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Neuroscience

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Abstract

Antes da degeneração neuronal, a causa dos déficits motores e cognitivos em pacientes com esclerose lateral amiotrófica (ELA) e/ou demência do lobo frontotemporal (FTLD) é a disfunção da comunicação entre neurônios e neurônios motores e músculos. O processo subjacente da transmissão sináptica envolve a fusão de vesícula sináptica dependente da despolarização da membrana e a liberação de neurotransmissores na sinapse. Esse processo ocorre através do influxo localizado de cálcio nos terminais pré-sinápticos onde residem vesículas sinápticas. Aqui, o protocolo descreve metodologias de imagem ao vivo baseadas em fluorescência que relatam de forma confiável exocitose sintárquica mediada pela despolarização e dinâmicas de influxo de cálcio terminal pré-sináptico em neurônios cultivados.

Usando um corante de estilingues que é incorporado em membranas vesículas sinápticas, a liberação de vesícula sináptica é elucidada. Por outro lado, para estudar a entrada de cálcio, o Gcamp6m é usado, um repórter fluorescente geneticamente codificado. Empregamos alta despolarização mediada por cloreto de potássio para imitar a atividade neuronal. Para quantificar a exocistose de vesícula sináptica de forma inequívoca, medimos a perda de fluorescência de corante styryl normalizada em função do tempo. Em condições de estimulação semelhantes, no caso do influxo de cálcio, a fluorescência Gcamp6m aumenta. A normalização e quantificação dessa mudança de fluorescência são realizadas de forma semelhante ao protocolo de corante styryl. Esses métodos podem ser multiplexados com a superexpressão baseada em transfecção de proteínas mutantes fluorescentes marcadas. Esses protocolos têm sido amplamente utilizados para estudar disfunção sináptica em modelos de FUS-ALS e C9ORF72-ALS, utilizando neurônios cortical e motor primários. Esses protocolos permitem facilmente uma triagem rápida de compostos que podem melhorar a comunicação neuronal. Como tal, esses métodos são valiosos não apenas para o estudo da ELA, mas para todas as áreas de pesquisa neurociência neurodegenerativa e de desenvolvimento.

Introduction

A modelagem da esclerose lateral amiotrófica (ELA) em laboratório é feita de forma singularmente desafiadora devido à natureza esmagadoramente esporádica de mais de 80% dos casos1, juntamente com o grande número de mutações genéticas conhecidas como causagens da doença2. Apesar disso, todos os casos de ELA compartilham a característica unificadora de que antes da degeneração neuronal total, há comunicação disfuncional entre neurônios motores pré-sinápticos e células musculares postsináspticas3,4. Clinicamente, à medida que os pacientes perdem a conectividade dos neurônios motores superiores e inferiores restantes, eles apresentam características de hiperexcitabilidade neuronal ao longo da doença5,6,7,8,9, refletindo complexas mudanças moleculares subjacentes a essas sinapses, que nós, como pesquisadores da ALS, buscamos entender.

Múltiplos modelos transgênicos ilustraram que a deterioração e a desorganização da junção neuromuscular ocorrem com a expressão de mutações genéticas causagens causal da ELA, incluindo SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 e TDP4317,18,19 através de avaliações morfológicas, incluindo avaliação de boutons sinápticos, densidades da coluna vertebral e organização pré/postiática. Mecanicamente, desde os trabalhos marcantes de Cole, Hodgkin e Huxley na década de 1930, também foi possível avaliar respostas sinápticas através de técnicas eletrofisiológicas na cultura celular in vitro ou preparações de fatias de tecido20. Por meio dessas estratégias, muitos modelos de ELA têm demonstrado déficits de transmissão sináptica. Por exemplo, uma variante mutante do TDP43 causa maior frequência de disparo e diminui o limiar potencial de ação em NSC-34 (medula espinhal x neuroblastoma célula híbrida linha 34) células semelhantes a neurônios motores21. Esta mesma variante também causa transmissão sináptica disfuncional na junção neuromuscular (NMJ) antes do início de déficits motores comportamentais em um modelo de mouse22. Foi mostrado anteriormente que a expressão de FUS mutante resulta em transmissão sináptica reduzida no NMJ em um modelo de drosophila de FUS-ALS antes de defeitos locomotor11. Um relatório recente usando células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de portadores de expansão C9orf72 revelou uma redução no pool facilmente liberado de vesículas sináptica23. Ao todo, esses estudos e outros destacam a importância de construir uma compreensão mais abrangente dos mecanismos subjacentes à sinalização sináptica em modelos relevantes para doenças da ELA. Isso será fundamental na compreensão da trajetória da ELA e no desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos para os pacientes.

Métodos de células de fixação de corrente e tensão têm sido inestimáveis na determinação de propriedades de membrana, como conduance, potencial de membrana de repouso e teor de sinapses individuais20,24. No entanto, uma das limitações significativas da eletrofisiologia é que ela é tecnicamente desafiadora e só fornece insights de um único neurônio de cada vez. A microscopia confocal de células vivas, juntamente com sondas fluorescentes específicas, oferece a oportunidade de investigar a transmissão sináptica de neurônios de forma espesso25,26,27. Embora não seja uma medida direta de excitabilidade neuronal, essa abordagem de fluorescência pode fornecer uma medição relativa de duas correlações moleculares da função sináptica: liberação de vesícula sináptica e transitórios de cálcio em terminais sinápticos.

Quando um potencial de ação atinge a região terminal pré-sináptica dos neurônios, os transitórios de cálcio são acionados, facilitando a transição de um sinal elétrico para o processo de liberação de neurotransmissores28. Canais de cálcio fechados de tensão localizados nessas áreas regulam fortemente a sinalização de cálcio para modular a cinética da liberação de neurotransmissores29. As primeiras gravações relatadas baseadas em fluorescência de transitórios de cálcio foram realizadas utilizando-se o indicador de comprimento de onda dupla Fura-2 AM ou o único corante de comprimento de onda Fluo-3 AM30,31,32. Embora esses corantes tenham oferecido uma nova visão na época, eles sofrem de várias limitações, como compartimentação não específica dentro das células, perda de corante ativo ou passivo de células rotuladas, fotobleaching e toxicidade se imagens por longos períodos de tempo33. Na última década, indicadores de cálcio geneticamente codificados tornaram-se os cavalos de trabalho para a imagem de várias formas de atividade neuronal. Esses indicadores combinam uma proteína fluorescente modificada com uma proteína querador de cálcio que muda rapidamente a intensidade da fluorescência após a ligação de íons ca2+34. A aplicação desses novos indicadores é vasta, permitindo uma visualização muito mais fácil de transintes intracelulares de cálcio tanto em configurações in vitro quanto in vivo. Uma família desses repórteres geneticamente codificados, conhecido como GCaMP, agora são amplamente utilizados. Esses indicadores contêm domínio de calmodulina terminal C, seguidos de proteína fluorescente verde (GFP), e são limitados por uma região de ligação de autodulina terminal N35,36. A ligação de cálcio ao domínio calmodulin desencadeia uma interação com a região de ligação de calmodulin, resultando em uma mudança conformacional na estrutura geral da proteína e um aumento substancial na fluorescência da moiety35,36 gfp. Ao longo dos anos, essa família de repórteres passou por várias evoluções para permitir leituras distintas para transitórios de cálcio específicos com cinética específica (lenta, média e rápida), cada uma com propriedades ligeiramente diferentes37,38. Aqui, foi destacado o uso do repórter GcaMP6, que já foi demonstrado anteriormente para detectar potenciais de ação única e transitórios de cálcio dendráticos em neurônios tanto in vivo quanto in vitro37.

Transitórios de cálcio na região pré-sináptica desencadeiam eventos de fusão de vesícula sináptica, causando liberação de neurotransmissores na sinapse e início de eventos de sinalização na célula postsinásptica28,39. As vesículas sinápticas são rapidamente liberadas e recicladas, já que a célula homeostaticamente mantém uma área de superfície de membrana celular estável e uma piscina prontamente liberada de vesículas ligadas à membrana 40. O corante de estirida usado aqui tem afinidade com membranas lipídicas e altera especificamente suas propriedades de emissão com base no ordenamento do ambiente lipídemo circundante41,42. Assim, é uma ferramenta ideal para rotular vesículas sinápticas de reciclagem e posterior rastreamento dessas vesículas, pois elas são posteriormente liberadas após estimulação neuronal41,42. O protocolo que foi gerado e otimizado é uma adaptação dos conceitos descritos inicialmente por Gaffield e colegas, o que nos permite visualizar puncta styryl com tinta styryl ao longo do tempo continuamente41.

Aqui, são descritas duas metodologias relacionadas baseadas em fluorescência, relatando de forma confiável eventos celulares específicos envolvidos na transmissão sináptica. Protocolos foram definidos para sondar a dinâmica do influxo de cálcio terminal pré-sináptico mediado pela despolarização e excitose de vesícula sináptica em neurônios cultivados. Aqui, métodos e resultados representativos estão focados no uso de neurônios cortical ou motor primários como o sistema de modelo in vitro, pois há estudos publicados utilizando esses tipos de células43,44. No entanto, esses métodos também são aplicáveis a neurônios humanos diferenciados como i3 cortical45, pois também tivemos sucesso com ambos os protocolos em experimentação atualmente em curso em nosso laboratório. O protocolo geral é delineado em um formato linear stepwise, mostrado na Figura 1. Resumindo, para estudar a dinâmica do cálcio em neurites, os neurônios maduros são transfectados com DNA plasmídeo para expressar o repórter fluorescente GCaMP6m sob um promotor de Cytomegalovirus (CMV)37,46. As células transfeinadas têm um baixo nível de fluorescência verde basal, o que aumenta na presença de cálcio. Regiões de interesse são especificadas para monitorar as mudanças de fluorescência ao longo de nossa manipulação. Isso permite que flutuações altamente espacial e temporalmente localizadas no cálcio sejam medidas37,46. Para avaliar a fusão e liberação de vesículas sinápticas, os neurônios maduros são carregados com corante estilístico incorporado em membranas vesículas sinápticas à medida que são reciclados, reformados e recarregados com neurotransmissores em células pré-sinápticas41,42,43,47,48. Os corantes atuais utilizados para este fim rotulam vesículas sinápticas ao longo de neurites e são usados como proxy para essas regiões em experimentos de imagem ao vivo, como foi mostrado pela co-coloração de corante e sinaptomin por Kraszewski e colegas49. Aqui estão incluídas imagens representativas de manchas semelhantes que também foram realizadas (Figura 2A). Pesquisadores anteriores usaram extensivamente tais corantes para relatar a dinâmica da vesícula sináptica na junção neuromuscular e neurônios hipocampais48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Selecionando regiões pontuadas de vesículas carregadas de corante e monitorando a diminuição da intensidade da fluorescência após a liberação da vesícula, a capacidade de transmissão sináptica funcional e a dinâmica temporal de liberação podem ser estudadas após a estimulação43. Para ambos os métodos, um meio contendo uma alta concentração de cloreto de potássio é empregado para despolarizar células para imitar a atividade neuronal. Os parâmetros de imagem são especificados para capturar intervalos sub-segundos que abrangem uma normalização da linha de base seguida pelo nosso período de captura de estimulação. As medidas de fluorescência em cada ponto de tempo são determinadas, normalizadas ao fundo e quantificadas ao longo do período experimental. O aumento da fluorescência GCaMP6m mediada por influxo de cálcio ou o aumento efetivo da excitose styísica styryl de isca de isca podem ser detectados através desta estratégia. Configuração metodológica detalhada e parâmetros para esses dois protocolos e uma discussão sobre suas vantagens e limitações são descritos abaixo.

Figure 1
Figura 1: Renderização visual do processo geral de protocolo geral. (1) Isolados e cultura neurônios roedores primários in vitro ao ponto de tempo de maturação escolhido. (2) Introduzir o DNA GCaMP ou o corante de estilílico como repórteres de atividade sináptica. (3) Configuração de paradigma de imagem usando microscópio confocal equipado de imagem ao vivo e software associado. Inicie o período de gravação da linha de base. (4) Enquanto as células ainda estão em captura de imagem ao vivo, estimule os neurônios através da perfusão de banho KCl alto. (5) Avalie as medidas de intensidade de fluorescência ao longo do tempo para medir transitórios de cálcio ou fusão de vesícula sináptica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

Todos os procedimentos animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Jefferson.

1. Cultura primária de neurônios a partir de córtex de rato embrionário

NOTA: Os neurônios corticais primários são isolados dos embriões de ratos E17,5 como descrito anteriormente57,58. Nenhum viés de tensão parece existir com o sucesso deste protocolo de cultivo. Este método é descrito brevemente abaixo. Os artigos anteriores indicados devem ser referenciados para detalhes completos.

  1. Eutanize as fêmeas grávidas por inalação de CO2 seguida de confirmação secundária por luxação cervical.
  2. Colher embriões e isolar cérebros em solução de sal balanceada de 20 mM hepes tampão de 20 mM da Hank (HBSS). Da casca do córtex exterior, separe e depois descarte estriado e hipocampi. Coleciona cortices.
  3. Use fórceps finos para remover meninges de cortices. Para isso, mantenha o córtex no lugar com um par de fórceps fechados usando pressão suave.
    NOTA: Com o segundo par de fórceps na segunda mão, belisque meninges. Descasque meninges usando movimento de rolamento com par apertado. Reposicione-se com os fórceps fechados e repita conforme necessário até que as meninges sejam totalmente removidas.
  4. Incubar cortices com 10 μg/mL de papain no HBSS por 4 min a 37 °C.
  5. Lave três vezes no HBSS e, em seguida, triturar suavemente 5-10 vezes com uma pipeta Pasteur de vidro polido de fogo para obter uma suspensão celular homogênea.
    NOTA: Evite bolhas; manter a pipeta dentro da suspensão da célula.
  6. Neurônios de placa em 100 μg/mL poli-D-lysine revestidos 35 mm de vidro-inferior a uma densidade de 75.000 células/prato em meio neurobásio com suplemento B27 (2%) e penicilina-estreptomicina.

2. Cultura primária de neurônios motores da medula espinhal de rato embrionário

NOTA: Os neurônios motores primários são preparados a partir de embriões de ratos E13.5 como descrito anteriormente, com poucas modificações59,60. Nenhum viés de tensão parece existir com o sucesso deste protocolo de cultivo. Este método é descrito brevemente abaixo. Os artigos anteriores indicados devem ser referenciados para detalhes completos.

  1. Eutanize ratos fêmeas grávidas como no passo 1.1.
  2. Disseque 10-20 medulas espinhais de embriões e quebre pequenos fragmentos mecanicamente usando dois pares de fórceps para beliscar e puxar, respectivamente.
  3. Incubar em 0,025% trypsin por 8 min, seguido pela adição de DNase a 1 mg/mL.
  4. Centrifugar através de uma almofada BSA de 4% a 470 x g por 5 min a 4 °C sem quebra.
  5. Células de pelotização centrífuga por 55 min a 830 x g a 4 °C sem freio através de uma almofada de gradiente de densidade de 10,4% (v/v) (ver Tabela de Materiais). Leve para a frente a banda de neurônio motor na interface visual.
    NOTA: Para garantir a captura de todas as células, use mídia livre de fenol para a etapa de gradiente de densidade e mídia contendo fenol para todas as outras etapas. A interface da mídia de gradiente de densidade e dissociação é facilmente identificável com base na diferença de cor.
  6. Gire bandas coletadas através de outra almofada BSA de 4% a 470 x g por 5 min a 4 °C sem quebra.
  7. Resuspend neurônios motores purificados em meio neurobásal completo com suplemento B27 (2%), glutamina (0,25%), 2-mercaptoetanol (0,1%), soro de cavalo (2%) e penicilina-estreptomicina.
  8. Neurônios de placa em 100 μg/mL de poli-lisina e 3 μg/mL de tampas revestidas de laminina a uma densidade de 50.000 células /35 mm de prato de fundo de vidro.

3. Transfecções neuronais

NOTA: Este passo é realizado para neurônios que serão submetidos a imagens de cálcio GCaMP e/ou neurônios nos quais um plasmídeo de DNA exógeno ou RNA de interesse é introduzido antes da avaliação sináptica. Em contraste, o corante de estilingues é carregado pouco antes da sessão de imagem e é abordado na seção 6. O resumo abaixo é o protocolo de transfecção usado para neurônios de roedores primários nos exemplos apresentados, mas pode ser facilmente adaptado e otimizado às necessidades do usuário.

  1. Transfeções para neurônios corticais primários cultivados ocorrem no dia 12 in vitro (DIV 12), enquanto os neurônios motores são transfectados no dia 7 in vitro (DIV 7).
    NOTA: Todas as seguintes etapas ocorrem dentro de um gabinete de biossegurança asséptica.
  2. Transfeito 500 ng de GCaMP6m usando reagente de transfecção a uma razão de 1:2 em volume. Para as co-transfecções, adicione um total de 1,25 μg de DNA/prato total, mantendo este DNA para a razão reagente.
    NOTA: Nos exemplos experimentais mostrados, 750 ng de plasmídeo de interesse relacionado à ALS/FTD foram transfectados para expressar dipeptídeos ligados ao C9orf72-ALS, proteína fus mutante, etc. Certifique-se de que a tag fluorescente do plasmídeo co-transfectado não entrará em conflito com o canal FITC de imagens GCaMP. Da mesma forma, se fizer imagens de corante de estirida, certifique-se de que o plasmídeo co-transfectado não entrará em conflito com o canal TRITC de imagem. O uso de sinápcisina-GCaMP3 é igualmente eficaz neste protocolo. Portanto, transfem a mesma quantidade deste plasmídeo e siga todos os passos como de costume na seção 7.
  3. Incubar o complexo de reagente de transfecção de DNA à temperatura ambiente por 10 minutos.
  4. Adicione suavemente o complexo incubado aos neurônios em gota com o redemoinho. Volte o prato para a incubadora de CO2 a 37 °C por 45-60 min.
  5. Remova toda a mídia cultural contendo o complexo de reagentes de transfecção de DNA e substitua-o por um 50-50 por volume de preparação de mídia neuronal pré-condicionada e fresca. Em seguida, coloque as células de volta na incubadora de CO2 por 48 h até a imagem.

4. Preparação de soluções tampão e solução de estoque de corantes de styryl

  1. Faça soluções aCSF baixas e altas frescas antes de fotografar usando os ingredientes listados na Tabela 1. Filtre ambas as soluções de buffer antes de usar.
    NOTA: O dihidrato caCl2 pode formar Ca(OH)2 no armazenamento. Para máxima eficácia, use sempre um recipiente recém-aberto. Se isso não for possível, para remover o Ca(OH)2 da superfície externa e garantir a solubilidade máxima, as soluções podem ser carbonadas com CO2 gasoso por 5 minutos antes da adição de CaCl2 . Se esse passo for dado, ajuste o pH da solução resultante para manter um valor de pH de 7,4, pois a carbonação excessiva resultará na formação de Ca(HCO3)2 .
Baixo amortecedor ACSF da KCL (pH 7,40 a 7,45)
Reagente Concentração
HEPES 10 mM
NaCl 140 mM
Kcl 5 mM
Glicose 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM
Tampão ACSF de KCL alto (pH 7,40 a 7,45)
Reagente Concentração
HEPES 10 mM
NaCl 95 mM
Kcl 50 mM
Glicose 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM

Tabela 1: Composição de tampões artificiais de fluido cefalorraquidiano (aCSF). Esta tabela inclui os ingredientes para preparar tampões de fluido cerebrospinal artificiais kcl baixos e altos usados durante a imagem e estimulando neurônios. Consulte a seção 4 para obter instruções de preparação.

  1. Prepare a solução de estoque de corante de estirida, tomando um frasco de 100 μg de corante e reconstituindo-o a uma concentração de estoque de 10 mM com água destilada ou meio neurobásal.

5. Configuração do sistema de microscópio e perfusão

NOTA: Para placas de Petri com fundo de vidro de imagem, um microscópio de fluorescência confocal invertido é preferido devido à flexibilidade da perfusão e ao uso de um objetivo de imersão de óleo de alta abertura numérica. Consulte a Tabela de Materiais para o microscópio confocal, câmera e objetivos utilizados para imagens de exemplos detalhados na seção Resultados Representativos .

  1. Realize todos os experimentos a 37 °C com níveis constantes de CO2 de 5% usando uma montagem de estágio acoplado ao sistema de incubadora.
  2. Controle a aquisição de imagens usando software confocal. Otimize as configurações de aquisição no início da sessão de imagem para escolher o poder de excitação e obter ganhos para garantir a visualização ideal de sinais sem fotobleaching.
    1. Mantenha a energia de excitação, o tempo de exposição, o ganho do detector e a taxa de quadros constantes em todas as amostras. Realize imagens de lapso de tempo usando uma proporção de 512 x 512 e taxa de quadros de 2 imagens/s para minimizar o branqueamento de corantes.
      NOTA: Embora o puncta deva ser claramente visível, a intensidade do laser deve ser definida ao mínimo possível para evitar branqueamento e fototoxicidade. Defina a abertura confocal para o ajuste mais estreito para obter a resolução ideal de puncta fluorescente dentro de neurites. O tempo de exposição é definido para 200 ms ou menos, consistente entre as amostras. A velocidade máxima de imagem da câmera utilizada foi de 2 imagens/s. Se usar uma câmera mais rápida, mais imagens/s podem ser tiradas. As configurações de imagem temporal devem ser escolhidas, se possível.
  3. Selecione as seguintes combinações de filtro de fluorescência/dicroica/emissão para imagens usando software confocal: Gcamp6m/Gcamp3 com FITC e corante de estria com TRITC, respectivamente.
  4. Use o recurso de foco perfeito do software de aquisição de imagens confocal durante a imagem de lapso de tempo para evitar o z-drift.
    NOTA: Devido à velocidade rápida da imagem, um único plano é imageado. Garantir a falta de z-drift durante o experimento é muito importante.
  5. Selecione a guia Tempo no painel de aquisição de imagens para definir os períodos e intervalos de gravação.
    1. Definir fase #1 para intervalo 500 ms, Duração 3 - 5 min.
    2. Definir fase #2 para intervalo 500 ms, Duração 5 min.
      NOTA: A fase #1 corresponde à gravação da linha de base, fase #2 ao período de estimulação, respectivamente.
  6. Monte o aparelho de perfusão de gravidade para aCSF usando um sistema de controle de válvula e um coletor de canal.
    1. Carregue kcl alto (ver Tabela 1) em uma seringa de 50 mL na parte superior do aparelho, com tubos passando pelo sistema. Defina a vazão para 1 mL/min.
  7. Carregue uma antena de vidro de 35 mm contendo neurônios no estágio de imagem confocal, com a extremidade da tubulação de perfusão colocada na borda do prato. Escolha o campo para imagens.

6. Imagem de corante de styryl da liberação de vesícula sináptica

  1. Incubar células em KCl aCSF baixo (ver Tabela 1) por 10 min a 37 °C, 48 h pós-transfecção.
  2. Carregue neurônios cortical primários ou motores em placas de Petri com corante de estirico.
    1. Remova o ACSF kcl baixo por aspiração.
    2. Use uma pipeta para carregar neurônios no escuro com 10 μM de corante de estirpe em aCSF contendo 50 mM KCl por 5 min.
    3. Remova a solução de carregamento e os neurônios do banho em baixo KCl aCSF por 10 minutos para eliminar o carregamento de corante não específico.
  3. Coloque o prato de fundo de vidro de 35 mm sobre o estágio de imagem e, em seguida, observe sob um objetivo de ar de 20x ou 40x objetivo de imersão de óleo de um microscópio confocal invertido.
    NOTA: Use fluorescência GFP para localizar células transfeminadas no caso de células co-transfeminadas com um plasmídeo marcado por GFP.
  4. Excite o corante de estiris usando um laser de 546 nm, colete emissões usando um filtro de bandpass de 630-730 nm (TRITC).
  5. Selecione o campo de imagem e engaje o foco perfeito. Em seguida, pegue uma única imagem parada com canais de marcadores de campo brilhante, TRITC e fluorescência para marcar limites neuronais.
  6. Inicie o Run Now no software de aquisição. Realize a gravação basal por 3-5 min para excluir variações na intensidade do corante, se houver (Fase #1).
    NOTA: É essencial garantir que qualquer diminuição na intensidade do corante seja devido à liberação de vesícula sináptica e não à difusão passiva de corante ou fotobleaching. Este período pré-estimulação de 3-5 min deve resultar em um nível de intensidade de corante estável e mantido. Os 30 s finais desta gravação serão usados para determinar um valor médio de fluorescência da linha de base para cada ROI. Antes de avaliar as condições experimentais, uma condição adicional de não estimulação de aproximadamente 10 minutos de gravação contínua usando as configurações de aquisição pretendidas também pode ser realizada para garantir valores de fluorescência constantes usando as configurações de laser por um período prolongado.
  7. Na mudança para a fase #2, acione no botão para o sistema de perfusão. Em seguida, perduse constantemente 50 mM KCL aos neurônios para facilitar o descarregamento de corante (Fase #2).
    1. Realize gravações para 300 s após a adição de KCl. Depois disso, a aquisição pára; acione o interruptor Off para o sistema de perfusão.
  8. Salve o experimento e analise os dados usando software confocal, conforme descrito na seção 8 abaixo.
    NOTA: O experimento pode ser interrompido neste momento, e a análise pode ser realizada posteriormente. No caso em que as células não requerem transfecção para a expressão de proteínas de interesse, este protocolo pode ser realizado a qualquer ponto de tempo in vitro ao procurar examinar a funcionalidade do descarregamento sináptico. Após um teste de células de controle para garantir o descarregamento sináptico adequado, o experimentador deve ser cego às condições genéticas ou farmacológicas de cada prato testado para minimizar o viés.

7. Imagens de fluorescência de transintes de cálcio Gcamp6m

  1. Transfect primary roedor cortical neurônios cultivados em pratos de fundo de vidro de 35 mm com 500 ng de Gcamp6m como indicado na seção 3.
    NOTA: Se desejar, os neurônios co-transfectos com um plasmid de interesse contendo uma etiqueta fluorescente na faixa vermelha ou vermelha.
  2. Incubar neurônios com baixo KCl aCSF por 15 min 48 h após a transfecção e, em seguida, montar o prato na plataforma de imagem.
  3. Visualize a fluorescência GCaMP6m usando um filtro FITC (488 nm) e um objetivo de 20x ou 40x.
  4. Selecione o campo de imagem e engaje o foco perfeito. Em seguida, pegue uma única imagem parada com canais marcadores de campo brilhante, FITC e fluorescência para marcar limites neuronais.
  5. Inicie o Run Now no software de aquisição. Realize a gravação da linha de base por 5 minutos e, em seguida, perfuse com aCSF contendo 50 mM KCL da mesma maneira descrita na seção 6 para experimentos de corante de estítil.
    NOTA: O objetivo desta imagem é medir os transitórios de cálcio evocados. Caso um neurônio tenha atividade de disparo basal e fluxos de cálcio durante o período de pré-estimulação, ele não é usado na análise de dados. Em vez disso, apenas células com fluorescência de fundo estável são usadas. Os períodos pós-estimulação também podem ser estendidos para 60 minutos para transitórios de cálcio, com ou sem perfusão adicional contínua de LCA.
  6. Salve o experimento e analise os dados usando software confocal, conforme descrito na seção 8 abaixo. O experimento pode ser interrompido neste momento, e a análise pode ser realizada mais tarde.
    NOTA: Se as células não necessitarem de transfecção para expressão de proteínas de interesse, este protocolo pode ser realizado a qualquer ponto de tempo in vitro na tentativa de examinar os transitórios de cálcio. Após um teste de células de controle para garantir a medição dos transitórios de cálcio, o experimentador deve ser cego às condições genéticas ou farmacológicas de cada prato testado para minimizar o viés.

8. Análise de imagem

  1. Abra imagens de lapso de tempo com software confocal.
  2. Alinhe imagens em série de lapso de tempo pela série de comando : Imagem | | de processamento Alinhe o documento atual. Selecione Alinhar ao Primeiro Quadro.
  3. Selecione regiões de interesse (ROIs) ao longo de neurites usando a ferramenta de seleção de ROI, um ícone em forma de feijão à direita do quadro de imagem (Figura 3B). Além disso, marque um ROI representando a intensidade de fluorescência de fundo.
    NOTA: Os ROIs são selecionados escolhendo áreas de puncta distintamente separada ao longo das faixas neuronais indicadas pela imagem ainda de campo brilhante. Pelo menos cinco ROIs por neurônio são escolhidos para análise. O ROI de fundo é escolhido em uma região do campo de visão que não contém neurites.
  4. Meça fluorescência bruta ao longo do tempo para ROIs selecionados usando as seguintes séries de comando: Medir | Medição de tempo.
    1. Inicie a função Medida na porção superior do painel De medição de tempo . Uma representação gráfica de fluorescência bruta ao longo do tempo (Figura 3C) e dados quantitativos são gerados.
      NOTA: Cada ponto de dados representa a fluorescência bruta para esse ROI para o quadro associado a esse ponto de tempo medido específico.
  5. Exporte intensidades de fluorescência bruta para o software de planilha.
  6. Analise cada ROI de forma independente. Primeiro, normalizar os dados subtraindo a intensidade do ROI de fundo do ROI de intensidade de interesse em cada ponto de tempo.
    1. Pegue o valor de fluorescência bruta do ROI de fundo em cada ponto de tempo específico e subtraia isso do ROI de valor de intensidade bruta de juros naquele ponto de tempo.
      NOTA: Isso é feito durante todo o período de gravação, tanto em fases basais quanto de estimulação.
  7. Determine o ROI médio de intensidade de juros para os últimos 30 s da linha de base.
    1. Em média, os valores basais crus normalizados gerados na etapa 8,6 dos 30 s finais do período de gravação basal de 3-5 min.
      NOTA: Todo o período de gravação basal poderia ser usado para gerar esse valor. No entanto, à medida que esse valor se estabiliza e é mantido, os 60 pontos dos 30 finais são de tamanho amostral suficiente para representar o todo.
  8. Compare este valor de linha de base com o valor de intensidade normalizado em cada ponto de tempo, gerando uma mudança no valor da fluorescência (ΔF).
    1. Pegue o valor da etapa 8.7 e subtraia o valor fluorescente médio da linha de base. Faça isso e etapas subsequentes durante todo o período de gravação, tanto em fases basais quanto de estimulação.
  9. Calcule esta alteração em relação ao valor da fluorescência da linha de base, gerando uma mudança na fluorescência/fluorescência da linha de base (ΔF/F). Para isso, pegue o valor da etapa 8.8 e divida-o pelo valor fluorescente médio da linha de base.
  10. Finalmente, defina o valor do ponto de partida para 1 para que os aumentos ou reduções possam ser facilmente visualizados graficamente ao longo do tempo.
    1. Pegue o valor gerado na etapa 8.9 e adicione 1.
      NOTA: Quando isso for feito corretamente, os 30 s dos valores do período de base devem pairar perto do valor de 1. Nas células que liberam efetivamente o conteúdo sináptico, esse valor deve variar de 1 para 0 após o início da estimulação. Um exemplo de passos 6-9 é apresentado na Figura 3E.

9. Análise de dados

NOTA: O experimentador pode não ser cego para condições experimentais para reunir dados para análise adequadamente. Use um tamanho amostral de pelo menos 10 neurônios por condição de cada um dos três experimentos independentes. Considere apenas neurônios para inclusão se pelo menos cinco regiões do ROI puderem ser designadas. Esse nível de replicação experimental foi suficiente em estudos publicados para demonstrar uma profunda perda de descarga sináptica em células contendo poli-GA relacionadas à ALS versus controles GFP (ver Resultados Representativos). No entanto, se um fenótipo mais sutil for observado, o número de réplicas biológicas e/ou técnicas pode exigir otimização pelo usuário.

  1. Utilizando todos os valores ΔF/F calculados ao longo do tempo a partir de ROIs de uma determinada condição experimental, determine um valor médio de ΔF/F para cada ponto de tempo, juntamente com um SEM.
  2. Plotar dados usando um programa de software de gráficos e estatísticas em formato xy, onde x é o tempo decorrido, e y é o valor ΔF/F calculado na etapa 9.1. Apresentar todos os valores como média ± SEM.
  3. Para determinar a significância estatística, utilize o teste t do Aluno para comparar dois grupos e análise unidirecional de variância (ANOVA) seguido da análise pós-octo de Tukey para comparação de três ou mais grupos.

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Representative Results

Após a implementação bem-sucedida do protocolo acima, os resultados representativos são mostrados para um típico experimento de liberação de vesícula styryl. Os neurônios cortical primários do rato cultivado foram carregados com corante usando o método descrito na seção 6. A especificidade do carregamento de tingimento foi determinada pela co-rotulagem com sináptica de marcador de vesícula sináptica. A maioria dos punctas positivos de corante styryl são co-positivos para este marcador (Figura 2A). Para determinar se as configurações utilizadas para a imagem de corante de estirquilina causam fotobleaching, tipicamente, um poço não tratado é carregado com corante e imageado por um período prolongado de 10 minutos sem estimulação para garantir que os valores de fluorescência permaneçam constantes.

Além disso, os resultados são novamente mostrados usando co-rotulagem de sinafitofisina e corante de estilingues como na Figura 2A. Estes fluoroforos foram co-imagens usando o paradigma indicado na seção 6 para imagem de corante de estilingues TRITC, além de captura dupla de fluorescência de sináplofia usando poder laser de alta intensidade no canal DAPI para visualizar a mTurquoise-sinaptophysin. São mostradas imagens representativas de regiões sinápticas pré e pós-estimulação (Figura 2B). Embora este método seja uma inferência indireta por falta de fotobleaching, a análise dos valores de intensidade bruta durante todo o período de imagem revela que a intensidade da sinápcia permanece constante, enquanto a intensidade do corante do estirquido diminui após a estimulação (Figura 2C). Assim, tomando este experimento e nossos outros controles de fluorescência estável antes da estimulação e por longos períodos em poços não estimuladores, estabelecemos que a diminuição da fluorescência do estilismo pode ser atribuída ao descarregamento sináptico através da despolarização do KCl em vez de efeitos fotobleaching.

Figure 2
Figura 2: Avaliação dos parâmetros de especificidade e imagem da rotulagem de corante de estilingues. (A) Uma imagem representativa de 40x de um neurônio cortical de rato rotulado de corante de estilinguário (vermelho), que foi transfeinado 24 h anteriormente com um plasmídeo para expressar mTurquoise2-sinaptophysin61 expulso do promotor de sinapsina (verde). A colocalização desses dois fluoroforos indica que a grande maioria dos puncta positivos de corante estilístico são co-manchados com sinástia de marcador sínáptico. A barra de escala indica 5 μm. (B) Os neurônios corticais foram transfectados e corantes de estirpe carregados como em (A) e imagedos de acordo com o paradigma do corante de estilingues, juntamente com a captura dupla de fluorescência da mTurquoise-synaptophysin no canal DAPI. Imagens representativas estão mostrando as regiões de styryl dye puncta pré e pós-estimulação. A barra de escala indica 5 μm. (C) A fluorescência foi monitorada ao longo do tempo para sináfitia (topo do canal DAPI) e corante de estilingues (fundo do canal FITC). A intensidade da sinápsofia foi mantida em uma fluorescência constante durante o período de imagem e estimulação, enquanto a fluorescência de corante estilado diminuiu à medida que o corante era descarregado na estimulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagens representativas mostram o carregamento de corante de estiris durante a imagem, com a seleção de ROIs (Figura 3A-B). A intensidade de fluorescência bruta de ROIs selecionados e um ROI de fundo são plotados usando o software confocal (Figura 3C). Os neurônios aqui mostrados também foram transfectados com plasmídeos para estudar os efeitos das proteínas dipeptidas produzidas no contexto do C9ORF72-ALS, ou seja, FLAG-eGFP e FLAG-GA50-eGFP expulsos do promotor T7. A liberação de vesícula sináptica bem sucedida resulta em perda impressionante de fluorescência de corantes após a alta despolarização de KCl (Figura 3D, dois painéis superiores) para um neurônio de controle transfectado por GFP. Um vídeo representativo incluído aqui demonstra como isso aparece durante a imagem. Além disso, um neurônio descarrega seletivamente o corante de estirite em uma região de neurite após a estimulação (Vídeo 1).

Por outro lado, a transmissão sináptica prejudicada é representada pela fluorescência de corante retida mesmo após a alta despolarização de KCl em neurônios transfeinados com uma construção repetitiva de dipeptídio ligada a C9ORF72 (GA50) (Figura 3D, dois painéis inferiores)43. Após a análise quantitativa dos dados (Figura 3E), os dados são representados como intensidade de corante em toda a imagem para os grupos de controle (GFP) e ALS/FTD (GA50) (Figura 3F)43. Este método também pode analisar efeitos intermediários e não é simplesmente uma medida binária "tudo ou nada". Em experimentos projetados para resgatar os déficits sinápticos mediados pelo GA50, a proteína sinapática associada à vesícula exógena 2 (SV2) foi introduzida pela transdução lentiviral usando o plasmídeo rSV2a-eGFP-pRRL expulso do promotor humano pgk. Seguindo imagens e análises como descrito acima, o disparo sináptico foi resgatado em neurônios co-expressando GA50 e SV2 (Figura 3G).

Figure 3
Figura 3: Avaliação da liberação de vesícula sináptica através da rotulagem de tingimento de estírio. (A) Uma imagem representativa de 40x de um neurônio rotulado de corante de estíryl em baixa mídia KCl aCSF no início de um experimento de imagem. A barra de escala indica 20 μm. (B) Representação da geração ROI na imagem de (A). Regiões de puncta específicas ao longo de neurites (#1-4) são escolhidas usando a ferramenta ROI, o botão em forma de feijão destacado à direita. Um ROI final (#5) é selecionado em uma região em branco para capturar a intensidade do sinal de fundo. Evita-se áreas com pontos brilhantes não específicos e não neuronais. A barra de escala indica 20 μm. (C) Representação das intensidades de sinal para ROIs #1-5 de (B) ao longo do tempo como grafada/retratada pelo software confocal. (D) Representações visuais de regiões do ROI pré/pós-estimulação para um neurônio que efetivamente sofre transmissão sináptica (dois painéis superiores). Os dois painéis inferiores são imagens ampliadas com um limiar imparcial aplicado para isolar puncta do fundo para mostrar regiões distintas visualmente. Os neurônios contendo GFP sofrem efetivamente a liberação sináptica, enquanto a expressão do peptídeo ga50 relacionado ao C9ORF2-ALS impede esse efeito. As barras de escala indicam 10 μm-Reimpressas do Jensen et al. 202043. (E) Exemplo de um arquivo de quantificação usando software de planilha, mostrando normalização de valores para a linha de base e geração de valores ΔF/F ao longo do tempo. Os dados são primeiro normalizados para o valor de intensidade de ROI de fundo em cada ponto de tempo. Esse valor é então comparado com o ROI médio do valor da linha de base de juros para os últimos 30 s pré-estimulação (mostrado aqui como 10 s em intervalos de 1 s para simplicidade) (ΔF). Esta mudança é calculada em seguida como uma fração da fluorescência da linha de base (ΔF/F). Finalmente, o valor do ponto de partida é definido como 1 para que o aumento ou diminuição possa ser facilmente visualizado graficamente ao longo do tempo. Pelo menos cinco regiões puncta por neurônio e pelo menos dez neurônios por condição experimental são coletados, com dados como este combinados para gerar medições médias em cada ponto de tempo. (F) Os dados de um arquivo de planilha, como in (E) são movidos para um programa de software de gráficos e estatísticas. Para o gráfico aqui mostrado, o valor ΔF/F em cada ponto de tempo médio sobre todas as regiões puncta de uma condição experimental é plotado, juntamente com seu erro padrão da média. O gráfico aqui são dados dos experimentos GFP versus GA50 indicados em (D), onde os últimos 10 s da linha de base e os primeiros 10 do período de estimulação são mostrados-reimpressos do Jensen et al. 202043. (G) Este ensaio pode produzir curvas para liberação sináptica intermediária e não é simplesmente uma resposta "tudo ou nada". O GA50 foi co-expresso com proteína sinapática exógena SV2 (proteína sintárquia associada à vesícula 2), e a imagem e análise de corante de estel estilíquio foram realizadas conforme indicado nas etapas anteriores. Como na Figura 3F, o gráfico aqui mostrado representa o valor ΔF/F em cada ponto de tempo médio sobre todas as regiões puncta de uma condição experimental é plotado, juntamente com seu erro padrão da média. O gráfico mostra o último minuto da linha de base e o primeiro minuto do período de estimulação de Jensen et al. 202043. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vídeo representativo do experimento de imagem de corante de estel. Mostrado é um vídeo representativo de um neurônio cortical carregado com corante de estilingues. O vídeo mostra o período que começa no momento da perfusão do banho de alta KCl aCSF. A região encaixotada destaca os neurites, com perda observável de fluorescência puncta ao longo do tempo. Clique aqui para baixar este vídeo.

Seguindo o método descrito na seção 7, mostrado são imagens representativas de fluorescência de neurônios corticais transfectados com GcaMP6m antes e depois da despolarização do KCl (Figura 4A). Os gráficos de intensidade bruta mostram aumento dos valores de fluorescência que flutuam, indicando a entrada de cálcio em neurites após a despolarização induzida por KCL (Figura 4B). Este segundo vídeo representativo mostra neurônios expressando GcaMP6m com baixa fluorescência no final do período de gravação da linha de base para demonstrar esse efeito. No início da estimulação, os neurônios apresentam um aumento dramático da fluorescência (Vídeo 2). Esta abordagem foi utilizada com sucesso para demonstrar alterações de entrada de cálcio em um modelo mutante de FUS-ALS. Os astrócitos neste modelo foram transduzidos com adenovírus contendo plasmídeos eGFP-FUS orientados pelo CMV. Quando o meio condicionado dos astrócitos mutantes que expressam fuscitos foi colocado em neurônios motores, observou-se aumento do fluxo de cálcio em comparação com as condições de FUS não mutantes após α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) +estimulação de ciclothiazida (Figura 4C)44. A sensibilidade deste ensaio foi testada realizando experimentos com e sem cálcio incluídos no meio de perfusão. No cenário de GFP versus GA50 mencionado acima, observou-se aumento do pico de transintes de cálcio em GA50 contendo neurônios motores. Notavelmente, isso dependia da chegada do cálcio à célula e não da liberação de estoques internos de cálcio. Quando o cálcio foi removido do meio estimulante aCSF, não foram observadas respostas transitórias de cálcio em nenhuma das condições experimentais (Figura 4D)43.

Figure 4
Figura 4: Observando transitórios de cálcio em tempo real usando repórteres GCaMP. (A) Uma imagem de 40x de um neurônio expresso GCaMP6m, pseudocolorido para mostrar a intensidade da fluorescência GFP (baixa em azul a alta em vermelho). Os painéis à esquerda mostram todo o campo de visão 40x pré e pós-estimulação. A barra de escala indica 20 μm. As imagens à direita são versões ampliadas das áreas encaixotados reveladas. Através dessas imagens, é evidente pelo olho que há um aumento robusto nos níveis neuróticos de cálcio focal após a estimulação. A barra de escala indica 12 μm. (B) A seleção do ROI e o monitoramento da intensidade da fluorescência ao longo do experimento são realizados como na Figura 3. Os 30 s finais de linha de base e 1 min de estimulação para dois ROIs selecionados de um neurônio submetido ao monitoramento de fluorescência GCaMP6m é mostrado aqui. Em contraste com a imagem de corante de estirico, a intensidade da fluorescência aumenta após a estimulação neuronal. Além disso, como se observa aqui, os transitórios de cálcio flutuam em neurites ao longo do tempo; portanto, os resultados são tipicamente representados como o pico médio normalizado de fluorescência valor de mudança para cada região do ROI. (C) A quantificação representativa de tal experimento é mostrada como foi publicado em Kia-McAvoy et al. 201844, onde neurônios motores primários que receberam supernacante derivados de astrócitos fus-ALS mutantes apresentaram um fluxo significativamente maior de cálcio após a estimulação do receptor AMPA, em comparação com neurônios que recebem supernaciantes de astrócitos expressos do tipo selvagem. (D) Quantificação representativa da imagem transitória de cálcio onde o cálcio não foi incluído no aCSF estimulante. São mostradas condições de mCherry versus GA50-mCherry estimuladas com alto KCl aCSF com ou sem cálcio conforme publicado no Jensen et al. 202043. GA50 contendo neurônios apresentou aumento do pico de fluxo de cálcio em comparação com mCherry contendo células. Não houve elevação dos níveis internos de cálcio em nenhuma das condições experimentais quando o cálcio foi removido do estímulo ao alto KCL aCSF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 2: Vídeo representativo do experimento transitório de cálcio GCaMP. Mostrado é um vídeo representativo de um campo de neurônios corticais transfectados com GCaMP6m. Após um período de linha de base, um grande fluxo de cálcio é notado na marca de 6 s quando o ACSF de KCl alto foi aplicado. A entrada de cálcio pode ser medida tanto para toda a célula, quanto em regiões específicas de neurite, conforme descrito. Clique aqui para baixar este vídeo.

Problemas potenciais Possíveis razões/solução
1 Carregamento não específico Seja preciso com o tempo de carregamento. Tempos de carregamento mais longos resultam em carregamento não específico de FM4-64 em endossomos e lysosomes
2 Sem exocitose apreciável em neurônios de controle Verifique o pH da solução ACSF de KCl alta.
3 Perda de foco e deriva lateral Certifique-se de que o foco perfeito está ligado. Alinhe as imagens após a imagem usando o software Nikon ou o plugin ImageJ.
4 Branqueamento da fluorescência FM4-64 Verifique a intensidade do laser usada para imagens. Tente sempre usar a menor intensidade possível. Confirmar que a intensidade do laser usada não resulta em branqueamento executando corridas de ensaio.

Tabela 2: Possíveis problemas e solução de problemas para experimentos de corante de estilingues. Cenários típicos para problemas e solução geral de problemas para experimentos de descarga sináptica.

Problemas potenciais Possíveis razões/solução
1 Eficiência de transfecção muito baixa Verifique a saúde neuronal. Se os neurônios são difíceis de transfetar, pode-se mudar para AAV ou transdução lentiviral de GCaMP.
2 Acúmulo de fluorescência GCaMP6 no núcleo Saúde neuronal comprometida. Verifique o protocolo de transfecção.
3 Perda de foco e drift de imagem lateral Certifique-se de que o foco perfeito está ligado. Alinhe as imagens após a imagem usando o software Nikon ou o plugin ImageJ.
4 Sem resposta de cálcio após a estimulação da KCL Certifique-se de que o pH do aCSF está correto.
5 Branqueamento da fluorescência GCaMP6 Verifique a intensidade do laser usada para imagens. Tente sempre usar a menor intensidade possível. Confirmar que a intensidade do laser usada não resulta em branqueamento executando corridas de ensaio.
6 Blebbing de neurites Saúde neuronal comprometida devido à transfecção. Use um lote fresco de culturas neuronais.

Tabela 3: Possíveis problemas e solução de problemas para imagem de transitores de cálcio em neurites. Cenários típicos para problemas e solução geral de problemas para experimentos transitórios de cálcio GCaMP.

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Discussion

Três passos comuns a ambos os métodos descritos são de importância crucial para o sucesso experimental e resultados quantificáveis. Primeiro, a preparação de um novo ACSF antes de cada rodada de experimentos é essencial, seguindo as instruções anexadas. Caso contrário, pode evitar a despolarização neuronal adequada. Uma amostra de neurônios de controle não tratados deve ser constantemente testada antes da estimulação de quaisquer grupos experimentais para garantir a despolarização celular adequada e fornecer uma referência para resultados positivos obtidos naquela sessão de imagem. Em segundo lugar, para rastrear com sucesso a fluorescência ao longo do tempo para regiões sinápticas específicas, também deve-se tomar cuidado especial ao configurar parâmetros de imagem e áreas de ROIs para monitoramento. A gravação do período de base deve ser imediatamente transita para o período de gravação de estimulação. Uma taxa de quadros suficientemente rápida (2 imagens/s) é necessária para capturar a dinâmica de decaimento único da liberação de corante styryl. Finalmente, um passo crítico na análise da experimentação é a normalização das medidas de fluorescência primeiro para o fundo de imagem e, em seguida, para a linha de base pré-estimulada. Como em outros protocolos de imagem, a subtração de uma região de imagem em branco é realizada pela primeira vez em todas as medidas de fluorescência de tempo emparelhadas para remover qualquer autofluorescência de fundo que a adição de mídia KCl possa introduzir. Também é essencial medir e calcular a leitura média de fluorescência para cada ROI a partir dos últimos 30 s antes da estimulação. Este valor inicial médio é então usado em todas as medições de tempo para esse ROI como um ponto de partida definido para quantificar a intensidade de "mudança da linha de base".

A cultura neuronal primária é notoriamente difícil de transfectar com DNA exógeno, e mesmo protocolos otimizados frequentemente produzem baixa eficiência das células totais na cultura. 20%-25% da eficiência da transfecção é comumente alcançada em nossas culturas neuronais, sem evidência de toxicidade induzida por transfecção. Embora expressões bastante consistentes sejam vistas em células contendo GCaMP, níveis sutilmente diferentes de expressão da sonda dentro de células individuais são considerados com base no método de quantificação individual da região de mudança na fluorescência da linha de base em comparação com essa linha de base. No entanto, com essa eficiência relativamente baixa, o uso de métodos baseados em transfecção para introduzir o repórter GCaMP não é de robustez suficiente para réplicas biológicas em larga escala para estudos de triagem de alto rendimento. Para superar isso, várias construções variantes estão disponíveis comercialmente para embalagens lentiviral ou adenoviral ou expressão específica de linhagem celular, o que permitirá maior eficiência de transdução. Uma modificação primária que pode ser desejada ao usar esses protocolos é usar estimulação optogenética de neurônios em vez de aplicação de banho de KCl62. A transdução com construções lentivirais projetadas para expressar uma das famílias de canalrhodopsins agora disponíveis, seguida de ativação com comprimentos de onda específicos de luz, permite o controle espacial para despolarização de subconjuntos de neurônios e também para a avaliação do efeito de trens de potencial de ação sobre níveis repetitivos de influxo de cálcio e esgotamento das lojas de vesículas sináptica63 . No entanto, é essencial ter em mente que o uso deste método está atualmente um pouco restrito, pois o usuário deve garantir que seu repórter optogenético, repórter sináptico e quaisquer proteínas exogenous adicionais introduzidas não tenham sobreposição espectral entre fluoroforos utilizados. Um problema comum de solução de problemas usando o corante de estiretil é a redução da intensidade passiva durante o período de gravação da linha de base. Antes dos estudos experimentais, é fundamental otimizar a intensidade do laser e os intervalos de captura de fotos para minimizar os efeitos de fotobleaching. Para que sejam considerados experimentos, é necessária a estabilização da intensidade para pelo menos os últimos 30 anos do período de base. Consulte as Tabelas 2 e Tabela 3 para problemas comuns e suas soluções para experimentos transitórios de corante e cálcio, respectivamente.

A principal limitação desses dois métodos é que as culturas só podem ser estimuladas e examinadas em uma única instância. Como a aplicação do banho é usada para introduzir o agente despolarizador KCl, todos os neurônios a serem examinados a partir dessa condição nesse prato devem estar dentro do campo de visão inicial do objetivo do microscópio. Se a funcionalidade ao longo do tempo for de interesse, culturas emparelhadas são necessárias. No entanto, o método optogenético mencionado acima permitirá que a dinâmica do cálcio seja observada ao longo do tempo, se desejar. Além disso, se os neurônios tiverem um defeito na reciclagem de vesículas sinápticas, o carregamento inicial do corante de estirpe será prejudicado. Embora a normalização da intensidade interna permita a comparação entre as condições, pequenas diferenças nas magnitudes das respostas podem ser difíceis de detectar. Finalmente, novas iterações desses repórteres rapidamente se tornaram disponíveis e podem ser trocadas por tempos de detecção mais rápidos ou resultados mais robustos. Por exemplo, gCaMP6m não é mais considerado o repórter mais rápido de transintes de cálcio em terminais sinápticos. Em vez disso, pode-se utilizar a última geração jGCaMP864.

Os métodos descritos aqui são uma maneira rápida e confiável de determinar se a manipulação genética ou farmacológica dos neurônios perturba a sinalização e liberação sináptica funcional. Os experimentos detalhados são menos tecnicamente desafiadores e menos caros do que a tradicional eletrofisiologia do grampo de tensão/corrente e microscopia eletrônica. Além disso, enquanto a eletrofisiologia é por natureza de baixa produtividade e no nível celular individual, os protocolos aqui descritos são mais elevados e rápidos, permitindo que vários neurônios sejam imagens simultaneamente e muitas iterações sejam realizadas em uma única sessão de imagem. Propõe-se que essas dinâmicas de cálcio e paradigmas de liberação sináptica sejam utilizados como primeiro indicador de alterações de transmissão sináptica em modelos de ELA e o estudo de outras formas de degeneração neuronal. Embora as conclusões derivadas da imagem de gcamp6m e corante de estírio não possam provocar precisamente um mecanismo específico de disfunção sináptica, com base em tais achados, os pesquisadores podem então realizar estudos complementares direcionados e baseados em evidências usando métodos tradicionais para determinar canais envolvidos, número de vesícula sináptica ou conteúdo quantal.

A utilidade nesses protocolos é a avaliação rápida e direta das alterações no influxo de cálcio mediado pela despolarização adequada e/ou fusão de vesícula sináptica em modelos específicos de ELA. Recentemente demonstramos isso em uma publicação mostrando aumento do fluxo de cálcio e abrogação do descarregamento sináptico em neurônios corticais expressando a proteína dipeptide (glycine-alanina)50 resultante da expansão de repetição de hexanucleotídeos C9ORF7243. Como mostrado em nosso trabalho publicado, esses métodos podem ser realizados facilmente em conjunto com a co-transfecção de RNAs mutantes ou proteínas de interesse ou em células cultivadas diretamente a partir de modelos animais transgênicos43. Além disso, a confiabilidade e robustez desses protocolos têm testado com sucesso em células-tronco pluripotentes induzidas por neurônios,45, permitindo que estudos futuros sejam feitos diretamente em células relevantes para doenças derivadas do paciente. Em outro manuscrito recente, fornecemos evidências de que os neurônios motores do tipo selvagem sofrem alto fluxo de cálcio após a estimulação quando na presença de um fator solúvel liberado do fus mutante expressando astrócitos44. Eventos de sinalização de cálcio acrítica também estão profundamente entrelaçados com a transmissão sináptica em neurônios vizinhos65. O protocolo de dinâmica de cálcio tem sido aplicado para investigar transintes de cálcio de células inteiras em modelos de cultura astróctica, que tem se mostrado eficaz tanto em células primárias quanto humanas derivadas de IPS. Uma maior compreensão da dinâmica astróctica do cálcio e da sinalização nos modelos de ELA fornecerá uma visão valiosa de como a transmissão sináptica talvez tenha sido afetada. Em última análise, a utilização de repórteres GCaMP específicos do tipo celular também será uma ferramenta poderosa para investigar a dinâmica do cálcio neuronal e astrócito em configurações mistas de cocultura e avaliar especificamente efeitos não-autônomos originários de cada população celular.

Finalmente, o uso potencial desses métodos se estende não apenas além do estudo da ELA, mas também aos campos mais amplos da neurociência neurodegenerativa e até mesmo do desenvolvimento. Informações detalhadas sobre os plasmídeos específicos utilizados para gerar os resultados representativos são fornecidas e bem sucedidas na transfecção de plasmídeos contendo muitas variantes genéticas diferentes de repetições e repetições de hexanucleotídeos DE FUS, SOD1 e C9ORF72 e dipeptides43,44,66,67,68. Desde que os plasmídeos contenham um promotor usado em neurônios, não há limitação sobre quais modelos de ELA ou doença degenerativa poderiam ser estudados usando esses métodos. Além disso, a transfecção para expressar proteínas mutantes é um passo totalmente opcional. Culturas geradas a partir de animais transgênicos ou células humanas derivadas do paciente eliminam a necessidade de identificar células que contêm a proteína mutante de interesse. Atualmente, esses sistemas são constrangidos na forma que, se o corante de estirico for usado, o canal TRITC é ocupado, e se o GcaMP6 for usado, o canal FITC será ocupado. Técnicas que permitem o exame da atividade neuronal e astróctica em tempo real ampliam as possibilidades de compreensão da análise do curso de tempo para maturação/degeneração sináptica, bem como testes rápidos para a eficácia de compostos farmacológicos na promoção ou supressão da comunicação neuronal. Estes dois métodos são favoráveis à alta escala de rendimento para triagem. Em vez de emplacamento de neurônios em pratos individuais de 35 mm, os parâmetros de imagem desses dois protocolos poderiam ser empregados de forma automatizada em placas de 96 poços. Usando essa plataforma, bibliotecas compostas podem ser rapidamente testadas para terapêuticas, que modulam a entrada de cálcio ou melhoram a liberação sináptica usando um modelo genético de doenças ou mesmo células derivadas diretamente de pacientes. Esse método poderia acelerar a possibilidade de terapêuticas específicas ou até mesmo personalizadas do subgrupo, identificando rapidamente moléculas candidatas para uma investigação mais aprofundada.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Gostaríamos de reconhecer os atuais e antigos membros do Jefferson Weinberg ALS Center para feedback crítico e sugestões para otimizar essas técnicas e suas análises. Este trabalho foi apoiado por financiamento do NIH (RF1-AG057882-01 e R21-NS0103118 para D.T), o NINDS (R56-NS092572 e R01-NS109150 a P.P), a Associação de Distrofia Muscular (D.T.), o Centro Robert Packard de Pesquisa da ALS (D.T.), a Fundação Família Strong 4 ALS e a Fundação Da Família Farber (B.K.J., K.K.K, e P.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

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Neurociência Edição 173
Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica
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Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

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