Summary

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Published: July 16, 2021
doi:

Summary

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Abstract

Vóór neuronale degeneratie is de oorzaak van motorische en cognitieve tekorten bij patiënten met amyotrofische laterale sclerose (ALS) en /of frontotemporale kwabdementie (FTLD) disfunctie van communicatie tussen neuronen en motorneuronen en spieren. Het onderliggende proces van synaptische transmissie omvat membraandepolarisatie-afhankelijke synaptische blaasjesfusie en de afgifte van neurotransmitters in de synaps. Dit proces vindt plaats door gelokaliseerde calciuminstroom in de presynaptische terminals waar synaptische blaasjes zich bevinden. Hier beschrijft het protocol op fluorescentie gebaseerde live-imaging-methodologieën die op betrouwbare wijze depolarisatie-gemedieerde synaptische blaasjesexocytose en presynaptische terminale calciuminstroomdynamiek in gekweekte neuronen rapporteren.

Met behulp van een styrylkleurstof die is opgenomen in synaptische blaasvliezen, wordt de afgifte van synaptische blaasjes opgehelderd. Aan de andere kant, om calciuminvoer te bestuderen, wordt Gcamp6m gebruikt, een genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggever. We gebruiken hoge kaliumchloride-gemedieerde depolarisatie om neuronale activiteit na te bootsen. Om synaptische blaasjesexocytose ondubbelzinnig te kwantificeren, meten we het verlies van genormaliseerde styrylkleurstoffluorescentie als functie van de tijd. Onder vergelijkbare stimulatieomstandigheden, in het geval van calciuminstroom, neemt de fluorescentie van Gcamp6m toe. Normalisatie en kwantificering van deze fluorescentieverandering worden op dezelfde manier uitgevoerd als het styrylkleurstofprotocol. Deze methoden kunnen worden gemultiplext met transfectie-gebaseerde overexpressie van fluorescerend gelabelde mutante eiwitten. Deze protocollen zijn uitgebreid gebruikt om synaptische disfunctie te bestuderen in modellen van FUS-ALS en C9ORF72-ALS, met behulp van primaire knaagdier corticale en motorische neuronen. Deze protocollen maken gemakkelijk een snelle screening van verbindingen mogelijk die de neuronale communicatie kunnen verbeteren. Als zodanig zijn deze methoden niet alleen waardevol voor de studie van ALS, maar voor alle gebieden van neurodegeneratief en ontwikkelingsneurowetenschappelijk onderzoek.

Introduction

Het modelleren van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het laboratorium wordt uniek uitdagend gemaakt vanwege de overweldigend sporadische aard van meer dan 80% van de gevallen1, in combinatie met het enorme aantal genetische mutaties waarvan bekend is dat ze ziekteveroorzakend zijn2. Desondanks delen alle gevallen van ALS het verenigende kenmerk dat er vóór regelrechte neuronale degeneratie disfunctionele communicatie is tussen presynaptische motorneuronen en postsynaptische spiercellen3,4. Klinisch gezien, als patiënten de connectiviteit van de resterende bovenste en onderste motorneuronen verliezen, presenteren ze zich met kenmerken van neuronale hyper- en hypoexcitabiliteit gedurende de ziekte5,6,7,8,9, als gevolg van complexe onderliggende moleculaire veranderingen in deze synapsen, die wij, als ALS-onderzoekers, proberen te begrijpen.

Meerdere transgene modellen hebben aangetoond dat verslechtering en desorganisatie van de neuromusculaire junctie optreden met de expressie van ALS-oorzakelijke genetische mutaties, waaronder SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 en TDP4317,18,19 door morfologische beoordelingen, waaronder evaluatie van synaptische boutons, wervelkolomdichtheden en pre / postsynaptische organisatie. Mechanistisch gezien, sinds de baanbrekende artikelen van Cole, Hodgkin en Huxley in de jaren 1930, is het ook mogelijk geweest om synaptische reacties te evalueren door middel van elektrofysiologische technieken in in vitro celkweek of weefselschijfpreparaten20. Door deze strategieën hebben veel modellen van ALS synaptische transmissietekorten aangetoond. Een gemuteerde variant van TDP43 veroorzaakt bijvoorbeeld een verhoogde vuurfrequentie en verlaagt de actiepotentiaaldrempel in NSC-34 (ruggenmerg x neuroblastoom hybride cellijn 34) motorneuronachtige cellen21. Deze zelfde variant veroorzaakt ook disfunctionele synaptische transmissie op de neuromusculaire junctie (NMJ) vóór het begin van gedragsmotorische tekorten in een muismodel22. Eerder werd aangetoond dat mutante FUS-expressie resulteert in verminderde synaptische transmissie bij de NMJ in een drosophila-model van FUS-ALS vóór locomotorische defecten11. Een recent rapport met geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van C9orf72-expansiedragers onthulde een vermindering van de gemakkelijk vrij te geven pool van synaptische blaasjes23. Al met al benadrukken deze studies en andere het belang van het opbouwen van een uitgebreider begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan synaptische signalering in ziekterelevante modellen van ALS. Dit zal cruciaal zijn in het begrijpen van de pathobiologie van ALS en het ontwikkelen van potentiële therapeutische doelen voor patiënten.

Methoden van stroom- en spanningsklemcellen zijn van onschatbare waarde geweest bij het bepalen van membraaneigenschappen zoals geleiding, rustmembraanpotentiaal en kwantitatief gehalte van individuele synapsen20,24. Een van de belangrijkste beperkingen van elektrofysiologie is echter dat het technisch uitdagend is en slechts inzichten biedt van een enkel neuron tegelijk. Live-cell confocale microscopie, gekoppeld aan specifieke fluorescerende probes, biedt de mogelijkheid om de synaptische transmissie van neuronen op een spatiotemporale manier te onderzoeken25,26,27. Hoewel het geen directe maat is voor neuronale prikkelbaarheid, kan deze fluorescentiebenadering een relatieve meting bieden van twee moleculaire correlaties van synaptische functie: synaptische blaasjesafgifte en calciumtransiënten op synaptische terminals.

Wanneer een actiepotentiaal het presynaptische terminale gebied van neuronen bereikt, worden calciumtransiënten geactiveerd, waardoor de overgang van een elektrisch signaal naar het proces van afgifte van neurotransmitters wordt vergemakkelijkt28. Spanningsafhankelijke calciumkanalen gelokaliseerd in deze gebieden reguleren de calciumsignalering strak om de kinetiek van de afgifte van neurotransmitters te moduleren29. De eerste gerapporteerde fluorescentie-gebaseerde opnames van calciumtransiënten werden uitgevoerd met behulp van de dual-golflengte indicator Fura-2 AM of de single golflengte kleurstof Fluo-3 AM30,31,32. Hoewel deze kleurstoffen destijds veel nieuw inzicht boden, lijden ze aan verschillende beperkingen, zoals niet-specifieke compartimentering in cellen, actief of passief kleurstofverlies van gelabelde cellen, fotobleeken en toxiciteit als ze gedurende langere tijd worden afgebeeld33. In het afgelopen decennium zijn genetisch gecodeerde calciumindicatoren de werkpaarden geworden voor het in beeld brengen van verschillende vormen van neuronale activiteit. Deze indicatoren combineren een gemodificeerd fluorescerend eiwit met een calciumchelatoreiwit dat snel van fluorescentie-intensiteit wisselt na de binding van Ca2+ ionen34. De toepassing van deze nieuwe indicatoren is enorm, waardoor een veel eenvoudigere visualisatie van intracellulaire calciumtransiënten mogelijk is, zowel in vitro als in vivo instellingen. Een familie van deze genetisch gecodeerde verslaggevers, bekend als GCaMP, wordt nu op grote schaal gebruikt. Deze indicatoren bevatten een C-terminaal calmodulin-domein, gevolgd door groen fluorescerend eiwit (GFP), en worden afgetopt door een N-terminaal calmodulin-bindend gebied35,36. Calciumbinding aan het calmodulinedomein veroorzaakt een interactie met het calmoduline-bindende gebied, wat resulteert in een conformationele verandering in de algehele eiwitstructuur en een aanzienlijke toename van de fluorescentie van het GFP-deel35,36. In de loop der jaren heeft deze familie van verslaggevers verschillende evoluties ondergaan om verschillende uitlezingen mogelijk te maken voor bepaalde calciumtransiënten met specifieke kinetiek (langzaam, gemiddeld en snel), elk met enigszins verschillende eigenschappen37,38. Hier is het gebruik van de reporter GcaMP6 benadrukt, waarvan eerder is aangetoond dat het enkelvoudige actiepotentialen en dendritische calciumtransiënten detecteert in neuronen, zowel in vivo als in vitro37.

Calciumtransiënten in het presynaptische gebied veroorzaken synaptische blaasjesfusiegebeurtenissen, waardoor neurotransmitterafgifte in de synaps en initiatie van signaleringsgebeurtenissen in de postsynaptische cel worden veroorzaakt28,39. Synaptische blaasjes worden zowel snel vrijgegeven als gerecycled, omdat de cel homeostatisch een stabiel celmembraanoppervlak en gemakkelijk vrij te geven pool van fusie-capabele membraangebonden blaasjes onderhoudt40. De hier gebruikte styrylkleurstof heeft een affiniteit met lipidemembranen en verandert specifiek de emissie-eigenschappen op basis van de ordening van de omringende lipideomgeving41,42. Het is dus een ideaal hulpmiddel voor het labelen van het recyclen van synaptische blaasjes en het volgen van deze blaasjes als ze later worden vrijgegeven na neuronale stimulatie41,42. Het protocol dat is gegenereerd en geoptimaliseerd is een aanpassing van de concepten die aanvankelijk door Gaffield en collega’s zijn beschreven, waardoor we in de loop van de tijd continu styryl dye-gelabelde synaptische vesicle puncta kunnen visualiseren41.

Hier worden twee gerelateerde op fluorescentie gebaseerde methodologieën beschreven, die op betrouwbare wijze specifieke cellulaire gebeurtenissen rapporteren die betrokken zijn bij synaptische transmissie. Protocollen zijn gedefinieerd om de dynamiek van depolarisatie-gemedieerde presynaptische terminale calciuminstroom en synaptische blaasjesexocytose in gekweekte neuronen te onderzoeken. Hier zijn methoden en representatieve resultaten gericht op het gebruik van primaire knaagdiercorticale of motorneuronen als het in vitro modelsysteem, zoals er gepubliceerde studies zijn met behulp van deze celtypen43,44. Deze methoden zijn echter ook van toepassing op gedifferentieerde menselijke i3 corticale neuronen45, omdat we ook succes hebben gehad met beide protocollen in de momenteel lopende experimenten in ons laboratorium. Het algemene protocol wordt geschetst in een stapsgewijs lineair formaat, weergegeven in figuur 1. Kortom, om de calciumdynamiek in neurieten te bestuderen, worden volwassen neuronen getransfecteerd met plasmide-DNA om de fluorescerende reporter GCaMP6m tot expressie te brengen onder een Cytomegalovirus (CMV) promotor37,46. Getransfecteerde cellen hebben een laag niveau van basale groene fluorescentie, die toeneemt in de aanwezigheid van calcium. Regio’s van belang worden gespecificeerd om fluorescentieveranderingen tijdens onze manipulatie te volgen. Hierdoor kunnen sterk ruimtelijk en temporeel gelokaliseerde fluctuaties in calcium worden gemeten37,46. Voor het evalueren van synaptische vesikelfusie en -afgifte worden volwassen neuronen geladen met styrylkleurstof die is opgenomen in synaptische blaaskelmembranen terwijl ze worden gerecycled, hervormd en opnieuw geladen met neurotransmitters in presynaptische cellen41,42,43,47,48. De huidige kleurstoffen die voor dit doel worden gebruikt, labelen synaptische blaasjes langs neurieten en worden gebruikt als een proxy voor deze regio’s in live-imaging-experimenten, zoals werd aangetoond door co-kleuring van styrylkleurstof en synaptotagmin door Kraszewski en collega’s49. Hier zijn representatieve afbeeldingen van vergelijkbare kleuringen opgenomen die ook zijn uitgevoerd (figuur 2A). Eerdere onderzoekers hebben dergelijke kleurstoffen uitgebreid gebruikt om synaptische blaasjesdynamica op de neuromusculaire kruising en hippocampale neuronen te rapporteren48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Door punctategebieden van met kleurstof beladen blaasjes te selecteren en door de afname van de fluorescentie-intensiteit na afgifte van het blaasje te monitoren, kunnen de functionele synaptische transmissiecapaciteit en de temporele dynamiek van afgifte na stimulatie worden bestudeerd43. Voor beide methoden wordt een medium met een hoge concentratie kaliumchloride gebruikt om cellen te depolariseren om neuronale activiteit na te bootsen. Beeldparameters worden gespecificeerd om intervallen van minder dan een seconde vast te leggen die een basislijnnormalisatie omvatten, gevolgd door onze stimulatie-opnameperiode. Fluorescentiemetingen op elk tijdstip worden bepaald, genormaliseerd naar de achtergrond en gekwantificeerd over de experimentele periode. Calciuminstroom gemedieerde GCaMP6m fluorescentie toename of effectieve synaptische vesikel exocytose styryl kleurstof afgifte fluorescentie afname kan worden gedetecteerd door middel van deze strategie. Gedetailleerde methodologische instellingen en parameters voor deze twee protocollen en een discussie over hun voordelen en beperkingen worden hieronder beschreven.

Figure 1
Figuur 1: Visuele weergave van het algemene protocolproces. (1) Isoleer en kweek primaire knaagdierneuronen in vitro tot het gekozen rijpingstijdpunt. (2) Introduceer GCaMP DNA of styrylkleurstof als verslaggevers van synaptische activiteit. (3) Stel het beeldvormingsparadigma in met behulp van live-imaging uitgeruste confocale microscoop en bijbehorende software. Begin de registratieperiode van de basislijn. (4) Terwijl cellen nog steeds live-image capture ondergaan, stimuleren neuronen via hoge KCl-badperfusie. (5) Beoordeel fluorescentie-intensiteitsmetingen in de loop van de tijd om calciumtransiënten of synaptische blaasjesfusie te meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Jefferson University. 1. Primaire kweek van neuronen uit de embryonale rattenschors OPMERKING: Primaire corticale neuronen worden geïsoleerd uit E17.5 rattenembryo’s zoals eerder beschreven57,58. Er lijkt geen strain bias te bestaan met het succes van dit kweekprotocol. Deze met…

Representative Results

Na de succesvolle implementatie van het bovenstaande protocol worden representatieve resultaten getoond voor een typisch styryl dye synaptisch vesikel release experiment. Gekweekte primaire corticale neuronen van ratten werden geladen met kleurstof met behulp van de methode beschreven in rubriek 6. De specificiteit van de kleurstofbelasting werd bepaald door co-labeling met synaptische blaasblaasmarker synaptofysine. Een meerderheid van de styrylkleurstof positieve puncta zijn co-positief voor deze marker (<strong class=…

Discussion

Drie stappen die beide beschreven methoden gemeen hebben, zijn van cruciaal belang voor experimenteel succes en kwantificeerbare uitkomsten. Ten eerste is de voorbereiding van verse aCSF vóór elke ronde van experimenten essentieel, volgens de bijgevoegde instructies. Als u dit niet doet, kan dit een geschikte neuronale depolarisatie voorkomen. Een monster van onbehandelde controleneuronen moet voortdurend worden getest voordat experimentele groepen worden gestimuleerd om een goede cellulaire depolarisatie te garanderen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen de huidige en voormalige leden van het Jefferson Weinberg ALS Center bedanken voor kritische feedback en suggesties voor het optimaliseren van deze technieken en hun analyses. Dit werk werd ondersteund door financiering van de NIH (RF1-AG057882-01 en R21-NS0103118 tot D.T.), de NINDS (R56-NS092572 en R01-NS109150 tot P.P), de Muscular Dystrophy Association (D.T.), het Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), de Family Strong 4 ALS foundation en de Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. en P.P).

Materials

20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle’s loop. American Journal of Physiology. 268 (6), 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Play Video

Cite This Article
Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

View Video