Summary
광유전학은 광범위한 응용 프로그램을 가진 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 청색 광 반응 TAEL/C120 시스템을 사용하여 제브라피시 배아에서 빛을 유도할 수 없는 유전자 발현을 달성하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
유도 성 유전자 발현 시스템은 생물학적 과정을 연구하기위한 귀중한 도구입니다. 광유전학 적 발현 시스템은 유도제로 빛을 사용하여 유전자 발현 타이밍, 위치 및 진폭에 대한 정밀한 제어를 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 광유전학 발현 시스템은 제브라피시 배아에서 빛을 유도할 수 없는 유전자 발현을 달성하기 위하여 이용됩니다. 이 시스템은 박테리아 E. litoralis에서자연적으로 발생하는 빛 활성화 전사 인자를 기반으로 TAEL이라는 엔지니어링 전사 인자에 의존한다. 파란색 광으로 조명되면 TAEL은 C120이라는 코그네이트 규제 요소에 팽창하고 전사를 활성화합니다. 이 프로토콜은 유비쿼터스 유브 프로모터의 통제 하에 TAEL 전사 인자를 표현하는 형질전환 제브라피시 배아를 사용합니다. 동시에, C120 조절 원소는 형광 기자 유전자(GFP)의 발현을 구동한다. 간단한 LED 패널을 사용하여 활성화된 청색광을 전달하며, GFP 발현의 유도는 30분 후에 먼저 검출될 수 있으며 3시간 이상의 광처리 후 130배 이상의 유도에 도달할 수 있다. 발현 유도는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 및 형광 현미경 검사법에 의해 평가될 수 있다. 이 방법은 광유전학 유전자 발현을 위한 다재다능하고 사용하기 쉬운 접근법입니다.
Introduction
유도 성 유전자 발현 시스템은 유전자 발현의 양, 타이밍 및 위치를 제어하는 데 도움이됩니다. 그러나, 다세포 유기체에 있는 정확한 공간 및 측두색 통제를 달성하는 것은 도전적이고 있습니다. 측두성 조절은 가장 일반적으로 소분자 화합물 을 첨가하여 달성1 또는 열 충격 프로모터2의 활성화. 여전히 두 가지 접근 방식은 타이밍, 유도 강도 및 오프 타겟 스트레스 응답 문제에 취약합니다. 공간 제어는 주로 조직 별 발기인3의사용에 의해 달성되지만,이 방법은 항상 사용할 수없는 적합한 프로모터 또는 규제 요소를 필요로하며, 하위 조직 수준 유도에 도움이되지 않습니다.
이러한 종래의 접근법과는 달리, 빛 활성화된 광유전적 전사 활성제는 유전자 발현4의더 미세한 공간 및 측두각 제어를 위한 잠재력을 갖는다. 파란색 광 반응형 TAEL/C120 시스템은 제브라피시 배아5,6에서사용하도록 개발및 최적화되었다. 본 시스템은 박테리아 E. 리토랄리스7,8로부터내인성 빛 활성화 전사 인자를 기반으로 한다. TAEL/C120 시스템은 Kal-TA4 트랜스활성화 도메인, 청색 광 반응형 LOV(광산소전압 감지) 도메인, 나선 턴-나선(HTH) DNA 결합 도메인5를포함하는 TAEL이라는 전사 활성제로 구성된다. 조명시, LOV 도메인은 두 개의 TAEL 분자가 분담하고, TAEL 반응형 C120 프로모터에 결합하고, 관심 있는 다운스트림 유전자의 전사를 개시하는 것을 허용하는 형태 변화를 겪습니다5,8. TAEL/C120 시스템은 독성을 최소화하여 신속하고 견고한 유도를 나타내며, 여러 가지 다른 광 전달 양식에 의해 활성화될 수 있습니다. 최근에는 TAEL/C120 시스템의 개선은 TAEL(TAEL-N)에 핵국소화 신호를 추가하고 C120 조절 요소를 cFos 기저 프로모터(C120F)(도1A)에결합하여 이루어졌다. 이러한 수정은 유도 수준을 15배 이상6배이상 향상시킴으로써.
이 프로토콜에서, 간단한 LED 패널은 TAEL/C120 시스템을 활성화하고 기자 유전자, GFP의 유비쿼터스 발현을 유도하는 데 사용된다. 발현 유도는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 사용하여 성적증명서 수준을 측정하여 형광 강도를 관찰하거나 정량적으로 관찰함으로써 질적으로 모니터링될 수 있다. 이 프로토콜은 TAEL/C120 시스템을 생체 내에서유전자 발현의 강력한 조절을 가능하게 하는 다재다능하고 사용하기 쉬운 도구로 시연할 것이다.
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Protocol
이 연구는 캘리포니아 메르세데스 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인으로 수행되었습니다.
1. 제브라피시 횡단 및 배아 수집
- TAEL 전사 활성제 또는 C120 대조 기자 유전자를 포함하는 별도의 형질전환 제브라피시 라인을 유지하여 스퓨리어스 활성화를 최소화한다.
- 표준 방법9를 사용하여 각 라인에서 6-8 성인 제브라피쉬를 교차하여 TAEL 및 C120성분(도 1B)을모두 포함하는 이중 형질전환 배아를 생성한다.
참고: 대안적으로, 두 성분 모두 표준방법(10)을사용하여 mRNA 또는 플라스미드 DNA의 미세 주입을 통해 과도하게 발현될 수 있다. - 달걀 물(증류수에 용해된 60 μg/mL 인스턴트 오션 바다 소금)이 함유된 페트리 접시에 배아를 수집하며, 조건당 약 30개의 배아를 테스트합니다.
- 주변 광에 의한 의도하지 않은 활성화를 최소화하기 위해 광루프 상자 또는 알루미늄 호일로 덮어 놓습니다(표 1참조).
2. 글로벌 라이트 유도
- 청색광(465nm) LED 패널을 사용하여 여러 배아에 한 번에 활성화된 청색광을 전달합니다.
- 배아를 함유하는 페트리 접시에 대한 LED 패널을 배치하여 배아에 의해 수신된 빛의 실제 전력이 광출력 및 에너지 계측기(도2A)에의해 측정된 약 1.5mW/cm2입니다.
- 3시간 이상 조명하면 타이머 릴레이를 이용하여 1h on/1h 간격으로 빛을 펄스하여 TAEL 전사 활성기5,8에대한 광손상 위험을 감소시다.
참고: 조명의 정확한 지속 시간을 특정 응용 프로그램에 최적화해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 30분, 1h, 3h 및 6h의 조명 지속 시간의 예가 제공됩니다. - 페트리 접시 뚜껑을 제거하여 응축에서 빛이 산란되는 것을 최소화합니다.
- 제어 배아가 들어 있는 페트리 접시를 방광 상자에 놓거나 알루미늄 호일로 덮어 어두운 컨트롤을 만듭니다.
3. qRT-PCR에 의한 유도의 정량적 평가
- 원하는 활성화 기간 후에 조명에서 배아를 제거합니다.
- 키트의 지시에 따라 RNA 격리 키트를 사용하여 30-50 광 활성화 및 30-50 개의 어두운 배아에서 총 RNA를 추출하십시오.
- 배아를 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기고 과도한 달걀 물을 제거합니다. 리시스 버퍼를 추가하고 플라스틱 봉헌으로 배아를 균질화합니다.
- lysate를 키트가 제공한 열로 옮기고 키트의 지침을 계속 사용합니다. 즉시 3.3 단계로 진행하거나 정제 된 RNA를 -20 °C에서 -80 °C로 저장합니다.
- 키트의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA 합성에 1 μg 총 RNA를 사용합니다.
- 얇은 벽0.2 mL PCR 튜브를 가지고, 5x cDNA 반응 마스터 믹스 (최적화 된 버퍼, 올리고 dT 및 임의프라이머, dNTP 포함), 20 배 역 전사 용액의 1 μL 및 20L μ의 총 부피에 뉴클레아제없는 물을 4 μL에 RNA 1 μg를 추가합니다.
- 다음과 같이 프로그래밍된 열순환기에 튜브를 배치: 22°C 10분, 42°C30분, 85°C 5분 동안, 그리고 4°C에서 누릅니다. 즉시 3.4 단계로 진행하거나 -20 °C에서 cDNA를 저장합니다.
- SYBR 녹색 효소 마스터 믹스, 5배 희석 cDNA(단계 3.3), GFP용 각 프라이머325nM을 함유한 qPCR 반응을 준비한다.
참고: 이 프로토콜에 사용되는 프라이머는 다음과 같습니다. GFP 포워드: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP 역: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a 포워드 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a 역: 5'-CAAGAAGAGTACCTAGTACCTAGCAT-3'). - 실시간 PCR 기계에서 qPCR 반응을 수행합니다.
참고 : PCR 프로그램 : 10 분 동안 95 °C에서 초기 활성화, 95 ° C에서 30 초40 사이클, 60 °C에서 30 초, 72 °C에서 1 분. - PCR이 완료되면 용융 곡선 해석을 수행하여 반응 특이성을 결정합니다. 각 샘플에 대해 세 가지 기술 복제를 수행합니다.
- 2-ΔΔCt 방법(11)을사용하여 어둠 속에서 유지된 배아에 비해 접힌 변화가 있기 때문에 광 활성화 유도를 계산한다. 통계적 유의성은 통계 소프트웨어 패키지로 결정할 수 있습니다.
4. 형광 현미경 검사법에 의한 유도의 질적 평가
- 활성화의 원하는 기간 후에 조명에서 배아를 제거합니다.
- 유리 우울증 슬라이드에서 0.01 % 트리카인을 함유 한 3 % 메틸 셀룰로오스에서 이미징을위한 배아를 고정합니다.
- 표준 GFP 필터 설정을 사용하여 디지털 카메라에 연결된 형광 스테레오현미경으로 형광 및 밝은 필드 이미지를 획득합니다. 모든 샘플에 대해 동일한 이미지 수집 설정을 사용합니다.
- 이미지 처리 소프트웨어와 인수 후 밝은 필드와 형광 이미지를 병합합니다.
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Representative Results
이 데모에서는 C120 반응형 GFP 리포터라인(Tg(C120F:GFP)ucm107)이 유비퀴틴 b(ubb)프로모터(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)로부터타엘-N 유비쿼터스를 발현하는 형질선과 교차하여 이중 암분요소를 함유하고 있다. 24h 후 수정, 배아는 청색광을 활성화하기 위해 노출되었고, 1h on/1 hoff의 주파수로 펄스되었다. GFP 발현의 유도는 qRT-PCR에 의해 30분, 1h, 3h 및 6h 사후활성화(도 2B 및 표 1)로정량화되었다. 대조군 형제 배아가 어둠 속에서 유지됨에 비해, GFP 발현의 유도는 청색광 노출 후 30분 즉시 검출되었다. 그런 다음 GFP 발현 의 수준은 활성화 후 6 시간까지 꾸준히 증가했습니다.
GFP 유도는 또한 활성화 후시점(도 2C-F)을동시에 검사하여 질적으로 평가하였다. 배경 수준 위의 GFP 형광은 처음 3 h 후 활성화에서 관찰되었고 6 h 후 활성화에서 눈에 띄게 밝아졌습니다. 대조적으로, 어둠 속에서 유지된 모든 시간 점에 대한 대조배아는 어떤 감사한 GFP 형광(도2G-J)을나타내지 않았다.
도 1: TAEL/C120 기능 및 실험 설계의 회로도. (A)TAEL/C120 시스템은 원자력 국소화 신호(TAEL-N)에 융합된 TAEL이라는 전사 활성제와 c120이라는 TL 반응형 조절 요소로 구성되어 있습니다. TAEL 의존적 전사는 청색광이 있는 상황에서는 활발하지만 어둠에는 있지 않습니다. NLS, 핵 국소화 신호. (B)본 프로토콜에서, 형질전환선은 이중 형질형 배아를 생산하기 위해 C120 구동 GFP 리포터라인(Tg(C120F:GFP)으로교차하여 TAEL-N유비쿼터스(Tg:TAEL-N)를표현한다. 24hpf부터 배아는 웹 기반 과학 일러스트 도구로 만든 최대 6h-일러스트레이션동안 청색광을 활성화하는 데 노출됩니다(재료표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: TAEL/C120을 사용하여 광 활성화 유전자 발현의 대표적인 결과. (A)전형적인 광 활성화 설정은 인큐베이터에 배치된 청색 LED 광원을 포함한다. 제브라피쉬 배아를 함유한 페트리 접시는 광원에 비해 배치되어 수신된 빛의 힘이 약 1.5mW/cm 2(점선)입니다. 페트리 접시 뚜껑은 빛 산란을 최소화하기 위해 빛 활성화 중에 제거됩니다. (B)청색광으로 활성화한 후 표시된 시점에서 qRT-PCR에 의한 GFP mRNA 수준을 정량화한다. 데이터는 어둠 속에서 유지 형제 대조군 배아에 비해 GFP 접이식 유도로 제시된다. 점은 생물학적 복제(클러치)를 나타냅니다. 솔리드 가로 막대는 평균을 나타냅니다. 오류 막대, 표준 편차. *p < 0.05, **p < 0.01, *p < 0.001. 단방향 ANOVA는 p 값을 결정했습니다. (C-J) 청색광(C-F)에 노출되거나 어둠 속에서 유지된 배아의 GFP 형광 강도를 보여주는 대표적인이미지(G-J). 형광 이미지(녹색)는 해당 밝은 필드 이미지 (회색 스케일)와 병합되었습니다 : 스케일 바, 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| GFP 폴드 유도 블루 라이트 (465 nm) |
GFP 폴드 유도 주변 광등 |
||||||
| 시간 후 조명 | 의미하다 | 상한 | 하한 | 의미하다 | 상한 | 하한 | p 값 |
| 30분 | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1h | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 시간 | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 h | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
표 1: 파란색 및 주변 광으로 TAEL/C120 유도된 발현을 비교합니다. 표시된 시간 동안 청광(465nm) 또는 주변 광을 활성화하기 위해 노출 된 후 GFP mRNA 수준의 접이식 유도, 어둠 속에서 유지 형제 배아를 제어하기 위해 정규화. mRNA 수준은 qRT-PCR에 의해 정량화되었다. 데이터는 평균 접이식 유도 +/- 상하한으로 보고됩니다. p 값은 여러 t-테스트에 의해 결정되었습니다. n = 모든 시간 포인트에 대한 3 클러치.
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Discussion
이 프로토콜은 청색 광 유도성 유전자 발현을 달성하기 위하여 광유전학 TAEL/C120 시스템의 사용을 기술합니다. 이 시스템은 발광시 블루라이트로 이산화하고 C120 조절 요소의 하류에 대한 관심 유전자의 전사를 활성화하는 전사 활성제 인 TAEL로 구성됩니다. GFP 리포터의 유도된 발현은 30분 에 불과한 빛 노출 후에 검출될 수 있으며, 이는 이 접근법이 상대적으로 빠르고 반응성이 뛰어난 운동학을 가지고 있음을 시사한다.
몇몇 요인은 유도 수준에 영향을 미칠 수 있습니다. 가장 중요한 것은 빛을 활성화시키는 파장과 힘입니다. 이 프로토콜에서는 1.5W/cm2에서 전달된 465nm LED 조명이 사용되었습니다. 파장이 짧고 길어지고(각각 보라색과 녹색 광)와 낮은 광전력은 발현을 효과적으로 활성화하지 못한다(데이터가 표시되지 않음). 다른 한편으로는, 더 많은 빛 힘은 배아를 손상의 리스크를 증가시킵니다. 따라서, TAEL 시스템의 성공적인 사용을 위해서는, 빛을 활성화하는 것은 가시광선 스펙트럼의 청색 범위에서 (1)이어야 하며(2) 태양의 효과적인 활성화와 감광손상 위험의 균형을 맞추기에 충분한 전력으로 있어야 한다. 효과적인 광력은 실험 조건에 따라 달라질 수 있으므로 경험적으로 결정되어야 할 수도 있습니다. 또한 활성화하기 전에 어느 정도의 청색광을 함유하고 있는 주변 광으로부터 배아를 보호하기 위해 주의를 기울여야 합니다. TAEL/C120-의존식은 청색광에 비해 훨씬 낮은 수준이기는 하지만 광스펙트럼 주변광에 의해 유도될 수 있는 것으로나타났다(표 1).
GFP 발현은 30분 후에 qPCR에 의해 먼저 검출될 수 있지만 식 수준은 안정적이지 않습니다. 여전히, 그들은 빛 처리의 3 h에서 피크에 도달할 때까지 상승을 계속합니다, 그 후에 이 높은 발현 수준은 6 시간까지 유지됩니다. 이러한 결과는 파장 및 광전력 외에도 TAEL/C120 유도식 식 수준도 적어도 시스템이 최대 또는 포화 상태에 도달할 때까지 조명 지속 시간에 의존한다는 것을 시사한다. 이러한 qPCR 결과와 는 달리, 우리는 3 시간 후에 까지 감사하는 GFP 형광을 질적으로 관찰하지 않으며, 형광 강도는 조명의 최대 6 시간까지 증가하는 것을 계속합니다. qPCR과 형광 강도 관측 사이의 불일치는 관심 유전자에 따라 달라질 가능성이 있는 GFP 합성, 접기 및 성숙 인자에 필요한 추가 시간에 의해 설명될 가능성이 높습니다. 따라서 응용 프로그램에 따라 조명 지속 시간의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜은 전 세계적으로 제브라피시 배아를 조명하기 위해 청색 LED 패널을 사용하여 TAEL /C120 시스템을 활성화하는 가장 간단한 방법을 제시했습니다. 이 접근 방식은 사용 편의성과 비용 효율성 모두에서 이점을 제공합니다. 그러나 필요한 경우 광 활성화를 공간적으로 제어할 수도 있습니다. 이전에는 TAEL 유도식이 여러 양식으로 공간적으로 제한되어 사용자 정의, 공간 패턴의 청색광5를전달할 수 있음을 입증했습니다. 추가공간 특이성은 조직 특이적 프로모터를 사용하여 TAEL 전사 활성제6의발현을 조절할 수 있다.
약물 또는 열 충격 유도식 시스템에 비해, 광유전학 적 발현 시스템은 잠재적으로 유도 제로 빛을 사용하여 더 나은 공간 및 시간 적 제어 과발현을 제공합니다. TAEL/C120 외에도 다른 조명 활성화 전사 시스템은12,13,14,15를개발되었다. 그러나, TAEL/C120 은 여러 가지 이유로 제브라피시(및 잠재적으로 다른 다세포 시스템)에서 사용하기에 특히 적합할 수 있습니다. 첫째, TAEL 전사 활성제는 호모이머역할을 하며, 이는 필요한 구성 요소의 수를 단순화합니다. 또한, TAEL과 같은 LOV 도메인 함유 단백질은 광흡수(16)를위해 플라빈 크로모포어를 필요로 한다. 이 보조 인자는 내인성 동물 세포 내에서 존재하며 다른 시스템과 마찬가지로 외인성 염색체를 추가 할 필요성을 제거합니다. 마지막으로, 활성화된 TAEL은 청색광8이없는 상태에서 약 30s의 비교적 짧은 반감기를 가질 것으로 예상되어 보다 정밀한 온/오프 제어를 가능하게 합니다. 그러나, 이 짧은 반감기는 또한 장기 또는 만성 표현이 상황에 따라 바람직할 지도 모르다 또는 바람직하지 않을 지도 모르다 태아의 장기 조명을 요구할 것이라는 것을 의미합니다.
요약하자면, 이 프로토콜은 TAEL/C120 시스템이 사용하기 쉽고 빠르고 반응성이 뛰어난 운동제를 소유하며 생체 내 응용 분야에 특히 적합한 청색 광 활성화 유전자 발현 시스템임을 보여줍니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
우리는 스테판 Materna와 이 프로토콜에 대한 유용한 제안과 의견에 대한 우와 마테나 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 이 프로토콜을 개발하면서 안나 리드, 케빈 가드너, 로라 모타 메나에게 귀중한 토론과 통찰력을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH)의 보조금에 의해 지원되었다; R03 DK106358) 및 캘리포니아 대학 암 연구 조정 위원회 (CRN-20-636896) S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
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