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Neuroscience

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro 培養ニューロンの生細胞イメージングを使用して、シナプス前カルシウム流入およびシナプス小胞膜融合のダイナミクスのリアルタイムモニタリングを可能にする。

Abstract

神経変性の前に、筋萎縮性側索硬化症(ALS)および/または前頭葉性認知症(FTLD)患者の運動および認知障害の原因は、ニューロンと運動ニューロンおよび筋肉との間のコミュニケーションの機能不全である。シナプス伝達の根底にあるプロセスは、膜脱分極依存性シナプス小胞融合およびシナプスへの神経伝達物質の放出を含む。このプロセスは、シナプス小胞が存在するシナプス前終末への局在的なカルシウム流入によって起こる。ここで、プロトコルは、培養ニューロンにおける脱分極媒介シナプス小胞エキソサイトーシスおよびシナプス前末端カルシウム流入ダイナミクスを確実に報告する蛍光ベースのライブイメージング方法論を記載する。

シナプス小胞膜に取り込まれたスチリル色素を用いて、シナプス小胞放出が解明される。一方、カルシウムの侵入を研究するために、遺伝子コードされた蛍光レポーターであるGcamp6mが使用される。我々は、ニューロン活性を模倣するために、高い塩化カリウム媒介性脱分極を採用している。シナプス小胞エキソサイトーシスを明確に定量するために、我々は、時間の関数として正規化されたスチリル色素蛍光の損失を測定する。同様の刺激条件下では、カルシウム流入の場合、Gcamp6m蛍光が増加する。この蛍光変化の正規化および定量化は、スチリル色素プロトコールと同様の方法で行われる。これらの方法は、蛍光標識された変異タンパク質のトランスフェクションベースの過剰発現と多重化することができる。これらのプロトコルは、初代げっ歯類皮質および運動ニューロンを利用して、 FUS−ALSおよび C9ORF72−ALSのモデルにおけるシナプス機能障害を研究するために広く使用されている。これらのプロトコルは、ニューロン通信を改善し得る化合物の迅速なスクリーニングを容易に可能にする。したがって、これらの方法は、ALSの研究だけでなく、神経変性および発達神経科学研究のすべての分野にとって貴重です。

Introduction

実験室での筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデリングは、症例の80%以上が圧倒的に散発的な性質を持っている1と、疾患の原因であることが知られている膨大な数の遺伝子変異2のために、他に類を見ないほど困難になっています2。それにもかかわらず、ALSのすべての症例は、完全なニューロン変性の前に、シナプス前運動ニューロンとシナプス後筋細胞との間に機能不全のコミュニケーションがあるという統一的な特徴を共有しています3,4。臨床的には、患者が残りの上部および下部運動ニューロンの接続性を失うにつれて、それらは疾患全体にわたってニューロンの過興奮性および低興奮性の特徴を呈し5、6、7、8、9、これらのシナプスへの複雑な根底にある分子変化を反映しており、ALS研究者として理解しようとしている。

複数のトランスジェニックモデルが、SOD110、FUS11,12、C9orf7213、14、15、16、およびTDP4317,18,19を含むALS原因遺伝子変異の発現とともに神経筋接合部の劣化および解体が起こることを実証している。 シナプスブートン、脊椎密度、シナプス前/シナプス後組織の評価を含む形態学的評価を通じて。機構的には、1930年代にコール、ホジキン、ハクスリーの画期的な論文が発表されて以来、in vitro細胞培養または組織スライス調製物のいずれかにおいて、電気生理学的手法を通じてシナプス応答を評価することも可能であった20。これらの戦略を通じて、ALSの多くのモデルはシナプス伝達欠損を実証している。例えば、TDP43の変異変異体は、NSC-34(脊髄x神経芽腫ハイブリッド細胞株34)の運動ニューロン様細胞21において発火頻度を増強し、活動電位閾値を低下させる。この同じ変異はまた、マウスモデルにおける行動運動欠損の発症前に神経筋接合部(NMJ)で機能不全のシナプス伝達を引き起こす22。変異型FUS発現は、自発運動障害前のFUS-ALSのショウジョウバエモデルにおいてNMJにおけるシナプス伝達の減少をもたらすことが以前に示された11。C9orf72増殖キャリアに由来する誘導多能性幹細胞を用いた最近の報告は、シナプス小胞の容易に放出可能なプールの減少を明らかにした23。全体として、これらの研究や他の研究は、ALSの疾患関連モデルにおけるシナプスシグナル伝達の根底にあるメカニズムのより包括的な理解を構築することの重要性を強調しています。これは、ALSの病態生物学を理解し、患者のための潜在的な治療標的を開発する上で極めて重要である。

電流および電圧クランプ細胞の方法は、コンダクタンス、静止膜電位、および個々のシナプスの量子的含有量などの膜特性を決定する上で非常に貴重であった20,24。しかし、電気生理学の重大な限界の1つは、それが技術的に困難であり、一度に単一のニューロンからの洞察しか提供しないことです。生細胞共焦点顕微鏡は、特異的蛍光プローブと相まって、ニューロンのシナプス伝達を時空間的に調査する機会を提供する25,26,27。ニューロン興奮性の直接的な尺度ではないが、この蛍光アプローチは、シナプス機能の2つの分子相関、すなわちシナプス小胞放出およびシナプス末端におけるカルシウム過渡現象の相対的測定を提供することができる。

活動電位がニューロンのシナプス前終末領域に到達すると、カルシウム一過性が誘発され、電気信号から神経伝達物質放出の過程への移行が容易になる28。これらの領域に局在する電位依存性カルシウムチャネルは、カルシウムシグナル伝達を厳密に調節して、神経伝達物質放出の動態を調節する29。カルシウム過渡現象の最初に報告された蛍光ベースの記録は、二波長指示薬Fura-2 AMまたは単一波長色素Fluo-3 AM30、31、32のいずれかを使用して実施された。これらの色素は当時、大きな新しい洞察を提供していましたが、細胞内の非特異的な区画化、標識細胞からの能動的または受動的な色素損失、フォトブリーチング、長期間にわたって画像化された場合の毒性など、いくつかの制限に苦しんでいます33。過去10年間で、遺伝的にコードされたカルシウム指標は、様々な形態のニューロン活動を画像化するための主力製品となっている。これらの指標は、修飾蛍光タンパク質と、Ca2+イオンの結合後に蛍光強度を急速に切り替えるカルシウムキレートタンパク質とを組み合わせる34。これらの新しい指標の適用は広範であり、in vitroおよびin vivo設定の両方で細胞内カルシウム過渡現象の視覚化をはるかに容易にすることを可能にする。GCaMPとして知られるこれらの遺伝的にコードされたレポーターの1つのファミリーは、現在広く利用されている。これらの指標は、C末端カルモジュリンドメインを含み、続いて緑色蛍光タンパク質(GFP)を含み、N末端カルモジュリン結合領域によってキャップされている35、36。カルモジュリンドメインへのカルシウム結合は、カルモジュリン結合領域との相互作用を誘発し、タンパク質全体の構造における立体構造変化およびGFP部分の蛍光の実質的な増加をもたらす35,36。長年にわたり、このレポーターファミリーは、それぞれがわずかに異なる特性を有する特定の動態(低速、中速、および高速)を有する特定のカルシウム過渡現象について、異なる読み出しを可能にするために、いくつかの進化を遂げてきた37,38。ここで、レポーターGcaMP6の使用が強調されており、これは、インビボおよびインビトロの両方のニューロンにおける単一活動電位および樹状カルシウム一過性を検出することが以前に示されている37。

シナプス前領域のカルシウム一過性はシナプス小胞融合事象を誘発し、シナプスへの神経伝達物質放出を引き起こし、シナプス後細胞におけるシグナル伝達事象の開始を引き起こす28,39。シナプス小胞は、細胞が恒常的に安定した細胞膜表面積および容易に放出可能な融合可能な膜結合小胞のプールを維持するので、急速に放出され、リサイクルされる40。ここで使用されるスチリル色素は、脂質膜に対して親和性を有し、周囲の脂質環境の秩序に基づいてその発光特性を特異的に変化させる41、42。したがって、これは、シナプス小胞のリサイクルを標識し、ニューロン刺激後に後に放出されるこれらの小胞のその後の追跡のための理想的なツールである41,42。生成および最適化されたプロトコルは、Gaffieldらによって最初に記述された概念の適応であり、スチリル色素標識シナプス小胞穿刺を経時的に連続的に視覚化することを可能にする41。

ここでは、2つの関連する蛍光ベースの方法論が記載されており、シナプス伝達に関与する特定の細胞事象を確実に報告する。培養ニューロンにおける脱分極媒介シナプス前終末カルシウム流入およびシナプス小胞エキソサイトーシスのダイナミクスをプローブするためのプロトコルが定義されている。ここで、方法および代表的な結果は、これらの細胞型を用いた公表された研究があるように、インビトロモデル系として原発性げっ歯類皮質または運動ニューロンを使用することに焦点を当てている43,44。しかし、これらの方法は、分化したヒトi3皮質様ニューロン45にも適用可能であり、現在、当研究室で進行中の実験では、両方のプロトコルでも成功しています。一般的なプロトコルは、図1に示すステップワイズ線形形式で概説されています。要するに、神経突起におけるカルシウム動態を研究するために、成熟ニューロンをプラスミドDNAでトランスフェクトし、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター下で蛍光レポーターGCaMP6mを発現させる37、46。トランスフェクトされた細胞は、低レベルの基底緑色蛍光を有し、カルシウムの存在下で増加する。関心領域は、我々の操作全体を通して蛍光変化を監視するために指定される。これにより、カルシウムの高度に空間的および時間的に局在する変動を測定することができます37,46。シナプス小胞の融合と放出を評価するために、成熟ニューロンはシナプス前細胞で神経伝達物質でリサイクルされ、改質され、リロードされるにつれてシナプス小胞膜に取り込まれたスチリル色素をロードされる41,42,43,47,48。この目的のために使用されている現在の色素は、神経突起に沿ってシナプス小胞を標識し、Kraszewskiらによるスチリル色素とシナプトタグミンの共染色によって示されたように、ライブイメージング実験においてこれらの領域の代理として使用されている49。ここにも実施された同様の染色の代表的な画像が含まれる(図2A)。これまでの研究者らは、神経筋接合部および海馬ニューロンにおけるシナプス小胞ダイナミクスを報告するために、このような色素を広範囲に使用してきた48,49,50,51,52,53,54,55,56.色素を負荷した小胞の点状領域を選択し、小胞放出後の蛍光強度の低下をモニタリングすることにより、刺激後の機能的シナプス伝達能力および放出の時間的ダイナミクスを研究することができる43。両方の方法において、高濃度の塩化カリウムを含む培地が使用され、細胞を脱分極させてニューロン活性を模倣する。イメージングパラメータは、ベースライン正規化とそれに続く刺激キャプチャ期間にまたがる1秒未満の間隔をキャプチャするように指定されます。各時点での蛍光測定値が決定され、バックグラウンドに正規化され、実験期間にわたって定量化されます。カルシウム流入媒介性GCaMP6m蛍光増加または効果的なシナプス小胞エキソサイトーシスチリル色素放出蛍光減少は、この戦略を通して検出することができる。これら2つのプロトコルの詳細な方法論的セットアップとパラメータ、およびそれらの利点と制限事項に関する議論については、以下で説明します。

Figure 1
図 1: 一般的なプロトコル プロセス全体の視覚的レンダリング。 (1)初代げっ歯類ニューロンを単離し、選択した成熟時点まで インビトロで 培養する。(2)シナプス活性のレポーターとしてGCaMP DNAまたはスチリル色素を導入する。(3)ライブイメージング搭載共焦点顕微鏡と関連ソフトウェアを用いたイメージングパラダイムの設定ベースライン記録期間を開始します。(4)細胞がまだライブ画像キャプチャを受けている間、高いKCl浴灌流を介してニューロンを刺激する。(5)蛍光強度測定値を経時的に評価し、カルシウム過渡現象またはシナプス小胞融合を測定する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Protocol

この研究で実施されたすべての動物処置は、ジェファーソン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。

1. 胚性ラット皮質由来のニューロンの初代培養

注:初代皮質ニューロンは、前述のようにE17.5ラット胚から単離される57,58。この培養プロトコルの成功により、株の偏りは存在しないようです。このメソッドについては、以下で簡単に説明します。詳細については、前述の記事を参照してください。

  1. 妊娠中の雌ラットをCO2 吸入によって安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼による二次確認を行う。
  2. 胚を採取し、氷冷した20 mM HEPS緩衝ハンクス平衡塩溶液(HBSS)で脳を単離する。外側の皮質の殻から、線条体と海馬を分離して捨てます。皮質を集める。
  3. 皮質から髄膜を除去するために細かい鉗子を使用してください。これを行うには、穏やかな圧力を使用して、閉じた鉗子の1組で皮質を所定の位置に保持します。
    注:2番目の鉗子のペアを秒針にして、髄膜をつまみます。つまんだペアで転がるような動きで髄膜を剥がします。閉じた鉗子で再配置し、髄膜が完全に除去されるまで必要に応じて繰り返す。
  4. 皮質をHBSS中の10μg/mLのパパインと共に37°Cで4分間インキュベートする。
  5. HBSSで3回洗浄し、次いで、火で磨かれたガラスパスツールピペットで穏やかに5〜10回粉砕し、均一な細胞懸濁液を得た。
    注:泡を避けてください。ピペットを細胞懸濁液内に保持する。
  6. B27サプリメント(2%)およびペニシリン - ストレプトマイシンを含む神経基礎培地中の75,000細胞/皿の密度でコーティングされた100μg/mLのポリD-リジンコーティングされた35mmガラス底ディッシュ上のプレートニューロン。

2. 胚性ラット脊髄由来の運動ニューロンの初代培養

注:初代運動ニューロンは、前述のようにE13.5ラット胚から調製され、ほとんど改変されていない59,60。この培養プロトコルの成功により、株の偏りは存在しないようです。このメソッドについては、以下で簡単に説明します。詳細については、上記の記事を参照してください。

  1. ステップ1.1のように妊娠中の雌ラットを安楽死させる。
  2. 胚から10〜20個の脊髄を解剖し、2対の鉗子を使用して機械的に小さな断片に分割し、それぞれつまんで引っ張る。
  3. 0.025%トリプシン中で8分間インキュベートし、続いてDNaseを1mg/mLで添加した。
  4. 470 x g の4% w/v BSAクッションを4°Cで5分間、休憩なしで遠心分離します。
  5. 遠心分離機は、10.4%(v/v)密度勾配培地(材料表を参照)クッションを通してブレーキなしで4°Cで830 x gで55分間細胞をペレット化しました。視覚インターフェースで運動ニューロンバンドを前方に持ち越す。
    メモ: すべての細胞を確実に捕捉するには、密度勾配ステップにはフェノールフリー培地を使用し、他のすべてのステップにはフェノール含有培地を使用します。密度勾配と解離媒体の界面は、色差に基づいて容易に識別可能である。
  6. スピンは、別の4% w/v BSAクッションを470 x g で4°Cで5分間、ブレークなしでバンドを収集しました。
  7. B27サプリメント(2%)、グルタミン(0.25%)、2-メルカプトエタノール(0.1%)、ウマ血清(2%)、およびペニシリン - ストレプトマイシンを含む完全な神経基礎培地中に精製運動ニューロンを再懸濁する。
  8. 50,000細胞/35mmのガラス底ディッシュの密度で、100μg/mLのポリリジンおよび3μg/mLのラミニンコーティングされたカバースリップ上のプレートニューロン。

3. ニューロントランスフェクション

注:このステップは、GCaMPカルシウムイメージングを受けるニューロンおよび/またはシナプス評価の前に目的の外因性DNAプラスミドまたはRNAが導入されるニューロンに対して行われる。対照的に、スチリル染料は、イメージングセッションの直前にロードされ、セクション6で扱われる。以下の要約は、提示された例の一次げっ歯類ニューロンに使用されるトランスフェクションプロトコルであるが、ユーザーのニーズに容易に適合および最適化することができる。

  1. 培養された初代皮質ニューロンのトランスフェクションは 、インビトロで 12日目(DIV 12)に行われ、運動ニューロンは インビトロで 7日目(DIV 7)にトランスフェクションされます。
    注:次の手順はすべて、無菌バイオセーフティキャビネット内で行われます。
  2. トランスフェクション試薬を用いて500ngのGCaMP6mを体積比1:2の割合でトランスフェクションする。コトランスフェクションの場合は、合計 1.25 μg の総 DNA/ディッシュを追加し、この DNA 対試薬比を維持します。
    注:図示の実験例では、C9orf72-ALS結合ジペプチド、変異型FUSタンパク質などを発現させるために、目的のALS/FTD関連プラスミド750ngをトランスフェクトしています。同時トランスフェクトプラスミドの蛍光タグがGCaMPイメージングのFITCチャネルと競合しないことを確認します。同様に、スチリル色素イメージングを行う場合は、同時トランスフェクトプラスミドがイメージングの TRITC チャネルと競合しないようにします。シナプトフィジン-GCaMP3の使用は、このプロトコルにおいても同様に有効である。したがって、このプラスミドを同量トランスフェクトし、セクション7で通常どおりすべての手順に従います。
  3. DNAトランスフェクション試薬複合体を室温で10分間インキュベートする。
  4. インキュベートした複合体を、渦巻きながらニューロンに静かに加える。皿を37°CのCO2 インキュベーターに45〜60分間戻します。
  5. DNAトランスフェクション試薬複合体を含む培養培地全体を除去し、それを予め馴化および新鮮なニューロン培地の50〜50体積単位の調製物と交換する。その後、イメージングまで48時間、細胞をCO2 インキュベーターに戻します。

4. 緩衝液およびスチリル色素原液の調製

  1. 表1にリストされている成分を使用して、イメージング前に低および高aCSF溶液を新鮮にします。使用前に両方のバッファー溶液をろ過してください。
    注:CaCl2二水和物は、貯蔵時にCa(OH)2を形成する可能性がある。最大限の効果を得るには、常に最近開いた容器を使用してください。これが不可能な場合は、Ca(OH)2を外部表面から除去し、最大の溶解性を確保するために、CaCl2添加前に溶液をガス状のCO2で5分間炭酸化することができます。このステップを踏む場合は、過度の炭酸化によってCa(HCO3)2が形成されるため、得られた溶液のpHを7.4のpH値に維持するように調整します。
低 KCL aCSF バッファー (pH 7.40 ~ 7.45)
試薬 濃度
ヘーペス 10ミリオンメートル
ナクル 140ミリオンメートル
ティッカー 5ミリオン
グルコース 10ミリオンメートル
CaCl2 2H2O 2ミリオンユーロ
マグネシウムCl2 4H2O 1 ミリオン
高KCL aCSF緩衝液(pH 7.40~7.45)
試薬 濃度
ヘーペス 10ミリオンメートル
ナクル 95ミリオンメートル
ティッカー 50ミリオンメートル
グルコース 10ミリオンメートル
CaCl2 2H2O 2ミリオンユーロ
マグネシウムCl2 4H2O 1 ミリオン

表1:人工脳脊髄液(aCSF)緩衝液の組成。 この表には、ニューロンをイメージングおよび刺激しながら使用される低および高KCl人工脳脊髄液緩衝液を調製するための成分が含まれています。準備手順については、セクション 4 を参照してください。

  1. 100μgの色素バイアルを採取し、蒸留水または神経基礎培地で10mMの原液濃度に再構成することにより、スチリル色素ストック溶液を調製する。

5. 顕微鏡と灌流システムのセットアップ

注:ガラス底のシャーレをイメージングするには、灌流の柔軟性と高開口数の油浸漬対物レンズの使用のために、倒立共焦点蛍光顕微鏡が好ましい。代表的な結果の項で詳述した例の撮像に用いる共焦点顕微鏡、カメラ、対物レンズについては、材料表を参照されたい。

  1. インキュベーターシステム結合ステージマウントを使用して、一定の5%CO2 レベルで37°Cですべての実験を実行します。
  2. 共焦点ソフトウェアを使用して画像取得を制御します。イメージングセッションの開始時に集録設定を最適化して励起電力とゲインを選択し、フォトブリーチングなしで信号を最適に視覚化します。
    1. 励起パワー、露光時間、検出器ゲイン、フレームレートをすべてのサンプルで一定に保ちます。アスペクト比512 x 512、フレームレート2 images/sを使用してタイムラプスイメージングを実行し、染料の漂白を最小限に抑えます。
      注:プンクタははっきりと見えるはずですが、レーザー強度は漂白や光毒性を避けるために可能な限り最小限に設定する必要があります。共焦点開口を最も狭い設定に設定して、神経突起内の蛍光穿刺の最適な分解能を達成する。露光時間は200ms以下に設定され、サンプル間で一貫しています。使用したカメラの最大撮影速度は2画像/秒でした。より高速なカメラを使用すると、より多くの画像が撮影できます。可能であれば、時間的なイメージング設定を選択する必要があります。
  3. 共焦点ソフトウェアを使用したイメージングには、FITCを使用したGcamp6m/Gcamp3およびTRITCを使用したスチリル色素の蛍光励起/ダイクロイック/発光フィルターの組み合わせをそれぞれ選択します。
  4. タイムラプスイメージング中に共焦点イメージング取得ソフトウェアの完璧なフォーカス機能を使用して、 zドリフトを回避します。
    メモ: イメージングの速度が速いため、1 つの平面がイメージ化されます。実験中にzドリフトがないことを確認することは非常に重要です。
  5. 画像取得パネルの 「時間 」タブを選択して、記録期間と間隔を設定します。
    1. フェーズ #1 を間隔 500 ミリ秒、期間 3 ~ 5 分に設定します。
    2. フェーズ #2 を間隔 500 ミリ秒、期間 5 分に設定します。
      注:フェーズ#1はベースライン記録に、フェーズ#2は刺激期間にそれぞれ対応します。
  6. バルブ制御システムとチャネルマニホールドを用いてaCSF用の重力灌流装置を組み立てる。
    1. 装置の上部にある 50 mL シリンジに高 KCl ( 表 1 を参照) をロードし、チューブがシステム内を通します。流量を1mL/minに設定します。
  7. ニューロンを含む35mmのガラス皿を共焦点イメージングステージにロードし、灌流チューブの端を皿の端に置きます。イメージングするフィールドを選択します。

6. シナプス小胞放出のスチリル色素イメージング

  1. 細胞を低KCl aCSF( 表1参照)中で37°Cで10分間、トランスフェクション後48時間インキュベートする。
  2. 一次皮質または運動ニューロンをスチリル染料でガラス底のペトリ皿に負荷する。
    1. 吸引により低KCl aCSFを除去する。
    2. ピペットを使用して、50 mM KClを含むaCSF中の10 μMのスチリル色素で暗所でニューロンを5分間ロードします。
    3. ローディング溶液を除去し、ニューロンを低KCl aCSFに10分間浴びせて、非特異的色素ローディングを排除します。
  3. 35 mm のガラス底ディッシュをイメージングステージに置き、倒立共焦点顕微鏡の 20 倍の空気対物レンズまたは 40 倍の油浸対物レンズの下で観察します。
    注: GFP タグ付きプラスミドを同時トランスフェクトした細胞の場合、GFP 蛍光を使用してトランスフェクトされた細胞の位置を特定します。
  4. 546nmレーザーを用いてスチリル色素を励起し、630-730nm(TRITC)バンドパスフィルターを用いて発光を収集する。
  5. イメージングフィールドを選択し、完璧な焦点を合わせます。次に、明視野、TRITC、および蛍光マーカーチャネルを含む単一の静止画を撮影して、ニューロン境界をマークします。
  6. 集録ソフトウェアで 今すぐ実行 を開始します。基礎記録を3〜5分間実行して、色素強度の変動がある場合は除外します(フェーズ#1)。
    注:色素強度の低下がシナプス小胞の放出によるものであり、受動的な色素拡散またはフォトブリーチングによるものではないことを確認することが不可欠です。この3〜5分の予備刺激期間は、安定した維持された色素強度レベルをもたらすはずである。この記録の最後の30秒は、各ROIの平均ベースライン蛍光値を決定するために使用される。実験条件を評価する前に、意図した取得設定を使用して約10分間の連続記録の追加非刺激条件も実行して、レーザー設定を使用して安定した蛍光値を長期間確保することもできます。
  7. フェーズ #2 への切り替えで、灌流システムのボタンの On をトリガーします。次に、50mM KClをニューロンに絶えず灌流して、色素のアンロードを容易にします(フェーズ#2)。
    1. KCl添加後300秒間録音を行います。この後、取得は停止します。灌流システムの オフ スイッチをトリガーします。
  8. 実験を保存し、以下のセクション8で説明するように共焦点ソフトウェアを使用してデータを分析します。
    注:実験はこの時点で停止され、分析は後で実行できます。細胞が目的のタンパク質の発現のためにトランスフェクションを必要としない場合において、このプロトコールは、シナプスアンロードの機能性を調べようとするときに 、インビトロで 任意の時点で実施され得る。適切なシナプスアンロードを確実にするために対照細胞の試験に続いて、実験者はバイアスを最小限に抑えるために試験された各皿の遺伝的または薬理学的条件に盲検化されるべきである。

7. Gcamp6mカルシウム過渡現象の蛍光イメージング

  1. セクション3に示すように、35mmのガラス底ディッシュで培養した初代げっ歯類皮質ニューロンを500ngのGcamp6mでトランスフェクトする。
    注:必要に応じて、赤色または遠赤色の範囲の蛍光タグを含む目的のプラスミドでニューロンを同時トランスフェクトします。
  2. トランスフェクション後15分間48時間、低KCl aCSFでニューロンをインキュベートし、次いでディッシュをイメージングプラットフォーム上にマウントする。
  3. FITCフィルター(488nm)と20倍または40倍の対物レンズを使用してGCaMP6m蛍光を視覚化します。
  4. イメージングフィールドを選択し、完璧な焦点を合わせます。次に、明視野、FITCおよび蛍光マーカーチャンネルを含む単一の静止画を撮影して、ニューロン境界をマークします。
  5. 集録ソフトウェアで 今すぐ実行 を開始します。ベースライン記録を5分間行い、次いで、スチリル色素実験のためのセクション6に記載したのと同じ方法で50mM KCLを含むaCSFで灌流する。
    注:このイメージングの目的は、誘発されたカルシウム過渡現象を測定することです。ニューロンが刺激前期間中に基礎発火活性およびカルシウムフラックスを有する場合、それはデータ分析において使用されない。代わりに、安定したバックグラウンド蛍光を有する細胞のみが使用される。刺激後の期間は、追加の連続的な高KCl灌流の有無にかかわらず、カルシウム過渡現象のために60分に延長することもできる。
  6. 実験を保存し、以下のセクション8で説明するように共焦点ソフトウェアを使用してデータを分析します。実験はこの時点で停止し、分析は後で実行することができます。
    注:細胞が目的のタンパク質の発現のためにトランスフェクションを必要としない場合、このプロトコールは、カルシウム過渡現象を調べるために インビトロで 任意の時点で実施され得る。カルシウム一過性の測定を確実にするために対照細胞を試験した後、実験者は、バイアスを最小限に抑えるために試験された各皿の遺伝的または薬理学的条件に盲検化されるべきである。

8. 画像解析

  1. 共焦点ソフトウェアでタイムラプス画像を開きます。
  2. コマンドシリーズによるタイムラプス系列の画像を整列させる: 画像|処理|現在のドキュメントを整列させます。 「最初のフレームに揃える」を選択します。
  3. ROI選択ツールを使用して神経突起に沿った関心領域(ROI)を選択し、画像フレームの右側に豆形のアイコンを表示する(図3B)。また、バックグラウンド蛍光強度を表すROIをマークする。
    注:ROIは、明視野静止画によって示されるニューロントラックに沿って明確に分離された穿刺の領域を選択することによって選択される。ニューロンごとに少なくとも5つのROIが分析のために選択される。背景ROIは、神経突起を含まない視野の領域において選択される。
  4. 次のコマンドシリーズを使用して、選択したROIの生蛍光を経時的に 測定します:|測定時間測定。
    1. 時間測定パネルの上部で測定機能を開始します。経時的な生蛍光のグラフ表示(図3C)と定量データの両方が生成されます。
      注:各データポイントは、その特定の測定時点に関連付けられたフレームのそのROIの生蛍光を表します。
  5. 生の蛍光強度を表計算ソフトにエクスポートします。
  6. 各ROIを個別に分析します。まず、各時点における対象のROI強度からバックグラウンドROI強度を差し引くことによってデータを正規化する。
    1. 各特定の時点におけるバックグラウンドROIから生蛍光値を取り、その時点における目的生強度値のROIからこれを差し引く。
      注:これは、基礎段階と刺激段階の両方の記録期間全体に対して行われます。
  7. ベースラインの最後の30秒間の関心強度の平均ROIを決定します。
    1. ステップ8.6で生成された正規化された生の基礎値を、3〜5分の基礎記録期間の最後の30秒から平均します。
      注: 基本記録の全期間を使用して、この値を生成できます。ただし、この値が安定して維持されるため、最後の 30 秒の 60 時点は、全体を表すのに十分なサンプリング サイズになります。
  8. このベースライン値を各時点での正規化された強度値と比較し、蛍光の変化(ΔF)値を発生させる。
    1. ステップ8.7から値を取り、ベースライン蛍光の平均値を差し引く。このステップとその後のステップは、記録期間全体、基礎フェーズと刺激フェーズの両方に対して実行します。
  9. ベースライン蛍光値に関するこの変化を計算し、蛍光/ベースライン蛍光(ΔF/F)の変化を生成します。これを行うには、ステップ8.8の値を取得し、それを平均ベースライン蛍光値で除算します。
  10. 最後に、開始点の値を 1 に設定して、時間の経過と共に増減を簡単にグラフィカルに視覚化できるようにします。
    1. ステップ 8.9 で生成された値を取得し、1 を加算します。
      メモ: これが正しく行われると、ベースライン期間値の 30 秒が値 1 の近くにホバリングされます。シナプス含量を効果的に放出する細胞では、この値は刺激の開始後に1から0にトレンドするはずである。ステップ6〜9の例を 図3Eに示す。

9. データ解析

注:実験者は、分析のためにデータを適切にプールするために、実験条件に盲検化されていない可能性があります。3つの独立した実験のそれぞれから、条件ごとに少なくとも10個のニューロンのサンプルサイズを使用する。少なくとも5つのROI領域を指定できる場合にのみ、ニューロンの包含を検討してください。このレベルの実験的複製は、ALS関連ポリGA含有細胞対GFP対照におけるシナプスアンロードの深刻な損失を実証するために、公表された研究において十分であった( 代表的な結果を参照)。しかしながら、より微妙な表現型が観察される場合、生物学的および/または技術的複製の数は、ユーザによる最適化を必要とするかもしれない。

  1. 所与の実験条件のROIから経時的に計算されたすべてのΔF/F値を使用して、SEMとともに各時点の平均ΔF/F値を決定する。
  2. グラフ作成および統計ソフトウェアプログラムを使用して、xy形式でデータをプロットします(xは経過時間、yはステップ9.1で計算されたΔF/F値)。SEMですべての値を平均値として提示±ます。
  3. 統計的有意性を判断するには、2つのグループを比較するためのスチューデン トのt検定と一元配置分散分析(ANOVA)を使用し、続いて3つ以上のグループを比較するためのTukeyのポストホック分析を使用します。

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Representative Results

上記のプロトコールの成功した実施に続いて、典型的なスチリル色素シナプス小胞放出実験について代表的な結果が示されている。培養ラット初代皮質ニューロンは、セクション6に記載の方法を用いて色素を負荷した。色素負荷の特異性は、シナプス小胞マーカーシナプトフィジンとの共標識によって決定した。陽性の点状穿刺のスチリル色素の大部分は、このマーカーに対して共陽性である(図2A)。スチリル色素イメージングに使用される設定がフォトブリーチングを引き起こすかどうかを判断するために、通常、未処理のウェルに色素をロードし、蛍光値が一定であることを確認するために刺激なしで長時間10分間画像化します。

さらに、 図2Aのようにシナプトフィジンとスチリル色素の共標識を用いた結果が再び示される。これらの蛍光色素は、TRITCスチリル色素イメージングのセクション6に示されたパラダイムを使用して共イメージングされ、さらにDAPIチャネル上の高強度レーザーパワーを使用してシナプトフィジン蛍光の二重捕捉が行われ、mTurquoise-synaptophysinが可視化されました。刺激前および刺激後のシナプス領域の代表的な画像が示されている(図2B)。この方法はフォトブリーチングの欠如に対する間接的な推論であるが、イメージング期間全体にわたる生の強度値を分析すると、シナプトフィジン強度は一定のままであるが、スチリル色素強度は刺激後に低下することが明らかになった(図2C)。したがって、この実験と、刺激前および非刺激ウェルでの長期間にわたる安定した蛍光の他の制御により、スチリル蛍光の減少は、光退色効果ではなくKCl脱分極によるシナプスアンロードに起因する可能性があることを立証した。

Figure 2
図2:スチリル色素標識の特異性とイメージングパラメータの評価。 (a)シナプシンプロモーター(緑)を追い出したmTurquoise2-synaptophysin61を発現するプラスミドで24時間前にトランスフェクトされたスチリル色素標識ラット皮質ニューロン(赤色)の代表的な40倍画像。これら2つの蛍光色素の共局在は、スチリル色素陽性穿刺の大多数がシナプス小胞マーカーシナプトフィシンと共染色されていることを示している。スケールバーは5μmを示す。(B)皮質ニューロンをトランスフェクトし、(A)のようにスチリル色素をロードし、DAPIチャネル上のmTurquoise-シナプトフィジンの二重蛍光捕捉とともに、スチリル色素パラダイムに従って画像化した。代表的な画像は、刺激前および刺激後のシナプトフィジンおよびスチリル色素穿刺領域を示している。スケールバーは5μmを示す。(c)シナプトフィジン(DAPIチャネル上部)およびスチリル色素(FITCチャネル下部)について蛍光を経時的にモニターした。シナプトフィジン強度は、イメージングおよび刺激期間にわたって安定した蛍光で維持されたが、スチリル色素の蛍光は、色素が刺激時にアンロードされるにつれて減少した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

代表的な画像は、ROIの選択を伴う、画像化中のスチリル色素の装填を示す(図3A−B)。選択されたROIの生蛍光強度およびバックグラウンドROIを、共焦点ソフトウェアを用いてプロットする(図3C)。ここに示したニューロンはまた、C9ORF72-ALSの文脈で産生されるジペプチドタンパク質、すなわちT7プロモーターから駆動されるFLAG-eGFPおよびFLAG-GA50-eGFPの効果を研究するためにプラスミドをトランスフェクトした。シナプス小胞放出の成功は、GFPトランスフェクト対照ニューロンについて、高いKCl脱分極(図3D、上部2つのパネル)時に色素蛍光の顕著な損失をもたらす。ここに含まれる代表的なビデオは、これがイメージング中にどのように表示されるかを示しています。さらに、ニューロンは刺激後に神経突起領域のスチリル色素を選択的にアンロードする(ビデオ1)。

一方、シナプス伝達の障害は、C9ORF72結合ジペプチド反復構築物(GA50)を導入したニューロンにおいて高いKCl脱分極後でさえも色素蛍光が保持されたことによって表される(図3D、下2つのパネル)43。定量的データ分析(図3E)に続いて、データは対照(GFP)およびALS/FTD(GA50)群(図3F)のイメージング全体にわたる色素強度として表されます43。このメソッドは中間効果を解析することもでき、単なる「すべてまたは何もない」バイナリメジャーではありません。GA50によって媒介されるシナプス欠損を救済するために設計された実験において、ヒトPGKプロモーターから駆動されるrSV2a-eGFP-pRRLプラスミドを用いたレンチウイルス形質導入によって、外因性シナプス小胞関連タンパク質2(SV2)が導入された。上記で概説した画像化および解析に続いて、シナプス発火は、GA50およびSV2を共発現するニューロンにおいて救助された(図3G)。

Figure 3
図3:スチリル色素標識によるシナプス小胞放出の評価。 (A)イメージング実験の開始時の低KCl aCSF培地中のスチリル色素標識ニューロンの代表的な40倍画像。スケールバーは20μmを示す。(B)(A)からの画像上のROI生成の描写。神経突起に沿った特定の穿刺領域(#1-4)は、ROIツールを使用して選択され、豆の形をしたボタンが右側に強調表示されます。ブランク領域で最終的なROI 5位が選択され、バックグラウンド信号強度をキャプチャします。非特異的で非ニューロンの輝点を有する領域は回避される。スケールバーは20μmを示す。(C) 共焦点ソフトウェアによってグラフ化/描写された(B)からのROIの#1-5の信号強度の経時的な表現。(D)シナプス伝達を効果的に受けるニューロンの刺激前/刺激後のROI領域の視覚的表現(上位2つのパネル)。下の 2 つのパネルはズームされた画像で、背景からプンクタを分離して視覚的に異なる領域を表示するために、バイアスのないしきい値が適用されています。GFP含有ニューロンはシナプス放出を効果的に受けるが、C9ORF2-ALS関連ペプチドGA50の発現はこの効果を妨げる。スケールバーは、Jensen et al. 202043から転載された10μmを示す。(E)表計算ソフトを用いた定量化ファイルの例で、ベースラインへの値の正規化と経時的なΔF/F値の生成を示すもの。データは、まず、各時点におけるバックグラウンドROI強度値に正規化される。次いで、この値は、最後の30秒前刺激についてのベースライン値(ここでは、単純化のために1秒間隔で10秒として示されている)の関心のある平均ROIと比較される(ΔF)。この変化は、次にベースライン蛍光(ΔF/F)の分数として計算されます。最後に、開始点の値を 1 に設定して、時間の経過と共に増減を簡単にグラフィカルに視覚化できるようにします。ニューロンあたり少なくとも5つの穿刺領域と実験条件ごとに少なくとも10のニューロンが収集され、このようなデータを組み合わせて各時点での平均測定値が生成されます。(F)(E)のようなスプレッドシートファイルのデータは、グラフ作成および統計ソフトウェアプログラムに移動されます。ここに示すグラフでは、実験条件のすべてのパンクタ領域について平均した各時点におけるΔF/F値を、その平均の標準誤差とともにプロットします。ここでのグラフは、(D)に示されたGFP対GA50実験からのデータであり、ベースラインの最後の10秒および刺激期間の最初の10秒が示されている - Jensen et al. 202043から転載されている。(G)このアッセイは、中間シナプス放出のための曲線を生成することができ、単に「すべてまたは何もない」応答ではない。GA50は外因性シナプスタンパク質SV2(シナプス小胞関連タンパク質2)と共発現し、前のステップで示したようにスチリル色素のイメージングおよび分析を行った。図3Fのように、ここに示すグラフは、実験条件の全パンクタ領域について平均化した各時点におけるΔF/F値をプロットし、その平均の標準誤差とともに表している。グラフは、Jensen et al. 202043からのベースラインの直前と刺激期間の最初の1分を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:スチリル色素イメージング実験の代表的なビデオ。 スチリル色素をロードした皮質ニューロンの代表的なビデオが示されている。ビデオは、高KCl aCSFの浴灌流時に始まる期間を示す。ボックス化された領域は神経突起を強調表示し、時間の経過とともに穿刺蛍光の観察可能な損失を伴う。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

セクション7に記載の方法に続いて、KCl脱分極前後のGcaMP6mを導入した皮質ニューロンの代表的な蛍光画像を示す(図4A)。生の強度グラフは、変動する蛍光値の増加を示し、KCl誘導脱分極後の神経突起へのカルシウム進入を示す(図4B)。この第2の代表的なビデオは、この効果を実証するために、記録ベースライン期間の終わりに低蛍光でGcaMP6mを発現するニューロンを示す。刺激の開始時に、ニューロンは劇的な蛍光増加を示す(ビデオ2)。このアプローチは、変異型FUS-ALSモデルにおけるカルシウムの侵入変化を実証するために首尾よく利用されている。このモデルにおけるアストロサイトを、CMVプロモーター駆動型eGFP-FUSプラスミドを含むアデノウイルスで形質導入した。変異型FUS発現アストロサイトからの馴化培地を運動ニューロン上に置いたところ、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)+シクロチアジド刺激後の非変異FUS条件と比較してカルシウム流入の増加が観察された(図4C)44。このアッセイの感度は、灌流培地に含まれるカルシウムの有無にかかわらず実験を行うことによって試験されている。上述のGFP対GA50の設定では、運動ニューロンを含むGA50においてカルシウム一過性のピークの増加が観察された。特に、これは細胞内に入ってくるカルシウムに依存しており、内部のカルシウム貯蔵の放出には依存していなかった。刺激性aCSF培地からカルシウムを除去した場合、いずれの実験条件においてもカルシウム一過性応答は認められなかった(図4D)43。

Figure 4
図4:GCaMPレポーターを用いてカルシウム過渡現象をリアルタイムで観察する。 (A)GFP蛍光の強度を示すために擬似着色されたGCaMP6m発現ニューロンの40倍画像(青色の低から赤色の高)を示す。左側のパネルは、刺激前後の40倍の視野全体を示しています。スケールバーは20μmを示す。右側の画像は、表示されたボックス化された領域のズームバージョンです。これらの画像を通して、刺激後の局所神経炎カルシウムレベルの堅調な増加があることは、目によって明らかである。スケールバーは12μmを示す。(b)ROI選択および蛍光強度モニタリングは、実験全体を通して、図3のように行われる。GCaMP6m蛍光モニタリングを受けているニューロンの2つの選択されたROIに対するベースラインおよび1分間の刺激の最後の30秒をここに示す。スチリル色素イメージングとは対照的に、蛍光強度はニューロン刺激に続いて増加する。さらに、ここで記されているように、カルシウム過渡現象は時間の経過とともに神経突起内で変動する。したがって、結果は、典型的には、各ROI領域について平均化されたピーク正規化蛍光変化値として表される。(c)このような実験の代表的な定量は、Kia-McAvoy et al. 201844に発表されたように示されており、変異型FUS-ALSアストロサイトに由来する上清を受けた初代運動ニューロンは、野生型FUS発現アストロサイトから上清を受けたニューロンと比較して、AMPA受容体刺激後のカルシウムの流入が有意に増加したことを示している。(d)カルシウムが刺激aCSFに含まれなかったカルシウム一過性イメージングの代表的な定量。示されているのは、Jensen et al. 202043で公開されているようにカルシウムの有無にかかわらず高KCl aCSFで刺激されたmCherry対GA50-mCherryの条件である。GA50含有ニューロンは、mCherry含有細胞と比較してカルシウム流入のピークの増加を示した。いずれの実験条件においても、高KCL aCSFを刺激することからカルシウムを除去した場合、内部カルシウムレベルの上昇はなかった。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:GCaMPカルシウム一過性実験の代表的なビデオ。 GCaMP6mを導入した皮質ニューロンのフィールドの代表的なビデオが示されている。ベースライン期間に続いて、高いKCl aCSFが適用されたとき、大きなカルシウム流入が6秒マークに認められる。カルシウム進入は、細胞全体について、または記載されたような特定の神経突起領域において測定することができる。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

潜在的な問題 考えられる理由/解決策
1 非特定荷重 読み込み時間を正確に設定してください。より長い装填時間は、エンドソームおよびリソソームへのFM4−64の非特異的装填をもたらす
2 制御ニューロンに顕著なエキソサイトーシスはない 高KCl aCSF溶液のpHを確認してください。
3 焦点の喪失と横方向のドリフト 完璧な焦点が当てられていることを確認してください。ニコンソフトウェアまたはImageJプラグインを使用して、イメージング後の画像を整列させます。
4 FM4-64蛍光の漂白 イメージングに使用するレーザー強度を確認します。常にできるだけ低い強度を使用するようにしてください。使用したレーザー強度が漂白にならないことを、試運転で確認します。

表2:スチリル色素実験で考えられる問題とトラブルシューティング。 問題の典型的なシナリオとシナプスアンロード実験の一般的なトラブルシューティング。

潜在的な問題 考えられる理由/解決策
1 トランスフェクション効率が低すぎる ニューロンの健康状態を確認してください。ニューロンがトランスフェクトしにくい場合は、AAVまたはGCaMPのレンチウイルス形質導入に切り替えることができます。
2 核内におけるGCaMP6蛍光の蓄積 ニューロンの健康を損なった。トランスフェクションプロトコルを確認してください。
3 焦点の喪失と横方向の画像ドリフト 完璧な焦点が当てられていることを確認してください。ニコンソフトウェアまたはImageJプラグインを使用して、イメージング後の画像を整列させます。
4 KCL刺激時にカルシウム反応がない aCSFのpHが正しいことを確認してください。
5 GCaMP6蛍光の漂白 イメージングに使用するレーザー強度を確認します。常にできるだけ低い強度を使用するようにしてください。使用したレーザー強度が漂白にならないことを、試運転で確認します。
6 神経突起のブレビング トランスフェクションによるニューロンの健康状態の悪化。ニューロン培養の新鮮なバッチを使用してください。

表3:神経突起中のカルシウム過渡現象を画像化するための考えられる問題とトラブルシューティング。 GCaMP カルシウム過渡実験の問題の一般的なシナリオと一般的なトラブルシューティング。

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Discussion

記載されている両方の方法に共通する3つのステップは、実験の成功と定量化可能な結果にとって非常に重要です。まず、各実験ラウンドの前に新鮮なaCSFの調製が不可欠であり、添付の指示に従ってください。そうしないと、適切なニューロン脱分極を妨げる可能性があります。未処理の対照ニューロンのサンプルは、適切な細胞脱分極を確実にし、そのイメージングセッションで得られた肯定的な結果のベンチマークを提供するために、任意の実験群の刺激の前に絶えず試験されるべきである。第二に、特定のシナプス領域の蛍光を経時的に追跡することに成功するためには、モニタリングのために画像化パラメータおよびROIの領域を設定する際にも特別な注意が必要である。ベースライン期間記録は、直ちに刺激記録期間に移行するべきである。スチリル色素放出の単一崩壊ダイナミクスを捕捉するには、十分に速いフレームレート(2画像/秒)が必要です。最後に、実験の分析における重要なステップは、蛍光測定を最初にイメージングバックグラウンドに正規化し、次に事前刺激ベースラインに正規化することです。他の画像化プロトコルと同様に、ブランク画像化領域の減算は、KCl培地の添加によって導入され得るバックグラウンド自己蛍光を除去するために、まず、すべての対をなす時間蛍光測定にわたって行われる。また、刺激前の最後の30秒のベースラインからの各ROIの平均蛍光読み取り値を測定および計算することも不可欠です。この平均開始値は、定義された開始点として、そのROIのすべての時間測定値にわたって使用され、「ベースラインからの変化」強度を定量化します。

初代ニューロン培養は、外因性DNAでトランスフェクトすることが難しいことで知られており、最適化されたプロトコルでさえ、培養中の全細胞の効率が低いことがよくあります。トランスフェクション効率の20%~25%は、当社のニューロン培養において一般的に達成されますが、トランスフェクションによる毒性の証拠はありません。GCaMPを含む細胞間でかなり一貫した発現が見られるが、個々の細胞内でのプローブ発現の微妙に異なるレベルは、そのベースラインと比較したベースライン蛍光の変化の個々の領域定量化の方法に基づいて考慮される。しかしながら、この比較的低い効率では、GCaMPレポーターを導入するトランスフェクションベースの方法を使用することは、ハイスループットスクリーニング研究のための大規模な生物学的複製に対して十分な堅牢性を有していない。これを克服するために、レンチウイルスもしくはアデノウイルスパッケージングまたは細胞系譜特異的発現のためにいくつかの変異体構築物が市販されており、これはより高い形質導入効率を可能にするであろう。これらのプロトコルを使用する場合に望まれ得る主要な改変は、KCl62の浴中適用の代わりにニューロンの光遺伝学的刺激を使用することである。現在利用可能なチャネルロドプシンのファミリーの1つを発現するように設計されたレンチウイルス構築物による形質導入、続いて特定の波長の光による活性化は、ニューロンのサブセットの脱分極のための空間制御を可能にし、また、反復的なカルシウム流入レベルおよびシナプス小胞貯蔵の枯渇に対する活動電位の列の影響の評価を可能にする63。.しかし、ユーザーは、光遺伝学的レポーター、シナプスレポーター、および追加の外因的に導入されたタンパク質が、利用された蛍光色素間にスペクトル重複を持たないことを保証する必要があるため、この方法の使用は現在、ある程度制約されていることに留意することが不可欠です。スチリル染料を使用する一般的なトラブルシューティングの問題は、ベースライン記録期間中の受動的な強度低下です。実験的研究の前に、レーザー強度と写真キャプチャ間隔を最適化して、フォトブリーチング効果を最小限に抑えることが重要です。考慮される実験のためには、ベースライン期間の少なくとも最後の30秒間の強度の安定化が必要である。スチリル色素およびカルシウム過渡実験の一般的な問題およびそれらの解決策については、それぞれ 表2 および 表3 を参照されたい。

これら2つの方法の主な制限は、培養物を刺激し、検査することができるのは1つのインスタンスでしかないということです。脱分極剤KClを導入するために浴の適用が使用されるので、その皿内のその状態から検査されるすべてのニューロンは、顕微鏡対物レンズの初期視野内になければならない。時間の経過に伴う機能が重要な場合は、ペアのカルチャが必要です。しかしながら、上述の光遺伝学的方法は、所望により、カルシウム動態を経時的に観察することを可能にするであろう。さらに、ニューロンがシナプス小胞のリサイクルに欠陥を有する場合、スチリル色素の初期負荷が損なわれる。内部強度の正規化により、条件間での比較が可能になりますが、応答の大きさのわずかな違いを検出するのが難しい場合があります。最後に、これらのレポーターの新しいイテレーションが急速に利用可能になり、より速い検出時間またはより堅牢な結果のために切り替えることができます。例えば、GCaMP6mはもはやシナプス末端におけるカルシウム過渡現象の最も速いレポーターとは見なされていない。代わりに、最新世代のjGCaMP864を利用できます。

ここで説明する方法は、ニューロンの遺伝的または薬理学的操作が機能的なシナプスシグナル伝達および放出を乱すかどうかを判断するための迅速かつ信頼性の高い方法である。詳細な実験は、従来の電圧/電流クランプ電気生理学および電子顕微鏡よりも技術的に困難ではなく、コストもかかりません。さらに、電気生理学は本質的にスループットが低く、個々の細胞レベルですが、ここで説明するプロトコルはスループットが高く高速であるため、複数のニューロンを同時にイメージングし、1回のイメージングセッションで多くの反復を実行できます。これらのカルシウム動態およびシナプス放出パラダイムが、ALSモデルおよびニューロン変性の他の形態の研究におけるシナプス伝達変化の最初の指標として使用されることが提案されている。Gcamp6mおよびスチリル色素イメージングから導き出された結論は、シナプス機能障害の特定のメカニズムを正確に解明することはできないが、そのような知見に基づいて、研究者は、関与するチャネル、シナプス小胞数、または量子コンテンツを決定するために、従来の方法を使用して、標的を絞ったエビデンスに基づく補完的研究に着手することができる。

これらのプロトコルにおける有用性は、特定のALSモデルにおける適切な脱分極媒介性カルシウム流入および/またはシナプス小胞融合の変化の迅速かつ直接的な評価である。我々は最近、C9ORF72ヘキサヌクレオチド反復拡大から生じるジペプチドタンパク質(グリシン-アラニン)50 を発現する皮質ニューロンにおけるカルシウム流入の増加とシナプスアンロードの廃止を示す出版物でこれを実証した43。我々の公表された研究に示されているように、これらの方法は、目的の変異RNAまたはタンパク質の同時トランスフェクションと並行して、またはトランスジェニック動物モデルから直接培養された細胞において容易に行うことができる43。さらに、これらのプロトコルの信頼性と堅牢性は、神経分化型ヒト人工多能性幹細胞45でテストに成功しており、将来の研究を患者由来の疾患関連細胞で直接行うことが可能になりました。別の最近の論文では、野生型運動ニューロンが、アストロサイトを発現する変異FUSから放出される可溶性因子の存在下で、刺激後に高いカルシウム流入を受けるという証拠を提供する44。アストロサイトーシスカルシウムシグナル伝達イベントは、隣接するニューロンにおけるシナプス伝達とも深く絡み合っています65。カルシウムダイナミクスプロトコルは、アストロサイト培養のモデルにおける全細胞カルシウム過渡現象を調査するために適用されており、これはげっ歯類の初代細胞およびヒトIPS由来細胞の両方に有効であることが証明されている。ALSモデルにおけるアストロサイトカルシウムダイナミクスとシグナル伝達のさらなる理解は、シナプス伝達が結果としてどのように影響するかについての貴重な洞察を提供するでしょう。究極的には、細胞型特異的GCaMPレポーターを採用することは、混合共培養環境におけるニューロンおよびアストロサイトカルシウムダイナミクスを調査し、各細胞集団に由来する非細胞自律的効果を具体的に評価するための強力なツールにもなる。

最後に、これらの方法の潜在的な使用法は、ALSの研究だけでなく、神経変性および発達神経科学のより広い分野にも及ぶ。代表的な結果を生成するために使用される特定のプラスミドに関する詳細な情報が提供され、FUS、SOD1およびC9ORF72ヘキサヌクレオチド反復ならびにジペプチド43、44、66、67、68の多くの異なる遺伝子変異体を含むプラスミドのトランスフェクトに成功した。プラスミドがニューロンで使用されるプロモーターを含むことを条件として、これらの方法を用いてALSまたは変性疾患のどのモデルを研究できるかに制限はない。さらに、変異タンパク質を発現させるトランスフェクションは、完全に任意のステップです。トランスジェニック動物またはヒト患者由来細胞から生成された培養物は、目的の変異タンパク質を含む細胞を同定する必要性を排除する。現在、これらのシステムは、スチリル染料が使用される場合、TRITCチャネルが占有され、GcaMP6が使用される場合、FITCチャネルが占有されるという様式で制約されている。ニューロンおよびアストロサイト活性をリアルタイムで調べることを可能にする技術は、シナプスの成熟/変性のための時間経過分析、ならびにニューロンコミュニケーションの促進または抑制における薬理学的化合物の有効性の迅速な試験を理解するための可能性を広げる。これら2つの方法は、スクリーニングのための高スループットスケーリングに適している。個々の35mm皿にニューロンをメッキするのではなく、これら2つのプロトコルのイメージングパラメータを96ウェルプレート全体で自動化された方法で採用することができます。このようなプラットフォームを使用して、化合物ライブラリーを、疾患の遺伝子モデルまたは患者から直接誘導された細胞を用いてカルシウムの侵入を調節するか、シナプス放出を改善する治療薬について迅速に試験することができる。この方法は、さらなる調査のために候補分子を迅速に同定することによって、サブグループ特異的または個別化治療薬の可能性を迅速に追跡することができる。

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Disclosures

著者らは、利益相反はないと宣言している。

Acknowledgments

ジェファーソン・ワインバーグALSセンターの現在および以前のメンバーの皆様には、これらの技術とその分析を最適化するための批判的なフィードバックと提案をお寄せいただき、誠にありがとうございます。この研究は、NIH(RF1-AG057882-01およびR21-NS0103118からD.T.まで)、NINDS(R56-NS092572およびR01-NS109150からP.P.まで)、筋ジストロフィー協会(D.T.)、ロバートパッカードALS研究センター(D.T.)、Family Strong 4 ALS財団、Farber Family Foundation(B.K.J.、K.K.、P.P.)からの資金提供によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

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神経科学 第173号
筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定
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Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

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