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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

Abstract

Avant la dégénérescence neuronale, la cause des déficits moteurs et cognitifs chez les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique (SLA) et / ou de démence du lobe frontotemporal (FTLD) est un dysfonctionnement de la communication entre les neurones et les motoneurones et les muscles. Le processus sous-jacent de transmission synaptique implique la fusion des vésicules synaptiques dépendantes de la dépolarisation membranaire et la libération de neurotransmetteurs dans la synapse. Ce processus se produit par l’afflux localisé de calcium dans les terminaux présynaptiques où résident les vésicules synaptiques. Ici, le protocole décrit des méthodologies d’imagerie en direct basées sur la fluorescence qui rapportent de manière fiable l’exocytose des vésicules synaptiques médiées par la dépolarisation et la dynamique de l’afflux de calcium terminal présynaptique dans les neurones cultivés.

À l’aide d’un colorant stylique incorporé dans les membranes des vésicules synaptiques, la libération des vésicules synaptiques est élucidée. D’autre part, pour étudier l’entrée du calcium, Gcamp6m est utilisé, un rapporteur fluorescent génétiquement codé. Nous utilisons une dépolarisation à haute teneur en chlorure de potassium pour imiter l’activité neuronale. Pour quantifier sans ambiguïté l’exocytose des vésicules synaptiques, nous mesurons la perte de fluorescence normalisée du colorant styryl en fonction du temps. Dans des conditions de stimulation similaires, en cas d’afflux de calcium, la fluorescence de Gcamp6m augmente. La normalisation et la quantification de ce changement de fluorescence sont effectuées de la même manière que le protocole du colorant styryl. Ces méthodes peuvent être multiplexées avec une surexpression basée sur la transfection de protéines mutantes marquées par fluorescence. Ces protocoles ont été largement utilisés pour étudier le dysfonctionnement synaptique dans des modèles de FUS-ALS et de C9ORF72-ALS, en utilisant des corticaux et des motoneurones de rongeurs primaires. Ces protocoles permettent facilement un dépistage rapide des composés susceptibles d’améliorer la communication neuronale. En tant que telles, ces méthodes sont précieuses non seulement pour l’étude de la SLA, mais aussi pour tous les domaines de la recherche en neurosciences neurodégénératives et développementales.

Introduction

La modélisation de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) en laboratoire est rendue particulièrement difficile en raison de la nature extrêmement sporadique de plus de 80 % des cas1, associée au grand nombre de mutations génétiques connues pour être à l’origine de la maladie2. Malgré cela, tous les cas de SLA partagent la caractéristique unificatrice qu’avant la dégénérescence neuronale pure et simple, il existe une communication dysfonctionnelle entre les motoneurones présynaptiques et les cellules musculaires postsynaptiques3,4. Cliniquement, à mesure que les patients perdent la connectivité des motoneurones supérieurs et inférieurs restants, ils présentent des caractéristiques d’hyper- et d’hypoexcitabilité neuronale tout au long de la maladie5,6,7,8,9, reflétant des changements moléculaires sous-jacents complexes à ces synapses, que nous, en tant que chercheurs sur la SLA, cherchons à comprendre.

Plusieurs modèles transgéniques ont montré que la détérioration et la désorganisation de la jonction neuromusculaire se produisent avec l’expression de mutations génétiques responsables de la SLA, y compris SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 et TDP4317,18,19 par des évaluations morphologiques, y compris l’évaluation des boutons synaptiques, des densités de la colonne vertébrale et de l’organisation pré/postsynaptique. Mécaniquement, depuis les articles historiques de Cole, Hodgkin et Huxley dans les années 1930, il a également été possible d’évaluer les réponses synaptiques grâce à des techniques électrophysiologiques dans des cultures cellulaires in vitro ou des préparations de tranches de tissu20. Grâce à ces stratégies, de nombreux modèles de SLA ont démontré des déficits de transmission synaptique. Par exemple, une variante mutante de TDP43 améliore la fréquence de tir et diminue le seuil de potentiel d’action dans les cellules de type moteur-neurone NSC-34 (moelle épinière x neuroblastome hybride lignée 34)21. Cette même variante provoque également une transmission synaptique dysfonctionnelle à la jonction neuromusculaire (NMJ) avant l’apparition de déficits moteurs comportementaux chez un modèle murin22. Il a déjà été démontré que l’expression mutante de FUS entraîne une réduction de la transmission synaptique au NMJ dans un modèle de drosophile de FUS-ALS avant les défauts locomoteurs11. Un rapport récent utilisant des cellules souches pluripotentes induites dérivées de porteurs d’expansion C9orf72 a révélé une réduction du pool facilement libérable de vésicules synaptiques23. Dans l’ensemble, ces études et d’autres soulignent l’importance d’acquérir une compréhension plus complète des mécanismes sous-jacents à la signalisation synaptique dans les modèles de SLA pertinents pour la maladie. Cela sera essentiel pour comprendre la pathobiologie de la SLA et développer des cibles thérapeutiques potentielles pour les patients.

Les méthodes de serrage du courant et de la tension ont été inestimables pour déterminer les propriétés de la membrane telles que la conductance, le potentiel de la membrane au repos et le contenu quantifial des synapses individuelles20,24. Cependant, l’une des limites importantes de l’électrophysiologie est qu’elle est techniquement difficile et ne fournit des informations qu’à partir d’un seul neurone à la fois. La microscopie confocale à cellules vivantes, associée à des sondes fluorescentes spécifiques, offre la possibilité d’étudier la transmission synaptique des neurones de manière spatio-temporelle25,26,27. Bien qu’il ne s’agisse pas d’une mesure directe de l’excitabilité neuronale, cette approche de fluorescence peut fournir une mesure relative de deux corrélations moléculaires de la fonction synaptique: la libération de vésicules synaptiques et les transitoires calciques aux terminaux synaptiques.

Lorsqu’un potentiel d’action atteint la région terminale présynaptique des neurones, des transitoires calciques sont déclenchés, facilitant la transition d’un signal électrique au processus de libération de neurotransmetteurs28. Les canaux calciques voltage-dépendants localisés dans ces zones régulent étroitement la signalisation du calcium pour moduler la cinétique de libération de neurotransmetteurs29. Les premiers enregistrements basés sur la fluorescence des transitoires de calcium ont été effectués à l’aide de l’indicateur à double longueur d’onde Fura-2 AM ou du colorant à longueur d’onde unique Fluo-3 AM30,31,32. Bien que ces colorants aient offert de nouvelles perspectives à l’époque, ils souffrent de plusieurs limitations telles que le compartimentage non spécifique au sein des cellules, la perte de colorant actif ou passif des cellules marquées, le photoblanchiment et la toxicité s’ils sont imagés sur de longues périodes de temps33. Au cours de la dernière décennie, les indicateurs de calcium génétiquement codés sont devenus les chevaux de bataille pour l’imagerie de diverses formes d’activité neuronale. Ces indicateurs combinent une protéine fluorescente modifiée avec une protéine chélateur de calcium qui change rapidement d’intensité de fluorescence après la liaison des ions Ca2+34. L’application de ces nouveaux indicateurs est vaste, permettant une visualisation beaucoup plus facile des transitoires de calcium intracellulaires à la fois in vitro et in vivo. Une famille de ces rapporteurs génétiquement codés, connue sous le nom de GCaMP, est maintenant largement utilisée. Ces indicateurs contiennent un domaine de calmoduline C-terminal, suivi d’une protéine fluorescente verte (GFP), et sont coiffés d’une région de liaison à la calmoduline N-terminale35,36. La liaison du calcium au domaine de la calmoduline déclenche une interaction avec la région de liaison à la calmoduline, entraînant un changement conformationnel de la structure protéique globale et une augmentation substantielle de la fluorescence de la fraction GFP35,36. Au fil des ans, cette famille de rapporteurs a subi plusieurs évolutions pour permettre des lectures distinctes pour des transitoires de calcium particuliers avec une cinétique spécifique (lente, moyenne et rapide), chacune avec des propriétés légèrement différentes37,38. Ici, l’utilisation du rapporteur GcaMP6 a été mise en évidence, qui a déjà été montré pour détecter les potentiels d’action unique et les transitoires de calcium dendritique dans les neurones à la fois in vivo et in vitro37.

Les transitoires calciques dans la région présynaptique déclenchent des événements de fusion des vésicules synaptiques, provoquant la libération de neurotransmetteurs dans la synapse et l’initiation d’événements de signalisation dans la cellule postsynaptique28,39. Les vésicules synaptiques sont à la fois rapidement libérées et recyclées, car la cellule maintient homéostatiquement une surface de membrane cellulaire stable et un pool facilement libérable de vésicules membranaires capables de fusion40. Le colorant styryl utilisé ici a une affinité pour les membranes lipidiques et modifie spécifiquement ses propriétés d’émission en fonction de l’ordre de l’environnement lipidique environnant41,42. C’est donc un outil idéal pour marquer les vésicules synaptiques de recyclage et le suivi ultérieur de ces vésicules telles qu’elles sont libérées plus tard après une stimulation neuronale41,42. Le protocole qui a été généré et optimisé est une adaptation des concepts décrits initialement par Gaffield et ses collègues, ce qui nous permet de visualiser en continu les puncta de vésicules synaptiques marquées par un colorant styryl au fil du temps41.

Ici, deux méthodologies connexes basées sur la fluorescence sont décrites, rapportant de manière fiable des événements cellulaires spécifiques impliqués dans la transmission synaptique. Des protocoles ont été définis pour sonder la dynamique de l’afflux de calcium terminal présynaptique médié par la dépolarisation et de l’exocytose des vésicules synaptiques dans les neurones en culture. Ici, les méthodes et les résultats représentatifs sont axés sur l’utilisation de corticaux ou de motoneurones primaires de rongeurs comme système de modèle in vitro, car il existe des études publiées utilisant ces types de cellules43,44. Cependant, ces méthodes sont également applicables aux neurones corticaux i3 humains différenciés45, car nous avons également eu du succès avec les deux protocoles dans l’expérimentation actuellement en cours dans notre laboratoire. Le protocole général est décrit dans un format linéaire par étapes, illustré à la figure 1. En bref, pour étudier la dynamique du calcium dans les neurites, les neurones matures sont transfectés avec de l’ADN plasmidique pour exprimer le rapporteur fluorescent GCaMP6m sous un promoteur de cytomégalovirus (CMV)37,46. Les cellules transfectées ont un faible niveau de fluorescence vert basal, ce qui augmente en présence de calcium. Les régions d’intérêt sont spécifiées pour surveiller les changements de fluorescence tout au long de notre manipulation. Cela permet de mesurer des fluctuations de calcium très localisées dans l’espace et dans le temps37,46. Pour évaluer la fusion et la libération des vésicules synaptiques, les neurones matures sont chargés de colorant styryl incorporé dans les membranes des vésicules synaptiques au fur et à mesure qu’ils sont recyclés, reformés et rechargés en neurotransmetteurs dans les cellules présynaptiques41,42,43,47,48. Les colorants actuels utilisés à cette fin marquent les vésicules synaptiques le long des neurites et sont utilisés comme proxy pour ces régions dans des expériences d’imagerie en direct, comme l’ont montré la co-coloration du colorant styryl et de la synaptotagmine par Kraszewski et ses collègues49. Sont incluses ici des images représentatives de taches similaires qui ont également été effectuées (Figure 2A). Des chercheurs antérieurs ont largement utilisé ces colorants pour rapporter la dynamique des vésicules synaptiques à la jonction neuromusculaire et aux neurones de l’hippocampe48,49,50,51,52,53,54,55,56 . En sélectionnant les régions ponctuées des vésicules chargées de colorant et en surveillant les diminutions de l’intensité de fluorescence après la libération des vésicules, la capacité de transmission synaptique fonctionnelle et la dynamique temporelle de libération peuvent être étudiées après stimulation43. Pour les deux méthodes, un milieu contenant une forte concentration de chlorure de potassium est utilisé pour dépolariser les cellules afin d’imiter l’activité neuronale. Les paramètres d’imagerie sont spécifiés pour capturer des intervalles inférieurs à la seconde couvrant une normalisation de base suivie de notre période de capture de stimulation. Les mesures de fluorescence à chaque point temporel sont déterminées, normalisées à l’arrière-plan et quantifiées au cours de la période expérimentale. L’augmentation de la fluorescence GCaMP6m médiée par l’afflux de calcium ou la diminution efficace de l’exocytose de la vésicule synaptique par la libération de colorant styryl peut être détectée grâce à cette stratégie. La configuration méthodologique détaillée et les paramètres de ces deux protocoles ainsi qu’une discussion sur leurs avantages et leurs limites sont décrits ci-dessous.

Figure 1
Figure 1 : Rendu visuel de l’ensemble du processus général du protocole. (1) Isoler et cultiver les neurones primaires des rongeurs in vitro jusqu’au point de temps de maturation choisi. (2) Introduire l’ADN GCaMP ou le colorant styryl comme rapporteurs de l’activité synaptique. (3) Configurer le paradigme de l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal équipé d’imagerie en direct et du logiciel associé. Commencez la période d’enregistrement de référence. (4) Pendant que les cellules subissent encore une capture d’images en direct, stimulez les neurones via une perfusion de bain KCl élevée. (5) Évaluer les mesures d’intensité de fluorescence au fil du temps pour mesurer les transitoires calciques ou la fusion des vésicules synaptiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

Toutes les procédures animales effectuées dans le cadre de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Jefferson.

1. Culture primaire de neurones du cortex embryonnaire du rat

REMARQUE: Les neurones corticaux primaires sont isolés à partir d’embryons de rats E17.5 comme décrit précédemment57,58. Aucun biais de souche ne semble exister avec le succès de ce protocole de culture. Cette méthode est décrite brièvement ci-dessous. Les articles précédents indiqués doivent être référencés pour plus de détails.

  1. Euthanasier les femelles gravides par inhalation de CO2 suivie d’une confirmation secondaire par luxation cervicale.
  2. Récoltez des embryons et isolez les cerveaux dans une solution saline équilibrée (HBSS) de Hank tamponnée hePES glacée de 20 mM. De la coquille externe du cortex, séparez puis jetez le striatum et l’hippocampe. Collectez les cortices.
  3. Utilisez des pinces fines pour enlever les méninges des cortex. Pour ce faire, maintenez le cortex en place avec une paire de pinces fermées en utilisant une légère pression.
    REMARQUE: Avec la deuxième paire de pinces dans la trotteuse, pincez les méninges. Pelez les méninges en utilisant un mouvement de roulement avec une paire pincée. Repositionnez avec les pinces fermées et répétez si nécessaire jusqu’à ce que les méninges soient entièrement enlevées.
  4. Incuber des cortices avec 10 μg/mL de papaïne dans hbSS pendant 4 min à 37 °C.
  5. Laver trois fois dans HBSS, puis triturer doucement 5 à 10 fois avec une pipette Pasteur en verre poli au feu pour obtenir une suspension cellulaire homogène.
    REMARQUE: Évitez les bulles; maintenir la pipette dans la suspension de la cellule.
  6. Neurones de plaque sur des boîtes de 100 μg/mL recouvertes de poly-D-lysine à fond de verre de 35 mm à une densité de 75 000 cellules/plat en milieu neurobasal avec supplément de B27 (2%) et pénicilline-streptomycine.

2. Culture primaire de motoneurones de la moelle épinière embryonnaire de rat

REMARQUE: Les motoneurones primaires sont préparés à partir d’embryons de rats E13.5 comme décrit précédemment, avec peu de modifications59,60. Aucun biais de souche ne semble exister avec le succès de ce protocole de culture. Cette méthode est décrite brièvement ci-dessous. Les articles précédents indiqués doivent être référencés pour plus de détails.

  1. Euthanasier les rates femelles gravides comme à l’étape 1.1.
  2. Disséquez 10 à 20 moelles épinières d’embryons et divisez en petits fragments mécaniquement à l’aide de deux paires de pinces pour pincer et tirer, respectivement.
  3. Incuber dans 0,025% de trypsine pendant 8 min, suivi de l’ajout de DNase à 1 mg / mL.
  4. Centrifuger à travers un coussin BSA de 4 % p/v à 470 x g pendant 5 min à 4 °C sans rupture.
  5. Centrifuger les cellules granulées pendant 55 min à 830 x g à 4 °C sans frein à travers un coussin de gradient de densité de 10,4 % (v/v) (voir Tableau des matériaux). Portez la bande de motoneurones vers l’avant à l’interface visuelle.
    REMARQUE: Pour assurer la capture de toutes les cellules, utilisez des milieux sans phénol pour l’étape de gradient de densité et des milieux contenant du phénol pour toutes les autres étapes. L’interface du gradient de densité et du support de dissociation est facilement identifiable en fonction de la différence de couleur.
  6. Faites tourner les bandes collectées à travers un autre coussin BSA de 4 % p/v à 470 x g pendant 5 min à 4 °C sans pause.
  7. Remettre en suspension les motoneurones purifiés en milieu neurobasal complet avec un supplément de B27 (2%), de la glutamine (0,25%), du 2-mercaptoéthanol (0,1%), du sérum de cheval (2%) et de la pénicilline-streptomycine.
  8. Neurones de plaque sur 100 μg/mL de poly-lysine et 3 μg/mL de couvercles recouverts de laminine à une densité de 50 000 cellules/plat à fond de verre de 35 mm.

3. Transfections neuronales

REMARQUE: Cette étape est effectuée pour les neurones qui subiront une imagerie calcique GCaMP et / ou les neurones dans lesquels un plasmide d’ADN exogène ou un ARN d’intérêt est introduit avant l’évaluation synaptique. En revanche, le colorant styryl est chargé juste avant la séance d’imagerie et est traité à la section 6. Le résumé ci-dessous est le protocole de transfection utilisé pour les neurones primaires des rongeurs dans les exemples présentés, mais il peut facilement être adapté et optimisé aux besoins de l’utilisateur.

  1. Les transfections des neurones corticaux primaires en culture se produisent au jour 12 in vitro (DIV 12), tandis que les motoneurones sont transfectés au jour 7 in vitro (DIV 7).
    REMARQUE: Toutes les étapes suivantes se produisent dans une armoire de biosécurité aseptique.
  2. Transfect 500 ng de GCaMP6m en utilisant un réactif de transfection à un rapport de 1:2 en volume. Pour les co-transfections, ajoutez un total de 1,25 μg d’ADN total / plat, en maintenant ce rapport ADN / réactif.
    NOTE: Dans les exemples expérimentaux montrés, 750 ng de plasmide d’intérêt lié à la SLA / FTD ont été transfectés pour exprimer des dipeptides liés à la SLA C9orf72, une protéine FUS mutante, etc. Assurez-vous que l’étiquette fluorescente du plasmide co-transfecté n’entrera pas en conflit avec le canal FITC de l’imagerie GCaMP. De même, si vous effectuez une imagerie de colorant styryl, assurez-vous que le plasmide co-transfecté n’entrera pas en conflit avec le canal d’imagerie TRITC. L’utilisation de la synaptophysine-GCaMP3 est tout aussi efficace dans ce protocole. Par conséquent, transfectez la même quantité de ce plasmide et suivez toutes les étapes comme d’habitude dans la section 7.
  3. Incuber le complexe de réactif de transfection ADN à température ambiante pendant 10 min.
  4. Ajoutez doucement le complexe incubé aux neurones goutte à goutte avec tourbillon. Remettre le plat dans l’incubateur à CO2 à 37 °C pendant 45-60 min.
  5. Retirer tout le milieu de culture contenant le complexe de réactif de transfection ADN et le remplacer par une préparation de 50 à 50 par volume de milieux neuronaux préconditionnés et frais. Ensuite, remettez les cellules dans l’incubateur à CO2 pendant 48 h jusqu’à l’imagerie.

4. Préparation de solutions tampons et de solution mère de colorant styryl

  1. Préparer des solutions de CSF faible et élevée fraîches avant l’imagerie à l’aide des ingrédients énumérés dans le tableau 1. Filtrez les deux solutions tampons avant utilisation.
    REMARQUE: CaCl2 dihydraté peut former Ca(OH)2 lors du stockage. Pour une efficacité maximale, utilisez toujours un récipient récemment ouvert. Si cela n’est pas possible, pour éliminer le Ca(OH)2 de la surface externe et assurer une solubilité maximale, les solutions peuvent être gazéifiées avec du CO2 gazeux pendant 5 min avant l’ajout de CaCl2 . Si cette étape est franchie, ajustez le pH de la solution résultante pour maintenir une valeur de pH de 7,4, car une carbonatation excessive entraînera la formation de Ca(HCO3)2 .
Tampon aCSF KCL faible (pH de 7,40 à 7,45)
Réactif Concentration
HEPES 10 mM
NaCl 140 mM
Kcl 5 mM
Glucose 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM
Tampon ACSF KCL élevé (pH de 7,40 à 7,45)
Réactif Concentration
HEPES 10 mM
NaCl 95 mM
Kcl 50 mM
Glucose 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM

Tableau 1 : Composition des tampons du liquide céphalo-rachidien artificiel (CSPa). Ce tableau comprend les ingrédients pour préparer des tampons de liquide céphalorachidien artificiel faible et élevé en KCl utilisés lors de l’imagerie et de la stimulation des neurones. Voir rubrique 4 pour les instructions de préparation.

  1. Préparer une solution mère de colorant styryl en prenant un flacon de 100 μg de colorant et en le reconstituant à une concentration de 10 mM avec de l’eau distillée ou un milieu neurobasal.

5. Configuration du microscope et du système de perfusion

REMARQUE: Pour l’imagerie des boîtes de Petri à fond de verre, un microscope à fluorescence confocale inversée est préféré en raison de la flexibilité de la perfusion et de l’utilisation d’un objectif d’immersion dans l’huile à grande ouverture numérique. Reportez-vous à la Table des matériaux pour le microscope confocal, la caméra et les objectifs utilisés pour l’imagerie d’exemples détaillés dans la section Résultats représentatifs .

  1. Effectuez toutes les expériences à 37 °C avec des niveaux constants de CO2 de 5 % à l’aide d’un support d’étage couplé à un système d’incubateur.
  2. Contrôlez l’acquisition d’images à l’aide d’un logiciel confocal. Optimisez les paramètres d’acquisition au début de la séance d’imagerie pour choisir la puissance d’excitation et le gain afin d’assurer une visualisation optimale des signaux sans photoblanchiment.
    1. Maintenez la puissance d’excitation, le temps d’exposition, le gain du détecteur et la fréquence d’images constants sur tous les échantillons. Effectuez une imagerie time-lapse en utilisant un rapport d’aspect de 512 x 512 et une fréquence d’images de 2 images / s pour minimiser le blanchiment de la teinture.
      REMARQUE: Bien que les ponctuations doivent être clairement visibles, l’intensité du laser doit être réglée au minimum possible pour éviter le blanchiment et la phototoxicité. Réglez l’ouverture confocale sur le réglage le plus étroit pour obtenir une résolution optimale des puncta fluorescents dans les neurites. Le temps d’exposition est réglé sur 200 ms ou moins, ce qui est cohérent entre les échantillons. La vitesse d’imagerie maximale de la caméra utilisée était de 2 images/s. Si vous utilisez un appareil photo plus rapide, plus d’images peuvent être prises. Les paramètres d’imagerie temporelle doivent être choisis si possible.
  3. Sélectionnez les combinaisons de filtres d’excitation/dichroïque/émission de fluorescence suivantes pour l’imagerie à l’aide d’un logiciel confocal : Gcamp6m/Gcamp3 avec FITC et colorant styryl avec TRITC, respectivement.
  4. Utilisez la fonction de mise au point parfaite du logiciel d’acquisition d’imagerie confocale pendant l’imagerie accélérée pour éviter la dérive z.
    REMARQUE: En raison de la vitesse rapide de l’imagerie, un seul plan est imagé. Il est très important de s’assurer de l’absence de dérive z pendant l’expérience.
  5. Sélectionnez l’onglet Heure dans le panneau d’acquisition d’image pour définir les périodes et les intervalles d’enregistrement.
    1. Réglez la phase #1 sur Intervalle 500 ms, Durée 3 - 5 min.
    2. Réglez la phase #2 sur Intervalle 500 ms, Durée 5 min.
      REMARQUE: La phase #1 correspond à l’enregistrement de base, la phase #2 à la période de stimulation, respectivement.
  6. Assemblez un appareil de perfusion par gravité pour aCSF à l’aide d’un système de commande de vanne et d’un collecteur de canaux.
    1. Chargez un KCl élevé (voir tableau 1) dans une seringue de 50 mL située au sommet de l’appareil, avec des tubes traversant le système. Réglez le débit sur 1 mL/min.
  7. Chargez une boîte en verre de 35 mm contenant des neurones sur l’étage d’imagerie confocale, avec l’extrémité du tube de perfusion placée au bord de la boîte. Choisissez le champ d’imagerie.

6. Imagerie par colorant styryl de la libération des vésicules synaptiques

  1. Incuber des cellules dans un CSAf à faible KCl (voir tableau 1) pendant 10 min à 37 °C, 48 h après la transfection.
  2. Chargez les neurones corticaux ou moteurs primaires sur des boîtes de Petri à fond de verre avec un colorant styryl.
    1. Éliminer le KCl aCSF faible par aspiration.
    2. Utilisez une pipette pour charger les neurones dans l’obscurité avec 10 μM de colorant styryl dans un CSF contenant 50 mM de KCl pendant 5 min.
    3. Retirer la solution de charge et les neurones de bain dans un faible KCl aCSF pendant 10 minutes pour éliminer la charge de colorant non spécifique.
  3. Placez la parabole à fond de verre de 35 mm sur la scène d’imagerie, puis observez soit sous un objectif d’air 20x, soit sous un objectif d’immersion dans l’huile 40x d’un microscope confocal inversé.
    REMARQUE: Utilisez la fluorescence GFP pour localiser les cellules transfectées dans le cas de cellules co-transfectées avec un plasmide marqué GFP.
  4. Excitez le colorant styryl à l’aide d’un laser de 546 nm, collectez les émissions à l’aide d’un filtre passe-bande de 630-730 nm (TRITC).
  5. Sélectionnez le champ d’imagerie et engagez une mise au point parfaite. Ensuite, prenez une seule image fixe avec des canaux de champ lumineux, triTC et marqueurs de fluorescence pour marquer les limites neuronales.
  6. Lancez Exécuter maintenant dans le logiciel d’acquisition. Effectuez l’enregistrement basal pendant 3 à 5 minutes pour exclure les variations d’intensité du colorant, le cas échéant (phase #1).
    REMARQUE: Il est essentiel de s’assurer que toute diminution de l’intensité du colorant est due à la libération de vésicules synaptiques et non à la diffusion passive du colorant ou au photoblanchiment. Cette période de pré-stimulation de 3 à 5 minutes devrait se traduire par un niveau d’intensité de colorant stable et maintenu. Les 30 dernières secondes de cet enregistrement seront utilisées pour déterminer une valeur de fluorescence de référence moyenne pour chaque retour sur investissement. Avant d’évaluer les conditions expérimentales, une condition supplémentaire de non-stimulation d’environ 10 minutes d’enregistrement continu à l’aide des paramètres d’acquisition prévus peut également être effectuée pour assurer des valeurs de fluorescence stables en utilisant les paramètres laser pendant une période prolongée.
  7. Au passage à la phase #2, déclenchez le bouton du système de perfusion. Ensuite, perfuser constamment 50 mM KCl aux neurones pour faciliter le déchargement des colorants (Phase #2).
    1. Effectuer des enregistrements pendant 300 s après l’ajout de KCl. Après cela, l’acquisition s’arrête; déclencher l’interrupteur Off du système de perfusion.
  8. Enregistrez l’expérience et analysez les données à l’aide d’un logiciel confocal comme décrit dans la section 8 ci-dessous.
    REMARQUE: L’expérience peut être arrêtée à ce stade et l’analyse peut être effectuée ultérieurement. Dans le cas où les cellules ne nécessitent pas de transfection pour l’expression de protéines d’intérêt, ce protocole peut être effectué à tout moment in vitro lorsque l’on cherche à examiner la fonctionnalité du déchargement synaptique. Après un test des cellules témoins pour assurer un déchargement synaptique approprié, l’expérimentateur doit être aveuglé par les conditions génétiques ou pharmacologiques de chaque plat testé afin de minimiser les biais.

7. Imagerie par fluorescence des transitoires calciques Gcamp6m

  1. Transfecter les neurones corticaux primaires des rongeurs cultivés sur des boîtes à fond de verre de 35 mm avec 500 ng de Gcamp6m comme indiqué à la section 3.
    REMARQUE: Si vous le souhaitez, co-transfectez les neurones avec un plasmide d’intérêt contenant une étiquette fluorescente dans la gamme rouge ou rouge lointain.
  2. Incuber les neurones avec un faible KCl aCSF pendant 15 min 48 h après la transfection, puis monter la parabole sur la plate-forme d’imagerie.
  3. Visualisez la fluorescence GCaMP6m à l’aide d’un filtre FITC (488 nm) et d’un objectif 20x ou 40x.
  4. Sélectionnez le champ d’imagerie et engagez une mise au point parfaite. Ensuite, prenez une seule image fixe avec des canaux de champ lumineux, de FITC et de marqueurs de fluorescence pour marquer les limites neuronales.
  5. Lancez Exécuter maintenant dans le logiciel d’acquisition. Effectuez l’enregistrement de base pendant 5 minutes, puis perfusez avec un CSF contenant 50 mM de KCL de la même manière que celle décrite à la section 6 pour les expériences de colorant styryl.
    NOTE: Le but de cette imagerie est de mesurer les transitoires de calcium évoqués. Si un neurone a une activité de déclenchement basale et des flux de calcium pendant la période de pré-stimulation, il n’est pas utilisé dans l’analyse des données. Au lieu de cela, seules les cellules avec une fluorescence de fond stable sont utilisées. Les périodes post-stimulation peuvent également être prolongées jusqu’à 60 minutes pour les transitoires de calcium, avec ou sans perfusion continue supplémentaire de KCl élevé.
  6. Enregistrez l’expérience et analysez les données à l’aide d’un logiciel confocal comme décrit dans la section 8 ci-dessous. L’expérience peut être arrêtée à ce stade, et l’analyse peut être effectuée plus tard.
    REMARQUE: Si les cellules ne nécessitent pas de transfection pour l’expression des protéines d’intérêt, ce protocole peut être effectué à tout moment in vitro lors de l’examen des transitoires calciques. Après un test des cellules témoins pour assurer la mesure des transitoires de calcium, l’expérimentateur doit être aveuglé par les conditions génétiques ou pharmacologiques de chaque plat testé afin de minimiser les biais.

8. Analyse d’images

  1. Ouvrez des images time-lapse avec un logiciel confocal.
  2. Aligner les images en série time-lapse par la série de commandes : Image | | de traitement Aligner le document actif. Sélectionnez Aligner sur la première image.
  3. Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) le long des neurites à l’aide de l’outil de sélection du retour sur investissement, une icône en forme de haricot à droite du cadre de l’image (Figure 3B). Marquez également un retour sur investissement représentant l’intensité de fluorescence de fond.
    REMARQUE: Les ROI sont sélectionnés en choisissant des zones de ponctuation distinctement séparées le long des pistes neuronales indiquées par l’image fixe en champ lumineux. Au moins cinq ROI par neurone sont choisis pour l’analyse. Le retour sur investissement d’arrière-plan est choisi dans une région du champ de vision qui ne contient pas de neurites.
  4. Mesurez la fluorescence brute au fil du temps pour les rois sélectionnés à l’aide des séries de commandes suivantes : Mesurer | Mesure du temps.
    1. Lancez la fonction Mesure dans la partie supérieure du panneau Mesure du temps . Une représentation graphique de la fluorescence brute au fil du temps (Figure 3C) et des données quantitatives sont toutes deux générées.
      REMARQUE : Chaque point de données représente la fluorescence brute de ce retour sur investissement pour la trame associée à ce point de temps mesuré spécifique.
  5. Exportez les intensités de fluorescence brutes vers le tableur.
  6. Analysez chaque retour sur investissement indépendamment. Tout d’abord, normalisez les données en soustrayant l’intensité du retour sur investissement de fond du retour sur investissement de l’intensité des intérêts à chaque point temporel.
    1. Prenez la valeur de fluorescence brute du retour sur investissement de fond à chaque point temporel spécifique et soustrayez-la de la valeur d’intensité brute du retour sur investissement d’intérêt à ce point temporel.
      REMARQUE: Ceci est fait pour toute la période d’enregistrement, à la fois les phases basales et de stimulation.
  7. Déterminez le retour sur investissement moyen de l’intensité des intérêts pour les 30 dernières années de référence.
    1. Moyenne des valeurs basales brutes normalisées générées à l’étape 8,6 à partir des 30 dernières s de la période d’enregistrement basal de 3 à 5 minutes.
      REMARQUE: Toute la période d’enregistrement basal pourrait être utilisée pour générer cette valeur. Cependant, à mesure que cette valeur se stabilise et est maintenue, les 60 points temporels des 30 dernières s sont d’une taille d’échantillonnage suffisante pour représenter l’ensemble.
  8. Comparez cette valeur de référence à la valeur d’intensité normalisée à chaque point temporel, générant un changement de la valeur de fluorescence (ΔF).
    1. Prenez la valeur de l’étape 8.7 et soustrayez la valeur fluorescente de base moyenne. Effectuez cette étape et les étapes suivantes pendant toute la période d’enregistrement, à la fois les phases basales et de stimulation.
  9. Calculer ce changement concernant la valeur de fluorescence de base, générant un changement de fluorescence/fluorescence de base (ΔF/F). Pour ce faire, prenez la valeur de l’étape 8.8 et divisez-la par la valeur fluorescente de base moyenne.
  10. Enfin, définissez la valeur du point de départ sur 1 afin que les augmentations ou les diminutions puissent être facilement visualisées graphiquement au fil du temps.
    1. Prenez la valeur générée à l’étape 8.9 et ajoutez 1.
      REMARQUE : Lorsque cela est fait correctement, les 30 s de valeurs de la période de référence doivent se situer près de la valeur de 1. Dans les cellules libérant efficacement du contenu synaptique, cette valeur devrait varier de 1 à 0 après le début de la stimulation. Un exemple des étapes 6 à 9 est présenté à la figure 3E.

9. Analyse des données

REMARQUE : L’expérimentateur peut être insensible aux conditions expérimentales pour regrouper les données à des fins d’analyse appropriées. Utilisez une taille d’échantillon d’au moins 10 neurones par condition de chacune des trois expériences indépendantes. Ne considérez les neurones pour l’inclusion que si au moins cinq régions de retour sur investissement peuvent être désignées. Ce niveau de réplication expérimentale était suffisant dans les études publiées pour démontrer une perte profonde de déchargement synaptique dans les cellules contenant des poly-GA liées à la SLA par rapport aux témoins GFP (voir Résultats représentatifs). Toutefois, si un phénotype plus subtil est observé, le nombre de répliques biologiques et/ou techniques peut nécessiter une optimisation de la part de l’utilisateur.

  1. En utilisant toutes les valeurs ΔF/F calculées au fil du temps à partir des ROI d’une condition expérimentale donnée, déterminez une valeur moyenne ΔF/F pour chaque point temporel avec un MEB.
  2. Tracez les données à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et de statistiques au format xy, où x est le temps écoulé et y est la valeur ΔF/F calculée à l’étape 9.1. Présentez toutes les valeurs sous forme de moyenne ± SEM.
  3. Pour déterminer la signification statistique, utilisez le test t de Student pour comparer deux groupes et l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivi de l’analyse posthoc de Tukey pour comparer trois groupes ou plus.

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Representative Results

Après la mise en œuvre réussie du protocole ci-dessus, des résultats représentatifs sont présentés pour une expérience typique de libération de vésicules synaptiques de colorant styryl. Les neurones corticaux primaires de rats cultivés ont été chargés de colorant à l’aide de la méthode décrite à la rubrique 6. La spécificité de la charge en colorant a été déterminée par co-marquage avec la synaptophysine, marqueur de vésicule synaptique. La majorité des colorants de styryl positifs sont co-positifs pour ce marqueur (Figure 2A). Pour déterminer si les paramètres utilisés pour l’imagerie des colorants styryl provoquent un photoblanchiment, généralement, un puits non traité est chargé de colorant et imagé pendant une période prolongée de 10 minutes sans stimulation pour s’assurer que les valeurs de fluorescence restent constantes.

De plus, les résultats sont à nouveau présentés à l’aide du co-marquage de la synaptophysine et du colorant styryl comme dans la figure 2A. Ces fluorophores ont été co-imagés en utilisant le paradigme indiqué à la section 6 pour l’imagerie des colorants styryl triTC, plus une double capture de la fluorescence de la synaptophysine en utilisant une puissance laser de haute intensité sur le canal DAPI pour visualiser la mTurquoise-synaptophysine. On y voit des images représentatives des régions synaptiques avant et après la stimulation (figure 2B). Bien que cette méthode soit une inférence indirecte pour l’absence de photoblanchiment, l’analyse des valeurs d’intensité brute sur toute la période d’imagerie révèle que l’intensité de la synaptophysine reste constante, tandis que l’intensité du colorant styryl diminue après la stimulation (Figure 2C). Ainsi, en prenant cette expérience et nos autres contrôles de fluorescence stable avant la stimulation et sur de longues périodes dans des puits non stimulants, nous avons établi que les diminutions de la fluorescence du styryl peuvent être attribuées au déchargement synaptique par dépolarisation KCl plutôt qu’à des effets de photoblanchiment.

Figure 2
Figure 2 : Évaluation de la spécificité et des paramètres d’imagerie de l’étiquetage des colorants styryl. (A) Une image représentative 40x d’un neurone cortical de rat marqué par un colorant styryl (rouge), qui a été transfecté 24 heures auparavant avec un plasmide pour exprimer mTurquoise2-synaptophysine61 chassé du promoteur de synapsine (vert). La colocalisation de ces deux fluorophores indique qu’une grande majorité des puncta positifs au colorant styryl sont co-colorés avec la synaptophysine marqueur de la vésicule synaptique. La barre d’échelle indique 5 μm. (B) Les neurones corticaux ont été transfectés et le colorant styryl chargé comme dans (A) et imagé selon le paradigme du colorant styryl avec la double capture de fluorescence de la mTurquoise-synaptophysine sur le canal DAPI. Des images représentatives montrent les régions de synaptophysine et de colorant styryl puncta avant et après la stimulation. La barre d’échelle indique 5 μm. (C) La fluorescence a été surveillée au fil du temps pour la synaptophysine (canal DAPI supérieur) et le colorant styryl (canal FITC inférieur). L’intensité de la synaptophysine a été maintenue à une fluorescence constante pendant la période d’imagerie et de stimulation, tandis que la fluorescence du colorant styryl a diminué à mesure que le colorant était déchargé lors de la stimulation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Des images représentatives montrent le chargement du colorant styryl pendant l’imagerie, avec la sélection des ROI (Figure 3A-B). L’intensité de fluorescence brute des ROI sélectionnés et un retour sur investissement de fond sont tracés à l’aide du logiciel confocal (Figure 3C). Les neurones montrés ici ont également été transfectés avec des plasmides pour étudier les effets des protéines dipeptides produites dans le contexte de C9ORF72-ALS, à savoir FLAG-eGFP et FLAG-GA50-eGFP chassés du promoteur T7. La libération réussie des vésicules synaptiques entraîne une perte frappante de fluorescence du colorant lors d’une dépolarisation élevée du KCl (Figure 3D, deux panneaux supérieurs) pour un neurone témoin transfecté par GFP. Une vidéo représentative incluse ici montre comment cela apparaît pendant l’imagerie. De plus, un neurone décharge sélectivement le colorant styryl dans une région de neurite après stimulation (vidéo 1).

D’autre part, l’altération de la transmission synaptique est représentée par la fluorescence de colorant retenue même après une dépolarisation élevée de KCl dans les neurones transfectés avec une construction de répétition de dipeptide liée à C9ORF72 (GA50) (Figure 3D, deux panneaux inférieurs)43. Après l’analyse quantitative des données (figure 3E), les données sont représentées sous forme d’intensité du colorant tout au long de l’imagerie pour les groupes témoin (GFP) et ALS/FTD (GA50) (Figure 3F)43. Cette méthode peut également analyser les effets intermédiaires et n’est pas simplement une mesure binaire « tout ou rien ». Dans des expériences conçues pour sauver les déficits synaptiques médiés par GA50, la protéine 2 associée aux vésicules synaptiques exogènes (SV2) a été introduite par transduction lentivirale à l’aide du plasmide rSV2a-eGFP-pRRL chassé du promoteur PGK humain. Après l’imagerie et l’analyse décrites ci-dessus, le déclenchement synaptique a été sauvé dans les neurones co-exprimant GA50 et SV2 (Figure 3G).

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de la libération de vésicules synaptiques par marquage de colorant styryl. (A) Image représentative 40x d’un neurone marqué par un colorant styryl dans un milieu à faible KCl aCSF au début d’une expérience d’imagerie. La barre d’échelle indique 20 μm. (B) Représentation de la génération de retour sur investissement sur l’image à partir de (A). Des régions de ponctuation spécifiques le long des neurites (#1-4) sont choisies à l’aide de l’outil ROI, le bouton en forme de haricot mis en évidence à droite. Un retour sur investissement final (#5) est sélectionné dans une région vide pour capturer l’intensité du signal d’arrière-plan. Les zones avec des points lumineux non spécifiques et non neuronaux sont évitées. La barre d’échelle indique 20 μm. (C) Représentation des intensités de signal pour les ROI #1-5 de (B) au fil du temps sous forme de graphique/représentée par un logiciel confocal. (D) Représentations visuelles des régions ROI pré/post-stimulation pour un neurone qui subit efficacement une transmission synaptique (deux panneaux supérieurs). Les deux panneaux inférieurs sont des images agrandies avec un seuil impartial appliqué pour isoler puncta de l’arrière-plan afin de montrer visuellement des régions distinctes. Les neurones contenant du GFP subissent efficacement une libération synaptique, tandis que l’expression du peptide GA50 lié à la SLA C9ORF2 empêche cet effet. Les barres d’échelle indiquent 10 μm-Réimprimé de Jensen et al. 202043. (E) Exemple d’un fichier de quantification utilisant un tableur, montrant la normalisation des valeurs par rapport à la ligne de base et la génération de valeurs ΔF/F au fil du temps. Les données sont d’abord normalisées à la valeur d’intensité du retour sur investissement en arrière-plan à chaque point temporel. Cette valeur est ensuite comparée à la valeur de référence moyenne du roi d’intérêt pour les 30 dernières s pré-stimulation (présentée ici sous forme d’intervalles de 10 s en 1 s pour plus de simplicité) (ΔF). Ce changement est ensuite calculé comme une fraction de la fluorescence de base (ΔF/F). Enfin, la valeur du point de départ est définie sur 1 afin que les augmentations ou les diminutions puissent être facilement visualisées graphiquement au fil du temps. Au moins cinq régions de puncta par neurone et au moins dix neurones par condition expérimentale sont collectés, avec des données comme celle-ci combinées pour générer des mesures moyennes à chaque point temporel. (F) Les données d’un fichier de feuille de calcul tel que le point (E) sont déplacées dans un logiciel de graphiques et de statistiques. Pour le graphique présenté ici, la valeur ΔF/F à chaque point temporel moyennée sur toutes les régions puncta d’une condition expérimentale est tracée, ainsi que son erreur-type de la moyenne. Le graphique ici est constitué de données provenant des expériences GFP par rapport à GA50 indiquées en (D), où les 10 dernières s de la ligne de base et les 10 premières s de la période de stimulation sont montrées-réimprimées à partir de Jensen et al. 202043. (G) Ce test peut produire des courbes pour la libération synaptique intermédiaire et n’est pas simplement une réponse « tout ou rien ». GA50 a été co-exprimé avec la protéine synaptique exogène SV2 (protéine 2 associée aux vésicules synaptiques), et l’imagerie et l’analyse du colorant styryl ont été effectuées comme indiqué dans les étapes précédentes. Comme dans la figure 3F, le graphique présenté ici représente la valeur ΔF/F à chaque point temporel moyenné sur toutes les régions puncta d’une condition expérimentale, ainsi que son erreur type de la moyenne. Le graphique montre la dernière minute de la ligne de base et la première minute de la période de stimulation de Jensen et al. 202043. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1: Vidéo représentative de l’expérience d’imagerie du colorant styryl. Une vidéo représentative d’un neurone cortical chargé de colorant styryl est montrée. La vidéo montre la période commençant au moment de la perfusion du bain de KCl aCSF élevé. La région en boîte met en évidence les neurites, avec une perte observable de fluorescence puncta au fil du temps. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Selon la méthode décrite à la rubrique 7, on voit des images de fluorescence représentatives de neurones corticaux transfectés avec GcaMP6m avant et après la dépolarisation de KCl (Figure 4A). Les graphiques d’intensité brute montrent des valeurs de fluorescence accrues qui fluctuent, indiquant l’entrée du calcium dans les neurites après la dépolarisation induite par KCl (figure 4B). Cette deuxième vidéo représentative montre des neurones exprimant GcaMP6m avec une faible fluorescence à la fin de la période d’enregistrement de référence pour démontrer cet effet. Au début de la stimulation, les neurones affichent une augmentation spectaculaire de la fluorescence (Vidéo 2). Cette approche a été utilisée avec succès pour démontrer les altérations de l’entrée dans le calcium dans un modèle FUS-ALS mutant. Les astrocytes de ce modèle ont été transduis avec un adénovirus contenant des plasmides eGFP-FUS pilotés par le promoteur du CMV. Lorsque le milieu conditionné à partir d’astrocytes mutants exprimant fus a été placé sur les motoneurones, une augmentation de l’afflux de calcium a été observée par rapport aux conditions FUS non mutantes à la suite d’une stimulation de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) + cyclothiazide (Figure 4C)44. La sensibilité de ce test a été testée en effectuant des expériences avec et sans calcium inclus dans le milieu de perfusion. Dans le cadre de la GFP par rapport à l’AG50 mentionné ci-dessus, une augmentation des transitoires de calcium de pointe a été observée dans les motoneurones contenant du GA50 . Notamment, cela dépendait de l’entrée de calcium dans la cellule et non de la libération de réserves internes de calcium. Lorsque le calcium a été retiré du milieu stimulant du CSCa, aucune réponse transitoire du calcium n’a été observée dans l’une ou l’autre des conditions expérimentales (figure 4D)43.

Figure 4
Figure 4 : Observation des transitoires calciques en temps réel à l’aide de rapporteurs GCaMP. (A) Image 40x d’un neurone exprimant GCaMP6m, pseudo-coloré pour montrer l’intensité de la fluorescence GFP (faible en bleu à élevé en rouge). Les panneaux de gauche montrent l’ensemble du champ de vision 40x avant et après la stimulation. La barre d’échelle indique 20 μm. Les images à droite sont des versions agrandies des zones encadrées révélées. Grâce à ces images, il est évident à l’œil nu qu’il y a une forte augmentation des niveaux de calcium neuritique focal après la stimulation. La barre d’échelle indique 12 μm. (B) La sélection du retour sur investissement et la surveillance de l’intensité de fluorescence tout au long de l’expérience sont effectuées comme dans la figure 3. Les 30 dernières s de stimulation de base et 1 min pour deux ROI sélectionnés d’un neurone subissant une surveillance de fluorescence GCaMP6m sont montrées ici. Contrairement à l’imagerie par colorant styryl, l’intensité de fluorescence augmente après une stimulation neuronale. De plus, comme il est noté ici, les transitoires de calcium fluctuent dans les neurites au fil du temps; par conséquent, les résultats sont généralement représentés comme la valeur moyenne de changement de fluorescence normalisée de crête pour chaque région de retour sur investissement. (C) La quantification représentative d’une telle expérience est montrée, comme cela a été publié dans Kia-McAvoy et al. 201844, où les motoneurones primaires qui ont reçu un surnageant dérivé d’astrocytes FUS-ALS mutants ont montré un afflux significativement accru de calcium après la stimulation des récepteurs AMPA, par rapport aux neurones recevant un surnageant de type sauvage FUS exprimant des astrocytes. (D) Quantification représentative de l’imagerie transitoire du calcium où le calcium n’était pas inclus dans le CSA stimulant. Les conditions de mCherry par rapport à GA50-mCherry stimulées avec un ACSF KCl élevé avec ou sans calcium sont montrées, telles que publiées dans Jensen et al. 202043. Les neurones contenant du GA50 ont montré un afflux de calcium maximal accru par rapport aux cellules contenant du mCherry. Il n’y avait pas d’élévation des niveaux internes de calcium dans l’une ou l’autre condition expérimentale lorsque le calcium a été retiré de la stimulation d’un KCL aCSF élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 2 : Vidéo représentative de l’expérience GCaMP sur le transitoire de calcium. Une vidéo représentative d’un champ de neurones corticaux transfectés avec GCaMP6m est montrée. Après une période de référence, un afflux important de calcium est noté à la marque de 6 s lorsque le KCl aCSF élevé a été appliqué. L’entrée de calcium peut être mesurée soit pour la cellule entière, soit dans des régions de neurites spécifiques comme décrit. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Problèmes potentiels Raisons possibles/solution
1 Chargement non spécifique Soyez précis avec le temps de chargement. Des temps de chargement plus longs entraînent une charge non spécifique de FM4-64 dans les endosomes et les lysosomes
2 Pas d’exocytose appréciable dans les neurones témoins Vérifiez le pH de la solution aCSF À KCl élevé.
3 Perte de concentration et dérive latérale Assurez-vous que l’accent est mis sur. Alignez les images post-imagerie à l’aide du logiciel Nikon ou du plugin ImageJ.
4 Blanchiment de la fluorescence FM4-64 Vérifiez l’intensité du laser utilisé pour l’imagerie. Essayez toujours d’utiliser l’intensité la plus faible possible. Confirmez que l’intensité du laser utilisé n’entraîne pas de blanchiment en effectuant des essais.

Tableau 2 : Problèmes possibles et dépannage pour les expériences sur les colorants styryl. Scénarios typiques pour les problèmes et le dépannage général pour les expériences de déchargement synaptique.

Problèmes potentiels Raisons possibles/solution
1 Efficacité de transfection trop faible Vérifiez la santé neuronale. Si les neurones sont difficiles à transfecter, on peut passer à l’AAV ou à la transduction lentivirale de GCaMP.
2 Accumulation de fluorescence GCaMP6 dans le noyau Santé neuronale compromise. Vérifiez le protocole de transfection.
3 Perte de mise au point et dérive latérale de l’image Assurez-vous que l’accent est mis sur. Alignez les images post-imagerie à l’aide du logiciel Nikon ou du plugin ImageJ.
4 Pas de réponse calcique lors de la stimulation KCL Assurez-vous que le pH de l’aCSF est correct.
5 Blanchiment de la fluorescence GCaMP6 Vérifiez l’intensité du laser utilisé pour l’imagerie. Essayez toujours d’utiliser l’intensité la plus faible possible. Confirmez que l’intensité du laser utilisé n’entraîne pas de blanchiment en effectuant des essais.
6 Blebbing des neurites Santé neuronale compromise en raison de la transfection. Utilisez un nouveau lot de cultures neuronales.

Tableau 3 : Problèmes possibles et dépannage pour l’imagerie des transitoires de calcium dans les neurites. Scénarios typiques pour les problèmes et le dépannage général pour les expériences de transitoire de calcium GCaMP.

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Discussion

Trois étapes communes aux deux méthodes décrites sont d’une importance cruciale pour le succès expérimental et les résultats quantifiables. Tout d’abord, la préparation d’un CSF frais avant chaque série d’expériences est essentielle, en suivant les instructions ci-jointes. Ne pas le faire peut empêcher une dépolarisation neuronale appropriée. Un échantillon de neurones témoins non traités doit être constamment testé avant la stimulation de tout groupe expérimental afin d’assurer une dépolarisation cellulaire appropriée et de fournir une référence pour les résultats positifs obtenus lors de cette séance d’imagerie. Deuxièmement, pour suivre avec succès la fluorescence au fil du temps pour des régions synaptiques spécifiques, une attention particulière doit également être prise lors de la configuration des paramètres d’imagerie et des zones de retour sur investissement à surveiller. L’enregistrement de la période de référence doit immédiatement passer à la période d’enregistrement de la stimulation. Une fréquence d’images suffisamment rapide (2 images/s) est nécessaire pour capturer la dynamique de désintégration unique de la libération de colorant styryl. Enfin, une étape critique dans l’analyse de l’expérimentation est la normalisation des mesures de fluorescence d’abord sur le fond de l’imagerie, puis sur la ligne de base pré-stimulée. Comme avec d’autres protocoles d’imagerie, la soustraction d’une région d’imagerie vierge est d’abord effectuée sur toutes les mesures de fluorescence temporelle appariées afin d’éliminer toute autofluorescence de fond que l’ajout de milieu KCl peut introduire. Il est également essentiel de mesurer et de calculer la lecture moyenne de fluorescence pour chaque retour sur investissement à partir des 30 dernières secondes de référence avant la stimulation. Cette valeur de départ moyenne est ensuite utilisée dans toutes les mesures de temps pour ce retour sur investissement comme point de départ défini pour quantifier l’intensité du « changement par rapport à la ligne de base ».

La culture neuronale primaire est notoirement difficile à transfecter avec de l’ADN exogène, et même des protocoles optimisés produisent souvent une faible efficacité des cellules totales en culture. 20% à 25% de l’efficacité de la transfection est généralement atteinte dans nos cultures neuronales, sans aucune preuve de toxicité induite par la transfection. Bien que des expressions assez cohérentes soient observées dans les cellules contenant des GCaMP, des niveaux subtilement différents d’expression de la sonde dans les cellules individuelles sont considérés en fonction de la méthode de quantification de la variation de la fluorescence de base par rapport à cette valeur de référence. Cependant, avec cette efficacité relativement faible, l’utilisation de méthodes basées sur la transfection pour introduire le rapporteur GCaMP n’est pas d’une robustesse suffisante pour les répliques biologiques à grande échelle pour les études de criblage à haut débit. Pour surmonter ce problème, plusieurs variantes de constructions sont disponibles dans le commerce pour l’emballage lentiviral ou adénoviral ou l’expression spécifique de la lignée cellulaire, ce qui permettra une plus grande efficacité de transduction. Une modification primaire qui peut être souhaitée lors de l’utilisation de ces protocoles est d’utiliser la stimulation optogénétique des neurones au lieu de l’application de bain de KCl62. La transduction avec des constructions lentivirales conçues pour exprimer l’une des familles de channelrhodopsines maintenant disponibles, suivie d’une activation avec des longueurs d’onde spécifiques de la lumière, permet un contrôle spatial pour la dépolarisation de sous-ensembles de neurones et aussi pour l’évaluation de l’effet des trains de potentiels d’action sur les niveaux répétitifs d’influx de calcium et l’épuisement des réserves de vésicules synaptiques63 . Cependant, il est essentiel de garder à l’esprit que l’utilisation de cette méthode est actuellement quelque peu limitée, car l’utilisateur doit s’assurer que son rapporteur optogénétique, son rapporteur synaptique et toute protéine supplémentaire introduite de manière exogène n’ont pas de chevauchement spectral entre les fluorophores utilisés. Un problème de dépannage courant à l’aide du colorant styryl est la réduction passive de l’intensité pendant la période d’enregistrement de référence. Avant les études expérimentales, il est essentiel d’optimiser l’intensité laser et les intervalles de capture de photos afin de minimiser les effets de photoblanchiment. Pour que les expériences soient envisagées, une stabilisation de l’intensité pendant au moins les 30 dernières secondes de la période de référence est nécessaire. Reportez-vous aux tableaux 2 et 3 pour connaître les problèmes courants et leurs solutions pour les expériences sur les colorants de styryl et les transitoires de calcium, respectivement.

La principale limite de ces deux méthodes est que les cultures ne peuvent être stimulées et examinées que dans un seul cas. Comme l’application du bain est utilisée pour introduire l’agent dépolarisant KCl, tous les neurones à examiner à partir de cette condition dans cette boîte doivent être dans le champ de vision initial de l’objectif du microscope. Si la fonctionnalité au fil du temps est intéressante, des cultures appariées sont nécessaires. Cependant, la méthode optogénétique mentionnée ci-dessus permettra d’observer la dynamique du calcium au fil du temps si vous le souhaitez. De plus, si les neurones ont un défaut dans le recyclage des vésicules synaptiques, la charge initiale du colorant styryl sera altérée. Bien que la normalisation de l’intensité interne permette une comparaison entre les conditions, de légères différences dans l’ampleur des réponses peuvent être difficiles à détecter. Enfin, de nouvelles itérations de ces rapporteurs sont rapidement devenues disponibles et peuvent être remplacées par des temps de détection plus rapides ou des résultats plus robustes. Par exemple, GCaMP6m n’est plus considéré comme le rapporteur le plus rapide des transitoires de calcium aux terminaux synaptiques. Au lieu de cela, on peut utiliser la dernière génération de jGCaMP864.

Les méthodes décrites ici sont un moyen rapide et fiable de déterminer si la manipulation génétique ou pharmacologique des neurones perturbe la signalisation et la libération synaptiques fonctionnelles. Les expériences détaillées sont moins difficiles techniquement et moins coûteuses que l’électrophysiologie traditionnelle des pinces tension/courant et la microscopie électronique. De plus, alors que l’électrophysiologie est par nature à faible débit et au niveau de la cellule individuelle, les protocoles décrits ici sont plus rapides et à débit plus élevé, permettant d’imager plusieurs neurones simultanément et d’effectuer de nombreuses itérations en une seule séance d’imagerie. Il est proposé que ces paradigmes de dynamique du calcium et de libération synaptique soient utilisés comme premier indicateur des altérations de la transmission synaptique dans les modèles de SLA et l’étude d’autres formes de dégénérescence neuronale. Bien que les conclusions dérivées de Gcamp6m et de l’imagerie des colorants styryl ne puissent pas identifier avec précision un mécanisme spécifique de dysfonctionnement synaptique, sur la base de ces résultats, les chercheurs peuvent alors entreprendre des études complémentaires ciblées et fondées sur des preuves en utilisant des méthodes traditionnelles pour déterminer les canaux impliqués, le nombre de vésicules synaptiques ou le contenu quantitatif.

L’utilité de ces protocoles est l’évaluation rapide et simple des altérations de l’afflux de calcium médié par la dépolarisation et/ou de la fusion des vésicules synaptiques dans des modèles spécifiques de SLA. Nous l’avons récemment démontré dans une publication montrant une augmentation de l’afflux de calcium et l’abrogation du déchargement synaptique dans les neurones corticaux exprimant la protéine dipeptide (glycine-alanine)50 résultant de l’expansion répétée de l’hexanucléotide C9ORF7243. Comme le montrent nos travaux publiés, ces méthodes peuvent être facilement réalisées en tandem avec la co-transfection d’ARN mutants ou de protéines d’intérêt ou dans des cellules cultivées directement à partir de modèles animaux transgéniques43. De plus, la fiabilité et la robustesse de ces protocoles ont été testées avec succès dans des cellules souches pluripotentes induites par l’homme différenciées sur le plan neuronal45, ce qui permet de réaliser de futures études directement dans des cellules pertinentes pour la maladie dérivées de patients. Dans un autre manuscrit récent, nous fournissons des preuves que les motoneurones de type sauvage subissent un afflux élevé de calcium après stimulation lorsqu’ils sont en présence d’un facteur soluble libéré par des FUS mutants exprimant des astrocytes44. Les événements de signalisation du calcium astrocytaire sont également profondément liés à la transmission synaptique dans les neurones voisins65. Le protocole de dynamique du calcium a été appliqué pour étudier les transitoires de calcium à cellules entières dans des modèles de culture astrocytaire, ce qui s’est avéré efficace dans les cellules primaires et humaines dérivées de l’IPS chez les rongeurs. Une meilleure compréhension de la dynamique du calcium astrocytaire et de la signalisation dans les modèles de SLA fournira des informations précieuses sur la façon dont la transmission synaptique peut être affectée par conséquent. En fin de compte, l’utilisation de rapporteurs GCaMP spécifiques au type cellulaire sera également un outil puissant pour étudier la dynamique du calcium neuronal et astrocytaire dans des contextes de co-culture mixte et évaluer spécifiquement les effets non autonomes des cellules provenant de chaque population cellulaire.

Enfin, l’utilisation potentielle de ces méthodes s’étend non seulement au-delà de l’étude de la SLA, mais aussi aux domaines plus larges des neurosciences neurodégénératives et même développementales. Des informations détaillées sur les plasmides spécifiques utilisés pour générer les résultats représentatifs sont fournies et réussissent à transfecter les plasmides contenant de nombreuses variantes génétiques différentes des répétitions d’hexanucléotides FUS, SOD1 et C9ORF72 et des dipeptides43,44,66,67,68. À condition que les plasmides contiennent un promoteur utilisé dans les neurones, il n’y a pas de limite sur les modèles de SLA ou de maladie dégénérative qui pourraient être étudiés à l’aide de ces méthodes. De plus, la transfection pour exprimer des protéines mutantes est une étape entièrement facultative. Les cultures générées à partir d’animaux transgéniques ou de cellules humaines dérivées de patients éliminent le besoin d’identifier les cellules contenant la protéine mutante d’intérêt. À l’heure actuelle, ces systèmes sont limités de la manière dont si un colorant styryl est utilisé, le canal TRITC est occupé, et si GcaMP6 est utilisé, le canal FITC est occupé. Les techniques qui permettent d’examiner l’activité neuronale et astrocytaire en temps réel élargissent les possibilités de compréhension de l’analyse temporelle pour la maturation synaptique / dégénérescence, ainsi que des tests rapides pour l’efficacité des composés pharmacologiques dans la promotion ou la suppression de la communication neuronale. Ces deux méthodes se prêtent à une mise à l’échelle à haut débit pour le criblage. Plutôt que de plaquer les neurones dans des boîtes individuelles de 35 mm, les paramètres d’imagerie de ces deux protocoles pourraient être utilisés de manière automatisée sur des plaques de 96 puits. En utilisant une telle plate-forme, les bibliothèques de composés peuvent être rapidement testées pour des thérapies, qui modulent l’entrée du calcium ou améliorent la libération synaptique en utilisant un modèle génétique de la maladie ou même des cellules dérivées directement des patients. Cette méthode pourrait accélérer la possibilité de thérapies spécifiques à un sous-groupe ou même personnalisées en identifiant rapidement des molécules candidates pour une étude plus approfondie.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier les membres actuels et anciens du Jefferson Weinberg ALS Center pour leurs commentaires critiques et leurs suggestions visant à optimiser ces techniques et leurs analyses. Ce travail a été soutenu par le financement des NIH (RF1-AG057882-01 et R21-NS0103118 à D.T.), du NINDS (R56-NS092572 et R01-NS109150 à P.P.), de la Muscular Dystrophy Association (D.T.), du Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), de la Family Strong 4 ALS Foundation et de la Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. et P.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

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References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

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Neurosciences numéro 173
Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique
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Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

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