сложности 1,25 мкг общей ДНК / чашку, поддерживая это соотношение ДНК к реагенту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментальных примерах 750 нг интересующей бас/FTD плазмиды было трансфектировано для экспрессии дипептидов, связанных с C9orf72-ALS, мутантного белка FUS и т.д. Убедитесь, что флуоресцентная метка котрансфектированной плазмиды не будет конфликтовать с каналом FITC визуализации GCaMP. Аналогичным образом, если вы делаете визуализацию стириловым красителем, убедитесь, что котрансфектированная плазмида не будет конфликтовать с каналом визуализации TRITC. Использование синаптофизина-GCaMP3 одинаково эффективно в этом протоколе. Поэтому переведите такое же количество этой плазмиды и выполните все шаги, как обычно в разделе 7.
  3. Инкубировать комплекс ДНК-трансфекционных реагентов при комнатной температуре в течение 10 мин.
  4. Осторожно добавляйте инкубированный комплекс к нейронам по каплям с закручиванием. Верните блюдо в CO2-инкубатор при 37 °C в течение 45-60 мин.
  5. Удаляют всю культуральную среду, содержащую комплекс реагентов ДНК-трансфекции, и заменяют ее 50-50 объемным препаратом предварительно кондиционированных и свежих нейрональных сред. Затем поместите клетки обратно в CO2-инкубатор на 48 ч до получения изображения.

4. Приготовление буферных растворов и раствора стирилкрасителя

  1. Сделайте растворы с низким и высоким содержанием aCSF свежими перед визуализацией с использованием ингредиентов, перечисленных в таблице 1. Отфильтруйте оба буферных раствора перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дигидрат CaCl2 может образовывать Ca(OH)2 при хранении. Для максимальной эффективности всегда используйте недавно открытый контейнер. Если это невозможно, для удаления Ca(OH)2 с внешней поверхности и обеспечения максимальной растворимости растворы могут быть газированы газообразным CO2 в течение 5 мин до добавления CaCl2. Если этот шаг сделан, отрегулируйте рН полученного раствора для поддержания значения рН 7,4, так как чрезмерная карбонизация приведет к образованию Ca(HCO3)2.
Низкий буфер KCL aCSF (pH от 7,40 до 7,45)
Реагент Концентрация
ХЕПЕС 10 мМ
НаКл 140 мМ
ККл 5 мМ
Глюкоза 10 мМ
CaCl2 2H2O 2 мМ
MgCl2 4H2O 1 мМ
Высокий буфер KCL aCSF (pH от 7,40 до 7,45)
Реагент Концентрация
ХЕПЕС 10 мМ
НаКл 95 мМ
ККл 50 мМ
Глюкоза 10 мМ
CaCl2 2H2O 2 мМ
MgCl2 4H2O 1 мМ

Таблица 1: Состав буферов искусственной спинномозговой жидкости (aCSF). Эта таблица включает ингредиенты для приготовления искусственных буферов спинномозговой жидкости с низким и высоким KCl, используемых при визуализации и стимуляции нейронов. Инструкции по подготовке см. в разделе 4.

  1. Приготовьте раствор стирилового красителя, взяв флакон с красителем 100 мкг и восстановив его до концентрации запаса 10 мМ с дистиллированной водой или нейробазальной средой.

5. Настройка микроскопа и перфузионной системы

ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации тарелок Петри со стеклянным дном предпочтительны инвертированные конфокальные флуоресцентные микроскопы из-за гибкости перфузии и для использования высокочисленного масляного погружного объектива с высокой числовой апертурой. Обратитесь к Таблице материалов для конфокального микроскопа, камеры и объективов, используемых для визуализации примеров, подробно описанных в разделе Репрезентативные результаты .

  1. Выполните все эксперименты при 37 °C с постоянным уровнем CO2 5% с использованием каскадного крепления, связанного с системой инкубатора.
  2. Управляйте получением изображений с помощью конфокального программного обеспечения. Оптимизируйте настройки сбора в начале сеанса визуализации, чтобы выбрать мощность возбуждения и усиления, чтобы обеспечить оптимальную визуализацию сигналов без фотоотбеливания.
    1. Поддерживайте мощность возбуждения, время экспозиции, усиление детектора и частоту кадров постоянными во всех образцах. Выполняйте покадровую съемку с соотношением сторон 512 x 512 и частотой кадров 2 изображения/с, чтобы свести к минимуму отбеливание красителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя пункта должна быть хорошо видна, интенсивность лазера должна быть установлена на минимально возможный уровень, чтобы избежать отбеливания и фототоксичности. Установите конфокальную диафрагму на самую узкую настройку для достижения оптимального разрешения флуоресцентной пункции в нейритах. Время экспозиции установлено на уровне 200 мс или менее, что соответствует всем образцам. Максимальная скорость изображения используемой камеры составляла 2 изображения/с. При использовании более быстрой камеры можно сделать больше изображений. По возможности следует выбирать временные параметры визуализации.
  3. Выберите следующие комбинации флуоресцентных возбуждений/дихроичных/эмиссионных фильтров для визуализации с использованием конфокального программного обеспечения: Gcamp6m/Gcamp3 с FITC и стириловый краситель с TRITC соответственно.
  4. Используйте идеальную функцию фокусировки программного обеспечения для сбора конфокальных изображений во время покадровой визуализации, чтобы избежать z-дрейфа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой скорости изображения визуализируется одна плоскость. Обеспечение отсутствия z-дрейфа во время эксперимента очень важно.
  5. Выберите вкладку Время на панели получения изображения, чтобы задать периоды и интервалы записи.
    1. Установите Фазу #1 на Интервал 500 мс, Продолжительность 3 - 5 мин.
    2. Установите Фазу #2 на Интервал 500 мс, Продолжительность 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза No 1 соответствует базовой записи, фаза No 2 - периоду стимуляции, соответственно.
  6. Соберите гравитационный перфузионный аппарат для aCSF с помощью системы управления клапанами и канального коллектора.
    1. Загрузите высокий KCl (см. таблицу 1) в шприц объемом 50 мл в верхней части аппарата, причем трубки проходят через систему. Установите скорость потока на 1 мл/мин.
  7. Загрузите стеклянную тарелку диаметром 35 мм, содержащую нейроны, на конфокальную стадию визуализации, а конец перфузионной трубки поместить на край чашки. Выберите поле для визуализации.

6. Визуализация стириловым красителем высвобождения синаптических пузырьков

  1. Инкубировать клетки при низком KCl aCSF (см. таблицу 1) в течение 10 мин при 37 °C, 48 ч после трансфекции.
  2. Загрузите первичные кортикальные или двигательные нейроны на стеклянные чашки Петри стириловым красителем.
    1. Удалить низкий KCl aCSF путем аспирации.
    2. Используйте пипетку для загрузки нейронов в темноте 10 мкМ стирилового красителя в aCSF, содержащего 50 мМ KCl в течение 5 мин.
    3. Удалите нагрузочный раствор и нейроны ванны при низком KCl aCSF в течение 10 мин, чтобы исключить неспецифическую нагрузку красителя.
  3. Поместите 35-миллиметровую стеклянную нижнюю тарелку на сцену визуализации, а затем наблюдайте либо под 20-кратным воздушным объективом, либо под 40-кратным масляным погружным объективом перевернутого конфокального микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуоресценцию GFP для обнаружения трансфектированных клеток в случае клеток, совместно трансфектированных плазмидой, помеченной GFP.
  4. Возбуждайте стириловый краситель с помощью лазера 546 нм, собирайте излучение с помощью полосового фильтра 630-730 нм (TRITC).
  5. Выберите поле изображения и обеспечьте идеальную фокусировку. Затем сделайте одно неподвижное изображение с каналами маркеров brightfield, TRITC и флуоресцентных маркеров, чтобы отметить границы нейронов.
  6. Запустите Run Now в программном обеспечении для приобретения. Проводят базальную запись в течение 3-5 мин, чтобы исключить изменения интенсивности красителя, если таковые имеются (фаза No1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно обеспечить, чтобы любое снижение интенсивности красителя было вызвано высвобождением синаптических пузырьков, а не пассивной диффузией красителя или фотоотбеливанием. Этот 3-5-минутный период предварительной стимуляции должен привести к устойчивому и поддерживаемому уровню интенсивности красителя. Последние 30 секунд этой записи будут использоваться для определения среднего базового значения флуоресценции для каждого ROI. Перед оценкой экспериментальных условий также может быть выполнено дополнительное условие нестимуляции приблизительно 10 мин непрерывной записи с использованием предполагаемых настроек сбора для обеспечения устойчивых значений флуоресценции с использованием лазерных настроек в течение длительного периода.
  7. При переключении на Фазу #2 срабатывайте на кнопке для перфузионной системы. Затем постоянно перфьминируйте 50 мМ KCl к нейронам, чтобы облегчить выгрузку красителя (фаза No 2).
    1. Выполняйте записи в течение 300 с после добавления KCl. После этого приобретение прекращается; запустить переключатель off для перфузионной системы.
  8. Сохраните эксперимент и проанализируйте данные с помощью конфокального программного обеспечения, как описано в разделе 8 ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть остановлен на этом этапе, а анализ может быть выполнен позже. В случае, когда клетки не требуют трансфекции для экспрессии интересующих белков, этот протокол может быть выполнен в любой момент времени in vitro при попытке изучить функциональность синаптической разгрузки. После теста контрольных клеток для обеспечения надлежащей синаптической разгрузки экспериментатор должен быть ослеплен генетическими или фармакологическими условиями каждого тестируемого блюда, чтобы свести к минимуму предвзятость.

7. Флуоресцентная визуализация переходных процессов кальция Gcamp6m

  1. Трансфектируют первичные корковые нейроны грызунов, культивируемые на 35-миллиметровой посуде со стеклянным дном с 500 нг Gcamp6m, как указано в разделе 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании совместно трансфектируют нейроны с интересующей плазмидой, содержащей флуоресцентную метку в красном или дальне-красном диапазоне.
  2. Инкубируйте нейроны с низким KCl aCSF в течение 15 мин 48 ч после трансфекции, а затем установите тарелку на платформу визуализации.
  3. Визуализируйте флуоресценцию GCaMP6m с помощью фильтра FITC (488 нм) и объектива 20x или 40x.
  4. Выберите поле изображения и обеспечьте идеальную фокусировку. Затем сделайте одно неподвижное изображение с каналами маркеров brightfield, FITC и флуоресцентных маркеров, чтобы отметить границы нейронов.
  5. Запустите Run Now в программном обеспечении для приобретения. Проводят базовую запись в течение 5 мин, а затем перфузируют с aCSF, содержащим 50 мМ KCL, таким же образом, как описано в разделе 6 для экспериментов со стириловым красителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой визуализации является измерение вызванных переходных процессов кальция. Если нейрон обладает базальной активностью возбуждения и потоками кальция в период предварительной стимуляции, он не используется в анализе данных. Вместо этого используются только клетки со стабильной фоновой флуоресценцией. Периоды постстимуляции также могут быть продлены до 60 мин для переходных процессов кальция, с дополнительной непрерывной перфузией kCl или без нее.
  6. Сохраните эксперимент и проанализируйте данные с помощью конфокального программного обеспечения, как описано в разделе 8 ниже. Эксперимент может быть остановлен на этом этапе, а анализ может быть выполнен позже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки не требуют трансфекции для экспрессии интересующих белков, этот протокол может быть выполнен в любой момент времени in vitro при попытке исследовать переходные процессы кальция. После тестирования контрольных клеток для обеспечения измерения переходных процессов кальция экспериментатор должен быть ослеплен генетическими или фармакологическими условиями каждого тестируемого блюда, чтобы свести к минимуму предвзятость.

8. Анализ изображений

  1. Открывайте покадровые изображения с помощью конфокального программного обеспечения.
  2. Выравнивание изображений в покадровых рядах с помощью командной серии : Image | обработка | Выровнять текущий документ. Выберите «Выровнять по первому кадру».
  3. Выделите интересующие области (ROI) вдоль нейритов с помощью инструмента выделения ROI, значка в форме боба справа от рамки изображения (рисунок 3B). Кроме того, отметьте рентабельность инвестиций, представляющую интенсивность фоновой флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ROI выбираются путем выбора областей отчетливо разделенной пункции вдоль нейронных дорожек, обозначенных неподвижным изображением яркого поля. Для анализа выбирается не менее пяти ROI на нейрон. Фон roi выбирается в области поля зрения, которая не содержит нейритов.
  4. Измерьте необработанную флуоресценцию с течением времени для выбранных ROI с помощью следующей серии команд: Измерение | Измерение времени.
    1. Запустите функцию «Измерение» в верхней части панели «Измерение времени ». Генерируется графическое представление необработанной флуоресценции с течением времени (рисунок 3C) и количественные данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая точка данных представляет собой необработанную флуоресценцию для этой рентабельности инвестиций для кадра, связанного с этой конкретной измеренной точкой времени.
  5. Экспортируйте интенсивность необработанной флуоресценции в программное обеспечение для работы с электронными таблицами.
  6. Анализируйте каждую рентабельность инвестиций независимо. Во-первых, нормализуйте данные, вычитая интенсивность фоновой ROI из интенсивности ROI интереса в каждый момент времени.
    1. Возьмите необработанное значение флуоресценции из фоновой рентабельности инвестиций в каждый конкретный момент времени и вычтите его из значения необработанной интенсивности ROI в этот момент времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается в течение всего периода записи, как базальной, так и стимулирующей фаз.
  7. Определите среднюю рентабельность инвестиций по процентной интенсивности за последние 30 с базового уровня.
    1. Усредните нормализованные исходные базальные значения, полученные на шаге 8,6, из последних 30 с 3-5-минутного базального периода записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Весь период базальной записи может быть использован для создания этого значения. Однако, поскольку это значение стабилизируется и сохраняется, 60-временные точки последних 30 секунд имеют достаточный размер выборки, чтобы представить целое.
  8. Сравните это базовое значение с нормализованным значением интенсивности в каждой точке времени, генерируя изменение значения флуоресценции (ΔF).
    1. Возьмите значение из шага 8.7 и вычтите среднее базовое значение флуоресцентной жидкости. Делайте это и последующие шаги в течение всего периода записи, как базальной, так и стимулирующей фаз.
  9. Рассчитайте это изменение относительно базового значения флуоресценции, генерируя изменение флуоресценции/базовой флуоресценции (ΔF/F). Для этого возьмите значение из шага 8.8 и разделите его на среднее базовое значение флуоресцента.
  10. Наконец, установите значение начальной точки равным 1, чтобы увеличение или уменьшение можно было легко визуализировать графически с течением времени.
    1. Возьмите значение, созданное на шаге 8.9, и добавьте 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это сделано правильно, 30 секунд значений базового периода должны находиться вблизи значения 1. В клетках, эффективно высвобождающих синаптическое содержимое, это значение должно иметь тенденцию от 1 до 0 после начала стимуляции. Пример шагов 6-9 представлен на рисунке 3E.

9. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментатор может быть не слеп к экспериментальным условиям, чтобы соответствующим образом объединить данные для анализа. Используйте размер выборки не менее 10 нейронов на условие из каждого из трех независимых экспериментов. Рассматривайте нейроны для включения только в том случае, если можно обозначить по крайней мере пять областей ROI. Этот уровень экспериментальной репликации был достаточным в опубликованных исследованиях, чтобы продемонстрировать глубокую потерю синаптической разгрузки в связанных с БАС поли-GA-содержащих клетках по сравнению с контрольной группой GFP (см. Репрезентативные результаты). Однако, если наблюдается более тонкий фенотип, количество биологических и/или технических реплик может потребовать оптимизации пользователем.

  1. Используя все вычисленные значения ΔF/F с течением времени из ROI данного экспериментального условия, определите среднее значение ΔF/F для каждой точки времени вместе с SEM.
  2. Построение данных с помощью программного обеспечения для построения графиков и статистики в формате xy, где x — прошедшее время, а y — значение ΔF/F, рассчитанное на шаге 9.1. Представьте все значения как средние ± SEM.
  3. Чтобы определить статистическую значимость, используйте t-тест Стьюдента для сравнения двух групп и одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA), за которым следует постхок-анализ Туки для сравнения трех или более групп.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После успешной реализации вышеуказанного протокола показаны репрезентативные результаты для типичного эксперимента по высвобождению синаптических пузырьков стириловым красителем. Культивируемые первичные корковые нейроны крыс нагружали красителем с использованием метода, описанного в разделе 6. Специфичность загрузки красителя определяли путем совместной маркировки с синаптическим везикулярным маркером синаптофизина. Большинство стириловых красителей положительных пункт являются коположительными для этого маркера (рисунок 2А). Чтобы определить, вызывают ли настройки, используемые для визуализации стирилового красителя, фотоотбеливание, как правило, необработанная скважина загружается красителем и визуализируется в течение длительного 10-минутного периода без стимуляции, чтобы убедиться, что значения флуоресценции остаются постоянными.

Кроме того, результаты снова показаны с использованием совместной маркировки синаптофизина и стирилового красителя, как показано на рисунке 2А. Эти флуорофоры были совместно изображены с использованием парадигмы, указанной в разделе 6 для визуализации стирилового красителя TRITC, плюс двойной захват флуоресценции синаптофизина с использованием высокоинтенсивной лазерной мощности на канале DAPI для визуализации mTurquoise-synaptophysin. Показаны репрезентативные изображения синаптических областей пре- и постстимуляции (рисунок 2В). Хотя этот метод является косвенным выводом об отсутствии фотоотбеливания, анализ необработанных значений интенсивности за весь период визуализации показывает, что интенсивность синаптофизина остается постоянной, в то время как интенсивность стирилового красителя снижается после стимуляции (рисунок 2C). Таким образом, взяв этот эксперимент и другие наши средства контроля стабильной флуоресценции перед стимуляцией и в течение длительных периодов времени в нестимуляционных скважинах, мы установили, что снижение стириловой флуоресценции можно отнести к синаптической разгрузке через деполяризацию KCl, а не к эффектам фотоотбеливания.

Figure 2
Рисунок 2: Оценка специфичности и параметров визуализации маркировки стириловым красителем. (A) Репрезентативное 40-кратное изображение меченого стириловым красителем кортикального нейрона крысы (красный), который был трансфектирован через 24 ч ранее плазмидой для экспрессии mTurquoise2-synaptophysin61, вытесненного промотором синапсина (зеленый). Колокализация этих двух флуорофоров указывает на то, что подавляющее большинство стириловых пункт, положительных на краситель, окрашиваются совместно с синаптическим везикулярным маркером синаптофизина. Шкала указывает на 5 мкм. (B) Кортикальные нейроны были трансфектированы, а стириловый краситель загружен как в (A) и визуализирован в соответствии с парадигмой стирилового красителя вместе с двойным флуоресцентным захватом mTurquoise-synaptophysin на канале DAPI. Репрезентативные изображения показывают области пункты синаптофизина и стирилового красителя до и после стимуляции. Шкала указывает на 5 мкм. (C) Флуоресценция контролировалась с течением времени для синаптофизина (верхний канал DAPI) и стирилового красителя (нижняя часть канала FITC). Интенсивность синаптофизина поддерживалась при устойчивой флуоресценции в течение периода визуализации и стимуляции, в то время как флуоресценция стирилового красителя уменьшалась по мере того, как краситель выгружался при стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Репрезентативные изображения показывают нагрузку стирилового красителя во время визуализации с выбором ROI (рисунок 3A-B). Интенсивность необработанной флуоресценции выбранных ROI и фоновая рентабельность инвестиций строятся с помощью конфокального программного обеспечения (рисунок 3C). Нейроны, показанные здесь, также были трансфектированы плазмидами для изучения эффектов дипептидных белков, продуцируемых в контексте C9ORF72-ALS, а именно FLAG-eGFP и FLAG-GA50-eGFP, вытесненных промотором T7. Успешное высвобождение синаптических пузырьков приводит к поразительной потере флуоресценции красителя при высокой деполяризации KCl (рисунок 3D, две верхние панели) для GFP-трансфектированного контрольного нейрона. Репрезентативное видео, включенное здесь, демонстрирует, как это проявляется во время визуализации. Кроме того, нейрон избирательно разгружает стириловый краситель в нейритовой области после стимуляции (Видео 1).

С другой стороны, нарушение синаптической передачи представлено сохраненной флуоресценцией красителя даже после высокой деполяризации KCl в нейронах, трансфектированных C9ORF72-связанной дипептидной конструкцией повтора (GA50) (Рисунок 3D, нижние две панели)43. После количественного анализа данных (рисунок 3E) данные представлены в виде интенсивности красителя во всей визуализации для контрольных (GFP) и ALS/FTD (GA50) групп (рисунок 3F)43. Этот метод также может анализировать промежуточные эффекты и не является просто двоичной мерой «все или ничего». В экспериментах, предназначенных для спасения синаптического дефицита, опосредованного GA50, экзогенный синаптический везикул-ассоциированный белок 2 (SV2) был введен лентивирусной трансдукцией с использованием плазмиды rSV2a-eGFP-pRRL, вытесненной промотором PGK человека. После визуализации и анализа, как описано выше, синаптическое возбуждение было спасено в нейронах, совместно экспрессирующих GA50 и SV2 (рисунок 3G).

Figure 3
Рисунок 3: Оценка высвобождения синаптических пузырьков через маркировку стириловым красителем. (A) Репрезентативное 40-кратное изображение меченого стириловым красителем нейрона в средах с низким KCl aCSF в начале эксперимента по визуализации. Шкала шкалы указывает на 20 мкм. (B) Изображение генерации ROI на изображении из (A). Определенные области пункты вдоль нейритов (#1-4) выбираются с помощью инструмента ROI, кнопка в форме бобов выделена справа. Окончательная рентабельность инвестиций (#5) выбирается в пустой области для определения интенсивности фонового сигнала. Области с неспецифическими, ненейронными яркими пятнами избегаются. Шкала шкалы указывает на 20 мкм. (C) Представление интенсивности сигнала для ROI #1-5 из (B) с течением времени, как показано на графике/изображено конфокальным программным обеспечением. (D) Визуальные представления областей ROI до / после стимуляции для нейрона, который эффективно подвергается синаптической передаче (две верхние панели). Две нижние панели представляют собой увеличенные изображения с непредвзятым порогом, применяемым для изоляции пунктута от фона, чтобы визуально показать отдельные области. Нейроны, содержащие GFP, эффективно подвергаются синаптическому высвобождению, тогда как экспрессия пептида GA50, связанного с C9ORF2-ALS, предотвращает этот эффект. Шкалы шкалы указывают 10 мкм - Перепечатано из Jensen et al. 202043. (E) Пример файла количественной оценки с использованием программного обеспечения для работы с электронными таблицами, показывающий нормализацию значений до базового уровня и генерацию значений ΔF/F с течением времени. Данные сначала нормализуются до фонового значения интенсивности ROI в каждый момент времени. Затем это значение сравнивается со средним базовым значением ROI интереса за последние 30 с предварительной стимуляции (показано здесь как 10 с в интервалах 1 с для простоты) (ΔF). Затем это изменение рассчитывается как доля базовой флуоресценции (ΔF/F). Наконец, значение начальной точки установлено равным 1, так что увеличение или уменьшение может быть легко визуализировано графически с течением времени. Собрано не менее пяти областей пункты на нейрон и не менее десяти нейронов на экспериментальное состояние, причем такие данные объединяются для получения средних измерений в каждый момент времени. (F) Данные из файла электронной таблицы, например в пункте (E), перемещаются в программу построения графиков и статистики. Для графика, показанного здесь, показано значение ΔF/F в каждой точке времени, усредненное по всем пунктным областям экспериментального условия, вместе с его стандартной погрешностью среднего. График здесь представляет собой данные экспериментов GFP против GA50, указанных в (D), где показаны последние 10 секунд исходного уровня и первые 10 секунд периода стимуляции, перепечатанные из Jensen et al. 202043. (G) Этот анализ может давать кривые для промежуточного синаптического высвобождения и не является просто реакцией «все или ничего». GA50 совместно экспрессировали с экзогенным синаптическим белком SV2 (синаптический везикулоассоциированный белок 2), а визуализацию и анализ стирилового красителя выполняли, как указано на предыдущих этапах. Как и на рисунке 3F, график, показанный здесь, представляет значение ΔF/F в каждой точке времени, усредненное по всем областям пункту экспериментального состояния, вместе с его стандартной погрешностью среднего. График показывает последнюю минуту исходного уровня и первую минуту периода стимуляции от Jensen et al. 202043. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Репрезентативное видео эксперимента по визуализации стирилового красителя. Показано репрезентативное видео кортикального нейрона, загруженного стириловым красителем. На видео показан период, начинающийся в момент перфузии в ванне высокого KCl aCSF. Коробчатая область выделяет нейриты с наблюдаемой потерей флуоресценции пункты с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Следуя способу, описанному в разделе 7, показаны репрезентативные флуоресцентные изображения корковых нейронов, трансфектированных GcaMP6m до и после деполяризации KCl (рисунок 4A). Графики интенсивности необработанных чисел показывают повышенные значения флуоресценции, которые колеблются, указывая на поступление кальция в нейриты после KCl-индуцированной деполяризации (рисунок 4B). Это второе репрезентативное видео показывает нейроны, экспрессирующие GcaMP6m с низкой флуоресценцией в конце исходного периода записи, чтобы продемонстрировать этот эффект. В начале стимуляции нейроны демонстрируют резкое увеличение флуоресценции (видео 2). Этот подход был успешно использован для демонстрации изменений поступления кальция в мутантной модели FUS-ALS. Астроциты в этой модели трансдуцировали аденовирусом, содержащим плазмиды eGFP-FUS, управляемые ЦМВ-промоторами. Когда кондиционированную среду из мутантных FUS-экспрессирующих астроцитов помещали на двигательные нейроны, наблюдался повышенный приток кальция по сравнению с немутантными условиями FUS после стимуляции α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA) + циклотиазида (Рисунок 4C)44. Чувствительность этого анализа была проверена путем проведения экспериментов с кальцием и без него, включенным в перфузионную среду. В условиях GFP по сравнению с GA50 , упомянутыми выше, повышенные пиковые переходные процессы кальция наблюдались в GA50 , содержащих двигательные нейроны. Примечательно, что это зависело от поступления кальция в клетку, а не от высвобождения внутренних запасов кальция. Когда кальций удаляли из стимулирующей среды aCSF, никаких переходных реакций кальция не наблюдалось ни в одном из экспериментальных условий (рисунок 4D)43.

Figure 4
Рисунок 4: Наблюдение за переходными процессами кальция в режиме реального времени с использованием репортеров GCaMP. (A) 40-кратное изображение GCaMP6m экспрессирующего нейрона, псевдо-цветное, чтобы показать интенсивность флуоресценции GFP (от низкого синего до высокого красного). Левые панели показывают все 40-кратное поле зрения до и послестимуляции. Шкала шкалы указывает на 20 мкм. Изображения справа представляют собой увеличенные версии показанных коробочных областей. Благодаря этим изображениям на глаз видно, что после стимуляции наблюдается устойчивое повышение уровня фокального невритического кальция. Шкала указывает на 12 мкм. (B) Выбор ROI и мониторинг интенсивности флуоресценции на протяжении всего эксперимента выполняется, как показано на рисунке 3. Здесь показаны последние 30 с исходного уровня и 1 мин стимуляции для двух выбранных ROI нейрона, проходящего флуоресцентный мониторинг GCaMP6m. В отличие от визуализации стириловым красителем, интенсивность флуоресценции увеличивается после стимуляции нейронов. Кроме того, как здесь отмечается, переходные процессы кальция колеблются в нейритах с течением времени; поэтому результаты обычно представляются в виде усредненного значения изменения пиковой нормализованной флуоресценции для каждой области ROI. (C) Репрезентативная количественная оценка такого эксперимента показана, как было опубликовано в Kia-McAvoy et al. 201844, где первичные двигательные нейроны, которые получали супернатант, полученный из мутантных астроцитов FUS-ALS, демонстрировали значительно повышенный приток кальция после стимуляции рецептора AMPA по сравнению с нейронами, получающими супернатант из fuS дикого типа, экспрессирующих астроциты. (D) Репрезентативная количественная оценка визуализации преходящего кальция, когда кальций не был включен в стимулирующий aCSF. Показаны состояния mCherry по сравнению с GA50-mCherry, стимулируемые высоким KCl aCSF с кальцием или без него, как опубликовано в Jensen et al. 202043. GA50, содержащие нейроны, показали повышенный пик притока кальция по сравнению с клетками, содержащими mCherry. Не было никакого повышения внутренних уровней кальция ни в одном из экспериментальных состояний, когда кальций был удален из стимулирующего высокого KCL aCSF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 2: Репрезентативное видео эксперимента GCaMP с переходным процессом кальция. Показано репрезентативное видео поля корковых нейронов, трансфектированных GCaMP6m. После исходного периода отмечается большой приток кальция на отметке 6 с при применении высокого KCl aCSF. Поступление кальция может быть измерено либо для всей клетки, либо в определенных областях нейритов, как описано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Потенциальные проблемы Возможные причины/решение
1 Неспецифическая нагрузка Будьте точны со временем загрузки. Более длительное время загрузки приводит к неспецифической загрузке FM4-64 в эндосомы и лизосомы
2 Отсутствие заметного экзоцитоза в контрольных нейронах Проверьте pH раствора с высоким KCl aCSF.
3 Потеря фокуса и боковой дрейф Убедитесь, что идеальный фокус на. Выровняйте изображения после создания образа с помощью программного обеспечения Nikon или плагина ImageJ.
4 Отбеливание флуоресценцией FM4-64 Проверьте интенсивность лазера, используемого для визуализации. Всегда старайтесь использовать как можно более низкую интенсивность. Подтвердите, что используемая интенсивность лазера не приводит к отбеливанию путем пробных запусков.

Таблица 2: Возможные проблемы и устранение неполадок в экспериментах со стириловым красителем. Типичные сценарии устранения неполадок и общие способы устранения неполадок для экспериментов по синатической выгрузке.

Потенциальные проблемы Возможные причины/решение
1 Слишком низкая эффективность трансфекции Проверьте здоровье нейронов. Если нейроны трудно трансфектировать, можно переключиться на AAV или лентивирусную трансдукцию GCaMP.
2 Накопление флуоресценции GCaMP6 в ядре Нарушение здоровья нейронов. Проверьте протокол трансфекции.
3 Потеря фокуса и боковой дрейф изображения Убедитесь, что идеальный фокус на. Выровняйте изображения после создания образа с помощью программного обеспечения Nikon или плагина ImageJ.
4 Отсутствие кальциевого ответа при стимуляции KCL Убедитесь, что pH aCSF правильный.
5 Отбеливание флуоресценции GCaMP6 Проверьте интенсивность лазера, используемого для визуализации. Всегда старайтесь использовать как можно более низкую интенсивность. Подтвердите, что используемая интенсивность лазера не приводит к отбеливанию путем пробных запусков.
6 Блеббинг нейритов Нарушение здоровья нейронов из-за трансфекции. Используйте свежую партию нейронных культур.

Таблица 3: Возможные проблемы и устранение неполадок для визуализации переходных процессов кальция в нейритах. Типичные сценарии возникновения проблем и общие способы устранения неполадок в экспериментах gCaMP с переходным процессом кальция.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Три шага, общие для обоих описанных методов, имеют решающее значение для успеха экспериментов и поддающихся количественной оценке результатов. Во-первых, подготовка свежего aCSF перед каждым раундом экспериментов имеет важное значение, следуя прилагаемым инструкциям. Неспособность сделать это может предотвратить соответствующую деполяризацию нейронов. Образец необработанных контрольных нейронов должен постоянно тестироваться перед стимуляцией любых экспериментальных групп, чтобы обеспечить надлежащую клеточную деполяризацию и обеспечить ориентир для положительных результатов, полученных в этом сеансе визуализации. Во-вторых, чтобы успешно отслеживать флуоресценцию с течением времени для конкретных синаптических областей, следует также проявлять особую осторожность при настройке параметров визуализации и областей ROI для мониторинга. Запись базового периода должна немедленно перейти к периоду регистрации стимуляции. Достаточно высокая частота кадров (2 изображения/с) необходима для захвата динамики одиночного распада высвобождения стирилового красителя. Наконец, критическим шагом в анализе экспериментов является нормализация измерений флуоресценции сначала на фоне визуализации, а затем на предварительно стимулированном исходном уровне. Как и в случае с другими протоколами визуализации, вычитание пустой области изображения сначала выполняется во всех парных измерениях флуоресценции времени, чтобы удалить любую фоновую автофлуоресценцию, которую может ввести добавление среды KCl. Также важно измерить и рассчитать среднее значение флуоресценции для каждого ROI от базового уровня последних 30 с до стимуляции. Это среднее начальное значение затем используется во всех измерениях времени для этой рентабельности инвестиций в качестве определенной отправной точки для количественной оценки интенсивности «изменения от базового уровня».

Первичную нейронную культуру, как известно, трудно трансфектировать с экзогенной ДНК, и даже оптимизированные протоколы часто дают низкую эффективность общих клеток в культуре. 20%-25% эффективности трансфекции обычно достигается в наших нейронных культурах, без каких-либо доказательств токсичности, вызванной трансфексией. В то время как довольно последовательные экспрессии наблюдаются в клетках, содержащих GCaMP, тонко отличающиеся уровни экспрессии зонда в отдельных клетках рассматриваются на основе метода количественной оценки отдельных областей изменения исходной флуоресценции по сравнению с этим исходным уровнем. Однако при такой относительно низкой эффективности использование основанных на трансфекции методов введения репортера GCaMP не является достаточно надежным для крупномасштабных биологических реплик для высокопроизводительных скрининговых исследований. Чтобы преодолеть это, коммерчески доступны несколько вариантов конструкций для лентивирусной или аденовирусной упаковки или экспрессии клеточной линии, что позволит повысить эффективность трансдукции. Первичной модификацией, которая может быть желательна при использовании этих протоколов, является использование оптогенетической стимуляции нейронов вместо применения KCl62 в ванне. Трансдукция лентивирусными конструкциями, предназначенными для экспрессии одного из семейств доступных в настоящее время канальныхродопсинов, с последующей активацией с определенными длинами волн света, позволяет осуществлять пространственный контроль для деполяризации подмножеств нейронов, а также для оценки влияния последовательностей потенциалов действия на повторяющиеся уровни притока кальция и истощение запасов синаптических пузырьков63 . Тем не менее, важно иметь в виду, что использование этого метода в настоящее время несколько ограничено, так как пользователь должен убедиться, что их оптогенетический репортер, синаптический репортер и любые дополнительные экзогенно введенные белки не имеют спектрального перекрытия между используемыми флуорофорами. Распространенной проблемой устранения неполадок с использованием стирилового красителя является снижение пассивной интенсивности в течение базового периода записи. Перед экспериментальными исследованиями важно оптимизировать интенсивность лазера и интервалы фотосъемки, чтобы свести к минимуму эффекты фотоотбеливания. Для рассмотрения экспериментов необходима стабилизация интенсивности по крайней мере в течение последних 30 с исходного периода. В таблицах 2 и 3 приведены общие проблемы и их решения для экспериментов с стириловым красителем и кальцием, соответственно.

Основным ограничением этих двух методов является то, что культуры могут быть стимулированы и исследованы только в одном случае. Поскольку применение ванны используется для введения деполяризующего агента KCl, все нейроны, подлежащие исследованию из этого состояния в этой чашке, должны находиться в пределах начального поля зрения объектива микроскопа. Если функциональность с течением времени представляет интерес, требуются парные культуры. Однако оптогенетический метод, упомянутый выше, при желании позволит наблюдать динамику кальция с течением времени. Кроме того, если нейроны имеют дефект в рециркуляции синаптических везикул, первоначальная нагрузка стирилового красителя будет нарушена. В то время как внутренняя нормализация интенсивности позволяет сравнивать между условиями, небольшие различия в величинах реакций может быть трудно обнаружить. Наконец, новые итерации этих репортеров быстро стали доступны и могут быть отключены для более быстрого времени обнаружения или более надежных результатов. Например, GCaMP6m больше не считается самым быстрым репортером переходных процессов кальция на синаптических терминалях. Вместо этого можно использовать jGCaMP864 последнего поколения.

Методы, описанные здесь, являются быстрым и надежным способом определить, нарушает ли генетическая или фармакологическая манипуляция нейронами функциональную синаптическую сигнализацию и высвобождение. Подробные эксперименты менее технически сложны и менее дорогостоящи, чем традиционная электрофизиология напряжения / тока и электронная микроскопия. Кроме того, в то время как электрофизиология по своей природе имеет низкую пропускную способность и на уровне отдельных клеток, описанные здесь протоколы имеют более высокую пропускную способность и скорость, что позволяет одновременно визуализировать несколько нейронов и выполнять множество итераций за один сеанс визуализации. Предлагается использовать эти парадигмы динамики кальция и синаптического высвобождения в качестве первого индикатора синаптических изменений передачи в моделях БАС и изучении других форм дегенерации нейронов. Хотя выводы, полученные из визуализации Gcamp6m и стириловым красителем, не могут точно определить конкретный механизм синаптической дисфункции, основываясь на таких результатах, исследователи могут затем провести целевые, основанные на фактических данных дополнительные исследования с использованием традиционных методов для определения вовлеченных каналов, числа синаптических пузырьков или квантового содержания.

Полезностью этих протоколов является быстрая и простая оценка изменений в надлежащем притоке кальция, опосредованном деполяризацией, и/или синаптическом слиянии везикул в конкретных моделях БАС. Недавно мы продемонстрировали это в публикации, показывающей увеличение притока кальция и отмену синаптической разгрузки в корковых нейронах, экспрессирующих дипептидный белок (глицин-аланин)50 в результате повторного расширения гексануклеотида C9ORF7243. Как показано в нашей опубликованной работе, эти методы могут быть легко выполнены в тандеме с котрансфекцией мутантных РНК или белков, представляющих интерес, или в клетках, культивируемых непосредственно из трансгенных моделей животных43. Кроме того, надежность и надежность этих протоколов были успешно протестированы на нейронно-дифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, индуцированных человеком45, что позволило проводить будущие исследования непосредственно в клетках, связанных с заболеванием, полученных от пациента. В другой недавней рукописи мы приводим доказательства того, что моторные нейроны дикого типа подвергаются высокому притоку кальция после стимуляции в присутствии растворимого фактора, высвобождаемого из мутантного FUS, экспрессирующего астроциты44. Астроцитарные сигнальные события кальция также глубоко переплетены с синаптической передачей в соседних нейронах65. Протокол динамики кальция был применен для исследования цельноклеточных переходных процессов кальция в моделях астроцитарной культуры, которая доказала свою эффективность как в первичных клетках грызунов, так и в клетках, полученных из IPS человека. Дальнейшее понимание динамики астроцитарного кальция и сигнализации в моделях БАС даст ценное представление о том, как синаптическая передача может повлиять на это. В конечном счете, использование репортеров GCaMP, специфичных для клеточного типа, также станет мощным инструментом для исследования динамики нейронов и астроцитарного кальция в смешанных условиях кокультуры и, в частности, для оценки неклеточных автономных эффектов, происходящих из каждой клеточной популяции.

Наконец, потенциальное использование этих методов распространяется не только на изучение БАС, но и на более широкие области нейродегенеративной и даже развивающей нейробиологии. Представлена подробная информация о конкретных плазмидах, используемых для получения репрезентативных результатов, и успешно трансфектированы плазмиды, содержащие множество различных генетических вариантов гексануклеотидных повторов и дипептидов FUS, SOD1 и C9ORF7243,44,66,67,68. При условии, что плазмиды содержат промотор, используемый в нейронах, нет никаких ограничений на то, какие модели БАС или дегенеративного заболевания могут быть изучены с использованием этих методов. Кроме того, трансфекция для экспрессии мутантных белков является совершенно необязательным этапом. Культуры, полученные из трансгенных животных или клеток, полученных от пациента человека, устраняют необходимость идентификации клеток, содержащих интересующий мутантный белок. В настоящее время эти системы ограничены таким образом, что если будет использоваться стириловый краситель, канал TRITC занят, а если используется GcaMP6, то занят канал FITC. Методы, позволяющие исследовать нейронную и астроцитарную активность в режиме реального времени, расширяют возможности для понимания анализа временного хода для синаптического созревания / дегенерации, а также экспресс-тестов на эффективность фармакологических соединений в стимулировании или подавлении нейронной коммуникации. Эти два метода поддаются масштабированию с высокой пропускной способностью для скрининга. Вместо того, чтобы покрывать нейроны в отдельных 35-миллиметровых тарелках, параметры визуализации этих двух протоколов могут быть использованы автоматически на 96-луночных пластинах. Используя такую платформу, библиотеки соединений могут быть быстро протестированы на терапевтические средства, которые модулируют поступление кальция или улучшают синаптическое высвобождение с использованием генетической модели заболевания или даже клеток, полученных непосредственно от пациентов. Этот метод может ускорить возможность подгрупповой или даже персонализированной терапии путем быстрой идентификации молекул-кандидатов для дальнейшего исследования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить нынешних и бывших членов Центра ALS Джефферсона Вайнберга за критические отзывы и предложения по оптимизации этих методов и их анализа. Эта работа была поддержана финансированием nih (RF1-AG057882-01 и R21-NS0103118 to D.T), NINDS (R56-NS092572 и R01-NS109150 to P.P),Ассоциации мышечной дистрофии (D.T.), Центра роберта Паккарда по исследованию БАС (D.T.), фонда Family Strong 4 ALS и Фонда семьи Фарбер (B.K.J., K.K. и P.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Tags

Неврология выпуск 173
Флуоресцентное измерение синаптических функций в реальном времени в моделях бокового амиотрофического склероза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter