Summary
Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug mit vielfältigen Anwendungen. Dieses Protokoll zeigt, wie eine lichtinduzierbare Genexpression in Zebrafischembryonen mit dem blaulichtempfindlichen TAEL/C120-System erreicht werden kann.
Abstract
Induzierbare Genexpressionssysteme sind ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung biologischer Prozesse. Optogenetische Expressionssysteme können eine präzise Kontrolle über das Timing, den Ort und die Amplitude der Genexpression mit Licht als induzierendem Mittel ermöglichen. In diesem Protokoll wird ein optogenetisches Expressionssystem verwendet, um eine lichtinduzierbare Genexpression in Zebrafischembryonen zu erreichen. Dieses System basiert auf einem künstlichen Transkriptionsfaktor namens TAEL, der auf einem natürlich vorkommenden lichtaktivierten Transkriptionsfaktor des Bakteriums E. litoralisbasiert. Bei blauer Beleuchtung dimerisiert TAEL, bindet an sein verwandtes regulatorisches Element namens C120 und aktiviert die Transkription. Dieses Protokoll verwendet transgene Zebrafischembryonen, die den TAEL-Transkriptionsfaktor unter der Kontrolle des allgegenwärtigen Ubb-Promotors exprimieren. Gleichzeitig treibt das regulatorische Element C120 die Expression eines fluoreszierenden Reportergens (GFP) an. Mit einem einfachen LED-Panel zur Abgabe von aktivierendem blauem Licht kann die Induktion der GFP-Expression erst nach 30 Minuten Beleuchtung erkannt werden und erreicht nach 3 Stunden Lichtbehandlung einen Höhepunkt von mehr als 130-facher Induktion. Die Expressionsinduktion kann mittels quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) und fluoreszenzmikroskopischer Mikroskopie beurteilt werden. Diese Methode ist ein vielseitiger und einfach zu bedienender Ansatz für die optogenetische Genexpression.
Introduction
Induzierbare Genexpressionssysteme helfen, die Menge, den Zeitpunkt und den Ort der Genexpression zu kontrollieren. Es war jedoch eine Herausforderung, eine genaue räumliche und zeitliche Kontrolle in mehrzelligen Organismen zu erreichen. Die zeitliche Kontrolle wird am häufigsten durch Zugabe von niedermolekularen Verbindungen1 oder Aktivierung von Hitzeschockpromotoren2erreicht. Dennoch sind beide Ansätze anfällig für Probleme des Timings, der Induktionsstärke und der Stressreaktionen außerhalb des Ziels. Die räumliche Kontrolle wird hauptsächlich durch die Verwendung von gewebespezifischen Promotorenerreicht 3, aber dieser Ansatz erfordert einen geeigneten Promotor oder ein regulatorisches Element, die nicht immer verfügbar sind, und es ist nicht förderlich für die Induktion auf Untergewebeebene.
Im Gegensatz zu solchen herkömmlichen Ansätzen haben lichtaktivierte optogenetische Transkriptionsaktivatoren das Potenzial für eine feinere räumliche und zeitliche Kontrolle der Genexpression4. Das blaulichtempfindliche TAEL/C120-System wurde für den Einsatz in Zebrafischembryonen5,6entwickelt und optimiert. Dieses System basiert auf einem endogenen lichtaktivierten Transkriptionsfaktor aus dem Bakterium E. litoralis7,8. Das TAEL/C120-System besteht aus einem Transkriptionsaktivator namens TAEL, der eine Kal-TA4-Transaktivierungsdomäne, eine blaulichtempfindliche LOV-Domäne (Light-Oxygen-Voltage Sensing) und eine Helix-Turn-Helix (HTH) DNA-Bindungsdomäne5enthält. Wenn sie beleuchtet werden, durchlaufen die LOV-Domänen eine Konformationsänderung, die es zwei TAEL-Molekülen ermöglicht, zu dimerisieren, an einen TAEL-responsiven C120-Promotor zu binden und die Transkription eines nachgeschalteten Gens von Interesseeinzuleiten 5,8. Das TAEL/C120-System weist eine schnelle und robuste Induktion mit minimaler Toxizität auf und kann durch verschiedene Lichtabgabemodalitäten aktiviert werden. Vor kurzem wurden Verbesserungen am TAEL/C120-System vorgenommen, indem ein nukleares Lokalisierungssignal zu TAEL (TAEL-N) hinzugefügt und das C120-Regulationselement an einen cFos-Basalpromotor (C120F) gekoppelt wurde(Abbildung 1A). Diese Modifikationen verbesserten die Induktion um mehr als das 15-fache6.
In diesem Protokoll wird ein einfaches LED-Panel verwendet, um das TAEL / C120-System zu aktivieren und die allgegenwärtige Expression eines Reportergens, GFP, zu induzieren. Die Expressionsinduktion kann qualitativ durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität oder quantitativ durch Messung der Transkriptspiegel mittels quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) überwacht werden. Dieses Protokoll wird das TAEL/C120-System als vielseitiges, einfach zu bedienendes Werkzeug demonstrieren, das eine robuste Regulierung der Genexpression in vivoermöglicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Diese Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California Merced durchgeführt.
1. Zebrafischkreuzung und Embryonentnahme
- Halten Sie separate transgene Zebrafischlinien aufrecht, die entweder den TAEL-Transkriptionsaktivator oder das C120-kontrollierte Reportergen enthalten, um eine falsche Aktivierung zu minimieren.
- Kreuzen Sie 6-8 erwachsene Zebrafische aus jeder Linie mit Standardmethoden9, um doppelte transgene Embryonen zu erzeugen, die sowohl die TAEL- als auch die C120-Komponente enthalten (Abbildung 1B).
HINWEIS: Alternativ können beide Komponenten transient durch Mikroinjektion von mRNA oder Plasmid-DNA mit Standardmethoden exprimiert werden10. - Sammeln Sie Embryonen in Petrischalen, die Eiwasser enthalten (60 μg / ml Instant Ocean Meersalz, gelöst in destilliertem Wasser), wobei etwa 30 Embryonen pro Zustand getestet werden müssen.
- Stellen Sie das Geschirr in eine lichtdichte Box oder decken Sie es mit Aluminiumfolie ab, um eine unbeabsichtigte Aktivierung durch Umgebungslicht zu minimieren (siehe Tabelle 1).
2. Globale Lichtinduktion
- Verwenden Sie ein Blaulicht-LED-Panel (465 nm), um mehrere Embryonen gleichzeitig aktivierendes blaues Licht zu liefern.
- Positionieren Sie das LED-Panel relativ zu den Petrischalen, die Embryonen enthalten, so dass die tatsächliche Lichtleistung, die von den Embryonen empfangen wird, ungefähr 1,5 mW/ cm2 beträgt, gemessen mit einem Lichtleistungs- und Energiemessgerät (Abbildung 2A).
- Pulsieren Sie das Licht in Abständen von 1 h ein / 1 h aus mit einem Timerrelais, wenn Sie mehr als 3 h leuchten, um das Risiko einer Fotoschäden für den TAEL-Transkriptionsaktivator zu reduzieren5,8.
HINWEIS: Die genaue Beleuchtungsdauer muss möglicherweise für bestimmte Anwendungen optimiert werden. In diesem Protokoll werden Beispiele für Beleuchtungsdauern von 30 min, 1 h, 3 h und 6 h bereitgestellt. - Entfernen Sie die Deckel der Petrischale, um die Lichtstreuung durch Kondensation zu minimieren.
- Legen Sie Petrischalen mit Kontrollembryonen in eine lichtdichte Box oder decken Sie sie mit Aluminiumfolie für dunkle Kontrollen ab.
3. Quantitative Beurteilung der Induktion mittels qRT-PCR
- Entfernen Sie Embryonen nach der gewünschten Aktivierungsdauer aus der Beleuchtung.
- Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus 30-50 lichtaktivierten und 30-50 dunklen Embryonen mit einem RNA-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Kits.
- Übertragen Sie die Embryonen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie überschüssiges Eiwasser. Fügen Sie Lysepuffer hinzu und homogenisieren Sie die Embryonen mit einem Kunststoffstößel.
- Übertragen Sie das Lysat in eine mit dem Kit bereitgestellte Säule und fahren Sie mit den Anweisungen des Kits fort. Fahren Sie sofort mit Schritt 3.3 fort oder lagern Sie gereinigte RNA bei -20 °C bis -80 °C.
- Verwenden Sie 1 μg Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese mit einem cDNA-Synthese-Kit gemäß den Anweisungen des Kits.
- Nehmen Sie eine dünnwandige 0,2 ml PCR-Röhrchen, fügen Sie 1 μg RNA zu 4 μL 5x cDNA-Reaktionsmaster-Mix (mit optimiertem Puffer, Oligo-dT und zufälligen Primern sowie dNTPs), 1 μL 20x Reverse Transkriptase-Lösung und nukleasefreiem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 20 μL hinzu.
- Legen Sie das Rohr in einen Thermocycler, der wie folgt programmiert ist: 22 °C für 10 min, 42 °C für 30 min, 85 °C für 5 min und dann bei 4 °C halten. Fahren Sie sofort mit Schritt 3.4 fort oder lagern Sie cDNA bei -20 °C.
- Bereiten Sie qPCR-Reaktionen vor, die SYBR Green Enzyme Master Mix, 5-fach verdünnte cDNA (Schritt 3.3) und 325 nM jeder Grundierung für GFP enthalten.
HINWEIS: Primer, die in diesem Protokoll wie folgt verwendet werden. GFP vorwärts: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP rückseite: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverse: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - Führen Sie qPCR-Reaktionen in einer Echtzeit-PCR-Maschine durch.
HINWEIS: PCR-Programm: Erstaktivierung bei 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 95 °C, 30 s bei 60 °C und 1 min bei 72 °C. - Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse durch, sobald die PCR abgeschlossen ist, um die Reaktionsspezifität zu bestimmen. Führen Sie für jedes Beispiel drei technische Replikate durch.
- Berechnen Sie die lichtaktivierte Induktion als Faltenänderung relativ zu Embryonen, die im Dunkeln gehalten werden, mit der2-ΔΔCt-Methode 11. Die statistische Signifikanz kann mit einem Statistik-Softwarepaket ermittelt werden.
4. Qualitative Beurteilung der Induktion durch Fluoreszenzmikroskopie
- Entfernen Sie die Embryonen nach der gewünschten Aktivierungsdauer aus der Beleuchtung.
- Immobilisieren Sie Embryonen für die Bildgebung in 3% Methylcellulose mit 0,01% Tricain in Glasdepressionobjektträgern.
- Erfassen Sie Fluoreszenz- und Hellfeldbilder auf einem fluoreszierenden Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera verbunden ist, mit Standard-GFP-Filtereinstellungen. Verwenden Sie identische Bilderfassungseinstellungen für alle Samples.
- Verschmelzen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder nach der Aufnahme mit einer Bildverarbeitungssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Für diese Demonstration wurde eine C120-responsive GFP-Reporterlinie (Tg(C120F:GFP)ucm107)) mit einer transgenen Linie gekreuzt, die TAEL-N ubiquitär aus dem Ubiquitin b (ubb) -Promotor (Tg (ubb: TAEL-N)ucm113) exprimiert, um doppelte transgene Embryonen zu erzeugen, die beide Elemente enthalten. 24 h nach der Befruchtung wurden die Embryonen der Aktivierung des blauen Lichts ausgesetzt, das mit einer Frequenz von 1 h an / 1 h aus gepulst wurde. Die Induktion der GFP-Expression wurde mittels qRT-PCR nach 30 min, 1 h, 3 h und 6 h nach der Aktivierung quantifiziert (Abbildung 2B und Tabelle 1). Im Vergleich zu Kontroll-Geschwisterembryonen, die im Dunkeln gehalten wurden, wurde die Induktion der GFP-Expression bereits 30 Minuten nach der Blaulichtexposition festgestellt. Die GFP-Expression stieg dann bis zu 6 Stunden nach der Aktivierung stetig an.
Die GFP-Induktion wurde auch qualitativ bewertet, indem die Fluoreszenzintensität gleichzeitig nach der Aktivierung untersucht wurde (Abbildung 2C-F). Die GFP-Fluoreszenz über dem Hintergrundniveau wurde erstmals um 3 Stunden nach der Aktivierung beobachtet und wurde nach 6 Stunden nach der Aktivierung merklich heller. Im Gegensatz dazu wiesen Kontrollembryonen für alle Zeitpunkte, die im Dunkeln gehalten wurden, keine nennenswerte GFP-Fluoreszenz auf (Abbildung 2G-J).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der TAEL/C120-Funktion und des experimentellen Designs. (A) Das TAEL/C120-System besteht aus einem Transkriptionsaktivator namens TAEL, der mit einem nuklearen Lokalisierungssignal (TAEL-N) verschmolzen ist, und einem TAEL-responsiven regulatorischen Element namens C120, das an einen cFos-Basalpromotor (C120F) gekoppelt ist, der die Expression eines interessierenden Gens antreibt. Die TAEL-abhängige Transkription ist in Gegenwart von blauem Licht aktiv, aber nicht im Dunkeln. NLS, nukleares Lokalisierungssignal. (B) In diesem Protokoll exprimiert eine transgene Linie TAEL-N ubiquitär (Tg (ubb: TAEL-N)) wird zu einer C120-gesteuerten GFP-Reporterlinie (Tg (C120F: GFP)) gekreuzt, um doppelte transgene Embryonen zu erzeugen. Ab 24 PSf werden die Embryonen für verschiedene Dauer bis zu 6 h-Illustrationen, die mit einem webbasierten wissenschaftlichen Illustrationstool erstellt wurden, dem aktivierenden blauen Licht ausgesetzt (siehe Materialtabelle). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der lichtaktivierten Genexpression mit TAEL/C120. (A) Ein typischer Lichtaktivierungsaufbau umfasst eine blaue LED-Lichtquelle, die in einem Inkubator platziert wird. Petrischalen mit Zebrafischembryonen sind relativ zur Lichtquelle positioniert, so dass die empfangene Lichtleistung ca. 1,5 mW/cm2 beträgt (gepunktete Linie). Petrischalendeckel werden während der Lichtaktivierung entfernt, um die Lichtstreuung zu minimieren. (B) Quantifizierung der GFP-mRNA-Spiegel durch qRT-PCR zu den angegebenen Zeitpunkten nach Aktivierung mit blauem Licht. Die Daten werden als GFP-Falteninduktion im Vergleich zu Geschwisterkontrollembryonen dargestellt, die im Dunkeln gehalten werden. Punkte stehen für biologische Replikate (Clutches). Durchgezogene horizontale Balken stellen den Mittelwert dar. Fehlerbalken, Standardabweichung. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Einweg-ANOVA ermittelte p-Werte. (C-J) Repräsentative Bilder, die die GFP-Fluoreszenzintensität von Embryonen zeigen, die blauem Licht ausgesetzt sind (C-F) oder im Dunkeln gehalten werden (G-J). Fluoreszierende Bilder (grün) wurden mit entsprechenden Hellfeldbildern (Graustufen) zusammengeführt: Skalenbalken, 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| GFP-Faltung Blaues Licht (465 nm) |
GFP-Faltung Umgebungslicht |
||||||
| Zeit nach der Beleuchtung | Bedeuten | Obergrenze | Untere Grenze | Bedeuten | Obergrenze | Untere Grenze | p-Wert |
| 30 Min. | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1 Std. | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 Std. | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 Std. | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
Tabelle 1: Vergleich der TAEL/C120-induzierten Expression durch Blau- und Umgebungslicht. Falteninduktion der GFP-mRNA-Spiegel nach Exposition gegenüber aktivierendem blauem Licht (465 nm) oder Umgebungslicht für die angegebene Zeit, normalisiert, um Geschwisterembryonen zu kontrollieren, die im Dunkeln gehalten werden. Die mRNA-Spiegel wurden mittels qRT-PCR quantifiziert. Die Daten werden als durchschnittliche Falteninduktion +/- obere und untere Grenzen gemeldet. p-Werte wurden durch mehrere t-Testsermittelt. n = 3 Kupplungen für alle Zeitpunkte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des optogenetischen TAEL/C120-Systems, um eine blaulichtinduzierbare Genexpression zu erreichen. Dieses System besteht aus einem Transkriptionsaktivator, TAEL, der bei Beleuchtung mit blauem Licht dimerisiert und die Transkription eines Gens von Interesse nach einem C120-Regulationselement aktiviert. Die induzierte Expression eines GFP-Reporters kann bereits nach 30 Minuten Lichteinwirkung nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass dieser Ansatz eine relativ schnelle und reaktionsschnelle Kinetik besitzt.
Mehrere Faktoren können das Induktionsniveau beeinflussen. Am kritischsten sind die Wellenlänge und die Kraft der Aktivierung von Licht. In diesem Protokoll wurden 465 nm LED-Leuchten mit 1,5 W/cm2 verwendet. Kürzere und längere Wellenlängen (violettes bzw. grünes Licht) und eine geringere Lichtleistung aktivieren die Expression nicht effektiv (Daten nicht gezeigt). Auf der anderen Seite erhöht mehr Lichtkraft das Risiko, die Embryonen zu photodamagingen. Für eine erfolgreiche Nutzung des TAEL-Systems muss das aktivierende Licht daher (1) im blauen Bereich des sichtbaren Lichtspektrums und (2) mit ausreichender Leistung sein, um eine effektive Aktivierung von TAEL mit einem reduzierten Photoschadenrisiko in Einklang zu bringen. Die effektive Lichtleistung kann je nach experimentellen Bedingungen variieren und muss daher möglicherweise empirisch bestimmt werden. Es sollte auch darauf geachtet werden, die Embryonen vor der Aktivierung vor Umgebungslicht zu schützen, das eine gewisse Menge an blauem Licht enthält. Es wurde festgestellt, dass die TAEL/C120-abhängige Expression durch Breitspektrum-Umgebungslicht induziert werden kann, wenn auch in viel niedrigeren Konzentrationen im Vergleich zu nur blauem Licht (Tabelle 1).
Während die GFP-Expression erst nach 30 Minuten Beleuchtung durch qPCR erkannt werden kann, sind die Expressionspegel nicht gleichmäßig. Dennoch steigen sie weiter an, bis sie bei 3 h Lichtbehandlung einen Höhepunkt erreichen, wonach diese hohen Expressionsniveaus bis zu 6 h lang aufrechterhalten werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass neben Wellenlänge und Lichtleistung auch TAEL/C120-induzierte Expressionsniveaus von der Beleuchtungsdauer abhängig sind, zumindest bis das System einen Maximal- oder Sättigungszustand erreicht. Im Gegensatz zu diesen qPCR-Ergebnissen beobachten wir qualitativ erst nach 3 h Beleuchtung eine nennenswerte GFP-Fluoreszenz, und die Fluoreszenzintensität nimmt für bis zu 6 h Beleuchtung weiter zu. Die Diskrepanz zwischen der qPCR- und der Fluoreszenzintensitätsbeobachtung erklärt sich wahrscheinlich durch die zusätzliche Zeit, die für die GFP-Synthese, -Faltung und -Reifung benötigt wird, die je nach interessierendem Gen variieren können. Daher kann je nach Anwendung eine gewisse Optimierung der Beleuchtungsdauer erforderlich sein.
Dieses Protokoll stellte die einfachste Methode zur Aktivierung des TAEL/C120-Systems mit einem Blaulicht-LED-Panel zur globalen Beleuchtung von Zebrafischembryonen dar. Dieser Ansatz hat die Vorteile sowohl der Benutzerfreundlichkeit als auch der Wirtschaftlichkeit. Die Lichtaktivierung kann bei Bedarf aber auch räumlich gesteuert werden. Es wurde bereits gezeigt, dass taEL-induzierte Expression räumlich eingeschränkt werden kann, indem mehrere Modalitäten verwendet werden, um benutzerdefiniertes, räumlich gemustertes blaues Licht zu liefern5. Zusätzliche räumliche Spezifität kann mit gewebespezifischen Promotoren erreicht werden, um die Expression des TAEL-Transkriptionsaktivators zu regulieren6.
Im Vergleich zu medikamenten- oder hitzeschockinduzierbaren Expressionssystemen bieten optogenetische Expressionssysteme potenziell eine bessere räumliche und zeitliche Kontrolle der Überexpression, indem sie Licht als induzierendes Mittel verwenden. Neben TAEL/C120 wurden weitere lichtaktivierte Transkriptionssysteme entwickelt12,13,14,15. TAEL/C120 kann jedoch aus mehreren Gründen besonders gut für den Einsatz bei Zebrafischen (und möglicherweise anderen mehrzelligen Systemen) geeignet sein. Erstens fungiert der TAEL-Transkriptionsaktivator als Homodimer, was die Anzahl der erforderlichen Komponenten vereinfacht. Darüber hinaus benötigen LOV-domänenhaltige Proteine wie TAEL ein Flavinchromophor zur Lichtabsorption16. Dieser Cofaktor ist endogen in tierischen Zellen vorhanden, wodurch die Notwendigkeit entsteht, wie bei anderen Systemen ein exogenes Chromophor hinzuzufügen. Schließlich wird dem aktivierten TAEL eine relativ kurze Halbwertszeit von etwa 30 s in Abwesenheit von blauem Licht8vorhergesagt, was eine präzisere Ein- / Aus-Steuerung ermöglicht. Diese kurze Halbwertszeit bedeutet jedoch auch, dass eine langfristige oder chronische Expression eine langfristige Beleuchtung der Embryonen erfordern würde, was je nach den Umständen wünschenswert sein kann oder auch nicht.
Zusammenfassend zeigt dieses Protokoll, dass das TAEL/C120-System ein blaulichtaktiviertes Genexpressionssystem ist, das einfach zu bedienen ist, eine schnelle und reaktionsschnelle Kinetik besitzt und sich besonders gut für In-vivo-Anwendungen eignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Stefan Materna und den Mitgliedern der Woo- und Materna-Labore für hilfreiche Anregungen und Kommentare zu diesem Protokoll. Wir danken Anna Reade, Kevin Gardner und Laura Motta-Mena für wertvolle Diskussionen und Einblicke bei der Entwicklung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) und das University of California Cancer Research Coordinating Committee (CRN-20-636896) an S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
