Fluorescerende måling i realtid af synaptiske funktioner i modeller af amyotrofisk lateral sklerose

Summary

To relaterede metoder er beskrevet for at visualisere subcellulære hændelser, der kræves til synaptisk transmission. Disse protokoller muliggør realtidsovervågning af dynamikken i præsynaptisk calciumtilstrømning og synaptisk vesikelmembranfusion ved hjælp af levende cellebilleddannelse af in vitro-dyrkede neuroner.

Abstract

Før neuronal degeneration er årsagen til motoriske og kognitive underskud hos patienter med amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og / eller frontotemporal lobe demens (FTLD) dysfunktion af kommunikation mellem neuroner og motorneuroner og muskler. Den underliggende proces med synaptisk transmission involverer membrandepolariseringsafhængig synaptisk vesikelfusion og frigivelse af neurotransmittere i synapsen. Denne proces sker gennem lokaliseret calciumtilstrømning til de præsynaptiske terminaler, hvor synaptiske vesikel befinder sig. Her beskriver protokollen fluorescensbaserede levende billeddannelsesmetoder, der pålideligt rapporterer depolariseringsmedieret synaptisk vesikelekocytose og præsynaptisk terminal calciumtilstrømningsdynamik i dyrkede neuroner.

Ved hjælp af et styrylfarvestof, der er inkorporeret i synaptiske vesikelmembraner, belyses den synaptiske vesiclefrigivelse. På den anden side anvendes Gcamp6m til at studere calciumindgang, en genetisk kodet fluorescerende reporter. Vi anvender høj kaliumchloridmedieret depolarisering til at efterligne neuronal aktivitet. For at kvantificere synaptisk vesicle exocytose entydigt måler vi tabet af normaliseret styrylfarvestoffluorescens som en funktion af tiden. Under lignende stimuleringsbetingelser øges Gcamp6m fluorescens i tilfælde af calciumtilstrømning. Normalisering og kvantificering af denne fluorescensændring udføres på samme måde som styrylfarvestofprotokollen. Disse metoder kan multiplexeres med transfektionsbaseret overekspression af fluorescerende mærkede mutante proteiner. Disse protokoller er blevet flittigt brugt til at studere synaptisk dysfunktion i modeller af FUS-ALS og C9ORF72-ALS, ved hjælp af primære gnaverkortikale og motorneuroner. Disse protokoller giver let mulighed for hurtig screening af forbindelser, der kan forbedre neuronal kommunikation. Som sådan er disse metoder værdifulde ikke kun for undersøgelsen af ALS, men for alle områder af neurodegenerativ og udviklingsmæssig neurovidenskabelig forskning.

Introduction

Modellering af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) i laboratoriet gøres unikt udfordrende på grund af den overvældende sporadiske karakter af over 80% af ^tilfældene1 kombineret med det store antal genetiske mutationer, der vides at være sygdomsfremkaldende2. På trods af dette deler alle tilfælde af ALS det samlende træk, at der før direkte neuronal degeneration er dysfunktionel kommunikation mellem præsynaptiske motorneuroner og postsynaptiske ^{muskelceller3,4}. Klinisk, når patienter mister forbindelsen mellem de resterende øvre og nedre motorneuroner, præsenterer de med træk ved neuronal hyper- og hypoexcitabilitet gennem hele ^{sygdommen5,6,7,8,9}, hvilket afspejler komplekse underliggende molekylære ændringer i disse synapser, som vi som ALS-forskere søger at forstå.

Flere transgene modeller har illustreret, at forringelse og desorganisering af det neuromuskulære kryds forekommer med ekspression af ALS-forårsagende genetiske mutationer, herunder ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 og TDP4317,18,19 gennem morfologiske vurderinger, herunder evaluering af synaptiske boutoner, rygsøjletætheder og præ/postsynaptisk organisation. Mekanisk har det siden Coles, Hodgkins og Huxleys skelsættende papirer i 1930’erne også været muligt at evaluere synaptiske responser gennem elektrofysiologiske teknikker i enten in vitro-cellekultur eller vævsskivepræparater20. Gennem disse strategier har mange modeller af ALS vist synaptiske transmissionsunderskud. For eksempel forårsager en mutant variant af TDP43 forbedret affyringsfrekvens og reducerer aktionspotentialetærsklen i NSC-34 (rygmarv x neuroblastom hybrid cellelinje 34) motorneuronlignende ^celler21. Den samme variant forårsager også dysfunktionel synaptisk transmission ved det neuromuskulære kryds (NMJ) før begyndelsen af adfærdsmæssige motoriske underskud i en ^musemodel22. Det er tidligere blevet påvist, at mutant FUS-ekspression resulterer i reduceret synaptisk transmission ved NMJ i en drosophila-model af FUS-ALS før lokomotoriske ^defekter11. En nylig rapport ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller afledt af C9orf72-ekspansionsbærere afslørede en reduktion i den let releasable pulje af synaptiske ^vesikler23. Alt i alt fremhæver disse undersøgelser og andre vigtigheden af at opbygge en mere omfattende forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for synaptisk signalering i sygdomsrelevante modeller af ALS. Dette vil være afgørende for at forstå ALS patobiologi og udvikle potentielle terapeutiske mål for patienter.

Metoder til strøm- og spændingsklemmeceller har været uvurderlige til bestemmelse af membranegenskaber såsom konduktans, hvilemembranpotentiale og kvantalt indhold af individuelle synapser20,24. En af de væsentlige begrænsninger ved elektrofysiologi er imidlertid, at det er teknisk udfordrende og kun giver indsigt fra en enkelt neuron ad gangen. Levende celle konfokal mikroskopi kombineret med specifikke fluorescerende sonder giver mulighed for at undersøge den synaptiske transmission af neuroner på en spatiotemporal måde25,26,27. Selvom det ikke er et direkte mål for neuronal excitabilitet, kan denne fluorescensmetode give en relativ måling af to molekylære korrelationer af synaptisk funktion: synaptisk vesikelfrigivelse og calciumtransienter ved synaptiske terminaler.

Når et handlingspotentiale når den præsynaptiske terminalregion af neuroner, udløses calciumtransienter, hvilket letter overgangen fra et elektrisk signal til processen med frigivelse af ^{neurotransmitter28}. Spændingsgated calciumkanaler lokaliseret til disse områder regulerer calciumsignalering tæt for at modulere kinetikken af ^{neurotransmitterfrigivelse29}. De første rapporterede fluorescensbaserede optagelser af calciumtransienter blev udført ved anvendelse af enten dobbeltbølgelængdeindikatoren Fura-2 AM eller det enkelte bølgelængdefarvestof Fluo-3 AM30,31,32. Mens disse farvestoffer gav stor ny indsigt på det tidspunkt, lider de af flere begrænsninger såsom ikke-specifik opdeling i celler, aktivt eller passivt farvestoftab fra mærkede celler, fotoblegelse og toksicitet, hvis de afbildes over længere ^tid33. I det sidste årti er genetisk kodede calciumindikatorer blevet arbejdsheste til billeddannelse af forskellige former for neuronal aktivitet. Disse indikatorer kombinerer et modificeret fluorescerende protein med et calciumchelatorprotein, der hurtigt skifter fluorescensintensitet efter bindingen af ^{Ca2+ ioner34}. Anvendelsen af disse nye indikatorer er enorm, hvilket giver mulighed for meget lettere visualisering af intracellulære calciumtransienter både in vitro– og in vivo-indstillinger. En familie af disse genetisk kodede journalister, kendt som GCaMP, bruges nu bredt. Disse indikatorer indeholder et C-terminalt calmodulindomæne efterfulgt af grønt fluorescerende protein (GFP) og er dækket af et N-terminalt calmodulinbindende ^område35,36. Calciumbinding til calmodulindomænet udløser en interaktion med det calmodulinbindende område, hvilket resulterer i en konformationsændring i den samlede proteinstruktur og en betydelig stigning i fluorescensen af GFP-moiety35,36. I årenes løb har denne familie af journalister gennemgået flere udviklinger for at muliggøre forskellige udlæsninger for bestemte calciumtransienter med specifik kinetik (langsom, medium og hurtig), hver med lidt forskellige ^{egenskaber37,38}. Her er brugen af reporteren GcaMP6 blevet fremhævet, som tidligere har vist sig at detektere enkeltaktionspotentialer og dendritiske calciumtransienter i neuroner både in vivo og in vitro37.

Calciumtransienter i den præsynaptiske region udløser synaptiske vesikelfusionshændelser, hvilket forårsager frigivelse af neurotransmitter i synapsen og initiering af signalhændelser i den postsynaptiske ^celle28,39. Synaptiske vesikler frigives og genanvendes både hurtigt, da cellen homeostatisk opretholder et stabilt cellemembranoverfladeareal og let releasable pool af fusionsdygtige membranbundne vesikler40. Det her anvendte styrylfarvestof har en affinitet over for lipidmembraner og ændrer specifikt dets emissionsegenskaber baseret på rækkefølgen af det omgivende ^{lipidmiljø41,42}. Det er således et ideelt værktøj til mærkning af genbrug af synaptiske vesikler og efterfølgende sporing af disse vesikler, da de senere frigives efter neuronal ^{stimulering41,42}. Protokollen, der er genereret og optimeret, er en tilpasning af de begreber, der oprindeligt blev beskrevet af Gaffield og kolleger, hvilket giver os mulighed for kontinuerligt at visualisere styrylfarvestofmærket synaptisk vesicle puncta over ^tid41.

Her beskrives to relaterede fluorescensbaserede metoder, der pålideligt rapporterer specifikke cellulære hændelser involveret i synaptisk transmission. Protokoller er blevet defineret for at undersøge dynamikken i depolariseringsmedieret præsynaptisk terminal calciumtilstrømning og synaptisk vesikelekocytose i dyrkede neuroner. Her er metoder og repræsentative resultater fokuseret på at bruge primære gnaverkortikale eller motorneuroner som in vitro-modelsystem, da der er offentliggjort undersøgelser ved hjælp af disse ^{celletyper43,44}. Disse metoder er dog også anvendelige på differentierede humane ⁱ³ kortikale ^neuroner45, da vi også har haft succes med begge protokoller i igangværende eksperimenter i vores laboratorium. Den generelle protokol er skitseret i et trinvist lineært format, vist i figur 1. Kort sagt, for at studere calciumdynamik i neuritter transfekter transfekteres modne neuroner med plasmid-DNA for at udtrykke den fluorescerende reporter GCaMP6m under en Cytomegalovirus (CMV) ^{promotor37,46}. Transfekterede celler har et lavt niveau af basal grøn fluorescens, hvilket stiger i nærvær af calcium. Regioner af interesse er specificeret til at overvåge fluorescensændringer under hele vores manipulation. Dette gør det muligt at måle stærkt rumligt og tidsmæssigt lokaliserede udsving i ^calcium37,46. Til evaluering af synaptisk vesikelfusion og frigivelse er modne neuroner fyldt med styrylfarvestof inkorporeret i synaptiske vesikkelmembraner, når de genbruges, reformeres og genindlæses med neurotransmittere i præsynaptiske celler41,42,43,47,48. De nuværende farvestoffer, der anvendes til dette formål, mærker synaptiske vesikler langs neuritter og anvendes som proxy for disse regioner i levende billeddannelsesforsøg, som det blev vist ved co-farvning af styrylfarvestof og synaptotagmin af Kraszewski og ^kolleger49. Inkluderet her er repræsentative billeder af lignende farvning, der også er udført (figur 2A). Tidligere efterforskere har i vid udstrækning brugt sådanne farvestoffer til at rapportere synaptisk vesikeldynamik ved det neuromuskulære kryds og hippocampale neuroner48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Ved at vælge punkterede områder af farvestofbelastede vesikler og ved at overvåge fald i fluorescensintensiteten efter vesikelfrigivelse kan funktionel synaptisk transmissionskapacitet og tidsmæssig dynamik i frigivelsen undersøges efter ^{stimulering43}. Til begge metoder anvendes et medium indeholdende en høj koncentration af kaliumchlorid til at depolarisere celler for at efterligne neuronal aktivitet. Billeddannelsesparametre er specificeret til at fange intervaller på under et sekund, der spænder over en baseline normalisering efterfulgt af vores stimuleringsoptagelsesperiode. Fluorescensmålinger på hvert tidspunkt bestemmes, normaliseres til baggrunden og kvantificeres over den eksperimentelle tidsperiode. Calcium-tilstrømning medieret GCaMP6m fluorescensforøgelse eller effektiv synaptisk vesikel exocytose styrylfarvestof frigivelse fluorescens fald kan detekteres gennem denne strategi. Detaljeret metodologisk opsætning og parametre for disse to protokoller og en diskussion om deres fordele og begrænsninger er beskrevet nedenfor.

Figur 1: Visuel gengivelse af den samlede generelle protokolproces. (1) Isoler og dyrkning af primære gnaverneuroner in vitro til det valgte modningstidspunkt. (2) Indfør GCaMP DNA eller styrylfarvestof som indberettere af synaptisk aktivitet. (3) Opsætning af billeddannelsesparadigme ved hjælp af konfokalmikroskop med levende billeddannelse og tilhørende software. Begynd den oprindelige optagelsesperiode. (4) Mens celler stadig gennemgår live-image capture, stimuleres neuroner via høj KCl-badperfusion. (5) Vurder fluorescensintensitetsmålinger over tid for at måle calciumtransienter eller synaptisk vesikelfusion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Jefferson University. 1. Primær kultur af neuroner fra embryonal rottecortex BEMÆRK: Primære kortikale neuroner isoleres fra E17.5 rotteembryoner som tidligere beskrevet57,58. Ingen stamme bias synes at eksistere med succesen med denne dyrkningsprotokol. Denne metode er beskrevet kort nedenfor. De…

Representative Results

Efter den vellykkede implementering af ovennævnte protokol vises repræsentative resultater for et typisk styrylfarvestofsynaptisk vesikelfrigivelseseksperiment. Dyrkede rotte primære kortikale neuroner blev fyldt med farvestof ved hjælp af metoden beskrevet i afsnit 6. Specificiteten af farvestofbelastning blev bestemt ved co-mærkning med synaptisk vesikelmarkør synaptophysin. Et flertal af styrylfarvestof positiv puncta er co-positive for denne markør (figur 2A). For at afgøre, om d…

Discussion

Tre trin, der er fælles for begge beskrevne metoder, er af afgørende betydning for eksperimentel succes og kvantificerbare resultater. For det første er forberedelse af frisk aCSF før hver runde af eksperimenter afgørende efter vedlagte instruktioner. Undladelse af at gøre dette kan forhindre passende neuronal depolarisering. En prøve af ubehandlede kontrolneuroner bør konstant testes før stimulering af eksperimentelle grupper for at sikre korrekt cellulær depolarisering og give et benchmark for positive result…

Materials

20x air objective	Nikon		For imaging
40x oil immersion objective	Nikon		For imaging
B27 supplement	Thermo Scientific	17504044	Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL	Thermo Scientific	13-689-8	Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood	Baker	SterilGARD III SG403A	Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148	For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418	For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate	Millipore Sigma	223506	Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator	Thermo Scientific	13-998-123	For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For neuronal culture preparation
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti +A1R core	For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera	Photometrics		For image acquisition
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270	Component of aCSF solutions
DNase	Millipore Sigma	D5025	For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats	Charles river	400SASSD	For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube	Nikon	77032509	For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye	Invitrogen	T13320	For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)	CellVis	D35-10-1.5-N	For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette	Grainger	52NK56	For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Millipore Sigma	H6648	For preparing neuronal cultures
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
horse serum	Millipore Sigma	H1138	For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood	NUAIRE	NU-301-630	For preparing neuronal cultures
Laminin	Thermo Scientific	23017015	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Scientific	11415064	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Scientific	21083027	For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Scientific	25030149	Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Scientific	11668019	For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride	Millipore Sigma	208337	Component of aCSF solutions
Microsoft Excel	Microsoft		Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES	Thermo Scientific	565-0020	Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium	Thermo Scientific	21103049	For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes	Thermo Scientific	339650	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep	Millipore Sigma	D1556	For preparing neuronal cultures
Papain	Millipore Sigma	P4762	For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Scientific	15140122	To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system	Warner Instruments	SF-77B	For exchange of aCSF
Perfusion tubing	Cole-Parmer	UX-30526-14	Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid	Addgene	40754	For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide	Millipore Sigma	P7886	Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761	Component of aCSF solutions
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888	Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator	Tokai Hit		For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube	Nikon	77032809	For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor	Millipore Sigma	T6414	For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table	New Port	VIP320X2430-135520	Table/stand for microscope