Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Abstract

Vóór neuronale degeneratie is de oorzaak van motorische en cognitieve tekorten bij patiënten met amyotrofische laterale sclerose (ALS) en /of frontotemporale kwabdementie (FTLD) disfunctie van communicatie tussen neuronen en motorneuronen en spieren. Het onderliggende proces van synaptische transmissie omvat membraandepolarisatie-afhankelijke synaptische blaasjesfusie en de afgifte van neurotransmitters in de synaps. Dit proces vindt plaats door gelokaliseerde calciuminstroom in de presynaptische terminals waar synaptische blaasjes zich bevinden. Hier beschrijft het protocol op fluorescentie gebaseerde live-imaging-methodologieën die op betrouwbare wijze depolarisatie-gemedieerde synaptische blaasjesexocytose en presynaptische terminale calciuminstroomdynamiek in gekweekte neuronen rapporteren.

Met behulp van een styrylkleurstof die is opgenomen in synaptische blaasvliezen, wordt de afgifte van synaptische blaasjes opgehelderd. Aan de andere kant, om calciuminvoer te bestuderen, wordt Gcamp6m gebruikt, een genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggever. We gebruiken hoge kaliumchloride-gemedieerde depolarisatie om neuronale activiteit na te bootsen. Om synaptische blaasjesexocytose ondubbelzinnig te kwantificeren, meten we het verlies van genormaliseerde styrylkleurstoffluorescentie als functie van de tijd. Onder vergelijkbare stimulatieomstandigheden, in het geval van calciuminstroom, neemt de fluorescentie van Gcamp6m toe. Normalisatie en kwantificering van deze fluorescentieverandering worden op dezelfde manier uitgevoerd als het styrylkleurstofprotocol. Deze methoden kunnen worden gemultiplext met transfectie-gebaseerde overexpressie van fluorescerend gelabelde mutante eiwitten. Deze protocollen zijn uitgebreid gebruikt om synaptische disfunctie te bestuderen in modellen van FUS-ALS en C9ORF72-ALS, met behulp van primaire knaagdier corticale en motorische neuronen. Deze protocollen maken gemakkelijk een snelle screening van verbindingen mogelijk die de neuronale communicatie kunnen verbeteren. Als zodanig zijn deze methoden niet alleen waardevol voor de studie van ALS, maar voor alle gebieden van neurodegeneratief en ontwikkelingsneurowetenschappelijk onderzoek.

Introduction

Het modelleren van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het laboratorium wordt uniek uitdagend gemaakt vanwege de overweldigend sporadische aard van meer dan 80% van de gevallen1, in combinatie met het enorme aantal genetische mutaties waarvan bekend is dat ze ziekteveroorzakend zijn2. Desondanks delen alle gevallen van ALS het verenigende kenmerk dat er vóór regelrechte neuronale degeneratie disfunctionele communicatie is tussen presynaptische motorneuronen en postsynaptische spiercellen3,4. Klinisch gezien, als patiënten de connectiviteit van de resterende bovenste en onderste motorneuronen verliezen, presenteren ze zich met kenmerken van neuronale hyper- en hypoexcitabiliteit gedurende de ziekte5,6,7,8,9, als gevolg van complexe onderliggende moleculaire veranderingen in deze synapsen, die wij, als ALS-onderzoekers, proberen te begrijpen.

Meerdere transgene modellen hebben aangetoond dat verslechtering en desorganisatie van de neuromusculaire junctie optreden met de expressie van ALS-oorzakelijke genetische mutaties, waaronder SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 en TDP4317,18,19 door morfologische beoordelingen, waaronder evaluatie van synaptische boutons, wervelkolomdichtheden en pre / postsynaptische organisatie. Mechanistisch gezien, sinds de baanbrekende artikelen van Cole, Hodgkin en Huxley in de jaren 1930, is het ook mogelijk geweest om synaptische reacties te evalueren door middel van elektrofysiologische technieken in in vitro celkweek of weefselschijfpreparaten20. Door deze strategieën hebben veel modellen van ALS synaptische transmissietekorten aangetoond. Een gemuteerde variant van TDP43 veroorzaakt bijvoorbeeld een verhoogde vuurfrequentie en verlaagt de actiepotentiaaldrempel in NSC-34 (ruggenmerg x neuroblastoom hybride cellijn 34) motorneuronachtige cellen21. Deze zelfde variant veroorzaakt ook disfunctionele synaptische transmissie op de neuromusculaire junctie (NMJ) vóór het begin van gedragsmotorische tekorten in een muismodel22. Eerder werd aangetoond dat mutante FUS-expressie resulteert in verminderde synaptische transmissie bij de NMJ in een drosophila-model van FUS-ALS vóór locomotorische defecten11. Een recent rapport met geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van C9orf72-expansiedragers onthulde een vermindering van de gemakkelijk vrij te geven pool van synaptische blaasjes23. Al met al benadrukken deze studies en andere het belang van het opbouwen van een uitgebreider begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan synaptische signalering in ziekterelevante modellen van ALS. Dit zal cruciaal zijn in het begrijpen van de pathobiologie van ALS en het ontwikkelen van potentiële therapeutische doelen voor patiënten.

Methoden van stroom- en spanningsklemcellen zijn van onschatbare waarde geweest bij het bepalen van membraaneigenschappen zoals geleiding, rustmembraanpotentiaal en kwantitatief gehalte van individuele synapsen20,24. Een van de belangrijkste beperkingen van elektrofysiologie is echter dat het technisch uitdagend is en slechts inzichten biedt van een enkel neuron tegelijk. Live-cell confocale microscopie, gekoppeld aan specifieke fluorescerende probes, biedt de mogelijkheid om de synaptische transmissie van neuronen op een spatiotemporale manier te onderzoeken25,26,27. Hoewel het geen directe maat is voor neuronale prikkelbaarheid, kan deze fluorescentiebenadering een relatieve meting bieden van twee moleculaire correlaties van synaptische functie: synaptische blaasjesafgifte en calciumtransiënten op synaptische terminals.

Wanneer een actiepotentiaal het presynaptische terminale gebied van neuronen bereikt, worden calciumtransiënten geactiveerd, waardoor de overgang van een elektrisch signaal naar het proces van afgifte van neurotransmitters wordt vergemakkelijkt28. Spanningsafhankelijke calciumkanalen gelokaliseerd in deze gebieden reguleren de calciumsignalering strak om de kinetiek van de afgifte van neurotransmitters te moduleren29. De eerste gerapporteerde fluorescentie-gebaseerde opnames van calciumtransiënten werden uitgevoerd met behulp van de dual-golflengte indicator Fura-2 AM of de single golflengte kleurstof Fluo-3 AM30,31,32. Hoewel deze kleurstoffen destijds veel nieuw inzicht boden, lijden ze aan verschillende beperkingen, zoals niet-specifieke compartimentering in cellen, actief of passief kleurstofverlies van gelabelde cellen, fotobleeken en toxiciteit als ze gedurende langere tijd worden afgebeeld33. In het afgelopen decennium zijn genetisch gecodeerde calciumindicatoren de werkpaarden geworden voor het in beeld brengen van verschillende vormen van neuronale activiteit. Deze indicatoren combineren een gemodificeerd fluorescerend eiwit met een calciumchelatoreiwit dat snel van fluorescentie-intensiteit wisselt na de binding van Ca2+ ionen34. De toepassing van deze nieuwe indicatoren is enorm, waardoor een veel eenvoudigere visualisatie van intracellulaire calciumtransiënten mogelijk is, zowel in vitro als in vivo instellingen. Een familie van deze genetisch gecodeerde verslaggevers, bekend als GCaMP, wordt nu op grote schaal gebruikt. Deze indicatoren bevatten een C-terminaal calmodulin-domein, gevolgd door groen fluorescerend eiwit (GFP), en worden afgetopt door een N-terminaal calmodulin-bindend gebied35,36. Calciumbinding aan het calmodulinedomein veroorzaakt een interactie met het calmoduline-bindende gebied, wat resulteert in een conformationele verandering in de algehele eiwitstructuur en een aanzienlijke toename van de fluorescentie van het GFP-deel35,36. In de loop der jaren heeft deze familie van verslaggevers verschillende evoluties ondergaan om verschillende uitlezingen mogelijk te maken voor bepaalde calciumtransiënten met specifieke kinetiek (langzaam, gemiddeld en snel), elk met enigszins verschillende eigenschappen37,38. Hier is het gebruik van de reporter GcaMP6 benadrukt, waarvan eerder is aangetoond dat het enkelvoudige actiepotentialen en dendritische calciumtransiënten detecteert in neuronen, zowel in vivo als in vitro37.

Calciumtransiënten in het presynaptische gebied veroorzaken synaptische blaasjesfusiegebeurtenissen, waardoor neurotransmitterafgifte in de synaps en initiatie van signaleringsgebeurtenissen in de postsynaptische cel worden veroorzaakt28,39. Synaptische blaasjes worden zowel snel vrijgegeven als gerecycled, omdat de cel homeostatisch een stabiel celmembraanoppervlak en gemakkelijk vrij te geven pool van fusie-capabele membraangebonden blaasjes onderhoudt40. De hier gebruikte styrylkleurstof heeft een affiniteit met lipidemembranen en verandert specifiek de emissie-eigenschappen op basis van de ordening van de omringende lipideomgeving41,42. Het is dus een ideaal hulpmiddel voor het labelen van het recyclen van synaptische blaasjes en het volgen van deze blaasjes als ze later worden vrijgegeven na neuronale stimulatie41,42. Het protocol dat is gegenereerd en geoptimaliseerd is een aanpassing van de concepten die aanvankelijk door Gaffield en collega's zijn beschreven, waardoor we in de loop van de tijd continu styryl dye-gelabelde synaptische vesicle puncta kunnen visualiseren41.

Hier worden twee gerelateerde op fluorescentie gebaseerde methodologieën beschreven, die op betrouwbare wijze specifieke cellulaire gebeurtenissen rapporteren die betrokken zijn bij synaptische transmissie. Protocollen zijn gedefinieerd om de dynamiek van depolarisatie-gemedieerde presynaptische terminale calciuminstroom en synaptische blaasjesexocytose in gekweekte neuronen te onderzoeken. Hier zijn methoden en representatieve resultaten gericht op het gebruik van primaire knaagdiercorticale of motorneuronen als het in vitro modelsysteem, zoals er gepubliceerde studies zijn met behulp van deze celtypen43,44. Deze methoden zijn echter ook van toepassing op gedifferentieerde menselijke i3 corticale neuronen45, omdat we ook succes hebben gehad met beide protocollen in de momenteel lopende experimenten in ons laboratorium. Het algemene protocol wordt geschetst in een stapsgewijs lineair formaat, weergegeven in figuur 1. Kortom, om de calciumdynamiek in neurieten te bestuderen, worden volwassen neuronen getransfecteerd met plasmide-DNA om de fluorescerende reporter GCaMP6m tot expressie te brengen onder een Cytomegalovirus (CMV) promotor37,46. Getransfecteerde cellen hebben een laag niveau van basale groene fluorescentie, die toeneemt in de aanwezigheid van calcium. Regio's van belang worden gespecificeerd om fluorescentieveranderingen tijdens onze manipulatie te volgen. Hierdoor kunnen sterk ruimtelijk en temporeel gelokaliseerde fluctuaties in calcium worden gemeten37,46. Voor het evalueren van synaptische vesikelfusie en -afgifte worden volwassen neuronen geladen met styrylkleurstof die is opgenomen in synaptische blaaskelmembranen terwijl ze worden gerecycled, hervormd en opnieuw geladen met neurotransmitters in presynaptische cellen41,42,43,47,48. De huidige kleurstoffen die voor dit doel worden gebruikt, labelen synaptische blaasjes langs neurieten en worden gebruikt als een proxy voor deze regio's in live-imaging-experimenten, zoals werd aangetoond door co-kleuring van styrylkleurstof en synaptotagmin door Kraszewski en collega's49. Hier zijn representatieve afbeeldingen van vergelijkbare kleuringen opgenomen die ook zijn uitgevoerd (figuur 2A). Eerdere onderzoekers hebben dergelijke kleurstoffen uitgebreid gebruikt om synaptische blaasjesdynamica op de neuromusculaire kruising en hippocampale neuronen te rapporteren48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Door punctategebieden van met kleurstof beladen blaasjes te selecteren en door de afname van de fluorescentie-intensiteit na afgifte van het blaasje te monitoren, kunnen de functionele synaptische transmissiecapaciteit en de temporele dynamiek van afgifte na stimulatie worden bestudeerd43. Voor beide methoden wordt een medium met een hoge concentratie kaliumchloride gebruikt om cellen te depolariseren om neuronale activiteit na te bootsen. Beeldparameters worden gespecificeerd om intervallen van minder dan een seconde vast te leggen die een basislijnnormalisatie omvatten, gevolgd door onze stimulatie-opnameperiode. Fluorescentiemetingen op elk tijdstip worden bepaald, genormaliseerd naar de achtergrond en gekwantificeerd over de experimentele periode. Calciuminstroom gemedieerde GCaMP6m fluorescentie toename of effectieve synaptische vesikel exocytose styryl kleurstof afgifte fluorescentie afname kan worden gedetecteerd door middel van deze strategie. Gedetailleerde methodologische instellingen en parameters voor deze twee protocollen en een discussie over hun voordelen en beperkingen worden hieronder beschreven.

Figure 1
Figuur 1: Visuele weergave van het algemene protocolproces. (1) Isoleer en kweek primaire knaagdierneuronen in vitro tot het gekozen rijpingstijdpunt. (2) Introduceer GCaMP DNA of styrylkleurstof als verslaggevers van synaptische activiteit. (3) Stel het beeldvormingsparadigma in met behulp van live-imaging uitgeruste confocale microscoop en bijbehorende software. Begin de registratieperiode van de basislijn. (4) Terwijl cellen nog steeds live-image capture ondergaan, stimuleren neuronen via hoge KCl-badperfusie. (5) Beoordeel fluorescentie-intensiteitsmetingen in de loop van de tijd om calciumtransiënten of synaptische blaasjesfusie te meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierprocedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Jefferson University.

1. Primaire kweek van neuronen uit de embryonale rattenschors

OPMERKING: Primaire corticale neuronen worden geïsoleerd uit E17.5 rattenembryo's zoals eerder beschreven57,58. Er lijkt geen strain bias te bestaan met het succes van dit kweekprotocol. Deze methode wordt hieronder kort beschreven. De vorige aangegeven artikelen moeten worden vermeld voor volledige details.

  1. Euthanaseer zwangere vrouwelijke ratten door CO2-inhalatie gevolgd door secundaire bevestiging door cervicale dislocatie.
  2. Oogst embryo's en isoleer de hersenen in ijskoude 20 mM HEPES-gebufferde Hank's balanced salt solution (HBSS). Van de buitenste cortexschaal, scheiden en vervolgens striatum en hippocampi weggooien. Verzamel cortices.
  3. Gebruik een fijne tang om hersenvliezen uit cortices te verwijderen. Om dit te doen, houdt u de cortex op zijn plaats met één paar gesloten tangen met zachte druk.
    OPMERKING: Met het tweede paar tang in de tweede hand, knijp hersenvliezen. Pel hersenvliezen weg met rollende beweging met geknepen paar. Verplaats met de gesloten tang en herhaal indien nodig totdat de hersenvliezen volledig zijn verwijderd.
  4. Incubeer cortices met 10 μg/ml papaïne in HBSS gedurende 4 minuten bij 37 °C.
  5. Was drie keer in HBSS en trituraleer vervolgens 5-10 keer voorzichtig met een vuurgepolijste glazen Pasteur-pipet om een homogene celsuspensie te verkrijgen.
    OPMERKING: Vermijd bubbels; de pipet in de celsuspensie te houden.
  6. Plaatneuronen op 100 μg / ml poly-D-lysine gecoate 35 mm glazen bodemschalen met een dichtheid van 75.000 cellen / schotel in neurobasaal medium met B27-supplement (2%) en penicilline-streptomycine.

2. Primaire kweek van motorneuronen uit het ruggenmerg van embryonale ratten

OPMERKING: Primaire motorneuronen worden bereid uit E13.5 rattenembryo's zoals eerder beschreven, met weinig wijzigingen59,60. Er lijkt geen strain bias te bestaan met het succes van dit kweekprotocol. Deze methode wordt hieronder kort beschreven. Naar de voorgaande artikelen moet worden verwezen voor volledige details.

  1. Euthanaseer zwangere vrouwelijke ratten zoals in stap 1.1.
  2. Ontleed 10-20 ruggenmerg van embryo's en breek mechanisch in kleine fragmenten met behulp van twee paar tangen om respectievelijk te knijpen en te trekken.
  3. Incubeer in 0,025% trypsine gedurende 8 minuten, gevolgd door toevoeging van DNase bij 1 mg/ml.
  4. Centrifugeer door een 4% w/v BSA-kussen bij 470 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C zonder onderbreking.
  5. Centrifugeer gepelletiseerde cellen gedurende 55 minuten bij 830 x g bij 4 °C zonder rem door een 10,4% (v/v) dichtheidsgradiëntmedium (zie materiaaltabel). Draag de motorneuronenband voort op de visuele interface.
    OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat alle cellen worden vastgelegd, gebruikt u fenolvrije media voor de dichtheidsgradiëntstap en fenolbevattende media voor alle andere stappen. De interface van het dichtheidsverloop en de dissociatiemedia is gemakkelijk te herkennen op basis van het kleurverschil.
  6. Draai verzamelde banden door nog eens 4% w/v BSA-kussen bij 470 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C zonder onderbreking.
  7. Resuspend gezuiverde motorneuronen in volledig neurobasaal medium met B27 supplement (2%), glutamine (0,25%), 2-mercaptoethanol (0,1%), paardenserum (2%), en penicilline-streptomycine.
  8. Plaatneuronen op 100 μg/ml poly-lysine en 3 μg/ml laminine-gecoate coverslips met een dichtheid van 50.000 cellen/35 mm glasbodemschaal.

3. Neuronale transfecties

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd voor neuronen die GCaMP-calciumbeeldvorming zullen ondergaan en / of neuronen waarin een exogene DNA-plasmide of RNA van belang wordt geïntroduceerd voorafgaand aan synaptische evaluatie. Styrylkleurstof wordt daarentegen vlak voor de beeldvormingssessie geladen en wordt behandeld in rubriek 6. De onderstaande samenvatting is het transfectieprotocol dat wordt gebruikt voor primaire knaagdierneuronen in de gepresenteerde voorbeelden, maar het kan gemakkelijk worden aangepast en geoptimaliseerd aan de behoeften van de gebruiker.

  1. Transfecties voor gekweekte primaire corticale neuronen treden op op dag 12 in vitro (DIV 12), terwijl motorneuronen op dag 7 in vitro worden getransfecteerd (DIV 7).
    OPMERKING: Alle volgende stappen vinden plaats in een aseptische bioveiligheidskast.
  2. Transfecteer 500 ng GCaMP6m met transfectiereagens in een volumeverhouding van 1:2. Voeg voor co-transfecties in totaal 1,25 μg totaal DNA/schotel toe, met behoud van deze VERHOUDING DNA en reagens.
    OPMERKING: In de getoonde experimentele voorbeelden is 750 ng ALS/FTD-gerelateerd plasmide van belang getransfecteerd om C9orf72-ALS-gebonden dipeptiden, mutant FUS-eiwit, enz. tot expressie te brengen. Zorg ervoor dat de fluorescerende tag van het co-getransfecteerde plasmide niet conflicteert met het FITC-kanaal van GCaMP-beeldvorming. Evenzo, als u styrylkleurstofbeeldvorming uitvoert, zorg er dan voor dat het co-getransfecteerde plasmide niet conflicteert met het TRITC-kanaal van beeldvorming. Het gebruik van synaptophysin-GCaMP3 is even effectief in dit protocol. Transfecteer daarom dezelfde hoeveelheid van dit plasmide en volg alle stappen zoals gewoonlijk in rubriek 7.
  3. Incubeer het DNA-transfectiereagenscomplex bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  4. Voeg het geïncubeerde complex voorzichtig druppelsgewijs toe aan neuronen met werveling. Breng de schaal terug naar de CO2-incubator bij 37 °C gedurende 45-60 min.
  5. Verwijder het volledige kweekmedium dat het DNA-transfectiereagenscomplex bevat en vervang het door een 50-50 door volumepreparaat van voorgeconditioneerde en verse neuronale media. Plaats vervolgens cellen terug in de CO2-incubator gedurende 48 uur totdat ze worden afgebeeld.

4. Bereiding van bufferoplossingen en styrylkleurstofvoorraadoplossing

  1. Maak lage en hoge aCSF-oplossingen vers voordat u de beeldvorming gebruikt met behulp van de ingrediënten in tabel 1. Filter beide bufferoplossingen voor gebruik.
    OPMERKING: CaCl2 dihydraat kan Ca(OH)2 vormen bij opslag. Gebruik voor maximale werkzaamheid altijd een recent geopende container. Als dit niet mogelijk is, om Ca(OH)2 van het buitenoppervlak te verwijderen en maximale oplosbaarheid te garanderen, mogen oplossingen gedurende 5 minuten vóór toevoeging van CaCl2 koolzuurhoudend worden gemaakt met gasvormig CO2 . Als deze stap wordt genomen, past u de pH van de resulterende oplossing aan om een pH-waarde van 7,4 te behouden, omdat overmatige carbonatatie zal resulteren in Ca (HCO3) 2-vorming .
Lage KCL aCSF buffer (pH 7,40 tot 7,45)
Reagens Concentratie
Hepes 10 meter
NaCl 140m
Kcl 5 meter
Glucose 10 meter
CaCl2 2H2O 2 meter
MgCl2 4H2O 1mm
Hoge KCL aCSF buffer (pH 7,40 tot 7,45)
Reagens Concentratie
Hepes 10 meter
NaCl 95 meter
Kcl 50 meter
Glucose 10 meter
CaCl2 2H2O 2 meter
MgCl2 4H2O 1mm

Tabel 1: Samenstelling van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) buffers. Deze tabel bevat de ingrediënten voor het bereiden van lage en hoge KCl kunstmatige cerebrospinale vloeistofbuffers die worden gebruikt bij het afbeelden en stimuleren van neuronen. Zie rubriek 4 voor bereidingsinstructies.

  1. Bereid styryl dye stock-oplossing door een injectieflacon van 100 μg kleurstof te nemen en deze te reconstitueren tot een voorraadconcentratie van 10 mM met gedestilleerd water of neurobasaal medium.

5. Microscoop en perfusiesysteem instellen

OPMERKING: Voor het afbeelden van petrischalen met glazen bodem heeft een omgekeerde confocale fluorescentiemicroscoop de voorkeur vanwege de flexibiliteit van perfusie en voor het gebruik van een olie-onderdompelingsobjectief met een hoog numeriek diafragma. Raadpleeg de tabel met materialen voor de confocale microscoop, camera en objectieven die worden gebruikt voor het afbeelden van voorbeelden die worden beschreven in de sectie Representatieve resultaten .

  1. Voer alle experimenten uit bij 37 °C met constante 5% CO2-niveaus met behulp van een incubatorsysteem-gekoppelde stage mount.
  2. Beheer beeldacquisitie met behulp van confocale software. Optimaliseer acquisitie-instellingen aan het begin van de beeldvormingssessie om excitatievermogen en versterking te kiezen om optimale visualisatie van signalen zonder fotobleaching te garanderen.
    1. Houd het excitatievermogen, de belichtingstijd, de detectorwinst en de framesnelheid constant voor alle monsters. Voer time-lapse-beeldvorming uit met een beeldverhouding van 512 x 512 en een framesnelheid van 2 afbeeldingen / s om kleurverbleking te minimaliseren.
      OPMERKING: Hoewel puncta duidelijk zichtbaar moet zijn, moet de laserintensiteit zo laag mogelijk worden ingesteld om bleken en fototoxiciteit te voorkomen. Stel het confocale diafragma in op de smalste instelling om een optimale resolutie van fluorescerende puncta in neurieten te bereiken. De belichtingstijd is ingesteld op 200 ms of minder, consistent voor alle monsters. De maximale beeldsnelheid van de gebruikte camera was 2 beelden/s. Bij gebruik van een snellere camera kunnen er meer foto's worden gemaakt. Indien mogelijk moeten temporele beeldvormingsinstellingen worden gekozen.
  3. Selecteer de volgende fluorescentie-excitatie/dichroïcum/emissiefiltercombinaties voor beeldvorming met behulp van confocale software: Gcamp6m/Gcamp3 met RESPECTIEVELIJK FITC en styrylkleurstof met TRITC.
  4. Gebruik de perfecte focusfunctie van de confocale imaging acquisition software tijdens time-lapse imaging om z-drift te voorkomen.
    OPMERKING: Vanwege de hoge snelheid van beeldvorming wordt een enkel vlak in beeld gebracht. Het is erg belangrijk om het ontbreken van z-drift tijdens het experiment te waarborgen.
  5. Selecteer het tabblad Tijd in het deelvenster voor het verwerven van afbeeldingen om de opnameperioden en -intervallen in te stellen.
    1. Stel fase # 1 in op interval 500 ms, duur 3 - 5 min.
    2. Stel fase # 2 in op interval 500 ms, duur 5 min.
      OPMERKING: Fase #1 komt overeen met baseline opname, Fase #2 met de stimulatieperiode, respectievelijk.
  6. Monteer zwaartekrachtperfusieapparatuur voor aCSF met behulp van een klepregelsysteem en een kanaalspruitstuk.
    1. Laad hoge KCl (zie tabel 1) in een spuit van 50 ml aan de bovenkant van het apparaat, met slangen die door het systeem lopen. Stel het debiet in op 1 ml/min.
  7. Plaats een glazen schaal van 35 mm met neuronen op het confocale beeldvormingsstadium, waarbij het uiteinde van de perfusieslang aan de rand van de schotel wordt geplaatst. Kies het veld voor beeldvorming.

6. Styryl kleurstof beeldvorming van synaptische vesikel release

  1. Incubeer cellen in lage KCl aCSF (zie tabel 1) gedurende 10 min bij 37 °C, 48 uur na transfectie.
  2. Laad primaire corticale of motorneuronen op petrischalen met glazen bodem met styrylkleurstof.
    1. Verwijder lage KCl aCSF door aspiratie.
    2. Gebruik een pipet om neuronen in het donker te laden met 10 μM styrylkleurstof in aCSF met 50 mM KCl gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder de beladingsoplossing en bad neuronen in lage KCl aCSF gedurende 10 minuten om niet-specifieke kleurstofbelasting te elimineren.
  3. Plaats de 35 mm glazen bodemschaal op het beeldvormingsstadium en observeer vervolgens onder een 20x luchtobjectief of 40x olie-onderdompelingsobjectief van een omgekeerde confocale microscoop.
    OPMERKING: Gebruik GFP-fluorescentie om getransfecteerde cellen te lokaliseren in het geval van cellen die co-getransfecteerd zijn met een GFP-gelabeld plasmide.
  4. Exciteer styrylkleurstof met behulp van een 546 nm laser, verzamel emissie met behulp van een 630-730 nm (TRITC) bandpassfilter.
  5. Selecteer het beeldvormende veld en stel perfect scherp. Maak vervolgens een enkel stilstaand beeld met brightfield-, TRITC- en fluorescentiemarkerkanalen om neuronale grenzen te markeren.
  6. Start Run Now in de acquisitiesoftware. Voer de basale opname gedurende 3-5 minuten uit om variaties in kleurstofintensiteit uit te sluiten, indien aanwezig (fase # 1).
    OPMERKING: Het is essentieel om ervoor te zorgen dat elke afname van de kleurstofintensiteit te wijten is aan het vrijkomen van synaptische blaasjes en niet aan passieve kleurstofdiffusie of fotobleaching. Deze 3-5 minuten durende pre-stimulatieperiode zou moeten resulteren in een stabiel en gehandhaafd kleurintensiteitsniveau. De laatste 30 s van deze registratie zullen worden gebruikt om een gemiddelde basislijn fluorescentiewaarde voor elke ROI te bepalen. Alvorens experimentele omstandigheden te evalueren, kan ook een extra niet-stimulatieconditie van ongeveer 10 minuten continue opname met behulp van de beoogde acquisitie-instellingen worden uitgevoerd om stabiele fluorescentiewaarden te garanderen met behulp van de laserinstellingen gedurende een langere periode.
  7. Bij de schakelaar naar fase #2 activeert u op de knop voor het perfusiesysteem. Laat vervolgens constant 50 mM KCl doordrenken naar neuronen om het lossen van kleurstof te vergemakkelijken (fase # 2).
    1. Voer opnames uit voor 300 s na KCl-toevoeging. Hierna stopt de acquisitie; activeer de uitschakelaar voor het perfusiesysteem.
  8. Sla het experiment op en analyseer gegevens met behulp van confocale software zoals beschreven in sectie 8 hieronder.
    OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden gestopt en de analyse kan later worden uitgevoerd. In het geval dat cellen geen transfectie nodig hebben voor de expressie van eiwitten van belang, kan dit protocol op elk moment in vitro worden uitgevoerd wanneer wordt geprobeerd de functionaliteit van synaptische ontlading te onderzoeken. Na een test van controlecellen om een goede synaptische ontlading te garanderen, moet de experimentator blind worden gemaakt voor de genetische of farmacologische omstandigheden van elke geteste schotel om vertekening te minimaliseren.

7. Fluorescentie beeldvorming van Gcamp6m calciumtransiënten

  1. Transfect primaire knaagdier corticale neuronen gekweekt op 35 mm glazen bodemschalen met 500 ng Gcamp6m zoals aangegeven in rubriek 3.
    OPMERKING: Indien gewenst, co-transfect neuronen met een plasmide van belang met een fluorescerende tag in het rode of ver-rode bereik.
  2. Incubeer neuronen met een lage KCl aCSF gedurende 15 min 48 h na transfectie en monteer vervolgens de schotel op het beeldvormingsplatform.
  3. Visualiseer GCaMP6m-fluorescentie met behulp van een FITC-filter (488 nm) en een 20x- of 40x-objectief.
  4. Selecteer het beeldvormende veld en stel perfect scherp. Neem vervolgens een enkel stilstaand beeld met brightfield-, FITC- en fluorescentiemarkerkanalen om neuronale grenzen te markeren.
  5. Start Run Now in de acquisitiesoftware. Voer de nulmeting gedurende 5 minuten uit en perfuseer vervolgens met aCSF die 50 mM KCL bevat op dezelfde manier als beschreven in rubriek 6 voor styrylkleurstofexperimenten.
    OPMERKING: Het doel van deze beeldvorming is het meten van geëvoceerde calciumtransiënten. Als een neuron basale vuuractiviteit en calciumfluxen heeft tijdens de pre-stimulatieperiode, wordt het niet gebruikt in data-analyse. In plaats daarvan worden alleen cellen met stabiele achtergrondfluorescentie gebruikt. Poststimulatieperioden kunnen ook worden verlengd tot 60 minuten voor calciumtransiënten, met of zonder extra continue hoge KCl-perfusie.
  6. Sla het experiment op en analyseer gegevens met behulp van confocale software zoals beschreven in sectie 8 hieronder. Het experiment kan op dit punt worden gestopt en de analyse kan later worden uitgevoerd.
    OPMERKING: Als de cellen geen transfectie nodig hebben voor de expressie van eiwitten van belang, kan dit protocol op elk moment in vitro worden uitgevoerd bij het onderzoeken van calciumtransiënten. Na een test van controlecellen om de meting van calciumtransiënten te garanderen, moet de experimentator blind zijn voor de genetische of farmacologische omstandigheden van elk getest gerecht om vertekening te minimaliseren.

8. Beeldanalyse

  1. Open time-lapse-afbeeldingen met confocale software.
  2. Afbeeldingen in time-lapse-reeksen uitlijnen met de opdrachtenreeks : Afbeelding | Verwerking | Sluit huidig document uit. Selecteer Uitlijnen op het eerste frame.
  3. Selecteer interessegebieden (ROI's) langs neurieten met behulp van het ROI-selectiegereedschap, een boonvormig pictogram aan de rechterkant van het afbeeldingskader (figuur 3B). Markeer ook een ROI die de fluorescentie-intensiteit op de achtergrond vertegenwoordigt.
    OPMERKING: ROIs worden geselecteerd door gebieden van duidelijk gescheiden puncta te kiezen langs neuronale sporen die worden aangegeven door het heldere stilstaande beeld. Ten minste vijf ROIs per neuron worden gekozen voor analyse. De ROI op de achtergrond wordt gekozen in een gebied van het gezichtsveld dat geen neurieten bevat.
  4. Meet ruwe fluorescentie in de loop van de tijd voor geselecteerde ROI's met behulp van de volgende opdrachtenreeks: Meet | Tijdmeting.
    1. Start de functie Meten in het bovenste gedeelte van het deelvenster Tijdmeting . Een grafische weergave van ruwe fluorescentie in de tijd (figuur 3C) en kwantitatieve gegevens worden beide gegenereerd.
      OPMERKING: Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de ruwe fluorescentie voor die ROI voor het frame dat is gekoppeld aan dat specifieke gemeten tijdspunt.
  5. Exporteer ruwe fluorescentie-intensiteiten naar de spreadsheetsoftware.
  6. Analyseer elke ROI onafhankelijk. Normaliseer eerst gegevens door de ROI-intensiteit op de achtergrond af te trekken van de ROI van interesse-intensiteit op elk tijdstip.
    1. Neem de ruwe fluorescentiewaarde van de achtergrond-ROI op elk specifiek tijdstip en trek dit af van de ROI van de ruwe intensiteitswaarde van rente op dat moment.
      OPMERKING: Dit wordt gedaan voor de gehele opnameperiode, zowel basale als stimulatiefasen.
  7. Bepaal de gemiddelde ROI van rente-intensiteit voor de laatste 30 s van de basislijn.
    1. Gemiddelde van de genormaliseerde ruwe basale waarden gegenereerd in stap 8.6 van de laatste 30 s van de basale opnameperiode van 3-5 minuten.
      OPMERKING: De gehele periode van basale opname kan worden gebruikt om deze waarde te genereren. Naarmate deze waarde echter stabiliseert en wordt gehandhaafd, zijn de 60-tijdspunten van de laatste 30 s van voldoende steekproefgrootte om het geheel weer te geven.
  8. Vergelijk deze basislijnwaarde met de genormaliseerde intensiteitswaarde op elk tijdstip, waardoor een verandering in fluorescentiewaarde (ΔF) wordt gegenereerd.
    1. Neem de waarde uit stap 8.7 en trek de gemiddelde fluorescerende basislijnwaarde af. Doe dit en de daaropvolgende stappen voor de gehele opnameperiode, zowel basale als stimulatiefasen.
  9. Bereken deze verandering met betrekking tot de uitgangsfluorescentiewaarde, waardoor een verandering in fluorescentie/basisfluorescentie (ΔF/F) wordt gegenereerd. Neem hiervoor de waarde uit stap 8.8 en deel deze door de gemiddelde fluorescerende basislijnwaarde.
  10. Stel ten slotte de beginpuntwaarde in op 1, zodat stijgingen of dalingen in de loop van de tijd gemakkelijk grafisch kunnen worden gevisualiseerd.
    1. Neem de waarde die is gegenereerd in stap 8.9 en voeg 1 toe.
      OPMERKING: Wanneer dit correct wordt gedaan, moeten de 30 s van de waarden van de basislijnperiode in de buurt van de waarde van 1 zweven. In cellen die effectief synaptische inhoud vrijgeven, zou deze waarde van 1 naar 0 moeten gaan na het begin van de stimulatie. Een voorbeeld van stap 6-9 is weergegeven in figuur 3E.

9. Data-analyse

OPMERKING: De experimentator kan worden losgekoppeld van experimentele omstandigheden om gegevens op de juiste manier te bundelen voor analyse. Gebruik een steekproefgrootte van ten minste 10 neuronen per aandoening uit elk van de drie onafhankelijke experimenten. Overweeg alleen neuronen voor opname als ten minste vijf ROI-regio's kunnen worden aangewezen. Dit niveau van experimentele replicatie was voldoende in gepubliceerde studies om een diepgaand verlies van synaptische ontlading aan te tonen in ALS-gerelateerde poly-GA-bevattende cellen versus GFP-controles (zie Representatieve resultaten). Als echter een subtieler fenotype wordt waargenomen, kan het aantal biologische en / of technische replicaties door de gebruiker worden geoptimaliseerd.

  1. Gebruik alle berekende ΔF/F-waarden in de loop van de tijd van ROIs van een bepaalde experimentele toestand en bepaal een gemiddelde ΔF/F-waarde voor elk tijdstip samen met een SEM.
  2. Plot gegevens met behulp van een grafische en statistische softwareprogramma in xy-formaat, waarbij x de verstreken tijd is en y de ΔF / F-waarde is berekend in stap 9.1. Presenteer alle waarden als gemiddelde ± SEM.
  3. Om statistische significantie te bepalen, gebruikt u de student t-test voor het vergelijken van twee groepen en eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door Tukey's posthoc-analyse voor het vergelijken van drie of meer groepen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na de succesvolle implementatie van het bovenstaande protocol worden representatieve resultaten getoond voor een typisch styryl dye synaptisch vesikel release experiment. Gekweekte primaire corticale neuronen van ratten werden geladen met kleurstof met behulp van de methode beschreven in rubriek 6. De specificiteit van de kleurstofbelasting werd bepaald door co-labeling met synaptische blaasblaasmarker synaptofysine. Een meerderheid van de styrylkleurstof positieve puncta zijn co-positief voor deze marker (figuur 2A). Om te bepalen of de instellingen die worden gebruikt voor styrylkleurstofbeeldvorming fotobleaching veroorzaken, wordt meestal een onbehandelde put geladen met kleurstof en gedurende een langere periode van 10 minuten zonder stimulatie in beeld gebracht om ervoor te zorgen dat de fluorescentiewaarden constant blijven.

Bovendien worden de resultaten opnieuw weergegeven met behulp van co-labeling van synaptophysine en styrylkleurstof zoals in figuur 2A. Deze fluoroforen werden gezamenlijk afgebeeld met behulp van het paradigma aangegeven in sectie 6 voor TRITC styryl kleurstof beeldvorming, plus dubbele opname van synaptophysine fluorescentie met behulp van hoge intensiteit laservermogen op het DAPI-kanaal om de mTurquoise-synaptophysine te visualiseren. Getoond worden representatieve beelden getoond van synaptische gebieden voor en na de stimulatie (figuur 2B). Hoewel deze methode een indirecte gevolgtrekking is voor het ontbreken van fotobleaching, blijkt uit analyse van de ruwe intensiteitswaarden over de gehele beeldvormingsperiode dat de synaptofysine-intensiteit constant blijft, terwijl de intensiteit van de styrylkleurstof na stimulatie afneemt (figuur 2C). Dus, met behulp van dit experiment en onze andere controles van stabiele fluorescentie vóór stimulatie en gedurende langere perioden in niet-stimulatieputten, hebben we vastgesteld dat afnames in styrylfluorescentie kunnen worden toegeschreven aan synaptische ontlading door KCl-depolarisatie in plaats van fotobleaching-effecten.

Figure 2
Figuur 2: Beoordeling van specificiteit en beeldvormingsparameters van styrylkleurstofetikettering. (A) Een representatief 40x beeld van een styrylkleurstof-gelabeld rat corticale neuron (rood), dat 24 uur eerder werd getransfecteerd met een plasmide om mTurquoise2-synaptophysin61 uit te drukken, verdreven van de synapsinepromotor (groen). Colocalisatie van deze twee fluoroforen geeft aan dat een grote meerderheid van styrylkleurstofpositieve puncta samen gekleurd is met synaptische blaasmarker synaptofysine. Schaalbalk geeft 5 μm aan. (B) Corticale neuronen werden getransfecteerd en styrylkleurstof geladen zoals in (A) en afgebeeld volgens het styrylkleurstofparadigma, samen met dubbele fluorescentievangst van de mTurquoise-synaptofysine op het DAPI-kanaal. Representatieve beelden tonen synaptophysine en styryl dye puncta regio's pre- en post-stimulatie. Schaalbalk geeft 5 μm aan. (C) Fluorescentie werd in de loop van de tijd gecontroleerd op synaptophysine (DAPI-kanaaltop) en styrylkleurstof (FITC-kanaalbodem). Synaptophysine-intensiteit werd gehandhaafd op een gestage fluorescentie gedurende de beeldvormings- en stimulatieperiode, terwijl de fluorescentie van de styrylkleurstof afnam naarmate de kleurstof bij stimulatie werd ontladen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representatieve beelden tonen de belasting van styrylkleurstof tijdens beeldvorming, met de selectie van ROI's (figuur 3A-B). De ruwe fluorescentie-intensiteit van geselecteerde ROI's en een achtergrond-ROI worden uitgezet met behulp van de confocale software (figuur 3C). De neuronen die hier worden getoond, werden ook getransfecteerd met plasmiden om de effecten te bestuderen van dipeptide-eiwitten geproduceerd in de context van C9ORF72-ALS, namelijk FLAG-eGFP en FLAG-GA50-eGFP verdreven van de T7-promotor. Succesvolle synaptische vesikelafgifte resulteert in opvallend verlies van kleurstoffluorescentie bij hoge KCl-depolarisatie (figuur 3D, bovenste twee panelen) voor een GFP-getransfecteerd controleneuron. Een representatieve video die hier is opgenomen, laat zien hoe dit zich tijdens het beeldvormen aandient. Bovendien lost een neuron selectief styrylkleurstof in een neurietgebied na stimulatie (video 1).

Aan de andere kant wordt verminderde synaptische transmissie vertegenwoordigd door behouden kleurstoffluorescentie, zelfs na hoge KCl-depolarisatie in neuronen getransfecteerd met een C9ORF72-gebonden dipeptide-herhalingsconstruct (GA50) (Figuur 3D, onderste twee panelen)43. Na kwantitatieve gegevensanalyse (figuur 3E) worden de gegevens weergegeven als kleurstofintensiteit gedurende de beeldvorming voor de controlegroepen (GFP) en ALS/FTD(GA50) (figuur 3F)43. Deze methode kan ook intermediaire effecten ontleden en is niet simpelweg een "alles of niets" binaire maat. In experimenten die waren ontworpen om de synaptische tekorten gemedieerd door GA50 te redden, werd exogene synaptische vesikel-geassocieerd eiwit 2 (SV2) geïntroduceerd door lentivirale transductie met behulp van het rSV2a-eGFP-pRRL plasmide verdreven van de menselijke PGK-promotor. Na beeldvorming en analyse zoals hierboven beschreven, werd synaptisch vuren gered in neuronen die GA50 en SV2 co-expressie gaven (figuur 3G).

Figure 3
Figuur 3: Evaluatie van de afgifte van synaptische blaasjes door middel van styrylkleurstofetikettering. (A) Een representatief 40x beeld van een styrylkleurstof-gelabeld neuron in lage KCl aCSF-media aan het begin van een beeldvormingsexperiment. Schaalbalk geeft 20 μm aan. (B) Weergave van ROI-generatie op de afbeelding van (A). Specifieke puncta-gebieden langs neurieten (# 1-4) worden gekozen met behulp van de ROI-tool, de boonvormige knop die aan de rechterkant is gemarkeerd. Een laatste ROI (#5) wordt geselecteerd in een leeg gebied om de intensiteit van het achtergrondsignaal vast te leggen. Gebieden met niet-specifieke, niet-neuronale heldere vlekken worden vermeden. Schaalbalk geeft 20 μm aan. (C) Weergave van de signaalintensiteiten voor ROIs #1-5 van (B) in de tijd zoals weergegeven/weergegeven door confocale software. (D) Visuele representaties van ROI-regio's voor/na-stimulatie voor een neuron dat effectief synaptische transmissie ondergaat (bovenste twee panelen). De onderste twee panelen zijn ingezoomde afbeeldingen met een onbevooroordeelde drempel die is toegepast om puncta van de achtergrond te isoleren om verschillende gebieden visueel weer te geven. GFP-bevattende neuronen ondergaan effectief synaptische afgifte, terwijl expressie van C9ORF2-ALS-gerelateerd peptide GA50 dit effect voorkomt. Schaalbalken geven 10 μm-Herdrukt aan van Jensen et al. 202043. (E) Voorbeeld van een kwantificeringsbestand met behulp van spreadsheetsoftware, met normalisatie van waarden tot basislijn en generatie van ΔF / F-waarden in de loop van de tijd. Gegevens worden eerst genormaliseerd naar de roi-intensiteitswaarde op de achtergrond op elk tijdstip. Deze waarde wordt vervolgens vergeleken met de gemiddelde ROI van de rentebasiswaarde voor de laatste 30 s pre-stimulatie (hier weergegeven als 10 s in 1 s intervallen voor eenvoud) (ΔF). Deze verandering wordt vervolgens berekend als een fractie van de basisfluorescentie (ΔF/F). Ten slotte wordt de beginpuntwaarde ingesteld op 1, zodat stijgingen of dalingen in de loop van de tijd gemakkelijk grafisch kunnen worden gevisualiseerd. Ten minste vijf puncta-regio's per neuron en ten minste tien neuronen per experimentele aandoening worden verzameld, waarbij gegevens zoals deze worden gecombineerd om gemiddelde metingen op elk tijdstip te genereren. (F) Gegevens uit een spreadsheetbestand zoals in (E) worden verplaatst naar een softwareprogramma voor grafieken en statistieken. Voor de hier getoonde grafiek wordt de ΔF/F-waarde op elk tijdstip uitgezet, gemiddeld over alle puncta-gebieden van een experimentele toestand, samen met de standaardfout van het gemiddelde. De grafiek hier is gegevens van de GFP versus GA50-experimenten aangegeven in (D), waar de laatste 10 s van baseline en eerste 10 s van de stimulatieperiode worden getoond - herdrukt van Jensen et al. 202043. (G) Deze test kan curven produceren voor intermediaire synaptische afgifte en is niet eenvoudigweg een "alles of niets" -reactie. GA50 werd mede tot expressie gebracht met exogene synaptische eiwit SV2 (synaptisch blaasjes-geassocieerd eiwit 2), en styrylkleurstof beeldvorming en analyse werden uitgevoerd zoals aangegeven in de vorige stappen. Net als in figuur 3F geeft de hier getoonde grafiek de ΔF/F-waarde weer op elk tijdstip dat gemiddeld is over alle puncta-gebieden van een experimentele toestand, samen met de standaardfout van het gemiddelde. De grafiek toont de laatste minuut van baseline en de eerste minuut van de stimulatieperiode van Jensen et al. 202043. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Representatieve video van styryl dye imaging experiment. Getoond is een representatieve video van een corticale neuron geladen met styryl kleurstof. De video toont de periode die begint op het moment van badperfusie van hoge KCl aCSF. Het boxed gebied benadrukt de neurieten, met waarneembaar verlies van puncta-fluorescentie in de loop van de tijd. Klik hier om deze video te downloaden.

Volgens de in rubriek 7 beschreven methode worden representatieve fluorescentiebeelden getoond van corticale neuronen die getransfecteerd zijn met GcaMP6m voor en na KCl-depolarisatie (figuur 4A). Ruwe intensiteitsgrafieken tonen verhoogde fluorescentiewaarden die fluctueren, wat wijst op calciuminvoer in neurieten na KCl-geïnduceerde depolarisatie (figuur 4B). Deze tweede representatieve video toont neuronen die GcaMP6m tot expressie brengen met lage fluorescentie aan het einde van de opnamebasislijnperiode om dit effect aan te tonen. Aan het begin van de stimulatie vertonen de neuronen een dramatische fluorescentietoename (video 2). Deze aanpak is met succes gebruikt om calcium-entry veranderingen in een mutant FUS-ALS model aan te tonen. Astrocyten in dit model werden getransduceerd met adenovirus dat CMV-promotor-gedreven eGFP-FUS plasmiden bevatte. Wanneer geconditioneerd medium van mutant FUS-tot expressie brengende astrocyten op motorneuronen werd geplaatst, werd een verhoogde calciuminstroom waargenomen in vergelijking met niet-mutante FUS-omstandigheden na α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) + cyclothiazidestimulatie (figuur 4C)44. De gevoeligheid van deze test is getest door experimenten uit te voeren met en zonder calcium in het perfusiemedium. In de hierboven genoemde setting van GFP versus GA50 werden verhoogde piekcalciumtransiënten waargenomen in GA50-bevattende motorneuronen. Dit was met name afhankelijk van calcium dat in de cel kwam en niet van de afgifte van interne calciumvoorraden. Wanneer calcium uit het stimulerende aCSF-medium werd verwijderd, werden in geen van beide experimentele omstandigheden calciumtransiënte responsen waargenomen (figuur 4D)43.

Figure 4
Figuur 4: Calciumtransiënten in realtime observeren met behulp van GCaMP-verslaggevers. (A) Een 40x-afbeelding van een GCaMP6m-expressieneuron, pseudokleurig om de intensiteit van GFP-fluorescentie weer te geven (laag in blauw tot hoog in rood). Linkerpanelen tonen het hele gezichtsveld van 40x voor en na de stimulatie. Schaalbalk geeft 20 μm aan. De afbeeldingen aan de rechterkant zijn ingezoomde versies van de onthulde boxed gebieden. Door deze beelden is het duidelijk op het oog dat er een robuuste toename is van focale neuritische calciumspiegels na stimulatie. Schaalbalk geeft 12 μm aan. (B) Roi-selectie en fluorescentie-intensiteitsmonitoring gedurende het hele experiment wordt uitgevoerd zoals in figuur 3. De laatste 30 s van baseline en 1 min stimulatie voor twee geselecteerde ROIs van een neuron dat GCaMP6m fluorescentiemonitoring ondergaat, wordt hier getoond. In tegenstelling tot styrylkleurstof beeldvorming, neemt de fluorescentie-intensiteit toe na neuronale stimulatie. Bovendien, zoals hier wordt opgemerkt, fluctueren calciumtransiënten in de loop van de tijd in neurieten; daarom worden de resultaten meestal weergegeven als de gemiddelde piekgenormaliseerde fluorescentieveranderingswaarde voor elke ROI-regio. (C) Representatieve kwantificering van een dergelijk experiment wordt getoond zoals werd gepubliceerd in Kia-McAvoy et al. 201844, waar primaire motorneuronen die supernatant ontvingen afgeleid van mutante FUS-ALS astrocyten significant verhoogde instroom van calcium vertoonden na AMPA-receptorstimulatie, vergeleken met neuronen die supernatant ontvingen van wild-type FUS die astrocyten tot expressie brengen. D) Representatieve kwantificering van calciumtransiënte beeldvorming waarbij calcium niet was opgenomen in de stimulerende aCSF. Getoond zijn de omstandigheden van mCherry versus GA50-mCherry gestimuleerd met hoge KCl aCSF met of zonder calcium zoals gepubliceerd in Jensen et al. 202043. GA50 bevattende neuronen vertoonden een verhoogde piek calciuminstroom in vergelijking met mCherry bevattende cellen. Er was geen verhoging van de interne calciumspiegels in beide experimentele omstandigheden wanneer calcium werd verwijderd uit het stimuleren van hoge KCL aCSF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 2: Representatieve video van GCaMP calcium transient experiment. Getoond is een representatieve video van een veld van corticale neuronen getransfecteerd met GCaMP6m. Na een baselineperiode wordt een grote calciuminstroom genoteerd bij de 6 s-markering wanneer hoge KCl aCSF werd toegepast. Calciuminvoer kan worden gemeten voor de hele cel of in specifieke neurietgebieden zoals beschreven. Klik hier om deze video te downloaden.

Potentiële problemen Mogelijke redenen/oplossing
1 Niet-specifieke belasting Wees precies met de laadtijd. Langere laadtijden resulteren in niet-specifieke belasting van FM4-64 in endosomen en lysosomen
2 Geen merkbare exocytose in controleneuronen Controleer de pH van een hoge KCl aCSF-oplossing.
3 Verlies van focus en zijdelingse drift Zorg ervoor dat de perfecte focus erop staat. Lijn de afbeeldingen na het afbeelden uit met behulp van Nikon-software of de ImageJ-plug-in.
4 Bleken van FM4-64 fluorescentie Controleer de laserintensiteit die wordt gebruikt voor beeldvorming. Probeer altijd een zo laag mogelijke intensiteit te gebruiken. Controleer of de gebruikte laserintensiteit niet resulteert in bleken door proefdraaien uit te voeren.

Tabel 2: Mogelijke problemen en probleemoplossing voor styrylkleurstofexperimenten. Typische scenario's voor problemen en algemene probleemoplossing voor synaptische losexperimenten.

Potentiële problemen Mogelijke redenen/oplossing
1 Transfectie-efficiëntie te laag Controleer de neuronale gezondheid. Als neuronen moeilijk te transfecteren zijn, kan men overschakelen op AAV of lentivirale transductie van GCaMP.
2 Accumulatie van GCaMP6-fluorescentie in de kern Gecompromitteerde neuronale gezondheid. Controleer het transfectieprotocol.
3 Verlies van focus en laterale beelddrift Zorg ervoor dat de perfecte focus erop staat. Lijn de afbeeldingen na het afbeelden uit met behulp van Nikon-software of de ImageJ-plug-in.
4 Geen calciumrespons bij KCL-stimulatie Controleer of de pH van aCSF correct is.
5 Bleken van GCaMP6 fluorescentie Controleer de laserintensiteit die wordt gebruikt voor beeldvorming. Probeer altijd een zo laag mogelijke intensiteit te gebruiken. Controleer of de gebruikte laserintensiteit niet resulteert in bleken door proefdraaien uit te voeren.
6 Blebbing van neurieten Gecompromitteerde neuronale gezondheid als gevolg van transfectie. Gebruik een verse partij neuronale culturen.

Tabel 3: Mogelijke problemen en probleemoplossing voor beeldvorming van calciumtransiënten in neurieten. Typische scenario's voor problemen en algemene probleemoplossing voor GCaMP calciumtransiënte experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drie stappen die beide beschreven methoden gemeen hebben, zijn van cruciaal belang voor experimenteel succes en kwantificeerbare uitkomsten. Ten eerste is de voorbereiding van verse aCSF vóór elke ronde van experimenten essentieel, volgens de bijgevoegde instructies. Als u dit niet doet, kan dit een geschikte neuronale depolarisatie voorkomen. Een monster van onbehandelde controleneuronen moet voortdurend worden getest voordat experimentele groepen worden gestimuleerd om een goede cellulaire depolarisatie te garanderen en een benchmark te bieden voor positieve resultaten die in die beeldvormingssessie zijn verkregen. Ten tweede, om fluorescentie in de loop van de tijd met succes te volgen voor specifieke synaptische regio's, moet ook bijzondere aandacht worden besteed aan het instellen van beeldvormingsparameters en gebieden van ROI's voor monitoring. De registratie van de basislijnperiode moet onmiddellijk overgaan op de stimulatieregistratieperiode. Een voldoende snelle framesnelheid (2 beelden/s) is vereist om de single-decay dynamiek van styryl dye release vast te leggen. Ten slotte is een cruciale stap in de analyse van experimenten de normalisatie van fluorescentiemetingen, eerst naar de beeldvormende achtergrond en vervolgens naar de vooraf gestimuleerde basislijn. Net als bij andere beeldvormingsprotocollen wordt eerst het aftrekken van een blanco beeldvormingsgebied uitgevoerd bij alle gepaarde tijd-fluorescentiemetingen om eventuele achtergrondautofluorescentie te verwijderen die de toevoeging van KCl-media kan introduceren. Het is ook essentieel om de gemiddelde fluorescentiemeting voor elke ROI van de laatste 30 s basislijn vóór stimulatie te meten en te berekenen. Deze gemiddelde startwaarde wordt vervolgens gebruikt voor alle tijdmetingen voor die ROI als een gedefinieerd startpunt om de intensiteit van de "verandering ten opzichte van de basislijn" te kwantificeren.

Primaire neuronale cultuur is notoir moeilijk te transfecteren met exogene DNA, en zelfs geoptimaliseerde protocollen leveren vaak lage efficiënties van totale cellen in cultuur op. 20% -25% van de transfectie-efficiëntie wordt vaak bereikt in onze neuronale culturen, zonder bewijs van transfectie-geïnduceerde toxiciteit. Hoewel vrij consistente expressies worden gezien in cellen die GCaMP bevatten, worden subtiel verschillende niveaus van sondeexpressie binnen individuele cellen beschouwd op basis van de methode van individuele regiokwantificering van verandering in baseline fluorescentie in vergelijking met die baseline. Met deze relatief lage efficiëntie is het gebruik van op transfectie gebaseerde methoden voor de introductie van de GCaMP-reporter echter niet van voldoende robuustheid voor grootschalige biologische replicaties voor screeningstudies met hoge doorvoer. Om dit te ondervangen, zijn verschillende variantconstructies commercieel beschikbaar voor lentivirale of adenovirale verpakking of cellijnspecifieke expressie, wat een hogere transductie-efficiëntie mogelijk maakt. Een primaire modificatie die gewenst kan zijn bij het gebruik van deze protocollen is het gebruik van optogenetische stimulatie van neuronen in plaats van badtoepassing van KCl62. Transductie met lentivirale constructies ontworpen om een van de families van nu beschikbare channelrhodopsinen tot expressie te brengen, gevolgd door activering met specifieke golflengten van licht, maakt ruimtelijke controle mogelijk voor depolarisatie van subsets van neuronen en ook voor de evaluatie van het effect van treinen van actiepotentialen op repetitieve calciuminstroomniveaus en uitputting van synaptische blaasjesvoorraden63 . Het is echter essentieel om in gedachten te houden dat het gebruik van deze methode momenteel enigszins beperkt is, omdat de gebruiker ervoor moet zorgen dat hun optogenetische reporter, synaptische reporter en eventuele extra exogene geïntroduceerde eiwitten geen spectrale overlap hebben tussen gebruikte fluoroforen. Een veelvoorkomend probleem bij het oplossen van de styrylkleurstof is passieve intensiteitsvermindering tijdens de basislijnregistratieperiode. Vóór experimentele studies is het van cruciaal belang om de laserintensiteit en foto-opname-intervallen te optimaliseren om fotobleaching-effecten te minimaliseren. Om experimenten in overweging te nemen, is stabilisatie van de intensiteit gedurende ten minste de laatste 30 s van de basislijnperiode noodzakelijk. Raadpleeg tabel 2 en tabel 3 voor veelvoorkomende problemen en hun oplossingen voor respectievelijk experimenten met styrylkleurstof en calciumtransiënt.

De belangrijkste beperking van deze twee methoden is dat culturen slechts in één geval kunnen worden gestimuleerd en onderzocht. Aangezien badtoepassing wordt gebruikt om het depolariserende middel KCl te introduceren, moeten alle neuronen die vanuit die toestand in die schotel moeten worden onderzocht, zich binnen het initiële gezichtsveld van het microscoopobjectief bevinden. Als functionaliteit in de loop van de tijd van belang is, zijn gepaarde culturen vereist. De hierboven genoemde optogenetische methode zal het echter mogelijk maken om calciumdynamiek in de loop van de tijd te observeren, indien gewenst. Bovendien, als neuronen een defect hebben in de recycling van synaptische blaasjes, zal de initiële belasting van de styrylkleurstof worden aangetast. Hoewel interne intensiteitsnormalisatie vergelijking tussen omstandigheden mogelijk maakt, kunnen kleine verschillen in grootte van reacties moeilijk te detecteren zijn. Ten slotte zijn nieuwe iteraties van deze verslaggevers snel beschikbaar gekomen en kunnen ze worden uitgeschakeld voor snellere detectietijden of robuustere resultaten. GCaMP6m wordt bijvoorbeeld niet langer beschouwd als de snelste verslaggever van calciumtransiënten op synaptische terminals. In plaats daarvan kan men de nieuwste generatie jGCaMP864 gebruiken.

De hier beschreven methoden zijn een snelle en betrouwbare manier om te bepalen of genetische of farmacologische manipulatie van neuronen functionele synaptische signalering en afgifte verstoort. De gedetailleerde experimenten zijn minder technisch uitdagend en minder kostbaar dan traditionele spanning/ stroomklem elektrofysiologie en elektronenmicroscopie. Bovendien, terwijl elektrofysiologie van nature een lage doorvoer heeft en op individueel celniveau, zijn de hier beschreven protocollen een hogere doorvoer en snel, waardoor meerdere neuronen tegelijkertijd in beeld kunnen worden gebracht en veel iteraties in één beeldsessie kunnen worden uitgevoerd. Er wordt voorgesteld om deze calciumdynamiek en synaptische afgifteparadigma's te gebruiken als de eerste indicator van synaptische transmissieveranderingen in ALS-modellen en de studie van andere vormen van neuronale degeneratie. Hoewel de conclusies afgeleid van Gcamp6m en styryl dye imaging een specifiek mechanisme van synaptische disfunctie niet precies kunnen uitpluizen, kunnen onderzoekers op basis van dergelijke bevindingen vervolgens gerichte, evidence-based complementaire studies uitvoeren met behulp van traditionele methoden om betrokken kanalen, synaptisch blaasjesnummer of kwantitatieve inhoud te bepalen.

Het nut van deze protocollen is de snelle en eenvoudige beoordeling van veranderingen in de juiste depolarisatie-gemedieerde calciuminstroom en/of synaptische blaasjesfusie in specifieke ALS-modellen. We hebben dit onlangs aangetoond in een publicatie die een verhoogde calciuminstroom en abrogatie van synaptische ontlading in corticale neuronen laat zien die het dipeptide-eiwit (glycine-alanine)50 tot expressie brengen als gevolg van de C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion43. Zoals blijkt uit ons gepubliceerde werk, kunnen deze methoden gemakkelijk worden uitgevoerd in combinatie met co-transfectie van gemuteerde RNA's of eiwitten van belang of in cellen die rechtstreeks uit transgene diermodellen zijn gekweekt43. Bovendien zijn de betrouwbaarheid en robuustheid van deze protocollen met succes getest in neuronaal gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen45, waardoor toekomstige studies rechtstreeks in patiënt-afgeleide ziekterelevante cellen kunnen worden uitgevoerd. In een ander recent manuscript leveren we bewijs dat wild-type motorneuronen een hoge calciuminstroom ondergaan na stimulatie in aanwezigheid van een oplosbare factor die vrijkomt uit mutant FUS die astrocyten tot expressie brengt44. Astrocytische calciumsignaleringsgebeurtenissen zijn ook diep verweven met de synaptische transmissie in naburige neuronen65. Calciumdynamicaprotocol is toegepast om calciumtransiënten van hele cellen te onderzoeken in modellen van astrocytische cultuur, die effectief is gebleken in zowel primaire als menselijke IPS-afgeleide cellen van knaagdieren. Verder begrip van astrocytische calciumdynamica en signalering in ALS-modellen zal waardevol inzicht geven in hoe synaptische transmissie bijgevolg kan worden beïnvloed. Uiteindelijk zal het gebruik van celtype-specifieke GCaMP-verslaggevers ook een krachtig hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van neuronale en astrocytische calciumdynamiek in gemengde co-cultuuromgevingen en specifiek het evalueren van niet-cel-autonome effecten afkomstig van elke celpopulatie.

Ten slotte reikt het potentiële gebruik van deze methoden niet alleen verder dan de studie van ALS, maar ook tot de bredere gebieden van neurodegeneratieve en zelfs ontwikkelingsneurowetenschappen. Gedetailleerde informatie over de specifieke plasmiden die worden gebruikt om de representatieve resultaten te genereren, wordt verstrekt en is succesvol in het transfecteren van plasmiden die veel verschillende genetische varianten van FUS, SOD1 en C9ORF72 hexanucleotideherhalingen en dipeptiden43,44,66,67,68 bevatten. Op voorwaarde dat plasmiden een promotor bevatten die in neuronen wordt gebruikt, is er geen beperking op welke modellen van ALS of degeneratieve ziekte met behulp van deze methoden kunnen worden bestudeerd. Bovendien is transfectie om gemuteerde eiwitten tot expressie te brengen een volledig optionele stap. Culturen gegenereerd uit transgene dieren of menselijke patiënt-afgeleide cellen elimineren de noodzaak om cellen te identificeren die het gemuteerde eiwit van belang bevatten. Momenteel zijn deze systemen beperkt in de manier dat als styrylkleurstof wordt gebruikt, het TRITC-kanaal bezet is en als GcaMP6 wordt gebruikt, het FITC-kanaal bezet is. Technieken die het mogelijk maken om neuronale en astrocytische activiteit in realtime te onderzoeken, verbreden de mogelijkheden voor het begrijpen van tijdsverloopanalyse voor synaptische rijping / degeneratie, evenals snelle tests voor de werkzaamheid van farmacologische verbindingen bij het bevorderen of onderdrukken van neuronale communicatie. Deze twee methoden zijn vatbaar voor hoge doorvoerschaling voor screening. In plaats van neuronen in individuele 35 mm-schotels te platen, kunnen de beeldvormingsparameters van deze twee protocollen op een geautomatiseerde manier worden gebruikt op 96-well-platen. Met behulp van een dergelijk platform kunnen samengestelde bibliotheken snel worden getest op therapeutica, die de invoer van calcium moduleren of de synaptische afgifte verbeteren met behulp van een genetisch ziektemodel of zelfs cellen die rechtstreeks van patiënten zijn afgeleid. Deze methode zou de mogelijkheid van subgroepspecifieke of zelfs gepersonaliseerde therapieën kunnen versnellen door snel kandidaat-moleculen te identificeren voor verder onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Acknowledgments

We willen de huidige en voormalige leden van het Jefferson Weinberg ALS Center bedanken voor kritische feedback en suggesties voor het optimaliseren van deze technieken en hun analyses. Dit werk werd ondersteund door financiering van de NIH (RF1-AG057882-01 en R21-NS0103118 tot D.T.), de NINDS (R56-NS092572 en R01-NS109150 tot P.P), de Muscular Dystrophy Association (D.T.), het Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), de Family Strong 4 ALS foundation en de Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. en P.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Tags

Neurowetenschappen Nummer 173
Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter