Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

قياس الفلورسنت في الوقت الحقيقي للوظائف المشبكية في نماذج التصلب الجانبي الضموري

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

يتم وصف طريقتين مرتبطتين لتصور الأحداث تحت الخلوية المطلوبة للانتقال المشبكي. تمكن هذه البروتوكولات من المراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات تدفق الكالسيوم قبل المشبكي واندماج غشاء الحويصلة المشبكية باستخدام تصوير الخلايا الحية للخلايا العصبية المستزرعة في المختبر .

Abstract

قبل التنكس العصبي ، فإن سبب العجز الحركي والمعرفي في المرضى الذين يعانون من التصلب الجانبي الضموري (ALS) و / أو خرف الفص الجبهي الصدغي (FTLD) هو خلل في التواصل بين الخلايا العصبية والخلايا العصبية الحركية والعضلات. تتضمن العملية الأساسية للانتقال المشبكي دمج الحويصلة المشبكية المعتمدة على إزالة الاستقطاب الغشائي وإطلاق الناقلات العصبية في المشبك. تحدث هذه العملية من خلال تدفق الكالسيوم الموضعي إلى المحطات الطرفية قبل المشبكي حيث توجد الحويصلات المتشابكة. هنا ، يصف البروتوكول منهجيات التصوير الحي القائمة على التألق التي تبلغ بشكل موثوق عن إفراز الحويصلة المشبكية بوساطة إزالة الاستقطاب وديناميكيات تدفق الكالسيوم الطرفية قبل المشبكية في الخلايا العصبية المستزرعة.

باستخدام صبغة ستايريل التي يتم دمجها في أغشية الحويصلة المشبكية ، يتم توضيح إطلاق الحويصلة المتشابكة. من ناحية أخرى ، لدراسة دخول الكالسيوم ، يتم استخدام Gcamp6m ، وهو مراسل فلورسنت مشفر وراثيا. نحن نستخدم إزالة الاستقطاب بوساطة كلوريد البوتاسيوم العالية لتقليد النشاط العصبي. لتحديد كمية إفرازات الحويصلة المشبكية بشكل لا لبس فيه ، نقيس فقدان تألق صبغة الستيريل الطبيعية كدالة للوقت. في ظل ظروف تحفيز مماثلة ، في حالة تدفق الكالسيوم ، يزداد التألق Gcamp6m. يتم إجراء التطبيع والقياس الكمي لهذا التغيير الفلوري بطريقة مماثلة لبروتوكول صبغة الستاريل. يمكن مضاعفة هذه الطرق مع الإفراط في التعبير القائم على النقل للبروتينات الطافرة الموسومة بالفلورسنت. وقد استخدمت هذه البروتوكولات على نطاق واسع لدراسة الخلل الوظيفي المتشابك في نماذج من FUS-ALS و C9ORF72-ALS ، باستخدام الخلايا العصبية القشرية والحركية للقوارض الأولية. تسمح هذه البروتوكولات بسهولة بالفحص السريع للمركبات التي قد تحسن التواصل العصبي. على هذا النحو ، فإن هذه الأساليب ذات قيمة ليس فقط لدراسة ALS ولكن لجميع مجالات أبحاث علم الأعصاب التنكسية العصبية والتنموية.

Introduction

إن نمذجة التصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر تشكل تحديا فريدا بسبب الطبيعة المتفرقة بشكل ساحق لأكثر من 80٪ من الحالات1، إلى جانب العدد الهائل من الطفرات الجينية المعروفة بأنها مسببة للأمراض2. على الرغم من ذلك ، تشترك جميع حالات ALS في ميزة موحدة مفادها أنه قبل التنكس العصبي الصريح ، هناك اتصال مختل وظيفيا بين الخلايا العصبية الحركية قبل المشبكي وخلايا العضلات بعد المشبكي 3,4. سريريا ، عندما يفقد المرضى اتصال الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية المتبقية ، فإنهم يقدمون ميزات فرط الخلايا العصبية ونقص الاستثارة طوال المرض5،6،7،8،9 ، مما يعكس التغيرات الجزيئية الكامنة المعقدة لهذه المشابك العصبية ، والتي نسعى ، كباحثين في ALS ، إلى فهمها.

وقد أوضحت نماذج متعددة معدلة وراثيا أن تدهور وتفكك الوصلة العصبية العضلية يحدث مع التعبير عن الطفرات الجينية المسببة ل ALS ، بما في ذلك SOD110 و FUS11,12 و C9orf7213,14,15,16 و TDP4317,18,19 من خلال التقييمات المورفولوجية ، بما في ذلك تقييم البوتونات المشبكية ، وكثافات العمود الفقري ، والتنظيم قبل / بعد المشبكية . ميكانيكيا ، منذ الأوراق التاريخية لكول وهودجكين وهكسلي في 1930s ، كان من الممكن أيضا تقييم الاستجابات المشبكية من خلال التقنيات الكهروفسيولوجية إما في زراعة الخلايا المختبرية أو مستحضرات شرائح الأنسجة20. من خلال هذه الاستراتيجيات ، أظهرت العديد من نماذج ALS عجزا في الانتقال المتشابك. على سبيل المثال، يتسبب متغير متحور من TDP43 في تحسين تردد إطلاق النار ويقلل من عتبة العمل المحتملة في NSC-34 (الحبل الشوكي × خط الخلايا الهجينة للورم الأرومي العصبي 34) الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية الحركية21. هذا المتغير نفسه يسبب أيضا انتقال متشابك مختل وظيفيا عند التقاطع العصبي العضلي (NMJ) قبل بداية العجز الحركي السلوكي في نموذج الفأر22. وقد تبين سابقا أن تعبير FUS المتحور يؤدي إلى انخفاض الانتقال المشبكي في NMJ في نموذج ذبابة الفاكهة من FUS-ALS قبل العيوب الحركية11. كشف تقرير حديث يستخدم الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من ناقلات التوسع C9orf72 عن انخفاض في مجموعة الحويصلات المشبكية القابلة للنشر بسهولة23. وإجمالا، تسلط هذه الدراسات وغيرها الضوء على أهمية بناء فهم أكثر شمولا للآليات الكامنة وراء الإشارات المشبكية في النماذج ذات الصلة بالأمراض من مرض التصلب الجانبي الضموري. سيكون هذا محوريا في فهم البيولوجيا المرضية ل ALS وتطوير أهداف علاجية محتملة للمرضى.

كانت طرق خلايا تثبيت التيار والجهد لا تقدر بثمن في تحديد خصائص الغشاء مثل التوصيل ، وإمكانات غشاء الراحة ، والمحتوى الكمي للمشابك الفردية 20،24. ومع ذلك ، فإن أحد القيود المهمة للفيزيولوجيا الكهربية هو أنه يمثل تحديا تقنيا ويوفر فقط رؤى من خلية عصبية واحدة في كل مرة. يوفر المجهر البؤري للخلايا الحية ، إلى جانب تحقيقات فلورية محددة ، الفرصة للتحقيق في الانتقال المتشابك للخلايا العصبية بطريقة مكانية زمانية 25،26،27. على الرغم من أنه ليس مقياسا مباشرا للاستثارة العصبية ، إلا أن نهج التألق هذا يمكن أن يوفر قياسا نسبيا لاثنين من الارتباطات الجزيئية للوظيفة المتشابكة: إطلاق الحويصلة المشبكية وانتقالات الكالسيوم في المحطات المتشابكة.

عندما يصل جهد العمل إلى المنطقة الطرفية قبل المشبكي للخلايا العصبية، يتم تشغيل انتقالات الكالسيوم، مما يسهل الانتقال من إشارة كهربائية إلى عملية إطلاق الناقل العصبي28. تنظم قنوات الكالسيوم ذات بوابات الجهد المترجمة إلى هذه المناطق إشارات الكالسيوم بإحكام لتعديل حركية إطلاق الناقل العصبي29. تم إجراء أول تسجيلات قائمة على التألق لعابرات الكالسيوم باستخدام مؤشر الطول الموجي المزدوج Fura-2 AM أو صبغة الطول الموجي الواحد Fluo-3 AM30,31,32. في حين أن هذه الأصباغ قدمت رؤية جديدة كبيرة في ذلك الوقت، إلا أنها تعاني من العديد من القيود مثل التقسيم غير المحدد داخل الخلايا، وفقدان الصبغة النشطة أو السلبية من الخلايا الموسومة، والتبييض الضوئي، والسمية إذا تم تصويرها على مدى فترات طويلة من الزمن33. في العقد الماضي ، أصبحت مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا هي العمود الفقري لتصوير أشكال مختلفة من النشاط العصبي. تجمع هذه المؤشرات بين بروتين الفلورسنت المعدل وبروتين مخلب الكالسيوم الذي يغير بسرعة شدة التألق بعد ربط أيونات Ca2+ 34. تطبيق هذه المؤشرات الجديدة واسع النطاق ، مما يسمح بتصور أسهل بكثير لعابرات الكالسيوم داخل الخلايا سواء في المختبر أو في إعدادات الجسم الحي. عائلة واحدة من هؤلاء المراسلين المشفرين وراثيا ، والمعروفة باسم GCaMP ، تستخدم الآن على نطاق واسع. تحتوي هذه المؤشرات على مجال كالمودولين C-terminal ، يليه بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، ويتم تغطيتها بمنطقة ربط الكالمودولين الطرفية N-terminal 35,36. يؤدي ربط الكالسيوم بمجال الكالمودولين إلى تفاعل مع منطقة ربط الكالمودولين ، مما يؤدي إلى تغيير مطابق في بنية البروتين الكلية وزيادة كبيرة في تألق GFP moiety35,36. على مر السنين ، خضعت هذه العائلة من المراسلين للعديد من التطورات لتمكين قراءات متميزة لعابرات الكالسيوم الخاصة ذات الحركيات المحددة (البطيئة والمتوسطة والسريعة) ، ولكل منها خصائص مختلفة قليلا37،38. هنا ، تم تسليط الضوء على استخدام المراسل GcaMP6 ، والذي ثبت سابقا أنه يكتشف إمكانات العمل الفردي وانتقالات الكالسيوم المتغصنة في الخلايا العصبية في كل من الجسم الحي والمختبر 37.

تؤدي انتقالات الكالسيوم في المنطقة قبل المشبكي إلى أحداث اندماج الحويصلة المشبكية ، مما يتسبب في إطلاق الناقل العصبي في المشبك العصبي وبدء أحداث الإشارات في الخلية ما بعد المشبكية28,39. يتم إطلاق الحويصلات المشبكية بسرعة وإعادة تدويرها، حيث تحافظ الخلية بشكل متجانس على مساحة سطح غشاء خلية مستقرة ومجموعة قابلة للنشر بسهولة من الحويصلات المرتبطة بالغشاء القادرة على الانصهار40. صبغة الستيريل المستخدمة هنا لها تقارب تجاه الأغشية الدهنية وتغير على وجه التحديد خصائص انبعاثاتها بناء على ترتيب البيئة الدهنية المحيطة41,42. وبالتالي ، فهي أداة مثالية لوضع العلامات على إعادة تدوير الحويصلات المشبكية والتتبع اللاحق لهذه الحويصلات حيث يتم إطلاقها لاحقا بعد التحفيز العصبي41,42. البروتوكول الذي تم إنشاؤه وتحسينه هو تكييف للمفاهيم التي وصفها غافيلد وزملاؤه في البداية ، مما يسمح لنا بتصور ثقب الحويصلة المشبكية المسمى بصبغة الستايريل بمرور الوقت بشكل مستمر41.

هنا ، يتم وصف منهجيتين قائمتين على التألق ، حيث يتم الإبلاغ بشكل موثوق عن أحداث خلوية محددة تشارك في الانتقال المشبكي. تم تعريف البروتوكولات للتحقيق في ديناميكيات تدفق الكالسيوم الطرفي قبل المشبكي بوساطة إزالة الاستقطاب وإفراز الحويصلة المشبكية في الخلايا العصبية المستزرعة. هنا ، تركز الطرق والنتائج التمثيلية على استخدام الخلايا العصبية القشرية أو الحركية الأولية للقوارض كنظام نموذج في المختبر ، حيث توجد دراسات منشورة باستخدام أنواع الخلايا هذه43,44. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق قابلة للتطبيق أيضا على الخلايا العصبية البشرية المتباينة i3 الشبيهة بالقشرية 45 ، حيث حققنا أيضا نجاحا مع كلا البروتوكولين في التجارب الجارية حاليا في مختبرنا. يتم تحديد البروتوكول العام في شكل خطي تدريجي ، كما هو موضح في الشكل 1. باختصار ، لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا العصبية ، يتم نقل الخلايا العصبية الناضجة باستخدام الحمض النووي البلازميدي للتعبير عن مراسل الفلورسنت GCaMP6m تحت مروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) 37,46. تحتوي الخلايا المنقولة على مستوى منخفض من التألق الأخضر القاعدي ، والذي يزداد في وجود الكالسيوم. يتم تحديد المناطق ذات الأهمية لمراقبة تغيرات التألق طوال فترة تلاعبنا. وهذا يسمح بقياس التقلبات المكانية والزمانية العالية في الكالسيوم37,46. لتقييم اندماج الحويصلة المشبكية وإطلاقها ، يتم تحميل الخلايا العصبية الناضجة بصبغة الستيريل المدمجة في أغشية الحويصلة المشبكية أثناء إعادة تدويرها وإصلاحها وإعادة تحميلها بالناقلات العصبية في الخلايا قبل المشبكية 41،42،43،47،48. الأصباغ الحالية المستخدمة لهذا الغرض تسمية الحويصلات المشبكية على طول الخلايا العصبية وتستخدم كوكيل لهذه المناطق في تجارب التصوير الحي ، كما هو موضح من خلال التلطيخ المشترك لصبغة الستايريل و synaptotagmin من قبل Kraszewski وزملاؤه49. تتضمن هنا صورا تمثيلية لتلطيخ مماثل تم إجراؤه أيضا (الشكل 2A). استخدم الباحثون السابقون هذه الأصباغ على نطاق واسع للإبلاغ عن ديناميكيات الحويصلة المشبكية عند التقاطع العصبي العضلي والخلايا العصبية الحصينية48,49,50,50,51,52,53,54,55,56 . ومن خلال اختيار المناطق المثقوبة من الحويصلات المحملة بالصبغة ورصد الانخفاضات في شدة التألق بعد إطلاق الحويصلة، يمكن دراسة قدرة الإرسال المتشابك الوظيفي والديناميات الزمنية للإطلاق بعد التحفيز43. بالنسبة لكلتا الطريقتين ، يتم استخدام وسط يحتوي على تركيز عال من كلوريد البوتاسيوم لإزالة استقطاب الخلايا لمحاكاة النشاط العصبي. يتم تحديد معلمات التصوير لالتقاط فترات دون الثانية تمتد عبر تطبيع خط الأساس تليها فترة التقاط التحفيز لدينا. يتم تحديد قياسات التألق في كل نقطة زمنية ، وتطبيعها في الخلفية ، وتحديدها كميا خلال الفترة الزمنية التجريبية. يمكن الكشف عن زيادة التألق بوساطة تدفق الكالسيوم GCaMP6m أو انخفاض التألق الفعال في الحويصلة الخارجية المشبكية لإخراج صبغة الستايريل من خلال هذه الاستراتيجية. ويرد أدناه وصف للإعداد المنهجي التفصيلي وبارامترات هذين البروتوكولين ومناقشة بشأن مزاياهما وقيودهما.

Figure 1
الشكل 1: العرض المرئي لعملية البروتوكول العامة الشاملة. (1) عزل وزراعة الخلايا العصبية القوارض الأولية في المختبر إلى نقطة النضج المختارة. (2) إدخال الحمض النووي GCaMP أو صبغة الستيريل كمراسلين للنشاط المشبكي. (3) إعداد نموذج التصوير باستخدام المجهر البؤري المجهز بالتصوير الحي والبرامج المرتبطة به. ابدأ فترة تسجيل خط الأساس. (4) بينما لا تزال الخلايا تخضع لالتقاط الصور الحية ، قم بتحفيز الخلايا العصبية عن طريق تروية حمام KCl عالية. (5) تقييم قياسات شدة التألق بمرور الوقت لقياس انتقالات الكالسيوم أو اندماج الحويصلة المتشابكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها بجامعة جيفرسون.

1. الثقافة الأولية للخلايا العصبية من قشرة الفئران الجنينية

ملاحظة: يتم عزل الخلايا العصبية القشرية الأولية من أجنة الفئران E17.5 كما هو موضح سابقا57,58. لا يبدو أن هناك تحيزا للسلالة مع نجاح بروتوكول الزراعة هذا. يتم وصف هذه الطريقة بإيجاز أدناه. وينبغي الرجوع إلى المواد السابقة المشار إليها للحصول على تفاصيل كاملة.

  1. القتل الرحيم للفئران الإناث الحوامل عن طريق استنشاق CO2 تليها تأكيد ثانوي عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. حصاد الأجنة وعزل الأدمغة في محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) المخزن مؤقتا ب 20 ملليمتر من HEPES. من قشرة القشرة الخارجية ، افصل المخطط والحصين ثم تخلص منهما. جمع القشرة.
  3. استخدم ملقط ناعم لإزالة السحايا من القشرة. للقيام بذلك ، قم بتثبيت القشرة في مكانها باستخدام زوج واحد من الملقط المغلق باستخدام ضغط لطيف.
    ملاحظة: مع الزوج الثاني من الملقط في اليد الثانية ، قرصة السحايا. قشر السحايا باستخدام الحركة المتدحرجة مع زوج مقروص. أعد وضعه باستخدام الملقط المغلق وكرر ذلك حسب الضرورة حتى تتم إزالة السحايا بالكامل.
  4. احتضان القشرة مع 10 ميكروغرام / مل من غراء في HBSS لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. اغسل ثلاث مرات في HBSS ، ثم قم بتثبيته بلطف 5-10 مرات باستخدام ماصة باستور الزجاجية المصقولة بالنار للحصول على تعليق خلوي متجانس.
    ملاحظة: تجنب الفقاعات. الحفاظ على ماصة داخل تعليق الخلية.
  6. لوحة الخلايا العصبية على 100 ميكروغرام / مل بولي دي ليسين المغلفة 35 ملم أطباق الزجاج القاع بكثافة 75000 خلية / طبق في الوسط العصبي القاعدي مع ملحق B27 (2 ٪) ، والبنسلين الستربتومايسين.

2. الثقافة الأولية للخلايا العصبية الحركية من الحبل الشوكي للفئران الجنينية

ملاحظة: يتم تحضير الخلايا العصبية الحركية الأولية من أجنة الفئران E13.5 كما هو موضح سابقا ، مع بعض التعديلات القليلة 59,60. لا يبدو أن هناك تحيزا للسلالة مع نجاح بروتوكول الزراعة هذا. يتم وصف هذه الطريقة بإيجاز أدناه. وينبغي الرجوع إلى المواد السابقة المشار إليها للحصول على تفاصيل كاملة.

  1. القتل الرحيم للفئران الإناث الحوامل كما هو الحال في الخطوة 1.1.
  2. تشريح 10-20 الحبل الشوكي من الأجنة وكسر إلى شظايا صغيرة ميكانيكيا باستخدام زوجين من الملقط للقرصة والسحب ، على التوالي.
  3. احتضان في 0.025٪ التربسين لمدة 8 دقائق، تليها إضافة DNase في 1 ملغ / مل.
  4. جهاز طرد مركزي من خلال وسادة BSA 4٪ w / v عند 470 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية دون انقطاع.
  5. خلايا حبيبات أجهزة الطرد المركزي لمدة 55 دقيقة عند 830 × g عند 4 درجات مئوية بدون فرامل من خلال وسادة تدرج كثافة 10.4٪ (v / v) (انظر جدول المواد). احمل شريط الخلايا العصبية الحركية إلى الأمام في الواجهة المرئية.
    ملاحظة: لضمان التقاط جميع الخلايا، استخدم الوسائط الخالية من الفينول لخطوة تدرج الكثافة والوسائط المحتوية على الفينول لجميع الخطوات الأخرى. يمكن التعرف بسهولة على واجهة وسائط تدرج الكثافة والتفكك بناء على اختلاف اللون.
  6. قم بتدوير الأشرطة المجمعة من خلال وسادة BSA أخرى بنسبة 4٪ w/v عند 470 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية دون انقطاع.
  7. إعادة تعليق الخلايا العصبية الحركية النقية في وسط عصبي قاعدي كامل مع ملحق B27 (2٪) ، الجلوتامين (0.25٪) ، 2-mercaptoethanol (0.1٪) ، مصل الحصان (2٪) ، والبنسلين الستربتومايسين.
  8. لوحة الخلايا العصبية على 100 ميكروغرام / مل من بولي ليسين و 3 ميكروغرام / مل من الأغطية المغلفة بالصفيحة بكثافة 50000 خلية / طبق زجاجي 35 مم.

3. التحولات العصبية

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة للخلايا العصبية التي ستخضع لتصوير الكالسيوم GCaMP و / أو الخلايا العصبية التي يتم فيها إدخال بلازميد الحمض النووي الخارجي أو الحمض النووي الريبي ذي الأهمية قبل التقييم المشبكي. في المقابل ، يتم تحميل صبغة الستيريل قبل جلسة التصوير مباشرة ويتم تناولها في القسم 6. الملخص أدناه هو بروتوكول النقل المستخدم للخلايا العصبية الأولية للقوارض في الأمثلة المقدمة ، ولكن يمكن تكييفه وتحسينه بسهولة لاحتياجات المستخدم.

  1. تحدث عمليات نقل الخلايا العصبية القشرية الأولية المستزرعة في اليوم 12 في المختبر (DIV 12) ، في حين يتم نقل الخلايا العصبية الحركية في اليوم 7 في المختبر (DIV 7).
    ملاحظة: تحدث كافة الخطوات التالية داخل خزانة السلامة الأحيائية المعقمة.
  2. نقل 500 نانوغرام من GCaMP6m باستخدام كاشف النقل بنسبة 1: 2 حسب الحجم. بالنسبة لعمليات النقل المشتركة ، أضف ما مجموعه 1.25 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي / الطبق ، مع الحفاظ على نسبة الحمض النووي إلى الكاشف.
    ملاحظة: في الأمثلة التجريبية الموضحة، تم نقل 750 نانوغرام من البلازميد المرتبط ب ALS/FTD للتعبير عن الببتيدات الثنائية المرتبطة ب C9orf72-ALS، وبروتين FUS الطافر، وما إلى ذلك. تأكد من أن علامة الفلورسنت الخاصة بالبلازميد المنقول المشترك لن تتعارض مع قناة FITC لتصوير GCaMP. وبالمثل ، إذا كنت تقوم بتصوير صبغة الستاتريل ، فتأكد من أن البلازميد المنقول بشكل مشترك لن يتعارض مع قناة TRITC للتصوير. استخدام synaptophysin-GCaMP3 فعال بنفس القدر في هذا البروتوكول. لذلك ، قم بنقل نفس الكمية من هذا البلازميد واتبع جميع الخطوات كالمعتاد في القسم 7.
  3. احتضان مجمع كاشف نقل الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  4. أضف بلطف المجمع المحتضن إلى الخلايا العصبية بقطرة مع دوامة. أعد الطبق إلى حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة.
  5. قم بإزالة وسائط الثقافة بأكملها التي تحتوي على مجمع كاشف نقل الحمض النووي واستبدله بإعداد 50-50 حسب الحجم للوسائط العصبية المشروطة مسبقا والطازجة. ثم ، ضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة CO2 لمدة 48 ساعة حتى التصوير.

4. إعداد حلول المخزن المؤقت وحل مخزون صبغة الستيريل

  1. اجعل محاليل aCSF المنخفضة والعالية طازجة قبل التصوير باستخدام المكونات المدرجة في الجدول 1. قم بتصفية كل من حلول التخزين المؤقت قبل الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن أن يشكل ثنائي هيدرات CaCl2 Ca(OH)2 عند التخزين. لتحقيق أقصى قدر من الفعالية ، استخدم دائما حاوية تم فتحها مؤخرا. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، لإزالة Ca(OH)2 من السطح الخارجي وضمان أقصى قدر من الذوبان ، فقد تكون المحاليل غازية مع CO2 الغازي لمدة 5 دقائق قبل إضافة CaCl2. إذا تم اتخاذ هذه الخطوة ، فاضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول الناتج للحفاظ على قيمة الرقم الهيدروجيني 7.4 ، لأن الكربنة المفرطة ستؤدي إلى تكوين Ca(HCO3)2.
مخزن مؤقت منخفض KCL aCSF (درجة الحموضة 7.40 إلى 7.45)
الكاشف تركيز
هيبس 10 مللي متر
كلوريد الصوديوم 140 مللي متر
كيه سي ال 5 مللي متر
الجلوكوز 10 مللي متر
CaCl2 2H2O 2 مللي متر
MgCl2 4H2O 1 مللي متر
مخزن مؤقت عالي KCL aCSF (درجة الحموضة 7.40 إلى 7.45)
الكاشف تركيز
هيبس 10 مللي متر
كلوريد الصوديوم 95 مللي متر
كيه سي ال 50 مللي متر
الجلوكوز 10 مللي متر
CaCl2 2H2O 2 مللي متر
MgCl2 4H2O 1 مللي متر

الجدول 1: تكوين المخازن المؤقتة للسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (aCSF). يتضمن هذا الجدول مكونات تحضير مخازن سائل دماغي شوكي اصطناعية منخفضة وعالية KCl تستخدم أثناء تصوير الخلايا العصبية وتحفيزها. انظر القسم 4 للحصول على تعليمات التحضير.

  1. تحضير محلول مخزون صبغة الستيريل عن طريق أخذ قارورة 100 ميكروغرام من الصبغة وإعادة تشكيلها إلى تركيز مخزون يبلغ 10 ملليمتر بالماء المقطر أو الوسط القاعدي العصبي.

5. إعداد نظام المجهر والتروية

ملاحظة: بالنسبة لتصوير أطباق بتري ذات القاع الزجاجي، يفضل استخدام مجهر فلوري مقلوب البؤرة بسبب مرونة التروية ولاستخدام هدف غمر زيت الفتحة العددية العالية. ارجع إلى جدول المواد الخاص بالمجهر البؤري والكاميرا والأهداف المستخدمة لتصوير الأمثلة المفصلة في قسم النتائج التمثيلية .

  1. قم بإجراء جميع التجارب عند 37 درجة مئوية مع مستويات ثابتة من CO2 بنسبة 5٪ باستخدام حامل مرحلة مقترن بنظام الحاضنة.
  2. التحكم في الحصول على الصور باستخدام برنامج متحد البؤرة. قم بتحسين إعدادات الاكتساب في بداية جلسة التصوير لاختيار قوة الإثارة والكسب لضمان التصور الأمثل للإشارات دون التبييض الضوئي.
    1. حافظ على قوة الإثارة ووقت التعرض وكسب الكاشف ومعدل الإطارات ثابتا عبر جميع العينات. قم بإجراء تصوير بفاصل زمني باستخدام نسبة عرض إلى ارتفاع تبلغ 512 × 512 ومعدل إطارات يبلغ 2 صورة / ثانية لتقليل تبييض الصبغة.
      ملاحظة: في حين يجب أن تكون الثقب مرئية بوضوح ، يجب ضبط شدة الليزر على الحد الأدنى الممكن لتجنب التبييض والسمية الضوئية. اضبط الفتحة البؤرية على أضيق إعداد لتحقيق الدقة المثلى للبوصم الفلورية داخل الخلايا العصبية. يتم ضبط وقت التعرض على 200 مللي ثانية أو أقل، وهو ما يتوافق مع العينات. كانت سرعة التصوير القصوى للكاميرا المستخدمة هي 2 صورة / ثانية. إذا كنت تستخدم كاميرا أسرع ، فيمكن التقاط المزيد من الصور / الصور. يجب اختيار إعدادات التصوير الزمني إن أمكن.
  3. حدد مجموعات مرشحات الإثارة / ثنائي اللون / الانبعاثات التالية للتصوير باستخدام برنامج متحد البؤرة: Gcamp6m / Gcamp3 مع FITC وصبغة الستايريل مع TRITC ، على التوالي.
  4. استخدم ميزة التركيز البؤري المثالية لبرنامج الحصول على التصوير متحد البؤرة أثناء التصوير بالفاصل الزمني لتجنب الانجراف على شكل حرف z.
    ملاحظة: نظرا للسرعة السريعة للتصوير، يتم تصوير مستوى واحد. من المهم جدا ضمان عدم وجود z-drift أثناء التجربة.
  5. حدد علامة التبويب الوقت في لوحة الحصول على الصورة لتعيين فترات التسجيل وفواصله.
    1. اضبط المرحلة #1 على الفاصل الزمني 500 مللي ثانية ، المدة 3 - 5 دقائق.
    2. اضبط المرحلة #2 على الفاصل الزمني 500 مللي ثانية ، المدة 5 دقائق.
      ملاحظة: تتوافق المرحلة رقم 1 مع تسجيل خط الأساس ، والمرحلة رقم 2 مع فترة التحفيز ، على التوالي.
  6. قم بتجميع جهاز تروية الجاذبية ل aCSF باستخدام نظام التحكم في الصمام ومشعب القناة.
    1. قم بتحميل KCl عالي (انظر الجدول 1) في حقنة سعة 50 مل في الجزء العلوي من الجهاز ، مع تشغيل الأنابيب عبر النظام. اضبط معدل التدفق على 1 مل / دقيقة.
  7. قم بتحميل طبق زجاجي 35 مم يحتوي على خلايا عصبية على مرحلة التصوير البؤري ، مع وضع نهاية أنبوب التروية على حافة الطبق. اختر الحقل للتصوير.

6. تصوير صبغة الستيريل لإطلاق الحويصلة المشبكية

  1. احتضان الخلايا في منخفض KCl aCSF (انظر الجدول 1) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 48 ساعة بعد النقل.
  2. قم بتحميل الخلايا العصبية القشرية أو الحركية الأولية على أطباق بتري ذات القاع الزجاجي مع صبغة الستيريل.
    1. إزالة منخفضة KCl aCSF عن طريق الطموح.
    2. استخدم ماصة لتحميل الخلايا العصبية في الظلام مع 10 ميكرومتر من صبغة الستيريل في aCSF تحتوي على 50 mM KCl لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإزالة محلول التحميل والخلايا العصبية للاستحمام في KCl aCSF منخفض لمدة 10 دقائق للقضاء على تحميل الصبغة غير المحددة.
  3. ضع الطبق ذو القاع الزجاجي مقاس 35 مم على مرحلة التصوير ، ثم راقب إما تحت هدف هوائي 20x أو هدف غمر الزيت 40x لمجهر بؤري مقلوب.
    ملاحظة: استخدم تألق GFP لتحديد موقع الخلايا المنقولة في حالة الخلايا المنقولة بشكل مشترك مع بلازميد يحمل علامة GFP.
  4. قم بإثارة صبغة الستيريل باستخدام ليزر 546 نانومتر ، وجمع الانبعاثات باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 630-730 نانومتر (TRITC).
  5. حدد مجال التصوير وتفاعل مع التركيز البؤري المثالي. بعد ذلك ، التقط صورة ثابتة واحدة باستخدام قنوات علامة brightfield و TRITC و fluorescence لتحديد الحدود العصبية.
  6. ابدأ التشغيل الآن في برنامج الاستحواذ. قم بإجراء التسجيل القاعدي لمدة 3-5 دقائق لاستبعاد الاختلافات في كثافة الصبغة ، إن وجدت (المرحلة # 1).
    ملاحظة: من الضروري التأكد من أن أي انخفاض في كثافة الصبغة يرجع إلى إطلاق الحويصلة المشبكية وليس انتشار الصبغة السلبي أو التبييض الضوئي. يجب أن تؤدي فترة ما قبل التحفيز التي تتراوح مدتها بين 3 و 5 دقائق إلى مستوى ثابت ومحافظ عليه من كثافة الصبغة. سيتم استخدام ال 30 ثانية الأخيرة من هذا التسجيل لتحديد متوسط قيمة التألق الأساسية لكل عائد استثمار. قبل تقييم الظروف التجريبية ، يمكن أيضا إجراء حالة إضافية غير محفزة لمدة 10 دقائق تقريبا من التسجيل المستمر باستخدام إعدادات الاكتساب المقصودة لضمان قيم تألق ثابتة باستخدام إعدادات الليزر لفترة طويلة.
  7. عند التبديل إلى المرحلة #2 ، قم بتشغيل الزر الخاص بنظام التروية. ثم ، قم باستمرار بدمج 50 mM KCl على الخلايا العصبية لتسهيل تفريغ الصبغة (المرحلة # 2).
    1. قم بإجراء تسجيلات لمدة 300 ثانية بعد إضافة KCCL. بعد ذلك ، يتوقف الاستحواذ. قم بتشغيل مفتاح إيقاف التشغيل لنظام التروية.
  8. احفظ التجربة وقم بتحليل البيانات باستخدام برنامج متحد البؤرة كما هو موضح في القسم 8 أدناه.
    ملاحظة: قد يتم إيقاف التجربة عند هذه النقطة، ويمكن إجراء التحليل لاحقا. في الحالة التي لا تتطلب فيها الخلايا نقل الحمل للتعبير عن البروتينات ذات الأهمية ، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في أي وقت في المختبر عند السعي إلى فحص وظيفة التفريغ المشبكي. بعد اختبار خلايا التحكم لضمان التفريغ المتشابك السليم ، يجب أن يعمي المجرب عن الظروف الوراثية أو الدوائية لكل طبق تم اختباره لتقليل التحيز.

7. التصوير الفلوري لعابرات الكالسيوم Gcamp6m

  1. الخلايا العصبية القشرية للقوارض الأولية المستزرعة على أطباق ذات قاع زجاجي 35 مم مع 500 نانوغرام من Gcamp6m كما هو موضح في القسم 3.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، شارك في نقل الخلايا العصبية مع بلازميد ذي أهمية يحتوي على علامة فلورسنت في النطاق الأحمر أو الأحمر البعيد.
  2. احتضن الخلايا العصبية ذات السائل الدماغي الشوكي المنخفض لمدة 15 دقيقة و 48 ساعة بعد النقل ثم قم بتركيب الطبق على منصة التصوير.
  3. تصور تألق GCaMP6m باستخدام مرشح FITC (488 نانومتر) وهدف 20x أو 40x.
  4. حدد مجال التصوير وتفاعل مع التركيز البؤري المثالي. بعد ذلك ، التقط صورة ثابتة واحدة باستخدام قنوات علامة brightfield و FITC و fluorescence لتحديد الحدود العصبية.
  5. ابدأ التشغيل الآن في برنامج الاستحواذ. قم بإجراء التسجيل الأساسي لمدة 5 دقائق ، ثم قم باستخدامه باستخدام aCSF الذي يحتوي على 50 mM KCL بنفس الطريقة الموضحة في القسم 6 لتجارب صبغة الستاريل.
    ملاحظة: الهدف من هذا التصوير هو قياس عابرات الكالسيوم المستحثة. إذا كان للخلية العصبية نشاط إطلاق قاعدي وتدفقات الكالسيوم خلال فترة ما قبل التحفيز ، فلا يتم استخدامها في تحليل البيانات. بدلا من ذلك ، يتم استخدام الخلايا ذات الخلفية الفلورية المستقرة فقط. يمكن أيضا تمديد فترات ما بعد التحفيز إلى 60 دقيقة لعابري الكالسيوم ، مع أو بدون تروية KCl عالية مستمرة إضافية.
  6. احفظ التجربة وقم بتحليل البيانات باستخدام برنامج متحد البؤرة كما هو موضح في القسم 8 أدناه. قد يتم إيقاف التجربة عند هذه النقطة ، ويمكن إجراء التحليل لاحقا.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا لا تتطلب النقل للتعبير عن البروتينات ذات الأهمية ، فيمكن تنفيذ هذا البروتوكول في أي نقطة زمنية في المختبر عند السعي إلى فحص انتقالات الكالسيوم. بعد اختبار خلايا التحكم لضمان قياس انتقالات الكالسيوم ، يجب أن يعمي المجرب عن الظروف الوراثية أو الدوائية لكل طبق تم اختباره لتقليل التحيز.

8. تحليل الصور

  1. افتح الصور ذات الفاصل الزمني باستخدام برنامج متحد البؤرة.
  2. محاذاة الصور في سلسلة الفاصل الزمني بواسطة سلسلة الأوامر: Image | | المعالجة محاذاة المستند الحالي. حدد محاذاة إلى الإطار الأول.
  3. حدد مناطق الاهتمام (ROIs) على طول الخلايا العصبية باستخدام أداة تحديد عائد الاستثمار، وهي أيقونة على شكل حبة على يمين إطار الصورة (الشكل 3B). أيضا ، ضع علامة على عائد الاستثمار يمثل كثافة التألق في الخلفية.
    ملاحظة: يتم تحديد عائد الاستثمار عن طريق اختيار مناطق من الثقب المنفصل بشكل واضح على طول المسارات العصبية المشار إليها في الصورة الثابتة للحقل الساطع. يتم اختيار ما لا يقل عن خمسة عائد استثمار لكل خلية عصبية للتحليل. يتم اختيار عائد الاستثمار في الخلفية في منطقة من مجال الرؤية لا تحتوي على neuroites.
  4. قياس التألق الخام بمرور الوقت لعائد الاستثمار المحدد باستخدام سلسلة الأوامر التالية: قياس | قياس الوقت.
    1. ابدأ وظيفة القياس في الجزء العلوي من لوحة قياس الوقت. يتم إنشاء تمثيل رسومي للتألق الخام بمرور الوقت (الشكل 3C) والبيانات الكمية.
      ملاحظة: تمثل كل نقطة بيانات التألق الخام لعائد الاستثمار هذا للإطار المرتبط بتلك النقطة الزمنية المحددة المقاسة.
  5. تصدير كثافة التألق الخام إلى برنامج جداول البيانات.
  6. تحليل كل عائد استثمار بشكل مستقل. أولا ، تطبيع البيانات عن طريق طرح كثافة عائد الاستثمار في الخلفية من عائد الاستثمار لكثافة الاهتمام في كل نقطة زمنية.
    1. خذ قيمة التألق الخام من عائد الاستثمار في الخلفية في كل نقطة زمنية محددة واطرحها من عائد الاستثمار لقيمة كثافة الفائدة الخام في تلك النقطة الزمنية.
      ملاحظة: يتم ذلك طوال فترة التسجيل ، سواء المراحل القاعدية أو التحفيزية.
  7. تحديد متوسط عائد الاستثمار لكثافة الفائدة لآخر 30 ثانية من خط الأساس.
    1. متوسط القيم القاعدية الخام العادية التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.6 من ال 30 ثانية الأخيرة من فترة التسجيل القاعدية التي تبلغ 3-5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن استخدام كامل فترة التسجيل القاعدي لإنشاء هذه القيمة. ومع ذلك ، مع استقرار هذه القيمة والحفاظ عليها ، فإن نقاط 60 مرة من ال 30 ثانية النهائية ذات حجم أخذ عينات كاف لتمثيل الكل.
  8. قارن قيمة خط الأساس هذه بقيمة الكثافة العادية في كل نقطة زمنية ، مما يؤدي إلى حدوث تغيير في قيمة التألق (ΔF).
    1. خذ القيمة من الخطوة 8.7 واطرح متوسط قيمة الفلورسنت الأساسية. قم بذلك والخطوات اللاحقة لفترة التسجيل بأكملها ، سواء المراحل القاعدية أو التحفيزية.
  9. احسب هذا التغير فيما يتعلق بقيمة التألق الأساسية، مما يولد تغيرا في التألق / التألق الأساسي (ΔF/F). للقيام بذلك، خذ القيمة من الخطوة 8.8 وقسمها على متوسط القيمة الفلورية الأساسية.
  10. وأخيرا، اضبط قيمة نقطة البداية على 1 بحيث يمكن تصور الزيادات أو النقصان بسهولة بيانيا بمرور الوقت.
    1. خذ القيمة التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.9 وأضف 1.
      ملاحظة: عند القيام بذلك بشكل صحيح، يجب أن تحوم 30 ثانية من قيم الفترة الأساسية بالقرب من قيمة 1. في الخلايا التي تطلق محتوى مشبكي بشكل فعال ، يجب أن تتجه هذه القيمة من 1 إلى 0 بعد بدء التحفيز. ويرد مثال على الخطوات من 6 إلى 9 في الشكل 3 هاء.

9. تحليل البيانات

ملاحظة: يمكن أن يكون المجرب غير أعمى عن الظروف التجريبية لتجميع البيانات لتحليلها بشكل مناسب. استخدم حجم عينة لا يقل عن 10 خلايا عصبية لكل حالة من كل تجربة من التجارب المستقلة الثلاث. فكر فقط في إدراج الخلايا العصبية إذا كان من الممكن تعيين خمس مناطق على الأقل من عائد الاستثمار. كان هذا المستوى من التكرار التجريبي كافيا في الدراسات المنشورة لإثبات فقدان عميق للتفريغ المشبكي في الخلايا المحتوية على poly-GA ذات الصلة ب ALS مقابل عناصر تحكم GFP (انظر النتائج التمثيلية). ومع ذلك ، إذا لوحظ نمط ظاهري أكثر دقة ، فقد يتطلب عدد النسخ المتماثلة البيولوجية و / أو التقنية التحسين من قبل المستخدم.

  1. باستخدام جميع قيم ΔF / F المحسوبة بمرور الوقت من عائد الاستثمار لحالة تجريبية معينة ، حدد متوسط قيمة ΔF / F لكل نقطة زمنية إلى جانب SEM.
  2. ارسم البيانات باستخدام برنامج رسوم بيانية وإحصائية بتنسيق xy، حيث x هو الوقت المنقضي، وy هي قيمة ΔF/F المحسوبة في الخطوة 9.1. تقديم جميع القيم كمتوسط ± SEM.
  3. لتحديد الدلالة الإحصائية ، استخدم اختبار t للطالب لمقارنة مجموعتين وتحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) متبوعا بتحليل Tukey اللاحق لمقارنة ثلاث مجموعات أو أكثر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد التنفيذ الناجح للبروتوكول المذكور أعلاه ، يتم عرض نتائج تمثيلية لتجربة إطلاق حويصلة متشابكة نموذجية لصبغة الستاريل. تم تحميل الخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران المستزرعة بالصبغة باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 6. تم تحديد خصوصية تحميل الصبغة عن طريق وضع العلامات المشتركة مع synaptophysin. غالبية الثقوب الإيجابية لصبغة الستيريل هي إيجابية مشتركة لهذه العلامة (الشكل 2A). لتحديد ما إذا كانت الإعدادات المستخدمة لتصوير صبغة الستيريل تسبب التبييض الضوئي ، عادة ما يتم تحميل بئر غير معالج بالصبغة وتصويره لفترة طويلة مدتها 10 دقائق دون تحفيز للتأكد من بقاء قيم التألق ثابتة.

بالإضافة إلى ذلك ، تظهر النتائج مرة أخرى باستخدام الوسم المشترك للسينابتوفيسين وصبغة الستيريل كما في الشكل 2A. تم تصوير هذه الفلوروفورات بشكل مشترك باستخدام النموذج المشار إليه في القسم 6 لتصوير صبغة الستايريل TRITC ، بالإضافة إلى الالتقاط المزدوج لتألق synaptophysin باستخدام طاقة ليزر عالية الكثافة على قناة DAPI لتصور mTurquoise-synaptophysin. تظهر صور تمثيلية للمناطق المتشابكة قبل وبعد التحفيز (الشكل 2B). في حين أن هذه الطريقة هي استدلال غير مباشر لعدم وجود تبييض ضوئي ، فإن تحليل قيم الكثافة الخام على مدار فترة التصوير بأكملها يكشف أن شدة synaptophysin تظل ثابتة ، في حين تنخفض شدة صبغة الستايريل بعد التحفيز (الشكل 2C). وهكذا ، مع أخذ هذه التجربة وضوابطنا الأخرى للتألق المستقر قبل التحفيز وعلى مدى فترات طويلة في الآبار غير المحفزة ، أثبتنا أن الانخفاض في تألق الستايريل يمكن أن يعزى إلى التفريغ المشبكي من خلال إزالة الاستقطاب KCl بدلا من تأثيرات التبييض الضوئي.

Figure 2
الشكل 2: تقييم الخصوصية ومعلمات التصوير لوضع العلامات على صبغة الستاريل. (أ) صورة تمثيلية 40x لخلية عصبية قشرية للفئران تحمل اسم صبغة الستايريل (حمراء) ، والتي تم نقلها قبل 24 ساعة باستخدام بلازميد للتعبير عن mTurquoise2-synaptophysin61 طردت من مروج المشبك (الأخضر). يشير التوطين المشترك لهذين الفلوروفور إلى أن الغالبية العظمى من البونكتا الإيجابية لصبغة الستيريل ملطخة بمتشابك مع سينابتوفيزين علامة الحويصلة المتشابكة. يشير شريط المقياس إلى 5 ميكرومتر. (ب) تم نقل الخلايا العصبية القشرية وتحميل صبغة الستيريل كما في (أ) وتصويرها وفقا لنموذج صبغة الستيريل جنبا إلى جنب مع التقاط التألق المزدوج ل mTurquoise-synaptophysin على قناة DAPI. تظهر الصور التمثيلية مناطق synaptophysin و styryl dye puncta قبل وبعد التحفيز. يشير شريط المقياس إلى 5 ميكرومتر. (ج) تم رصد التألق بمرور الوقت للسينابتوفيزين (أعلى قناة DAPI) وصبغة الستيريل (قاع قناة FITC). تم الحفاظ على شدة Synaptophysin في تألق ثابت خلال فترة التصوير والتحفيز ، في حين انخفض تألق صبغة الستايريل حيث تم تفريغ الصبغة عند التحفيز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تظهر الصور التمثيلية تحميل صبغة الستيريل أثناء التصوير ، مع اختيار عائد الاستثمار (الشكل 3A-B). يتم رسم كثافة التألق الخام لعائد الاستثمار المحدد وعائد الاستثمار في الخلفية باستخدام البرنامج البؤري (الشكل 3C). كما تم نقل الخلايا العصبية الموضحة هنا باستخدام البلازميدات لدراسة آثار بروتينات ثنائي الببتيد المنتجة في سياق C9ORF72-ALS ، وهي FLAG-eGFP و FLAG-GA50-eGFP التي تم طردها من مروج T7. يؤدي إطلاق الحويصلة المشبكية بنجاح إلى فقدان مذهل لتألق الصبغة عند إزالة الاستقطاب العالية KCl (الشكل 3D ، أعلى لوحتين) لخلية تحكم GFP منقولة. يوضح مقطع فيديو تمثيلي مدرج هنا كيفية ظهور ذلك أثناء التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، تقوم خلية عصبية بتفريغ صبغة الستيريل بشكل انتقائي في منطقة عصبية بعد التحفيز (فيديو 1).

من ناحية أخرى ، يتم تمثيل ضعف الانتقال المشبكي من خلال تألق الصبغة المحتفظ به حتى بعد إزالة الاستقطاب العالية KCl في الخلايا العصبية المنقولة باستخدام بناء تكرار ثنائي الببتيد المرتبط ب C9ORF72 (GA50) (الشكل 3D ، أسفل لوحين ) 43. بعد التحليل الكمي للبيانات (الشكل 3E)، يتم تمثيل البيانات على أنها كثافة صبغة في جميع أنحاء التصوير لمجموعات التحكم (GFP) و ALS/FTD (GA50) (الشكل 3F)43. يمكن لهذه الطريقة أيضا تحليل التأثيرات الوسيطة وليست مجرد مقياس ثنائي "كل شيء أو لا شيء". في التجارب المصممة لإنقاذ العجز المشبكي بوساطة GA50 ، تم إدخال البروتين 2 المرتبط بالحويصلة المشبكية الخارجية (SV2) عن طريق النقل الفيروسي باستخدام بلازميد rSV2a-eGFP-pRRL الذي تم طرده من مروج PGK البشري. بعد التصوير والتحليل كما هو موضح أعلاه ، تم إنقاذ إطلاق متشابك في الخلايا العصبية التي تشترك في التعبير عن GA50 و SV2 (الشكل 3G).

Figure 3
الشكل 3: تقييم إطلاق الحويصلة المشبكية من خلال وضع علامات صبغة الستاريل. (أ) صورة تمثيلية 40x لخلية عصبية تحمل علامة صبغة الستيريل في وسائط KCl aCSF منخفضة في بداية تجربة التصوير. يشير شريط المقياس إلى 20 ميكرومتر. (ب) تصوير توليد العائد على الاستثمار على الصورة من (أ). يتم اختيار مناطق محددة من البونكتا على طول الخلايا العصبية (#1-4) باستخدام أداة عائد الاستثمار ، الزر على شكل حبة مميزة على اليمين. يتم تحديد عائد استثمار نهائي في منطقة فارغة لالتقاط كثافة إشارة الخلفية. يتم تجنب المناطق ذات النقاط المضيئة غير المحددة وغير العصبية. يشير شريط المقياس إلى 20 ميكرومتر. (ج) تمثيل كثافة الإشارة لعائد الاستثمار #1-5 من (B) بمرور الوقت على النحو المرسوم/المصور بواسطة برنامج متحد البؤرة. (د) التمثيلات المرئية لمناطق عائد الاستثمار قبل / بعد التحفيز للخلية العصبية التي تخضع بفعالية للانتقال المشبكي (أعلى لوحتين). اللوحتان السفليتان عبارة عن صور مكبرة مع عتبة غير متحيزة يتم تطبيقها لعزل الثقب عن الخلفية لإظهار المناطق المتميزة بصريا. تخضع الخلايا العصبية المحتوية على GFP بشكل فعال لإطلاق متشابك ، في حين أن التعبير عن الببتيد المرتبط ب C9ORF2-ALS GA50 يمنع هذا التأثير. تشير أشرطة المقياس إلى 10 ميكرومتر - أعيد طبعها من Jensen et al. 202043. (هاء) مثال على ملف قياس كمي يستخدم برامجيات جداول البيانات، يبين تطبيع القيم إلى خط الأساس وتوليد قيم ΔF/F بمرور الوقت. يتم تطبيع البيانات أولا إلى قيمة كثافة عائد الاستثمار في الخلفية في كل نقطة زمنية. ثم تتم مقارنة هذه القيمة بمتوسط عائد الاستثمار لقيمة خط الأساس للفائدة لآخر 30 ثانية قبل التحفيز (كما هو موضح هنا على أنه 10 s في فترات 1 ثانية للبساطة) (ΔF). ويحسب هذا التغيير بعد ذلك كجزء من التألق الأساسي (ΔF/F). وأخيرا، يتم تعيين قيمة نقطة البداية إلى 1 بحيث يمكن تصور الزيادات أو النقصان بسهولة بيانيا بمرور الوقت. يتم جمع ما لا يقل عن خمس مناطق بونكتا لكل خلية عصبية وما لا يقل عن عشرة خلايا عصبية لكل حالة تجريبية ، مع جمع بيانات مثل هذه لإنشاء متوسط القياسات في كل نقطة زمنية. (و) يتم نقل البيانات من ملف جدول بيانات كما هو الحال في (E) إلى برنامج برمجي للرسوم البيانية والإحصاءات. بالنسبة للرسم البياني الموضح هنا، يتم رسم قيمة ΔF/F في كل نقطة زمنية يتم حسابها في المتوسط على جميع مناطق الثقب في حالة تجريبية، إلى جانب الخطأ القياسي للمتوسط. الرسم البياني هنا عبارة عن بيانات من تجارب GFP مقابل GA50 المشار إليها في (D) ، حيث يتم عرض آخر 10 s من خط الأساس وأول 10 s من فترة التحفيز وإعادة طباعتها من Jensen et al. 202043. (ز) يمكن لهذا الفحص أن ينتج منحنيات للإفراج المشبكي الوسيط وليس مجرد استجابة "كل شيء أو لا شيء". تم التعبير عن GA50 بالاشتراك مع البروتين المشبكي الخارجي SV2 (البروتين المرتبط بالحويصلة المشبكية 2) ، وتم إجراء تصوير وتحليل صبغة الستيريل كما هو موضح في الخطوات السابقة. كما هو الحال في الشكل 3F ، يمثل الرسم البياني الموضح هنا قيمة ΔF / F في كل نقطة زمنية يتم رسمها في المتوسط على جميع مناطق puncta لحالة تجريبية ، إلى جانب الخطأ القياسي للمتوسط. يوضح الرسم البياني الدقيقة الأخيرة من خط الأساس والدقيقة الأولى من فترة التحفيز من Jensen et al. 202043. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1: فيديو تمثيلي لتجربة تصوير صبغة الستيريل. يظهر فيديو تمثيلي لخلية عصبية قشرية محملة بصبغة الستاريل. يظهر الفيديو الفترة التي تبدأ في وقت تروية الحمام من KCl aCSF عالية. تسلط المنطقة المربعة الضوء على الخلايا العصبية ، مع فقدان ملحوظ لتألق البونكتا بمرور الوقت. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

باتباع الطريقة الموضحة في القسم 7 ، تظهر صور فلورية تمثيلية للخلايا العصبية القشرية المنقولة باستخدام GcaMP6m قبل وبعد إزالة الاستقطاب KCl (الشكل 4A). تظهر الرسوم البيانية للكثافة الخام زيادة قيم التألق التي تتقلب ، مما يشير إلى دخول الكالسيوم إلى الخلايا العصبية بعد إزالة الاستقطاب الناجم عن KCl (الشكل 4B). يظهر هذا الفيديو التمثيلي الثاني الخلايا العصبية التي تعبر عن GcaMP6m مع تألق منخفض في نهاية فترة خط الأساس للتسجيل لإثبات هذا التأثير. في بداية التحفيز ، تعرض الخلايا العصبية زيادة كبيرة في التألق (فيديو 2). وقد استخدم هذا النهج بنجاح لإثبات تغيرات دخول الكالسيوم في نموذج FUS-ALS المتحور. تم نقل الخلايا النجمية في هذا النموذج باستخدام الفيروس الغدي الذي يحتوي على بلازميدات eGFP-FUS التي يحركها مروج CMV. عندما تم وضع وسط مشروط من الخلايا النجمية المتحولة عن FUS على الخلايا العصبية الحركية ، لوحظ زيادة تدفق الكالسيوم مقارنة بظروف FUS غير المتحولة بعد α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) + تحفيز cyclothiazide (الشكل 4C)44. تم اختبار حساسية هذا الفحص من خلال إجراء تجارب مع وبدون الكالسيوم المضمن في وسط التروية. في إعداد GFP مقابل GA50 المذكور أعلاه ، لوحظت زيادة في ذروة انتقالات الكالسيوم في GA50 التي تحتوي على الخلايا العصبية الحركية. والجدير بالذكر أن هذا يعتمد على الكالسيوم القادم إلى الخلية وليس إطلاق مخازن الكالسيوم الداخلية. عندما تمت إزالة الكالسيوم من وسط aCSF المحفز ، لم يلاحظ أي استجابات عابرة للكالسيوم في أي من الحالتين التجريبيتين (الشكل 4D)43.

Figure 4
الشكل 4: مراقبة انتقالات الكالسيوم في الوقت الفعلي باستخدام مراسلي GCaMP. (أ) صورة 40x ل GCaMP6m تعبر عن الخلايا العصبية ، ذات اللون الزائف لإظهار شدة تألق GFP (منخفض باللون الأزرق إلى مرتفع باللون الأحمر). تعرض اللوحات اليسرى مجال الرؤية الكامل 40x قبل وبعد التحفيز. يشير شريط المقياس إلى 20 ميكرومتر. الصور الموجودة على اليمين هي إصدارات مكبرة من المناطق المربعة التي تم الكشف عنها. من خلال هذه الصور ، من الواضح بالعين أن هناك زيادة قوية في مستويات الكالسيوم العصبية البؤرية بعد التحفيز. يشير شريط المقياس إلى 12 ميكرومتر. (ب) يتم اختيار عائد الاستثمار ورصد كثافة التألق طوال التجربة كما هو موضح في الشكل 3. يتم عرض 30 ثانية النهائية من خط الأساس و 1 دقيقة من التحفيز لاثنين من عائد الاستثمار المحدد للخلية العصبية التي تخضع لمراقبة التألق GCaMP6m هنا. على النقيض من تصوير صبغة الستيريل ، تزداد شدة التألق بعد التحفيز العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو مذكور هنا ، تتقلب عابرات الكالسيوم في الخلايا العصبية بمرور الوقت. لذلك ، يتم تمثيل النتائج عادة كمتوسط قيمة تغيير التألق الفلوري الطبيعي لكل منطقة عائد استثمار. (ج) يظهر التقدير الكمي التمثيلي لمثل هذه التجربة كما نشر في Kia-McAvoy et al. 201844 ، حيث أظهرت الخلايا العصبية الحركية الأولية التي تلقت supernatant المشتقة من الخلايا النجمية FUS-ALS المتحولة تدفقا متزايدا بشكل كبير للكالسيوم بعد تحفيز مستقبلات AMPA ، مقارنة بالخلايا العصبية التي تتلقى supernatant من FUS البرية التي تعبر عن الخلايا النجمية. (د) التحديد الكمي التمثيلي للتصوير العابر للكالسيوم حيث لم يكن الكالسيوم مدرجا في السائل الدماغي الوسيط المحفز. تظهر حالات mCherry مقابل GA50-mCherry التي يتم تحفيزها باستخدام KCl aCSF عالي مع أو بدون الكالسيوم كما هو منشور في Jensen et al. 202043. أظهرت الخلايا العصبية التي تحتوي على GA50 زيادة في تدفق الكالسيوم مقارنة بالخلايا التي تحتوي على mCherry. لم يكن هناك ارتفاع في مستويات الكالسيوم الداخلية في أي من الحالتين التجريبيتين عندما تمت إزالة الكالسيوم من تحفيز KCL aCSF العالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 2: فيديو تمثيلي لتجربة GCaMP الكالسيوم العابرة. يظهر فيديو تمثيلي لحقل من الخلايا العصبية القشرية المنقولة باستخدام GCaMP6m. بعد فترة خط الأساس ، لوحظ تدفق كبير للكالسيوم عند علامة 6 ثانية عند تطبيق KCl aCSF العالي. يمكن قياس دخول الكالسيوم إما للخلية بأكملها ، أو في مناطق عصبية محددة كما هو موضح. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

المشاكل المحتملة الأسباب / الحلول المحتملة
1 تحميل غير محدد كن دقيقا مع وقت التحميل. تؤدي أوقات التحميل الأطول إلى تحميل غير محدد ل FM4-64 إلى إندوسومات وليزوسومات
2 لا يوجد إفرازات خارجية ملحوظة في الخلايا العصبية الضابطة تحقق من درجة الحموضة من محلول KCl aCSF العالي.
3 فقدان التركيز والانجراف الجانبي تأكد من التركيز المثالي على. قم بمحاذاة الصور بعد التصوير باستخدام برنامج نيكون أو المكون الإضافي ImageJ.
4 تبييض التألق FM4-64 تحقق من كثافة الليزر المستخدمة للتصوير. حاول دائما استخدام أقل كثافة ممكنة. تأكد من أن كثافة الليزر المستخدمة لا تؤدي إلى التبييض عن طريق تشغيل التشغيل التجريبي.

الجدول 2: المشاكل المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتجارب صبغة الستيريل. سيناريوهات نموذجية للمشكلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها العامة لتجارب التفريغ المتشابكة.

المشاكل المحتملة الأسباب / الحلول المحتملة
1 كفاءة النقل منخفضة جدا تحقق من صحة الخلايا العصبية. إذا كان من الصعب نقل الخلايا العصبية ، فيمكن للمرء أن يتحول إلى AAV أو نقل الفيروس العاهري ل GCaMP.
2 تراكم تألق GCaMP6 في النواة تدهور صحة الخلايا العصبية. تحقق من بروتوكول النقل.
3 فقدان التركيز البؤري وانجراف الصورة الجانبي تأكد من التركيز المثالي على. قم بمحاذاة الصور بعد التصوير باستخدام برنامج نيكون أو المكون الإضافي ImageJ.
4 لا توجد استجابة الكالسيوم عند تحفيز KCL تأكد من صحة الرقم الهيدروجيني ل aCSF.
5 تبييض التألق GCaMP6 تحقق من كثافة الليزر المستخدمة للتصوير. حاول دائما استخدام أقل كثافة ممكنة. تأكد من أن كثافة الليزر المستخدمة لا تؤدي إلى التبييض عن طريق تشغيل التشغيل التجريبي.
6 نفض الخلايا العصبية تعرض صحة الخلايا العصبية للخطر بسبب النقل. استخدم مجموعة جديدة من الثقافات العصبية.

الجدول 3: المشاكل المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتصوير انتقالات الكالسيوم في الخلايا العصبية. سيناريوهات نموذجية للمشكلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها العامة لتجارب GCaMP العابرة للكالسيوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك ثلاث خطوات مشتركة بين كلتا الطريقتين الموصوفتين ذات أهمية حاسمة للنجاح التجريبي والنتائج القابلة للقياس الكمي. أولا ، يعد إعداد aCSF الطازج قبل كل جولة من التجارب أمرا ضروريا ، باتباع التعليمات المرفقة. الفشل في القيام بذلك قد يمنع إزالة الاستقطاب العصبي المناسب. يجب اختبار عينة من الخلايا العصبية الضابطة غير المعالجة باستمرار قبل تحفيز أي مجموعات تجريبية لضمان إزالة الاستقطاب الخلوي السليم وتوفير معيار للنتائج الإيجابية التي تم الحصول عليها في جلسة التصوير تلك. ثانيا، لتتبع التألق بنجاح مع مرور الوقت لمناطق متشابكة محددة، ينبغي أيضا توخي الحذر بشكل خاص عند إعداد معلمات التصوير ومناطق عائد الاستثمار للرصد. وينبغي أن ينتقل تسجيل فترة الأساس فورا إلى فترة تسجيل التحفيز. مطلوب معدل إطارات سريع بما فيه الكفاية (2 صورة / ثانية) لالتقاط ديناميكيات الاضمحلال الفردي لإطلاق صبغة الستاريل. وأخيرا، تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في تحليل التجريب في تطبيع قياسات التألق أولا إلى خلفية التصوير ثم إلى خط الأساس الذي تم تحفيزه مسبقا. كما هو الحال مع بروتوكولات التصوير الأخرى ، يتم إجراء طرح منطقة تصوير فارغة أولا عبر جميع قياسات التألق الزمني المقترن لإزالة أي تألق تلقائي في الخلفية قد تدخله إضافة وسائط KCl. من الضروري أيضا قياس وحساب متوسط قراءة التألق لكل عائد استثمار من خط الأساس 30 s الأخير قبل التحفيز. ثم يتم استخدام متوسط قيمة البدء هذه عبر جميع القياسات الزمنية لعائد الاستثمار هذا كنقطة انطلاق محددة لتحديد كثافة "التغيير من خط الأساس".

من المعروف أن الثقافة العصبية الأولية يصعب نقلها باستخدام الحمض النووي الخارجي ، وحتى البروتوكولات المحسنة غالبا ما تسفر عن كفاءات منخفضة للخلايا الكلية في الثقافة. يتم تحقيق 20٪ -25٪ من كفاءة النقل بشكل شائع في ثقافاتنا العصبية ، مع عدم وجود دليل على السمية الناجمة عن النقل. في حين أن التعبيرات المتسقة إلى حد ما تظهر عبر الخلايا التي تحتوي على GCaMP ، إلا أن المستويات المختلفة بمهارة من تعبير المسبار داخل الخلايا الفردية تعتبر بناء على طريقة التحديد الكمي للمنطقة الفردية للتغير في التألق الأساسي مقارنة بخط الأساس هذا. ومع ذلك ، مع هذه الكفاءة المنخفضة نسبيا ، فإن استخدام الأساليب القائمة على النقل لتقديم مراسل GCaMP ليس ذا متانة كافية للنسخ المتماثلة البيولوجية واسعة النطاق لدراسات الفحص عالية الإنتاجية. للتغلب على ذلك ، تتوفر العديد من التركيبات المتغيرة تجاريا للتغليف الفيروسي أو الفيروسي الغدي أو التعبير المحدد عن سلالة الخلايا ، مما سيسمح بكفاءة نقل أعلى. التعديل الأساسي الذي قد يكون مرغوبا فيه عند استخدام هذه البروتوكولات هو استخدام التحفيز البصري الوراثي للخلايا العصبية بدلا من تطبيق حمام KCl62. ويسمح النقل باستخدام بنى فيروسية لنية مصممة للتعبير عن إحدى عائلات القنوات المتاحة الآن، متبوعا بالتنشيط بأطوال موجية محددة من الضوء، بالتحكم المكاني لإزالة استقطاب المجموعات الفرعية من الخلايا العصبية وأيضا لتقييم تأثير قطارات إمكانات العمل على مستويات تدفق الكالسيوم المتكررة واستنفاد مخازن الحويصلات المتشابكة63 . ومع ذلك ، من الضروري أن نضع في اعتبارنا أن استخدام هذه الطريقة مقيد إلى حد ما في الوقت الحالي ، حيث يجب على المستخدم التأكد من أن مراسله البصري الوراثي ، ومراسل متشابك ، وأي بروتينات إضافية يتم إدخالها خارجيا ليس لها تداخل طيفي بين الفلوروفورات المستخدمة. هناك مشكلة شائعة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام صبغة الستيريل وهي تقليل الكثافة السلبية خلال فترة التسجيل الأساسية. قبل الدراسات التجريبية ، من الأهمية بمكان تحسين كثافة الليزر وفترات التقاط الصور لتقليل تأثيرات التبييض الضوئي. ولكي ينظر في التجارب، من الضروري تثبيت الشدة لما لا يقل عن 30 ثانية الأخيرة من فترة خط الأساس. ارجع إلى الجدولين 2 والجدول 3 للاطلاع على المشاكل الشائعة وحلولها لتجارب صبغة الستيريل والكالسيوم العابرة، على التوالي.

القيد الأساسي لهاتين الطريقتين هو أنه لا يمكن تحفيز الثقافات وفحصها إلا في حالة واحدة. نظرا لاستخدام تطبيق الحمام لإدخال عامل إزالة الاستقطاب KCl ، يجب أن تكون جميع الخلايا العصبية المراد فحصها من تلك الحالة في هذا الطبق ضمن مجال الرؤية الأولي لهدف المجهر. إذا كانت الوظائف بمرور الوقت ذات أهمية ، فستكون الثقافات المقترنة مطلوبة. ومع ذلك ، فإن الطريقة البصرية الوراثية المذكورة أعلاه ستسمح بمراقبة ديناميكيات الكالسيوم بمرور الوقت إذا رغبت في ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان لدى الخلايا العصبية عيب في إعادة تدوير الحويصلات المشبكية ، إضعاف التحميل الأولي لصبغة الستاريل. في حين أن تطبيع الكثافة الداخلية يسمح بالمقارنة بين الظروف، قد يكون من الصعب اكتشاف اختلافات طفيفة في أحجام الاستجابات. وأخيرا، سرعان ما أصبحت التكرارات الجديدة لهؤلاء المراسلين متاحة ويمكن تبديلها للحصول على أوقات اكتشاف أسرع أو نتائج أكثر قوة. على سبيل المثال ، لم يعد GCaMP6m يعتبر أسرع مراسل لعابري الكالسيوم في المحطات الطرفية المتشابكة. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام أحدث جيل من jGCaMP864.

الطرق الموضحة هنا هي طريقة سريعة وموثوقة لتحديد ما إذا كان التلاعب الجيني أو الدوائي للخلايا العصبية يزعج الإشارات المشبكية الوظيفية وإطلاقها. التجارب التفصيلية أقل تحديا من الناحية الفنية وأقل تكلفة من الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية للجهد / المشبك الحالي والمجهر الإلكتروني. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن الفيزيولوجيا الكهربية هي بطبيعتها إنتاجية منخفضة وعلى مستوى الخلية الفردية ، فإن البروتوكولات الموصوفة هنا هي إنتاجية أعلى وسريعة ، مما يسمح بتصوير العديد من الخلايا العصبية في وقت واحد والعديد من التكرارات التي يتم إجراؤها في جلسة تصوير واحدة. يقترح استخدام ديناميكيات الكالسيوم هذه ونماذج الإطلاق المتشابك كأول مؤشر على تغيرات الانتقال المشبكية في نماذج ALS ودراسة أشكال أخرى من التنكس العصبي. على الرغم من أن الاستنتاجات المستمدة من Gcamp6m وتصوير صبغة الستيريل لا يمكنها أن تحدد بدقة آلية محددة من الخلل الوظيفي المشبكي ، بناء على هذه النتائج ، يمكن للباحثين بعد ذلك إجراء دراسات تكميلية مستهدفة قائمة على الأدلة باستخدام الطرق التقليدية لتحديد القنوات المعنية أو عدد الحويصلات المشبكية أو المحتوى الكمي.

الفائدة في هذه البروتوكولات هي التقييم السريع والمباشر للتغيرات في تدفق الكالسيوم السليم بوساطة إزالة الاستقطاب و / أو اندماج الحويصلة المشبكية في نماذج ALS محددة. وقد أثبتنا ذلك مؤخرا في منشور يظهر زيادة تدفق الكالسيوم وإلغاء التفريغ المشبكي في الخلايا العصبية القشرية التي تعبر عن بروتين ثنائي الببتيد (الجلايسين-ألانين)50 الناتج عن توسع تكرار سداسي النوكليوتيد C9ORF7243. وكما هو موضح في عملنا المنشور، يمكن تنفيذ هذه الطرق بسهولة جنبا إلى جنب مع النقل المشترك للحمض النووي الريبي المتحور أو البروتينات ذات الأهمية أو في الخلايا المستزرعة مباشرة من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا43. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار موثوقية ومتانة هذه البروتوكولات بنجاح في الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان بشكل عصبي45، مما مكن من إجراء الدراسات المستقبلية مباشرة في الخلايا ذات الصلة بالأمراض المشتقة من المريض. في مخطوطة حديثة أخرى ، نقدم دليلا على أن الخلايا العصبية الحركية من النوع البري تخضع لتدفق عالي للكالسيوم بعد التحفيز عندما تكون في وجود عامل قابل للذوبان يتم إطلاقه من FUS المتحور الذي يعبر عن الخلايا النجمية44. كما تتشابك أحداث إشارات الكالسيوم النجمية بعمق مع الانتقال المشبكي في الخلايا العصبية المجاورة65. تم تطبيق بروتوكول ديناميكيات الكالسيوم للتحقيق في انتقالات الكالسيوم كاملة الخلايا في نماذج من الثقافة النجمية ، والتي أثبتت فعاليتها في كل من القوارض الأولية والخلايا البشرية المشتقة من IPS. سيوفر المزيد من الفهم لديناميكيات الكالسيوم النجمية والإشارات في نماذج ALS نظرة ثاقبة قيمة حول كيفية تأثر الانتقال المشبكي نتيجة لذلك. في نهاية المطاف، سيكون توظيف مراسلي GCaMP من نوع الخلايا أداة قوية للتحقيق في ديناميكيات الكالسيوم العصبية والنجمية في إعدادات الزراعة المشتركة المختلطة وتقييم التأثيرات غير المستقلة للخلايا التي تنشأ من كل مجموعة خلايا.

وأخيرا ، فإن الاستخدام المحتمل لهذه الأساليب لا يمتد فقط إلى ما وراء دراسة ALS ، ولكن أيضا إلى المجالات الأوسع لعلم الأعصاب التنكسي العصبي وحتى التنموي. يتم توفير معلومات مفصلة حول البلازميدات المحددة المستخدمة لتوليد النتائج التمثيلية والنجاح في نقل البلازميدات التي تحتوي على العديد من المتغيرات الجينية المختلفة لتكرار FUS و SOD1 و C9ORF72 سداسي النوكليوتيد وثنائي الببتيدات43،44،66،67،68. شريطة أن تحتوي البلازميدات على مروج يستخدم في الخلايا العصبية ، فلا توجد قيود على نماذج ALS أو الأمراض التنكسية التي يمكن دراستها باستخدام هذه الطرق. علاوة على ذلك ، فإن النقل للتعبير عن البروتينات الطافرة هو خطوة اختيارية تماما. الثقافات المتولدة من الحيوانات المعدلة وراثيا أو الخلايا المشتقة من المريض البشري تلغي الحاجة إلى تحديد الخلايا التي تحتوي على البروتين الطافر محل الاهتمام. في الوقت الحاضر ، يتم تقييد هذه الأنظمة بطريقة أنه إذا تم استخدام صبغة الستايريل ، شغل قناة TRITC ، وإذا تم استخدام GcaMP6 ، احتلال قناة FITC. التقنيات التي تسمح بفحص النشاط العصبي والخلايا النجمية في الوقت الحقيقي توسع إمكانيات فهم تحليل المسار الزمني للنضج / التنكس المشبكي ، وكذلك الاختبارات السريعة لفعالية المركبات الدوائية في تعزيز أو قمع التواصل العصبي. هاتان الطريقتان قابلتان لتوسيع نطاق الإنتاجية العالية للفحص. بدلا من طلاء الخلايا العصبية في أطباق فردية بحجم 35 مم ، يمكن استخدام معلمات التصوير لهذين البروتوكولين بطريقة آلية عبر لوحات 96 بئرا. باستخدام مثل هذه المنصة ، يمكن اختبار المكتبات المركبة بسرعة بحثا عن العلاجات ، التي تعدل دخول الكالسيوم أو تحسن الإطلاق المشبكي باستخدام نموذج وراثي للمرض أو حتى الخلايا المشتقة مباشرة من المرضى. يمكن لهذه الطريقة تسريع إمكانية العلاجات الخاصة بمجموعة فرعية أو حتى الشخصية من خلال تحديد الجزيئات المرشحة بسرعة لمزيد من التحقيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نشيد بالأعضاء الحاليين والسابقين في مركز جيفرسون واينبرغ ALS للحصول على تعليقات واقتراحات نقدية لتحسين هذه التقنيات وتحليلاتها. تم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (RF1-AG057882-01 و R21-NS0103118 إلى D.T) ، و NINDS (R56-NS092572 و R01-NS109150 إلى P.P) ، وجمعية ضمور العضلات (D.T.) ، ومركز روبرت باكارد لأبحاث ALS (D.T.) ، ومؤسسة Family Strong 4 ALS ومؤسسة Farber Family Foundation (B.K.J. ، K.K ، و P.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 173 ،
قياس الفلورسنت في الوقت الحقيقي للوظائف المشبكية في نماذج التصلب الجانبي الضموري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter