Summary
Optogenetik er et kraftfuldt værktøj med vidtrækkende applikationer. Denne protokol viser, hvordan man opnår let induktible genekspression i zebrafisk embryoner ved hjælp af det blå lys-lydhør TAEL/C120 system.
Abstract
Inucible genekspressionssystemer er et uvurderligt værktøj til at studere biologiske processer. Optogenetiske ekspressionssystemer kan give præcis kontrol over genekspression timing, placering og amplitud ved hjælp af lys som inducerende middel. I denne protokol bruges et optogenetisk ekspressionssystem til at opnå let induktivt genekspression i zebrafiskembryoner. Dette system er afhængig af en manipuleret transskription faktor kaldet TAEL baseret på en naturligt forekommende lys-aktiveret transskription faktor fra bakterien E. litoralis. Når TAEL lyser med blåt lys, dimerizes, binder sig til sit cognate regulatoriske element kaldet C120 og aktiverer transskription. Denne protokol bruger transgene zebrafisk embryoner, der udtrykker TAEL transskription faktor under kontrol af den allestedsnærværende ubb promotor. Samtidig driver C120-reguleringselementet udtrykket af et fluorescerende reportergen (GFP). Ved hjælp af et simpelt LED-panel til at levere aktiverende blåt lys kan induktion af GFP-udtryk først detekteres efter 30 minutters belysning og når et højdepunkt på mere end 130 gange induktion efter 3 timers lysbehandling. Udtrykinduktion kan vurderes ved kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) og ved fluorescensmikroskopi. Denne metode er en alsidig og brugervenlig tilgang til optogenetisk genekspression.
Introduction
Inucible genekspressionssystemer hjælper med at kontrollere mængden, timingen og placeringen af genekspression. Det har imidlertid været en udfordring at opnå nøjagtig rumlig og tidsmæssig kontrol i flercellede organismer. Tidsmæssig kontrol opnås oftest ved at tilføje småmolekyleforbindelser1 eller aktivering af varmechok promotorer2. Stadig, begge tilgange er sårbare over for spørgsmål om timing, induktion styrke, og off-target stress svar. Rumlig kontrol opnås hovedsageligt ved brug af vævsspecifikke initiativtagere3, men denne tilgang kræver et passende promotor- eller reguleringselement, som ikke altid er tilgængeligt, og det er ikke befordrende for induktion på subvævsniveau.
I modsætning til sådanne konventionelle tilgange har lysaktiverede optogenetiske transskriptoratorer potentiale for finere rumlig og tidsmæssig kontrol af genekspression4. Det blå lysfølsomme TAEL/C120-system er udviklet og optimeret til brug i zebrafiskembryoner5,6. Dette system er baseret på en endogen lysaktiveret transskription faktor fra bakterien E. litoralis7,8. TAEL/C120-systemet består af en transskriptionsaktivator kaldet TAEL, der indeholder et Kal-TA4 transaktiveringsdomæne, et blåt lysfølsomt LOV-domæne (lys-ilt-spændingssensor) domæne og et helix-turn-helix (HTH) DNA-bindende domæne5. Når de belyses, gennemgår LOV-domænerne en kropsbygningsændring, der gør det muligt for to TAEL-molekyler at dimerisere, binde sig til en TAEL-lydhør C120-promotor og indlede transskription af et downstream-gen af interesse5,8. TAEL/C120-systemet udviser hurtig og robust induktion med minimal toksicitet, og det kan aktiveres af flere forskellige lette leveringsmetoder. For nylig blev der foretaget forbedringer af TAEL/C120-systemet ved at tilføje et nukleart lokaliseringssignal til TAEL (TAEL-N) og ved at koble C120-reguleringselementet til en cFos basal promotor (C120F) (figur 1A). Disse ændringer forbedrede induktionsniveauet med mere end 15 gange6.
I denne protokol bruges et simpelt LED-panel til at aktivere TAEL/C120-systemet og fremkalde allestedsnærværende udtryk for et reportergen, GFP. Udtryk induktion kan overvåges kvalitativt ved at observere fluorescens intensitet eller kvantitativt ved at måle udskrift niveauer ved hjælp af kvantitative real-time PCR (qRT-PCR). Denne protokol vil demonstrere TAEL/C120-systemet som et alsidigt, brugervenligt værktøj, der muliggør robust regulering af genekspression in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført med godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of California Merced.
1. Zebrafisk passage og embryo indsamling
- Bevar separate transgene zebrafisklinjer, der indeholder enten TAEL-transskriptionsaktivatoren eller det C120-kontrollerede reportergen for at minimere falsk aktivering.
- Kryds 6-8 voksne zebrafisk fra hver linje ved hjælp af standardmetoder9 til fremstilling af dobbelte transgene embryoner, der indeholder både TAEL- og C120-komponenterne (figur 1B).
BEMÆRK: Alternativt kan begge komponenter udtrykkes forbigående gennem mikroinjektion af mRNA eller plasmid DNA ved hjælp af standardmetoder10. - Saml embryoner i petriskåle, der indeholder æggevand (60 μg/mL Instant Ocean havsalt opløst i destilleret vand), med ca. 30 embryoner pr. tilstand, der skal testes.
- Placer opvasken i en lystæt kasse eller dæksel med aluminiumsfolie for at minimere utilsigtet aktivering ved omgivende lys (se tabel 1).
2. Global lys induktion
- Brug et blåt lys (465 nm) LED-panel til at levere aktiverende blåt lys til flere embryoner på én gang.
- Led-panelet placeres i forhold til petriskålene, der indeholder embryoner, således at embryonernes faktiske lyseffekt er ca. 1,5 mW/cm2 målt ved hjælp af en lyseffekt og energimåler (figur 2A).
- Lygten skal pulseres med intervaller på 1 time på/1 h ved hjælp af et timerrelæ, hvis det lyser i mere end 3 timer for at reducere risikoen for fotodamage til TAEL-transskriptionatoren5,8.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at optimere den nøjagtige varighed af belysningen til bestemte applikationer. I denne protokol gives eksempler på belysningsvarighed på 30 min, 1 time, 3 timer og 6 timer. - Fjern Petriskål låg for at minimere lysspredning fra kondens.
- Placer petriskåle, der indeholder kontrolfostre, i en lystæt kasse eller dæksel med aluminiumsfolie til mørk kontrol.
3. Kvantitativ vurdering af induktion ved qRT-PCR
- Fjern embryoner fra belysning efter den ønskede aktiveringsvarighed.
- Uddrag I alt RNA fra 30-50 lysaktiverede og 30-50 mørke embryoner ved hjælp af et RNA-isolationssæt efter sættets anvisninger.
- Overfør embryoner til et 1,5 mL mikrocentrifugerør og fjern overskydende æggevand. Tilsæt lysis buffer og homogeniser embryonerne med en plastik støder.
- Overfør lysatet til en kit-forudsat kolonne og fortsætte med sættets instruktioner. Fortsæt straks til trin 3.3, eller opbevar renset RNA ved -20 °C til -80 °C.
- Brug 1 μg total RNA til cDNA syntese ved hjælp af et cDNA syntesesæt efter sættets anvisninger.
- Tag et tyndvægget 0,2 mL PCR-rør, tilsæt 1 μg RNA til 4 μL 5x cDNA reaktionsmasterblanding (indeholdende optimeret buffer, oligo-dT og tilfældige primere og dNTPs), 1 μL 20x omvendt transskriptaseopløsning og nucleasefrit vand til et samlet volumen på 20 μL.
- Røret placeres i en termocykel, der er programmeret som følger: 22 °C i 10 min, 42 °C i 30 min, 85 °C i 5 min, og hold derefter ved 4 °C. Fortsæt straks til trin 3.4 eller opbevar cDNA ved -20 °C.
- Forbered qPCR-reaktioner, der indeholder SYBR grøn enzym master mix, 5-fold fortyndet cDNA (trin 3.3) og 325 nM af hver primer til GFP.
BEMÆRK: Primere, der bruges i denne protokol som følger. GFP fremad: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP omvendt: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a fremad 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a omvendt: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - Udfør qPCR-reaktioner i en PCR-maskine i realtid.
BEMÆRK: PCR-program: indledende aktivering ved 95 °C i 10 min, efterfulgt af 40 cyklusser på 30 s ved 95 °C, 30 s ved 60 °C og 1 min ved 72 °C. - Udfør en smeltekurve analyse, når PCR er afsluttet for at bestemme reaktion specificitet. Udfør tre tekniske replikeringer for hvert eksempel.
- Beregn lysaktiveret induktion som fold ændring i forhold til embryoner holdes i mørke ved hjælp af 2-ΔΔCt metode11. Statistisk signifikans kan bestemmes med en statistik softwarepakke.
4. Kvalitativ vurdering af induktion ved fluorescensmikroskopi
- Fjern embryonerne fra belysningen efter den ønskede aktiveringstid.
- Immobilisere embryoner til billeddannelse i 3% methylcellulose indeholdende 0,01% tricain i glas depression dias.
- Få fluorescens og brightfield billeder på et fluorescerende stereomikroskop, der er tilsluttet et digitalt kamera ved hjælp af standard GFP-filterindstillinger. Brug identiske indstillinger for billedopsamling for alle eksempler.
- Flet brightfield og fluorescens billeder efter erhvervelsen med billedbehandling software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til denne demonstration blev en C120-responsiv GFP-reporterlinje (Tg(C120F:GFP)ucm107)) krydset med en transgen linje, der udtrykker TAEL-N allestedsnærværende fra den allestedsnærværende b (ubb) promotor (Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) for at producere dobbelt transgene embryoner, der indeholder begge elementer. 24 timer efter befrugtningen blev embryonerne udsat for aktivering af det blå lys, pulseret med en frekvens på 1 time på/1 time off. Induktion af GFP-udtryk blev kvantificeret ved qRT-PCR ved 30 min, 1 h, 3 h og 6 timer efter aktivering (figur 2B og tabel 1). Sammenlignet med kontrol søskende embryoner holdes i mørke, induktion af GFP udtryk blev opdaget så snart 30 min efter det blå lys eksponering. Niveauet af GFP udtryk fortsatte derefter med at stige op til 6 timer efter aktivering støt.
GFP-induktionen blev også kvalitativt vurderet ved at undersøge fluorescensintensiteten samtidig punkter efter aktiveringen (figur 2C-F). GFP fluorescens over baggrundsniveauerne blev først observeret ved 3 timer efter aktivering og blev mærkbart lysere ved 6 timer efter aktivering. I modsætning hertil udviste kontrolfostre for alle tidspunkter, der blev holdt i mørke, ikke nogen mærkbar GFP-fluorescens (figur 2G-J).
Figur 1: Skematisk for TAEL/C120-funktion og eksperimentelt design. (A) TAEL/C120-systemet består af en transskriptionsaktivator kaldet TAEL smeltet sammen til et nukleart lokaliseringssignal (TAEL-N) og et TAEL-responsivt reguleringselement kaldet C120 koblet til en cFos basal promotor (C120F) kørselsekspression af et interessegen. TAEL-afhængig transskription er aktiv i nærværelse af blåt lys, men ikke i mørket. NLS, nuklear lokalisering signal. (B) I denne protokol udtrykkes TAEL-N allestedsnærværende (Tg(ubb:TAEL-N)) til en C120-drevet GFP-reporterlinje (Tg(C120F:GFP)) for at producere dobbelte transgene embryoner. Fra 24 hk udsættes embryonerne for at aktivere blåt lys i forskellige varigheder op til 6 h-illustrationer, der er skabt med et webbaseret videnskabeligt illustrationsværktøj (se Materialetabel). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative resultater af lysaktiveret genekspression med TAEL/C120. (A) En typisk lysaktiveringsopsætning omfatter en blå LED-lyskilde, der er placeret i en inkubator. Petriskåle, der indeholder zebrafiskembryoner, er placeret i forhold til lyskilden, således at lysets modtagne kraft er ca. 1,5 mW/cm2 (prikket linje). Petriskål låg fjernes under lys aktivering for at minimere lys spredning. (B) Kvantificering af GFP mRNA-niveauer efter qRT-PCR på det angivne tidspunkt efter aktivering med blåt lys. Data præsenteres som GFP fold induktion i forhold til søskende kontrol embryoner holdes i mørke. Prikker repræsenterer biologiske kopier (koblinger). Dækkende vandrette søjler repræsenterer middelværdi. Fejllinjer, standardafvigelse. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Envejs ANOVA bestemte p-værdier. (C-J) Repræsentative billeder, der viser GFP fluorescens intensitet af embryoner udsat for blåt lys (C-F) eller holdes i mørke (G-J). Fluorescerende billeder (grøn) er blevet flettet med tilsvarende brightfield billeder (gråtoneskala): skala barer, 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Induktion af GFP-folder Blåt lys (465 nm) |
Induktion af GFP-folder Omgivende lys |
||||||
| Tid Efter belysning | Betyde | Øvre grænse | Nedre grænse | Betyde | Øvre grænse | Nedre grænse | p-værdi |
| 30 min | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1 time | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 timer | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 timer | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
Tabel 1: Sammenligning af TAEL/C120-induceret udtryk med blåt og omgivende lys. Fold induktion af GFP mRNA-niveauer efter eksponering for aktivering af blåt lys (465 nm) eller omgivende lys i den angivne tid, normaliseret for at kontrollere søskendefostre, der holdes i mørke. mRNA-niveauerne blev kvantificeret ved qRT-PCR. Data rapporteres som gennemsnitlig fold induktion +/- øvre og nedre grænser. p-værdierne blev bestemt af flere t-tests. n = 3 koblinger for alle tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver brugen af det optogenetiske TAEL/C120-system til at opnå blåt lysinducerbart genekspression. Dette system består af en transskriptionsaktivator, TAEL, der dimerizes ved belysning med blåt lys og aktiverer transskription af et gen af interesse nedstrøms af et C120-reguleringselement. Induceret udtryk for en GFP reporter kan påvises efter så lidt som 30 min af lys eksponering, tyder på, at denne tilgang besidder relativt hurtig og lydhør kinetikere.
Flere faktorer kan påvirke induktionsniveauer. Mest kritiske er bølgelængden og kraften i at aktivere lys. I denne protokol blev der anvendt 465 nm LED-lys leveret ved 1,5 W/cm2. Kortere og længere bølgelængder (henholdsvis lilla og grønt lys) og lavere lys aktiverer ikke udtrykket effektivt (data, der ikke vises). På den anden side øger mere lyskraft risikoen for fotodamaging embryonerne. For en vellykket anvendelse af TAEL-systemet skal aktiveringslyset således være (1) i det synlige lysspektrums blå rækkevidde og (2) ved tilstrækkelig kraft til at afbalancere effektiv aktivering af TAEL med reduceret risiko for fotodamage. Effektiv lyseffekt kan variere afhængigt af eksperimentelle forhold og skal derfor muligvis empirisk bestemmes. Der bør også udvises forsigtighed for at beskytte embryoner mod omgivende lys, der indeholder en vis mængde blåt lys, før aktivering. Det er blevet konstateret, at TAEL/C120-afhængige udtryk kan fremkaldes af bredspektret omgivende lys, om end på meget lavere niveauer sammenlignet med kun blåt lys (tabel 1).
Mens GFP-udtryk først kan detekteres af qPCR efter 30 minutters belysning, er udtryksniveauerne ikke stabile. Alligevel fortsætter de med at stige, indtil de når et højdepunkt ved 3 timers let behandling, hvorefter disse høje udtryksniveauer opretholdes i op til 6 timer. Disse resultater tyder på, at TAEL/C120-inducerede udtryksniveauer ud over bølgelængde og lyseffekt også er afhængige af belysningsvarighed, i det mindste indtil systemet når en maksimal eller mætningstilstand. I modsætning til disse qPCR-resultater observerer vi ikke kvalitativt mærkbar GFP-fluorescens før efter 3 timers belysning, og fluorescensintensiteten fortsætter med at stige i op til 6 timers belysning. Forskellen mellem qPCR og fluorescensintensitetsobservationer kan sandsynligvis forklares ved den ekstra tid, der er nødvendig for GFP-syntese, foldning og modning-faktorer, der sandsynligvis vil variere afhængigt af interessegen. Derfor kan en vis optimering af belysningsvarigheden være nødvendig afhængigt af applikationen.
Denne protokol præsenterede den mest enkle metode til aktivering af TAEL/C120-systemet ved hjælp af et blåt lys LED-panel til at belyse zebrafiskembryoner globalt. Denne tilgang har fordelene ved både brugervenlighed og omkostningseffektivitet. Lysaktivering kan dog også styres rumligt, hvis det er nødvendigt. Det blev tidligere påvist, at TAEL-induceret udtryk kunne være rumligt begrænset ved hjælp af flere modaliteter til at levere brugerdefineret, rumligt mønstret blåt lys5. Yderligere rumlig specificitet kan opnås ved hjælp af vævsspecifikke initiativtagere til at regulere udtrykket af TAEL-transskriptoren6.
Sammenlignet med stof- eller varmechok-indukible udtrykssystemer tilbyder optogenetiske ekspressionssystemer potentielt bedre rumlig og tidsmæssig kontrol overekspression ved at bruge lys som det inducerende middel. Ud over TAEL/C120 er der udviklet andre lysaktiverede transskriptionssystemer12,13,14,15. TAEL/C120 kan dog være særligt velegnet til brug i zebrafisk (og potentielt andre flercellede systemer) af flere årsager. For det første fungerer TAEL-transskriptionatoren som en homodimer, hvilket forenkler antallet af nødvendige komponenter. Derudover kræver LOV-domæneholdige proteiner som TAEL en flavinchromophore til lysabsorption16. Denne cofaktor er endogent til stede i dyreceller, fjerne behovet for at tilføje en udefrakommende kromohore som med andre systemer. Endelig forventes aktiveret TAEL at have en relativt kort halveringstid på ca. 30 s i mangel af blåt lys8, hvilket muliggør mere præcis on/off kontrol. Denne korte halveringstid betyder imidlertid også, at langvarig eller kronisk udtryk ville kræve langsigtet belysning af embryoner, hvilket måske eller måske ikke er ønskeligt afhængigt af omstændighederne.
Sammenfattende viser denne protokol, at TAEL/C120-systemet er et blåt lysaktiveret genekspressionssystem, der er let at bruge, besidder hurtig og responsiv kinetik og er særligt velegnet til in vivo-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der blev ikke erklæret interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Stefan Materna og medlemmer af Woo og Materna labs for nyttige forslag og kommentarer til denne protokol. Vi takker Anna Reade, Kevin Gardner og Laura Motta-Mena for værdifuld diskussion og indsigt, mens de udvikler denne protokol. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) og University of California Cancer Research Coordination Committee (CRN-20-636896) til S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
