Summary
L’optogénétique est un outil puissant avec de nombreuses applications. Ce protocole montre comment obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue.
Abstract
Les systèmes d’expression génique inductibles sont un outil inestimable pour l’étude des processus biologiques. Les systèmes d’expression optogénétique peuvent fournir un contrôle précis sur le moment, l’emplacement et l’amplitude de l’expression des gènes en utilisant la lumière comme agent inducteur. Dans ce protocole, un système d’expression optogénétique est utilisé pour obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre. Ce système repose sur un facteur de transcription conçu appelé TAEL basé sur un facteur de transcription naturel activé par la lumière de la bactérie E. litoralis. Lorsqu’il est éclairé par une lumière bleue, TAEL se dimérise, se lie à son élément régulateur apparenté appelé C120 et active la transcription. Ce protocole utilise des embryons transgéniques de poisson zèbre qui expriment le facteur de transcription TAEL sous le contrôle du promoteur ubb omniprésent. Dans le même temps, l’élément régulateur C120 entraîne l’expression d’un gène rapporteur fluorescent (GFP). En utilisant un simple panneau LED pour délivrer une lumière bleue activatrice, l’induction de l’expression GFP peut d’abord être détectée après 30 minutes d’éclairage et atteint un pic de plus de 130 fois l’induction après 3 h de traitement par la lumière. L’induction de l’expression peut être évaluée par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et par microscopie à fluorescence. Cette méthode est une approche polyvalente et facile à utiliser pour l’expression des gènes optogénétiques.
Introduction
Les systèmes d’expression génique inductibles aident à contrôler la quantité, le moment et l’emplacement de l’expression des gènes. Cependant, il a été difficile d’obtenir un contrôle spatial et temporel exact dans les organismes multicellulaires. Le contrôle temporel est le plus souvent obtenu par l’ajout de composés à petites molécules1 ou l’activation de promoteurs de choc thermique2. Pourtant, les deux approches sont vulnérables aux problèmes de timing, de force d’induction et de réponses au stress hors cible. Le contrôle spatial est principalement réalisé par l’utilisation de promoteurs spécifiques aux tissus 3 , maiscetteapproche nécessite un promoteur ou un élément régulateur approprié, qui ne sont pas toujours disponibles, et elle n’est pas propice à l’induction au niveau des sous-tissus.
Contrairement à ces approches conventionnelles, les activateurs transcriptionnels optogénétiques activés par la lumière ont le potentiel d’un contrôle spatial et temporel plus fin de l’expression des gènes4. Le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue a été développé et optimisé pour une utilisation dans les embryons de poisson zèbre5,6. Ce système est basé sur un facteur de transcription endogène activé par la lumière de la bactérie E. litoralis7,8. Le système TAEL/C120 se compose d’un activateur transcriptionnel appelé TAEL qui contient un domaine de transactivation Kal-TA4, un domaine LOV (détection lumière-oxygène-tension) sensible à la lumière bleue et un domaine de liaison à l’ADN HTH (helix-turn-helix)5. Lorsqu’ils sont éclairés, les domaines LOV subissent un changement conformationnel qui permet à deux molécules TAEL de se dimériser, de se lier à un promoteur C120 sensible au TAEL et d’initier la transcription d’un gène d’intérêt en aval5,8. Le système TAEL/C120 présente une induction rapide et robuste avec une toxicité minimale, et il peut être activé par plusieurs modalités de livraison de lumière différentes. Récemment, des améliorations ont été apportées au système TAEL/C120 en ajoutant un signal de localisation nucléaire au TAEL (TAEL-N) et en couplant l’élément régulateur C120 à un promoteur basal cFos (C120F)(Figure 1A). Ces modifications ont amélioré les niveaux d’induction de plus de 15 fois6.
Dans ce protocole, un simple panneau LED est utilisé pour activer le système TAEL/C120 et induire l’expression omniprésente d’un gène rapporteur, GFP. L’induction de l’expression peut être surveillée qualitativement en observant l’intensité de fluorescence ou quantitativement en mesurant les niveaux de transcription à l’aide de la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Ce protocole démontrera le système TAEL/C120 comme un outil polyvalent et facile à utiliser qui permet une régulation robuste de l’expression des gènes in vivo.
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Protocol
Cette étude a été réalisée avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie Merced.
1. Croisement de poissons-zèbres et collecte d’embryons
- Maintenir des lignées de poissons-zèbres transgéniques distinctes contenant soit l’activateur transcriptionnel TAEL, soit le gène rapporteur contrôlé par C120 afin de minimiser l’activation fallacieuse.
- Croisez 6 à 8 poissons-zèbres adultes dechaque lignée en utilisant les méthodes standard 9 pour produire des embryons transgéniques doubles contenant à la fois les composants TAEL et C120(figure 1B).
REMARQUE: Alternativement, les deux composants peuvent être exprimés transitoirement par microinjection de l’ARNm ou de l’ADN plasmidique en utilisant des méthodes standard10. - Recueillir des embryons dans des boîtes de Pétri contenant de l’eau d’œuf (60 μg/mL de sel de mer instant de l’océan dissous dans de l’eau distillée), avec environ 30 embryons par condition à tester.
- Placez la vaisselle dans une boîte à l’épreuve de la lumière ou couvrez avec du papier d’aluminium pour minimiser l’activation involontaire par la lumière ambiante (voir le tableau 1).
2. Induction lumineuse globale
- Utilisez un panneau LED à lumière bleue (465 nm) pour transmettre une lumière bleue activatrice à plusieurs embryons à la fois.
- Positionner le panneau LED par rapport aux boîtes de Petri contenant des embryons de manière à ce que la puissance réelle de la lumière reçue par les embryons soit d’environ 1,5 mW/cm2 mesurée par un compteur de puissance lumineuse et d’énergie(Figure 2A).
- Pulser la lumière à des intervalles de 1 h on/1 h d’arrêt à l’aide d’un relais de minuterie si elle s’allume pendant plus de 3 h pour réduire le risque de photodommages à l’activateur transcriptionnel TAEL5,8.
REMARQUE: La durée exacte de l’éclairage peut devoir être optimisée pour des applications spécifiques. Dans ce protocole, des exemples de durée d’éclairement de 30 min, 1 h, 3 h et 6 h sont fournis. - Retirez les couvercles des boîtes de Petri pour minimiser la diffusion de la lumière due à la condensation.
- Placez les boîtes de Petri contenant des embryons de contrôle dans une boîte résistante à la lumière ou couvrez-les de papier d’aluminium pour les contrôles sombres.
3. Évaluation quantitative de l’induction par qRT-PCR
- Retirez les embryons de l’éclairage après la durée d’activation souhaitée.
- Extrayez l’ARN total de 30 à 50 embryons activés par la lumière et de 30 à 50 embryons sombres à l’aide d’un kit d’isolement d’ARN en suivant les instructions du kit.
- Transférer les embryons dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et éliminer l’excès d’eau d’œuf. Ajouter un tampon de lyse et homogénéiser les embryons avec un pilon en plastique.
- Transférez le lysate dans une colonne fournie par le kit et continuez avec les instructions du kit. Passez immédiatement à l’étape 3.3 ou stockez l’ARN purifié à -20 °C à -80 °C.
- Utilisez 1 μg d’ARN total pour la synthèse de l’ADNc à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc en suivant les instructions du kit.
- Prenez un tube PCR de 0,2 mL à paroi mince, ajoutez 1 μg d’ARN à 4 μL de 5x mélange maître de réaction d’ADNc (contenant un tampon optimisé, des oligo-dT et des amorces aléatoires, et des dNTP), 1 μL de solution de transcriptase inverse 20x et de l’eau sans nucléase pour un volume total de 20 μL.
- Placez le tube dans un thermocycleur programmé comme suit : 22 °C pendant 10 min, 42 °C pendant 30 min, 85 °C pendant 5 min, puis maintenez à 4 °C. Passez immédiatement à l’étape 3.4 ou stockez l’ADNc à -20 °C.
- Préparer des réactions qPCR contenant le mélange maître d’enzyme verte SYBR, 5 fois l’ADNc dilué (étape 3.3) et 325 nM de chaque amorce pour la GFP.
REMARQUE : Amorces utilisées dans ce protocole comme suit. GFP en avant: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP inversé: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a inverse : 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - Effectuer des réactions qPCR dans une machine PCR en temps réel.
REMARQUE: Programme PCR: activation initiale à 95 °C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de 30 s à 95 °C, 30 s à 60 °C et 1 min à 72 °C. - Effectuer une analyse de la courbe de fusion une fois la PCR terminée pour déterminer la spécificité de la réaction. Effectuez trois réplications techniques pour chaque échantillon.
- Calculer l’induction activée par la lumière en tant que changement de pli par rapport aux embryons maintenus dans l’obscurité en utilisant la méthode2 -ΔΔCt 11. La signification statistique peut être déterminée à l’aide d’un progiciel de statistiques.
4. Évaluation qualitative de l’induction par microscopie à fluorescence
- Retirez les embryons de l’éclairage après la durée d’activation souhaitée.
- Immobiliser des embryons pour l’imagerie dans 3% de méthylcellulose contenant 0,01% de tricaïne dans des lames de dépression en verre.
- Obtenez des images de fluorescence et de champ lumineux sur un stéréomicroscope fluorescent connecté à un appareil photo numérique à l’aide des paramètres de filtre GFP standard. Utilisez des paramètres d’acquisition d’image identiques pour tous les échantillons.
- Fusionnez les images en champ clair et en fluorescence après l’acquisition avec un logiciel de traitement d’image.
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Representative Results
Pour cette démonstration, une ligne rapporteur GFP sensible au C120 (Tg(C120F:GFP)ucm107)) a été croisée avec une ligne transgénique qui exprime TAEL-N de manière omniprésente à partir du promoteur de l’ubiquitine b (ubb) (Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) pour produire des embryons transgéniques doubles contenant les deux éléments. 24 h après la fécondation, les embryons ont été exposés à l’activation de la lumière bleue, pulsée à une fréquence de 1 h on/1 h off. L’induction de l’expression de la GFP a été quantifiée par qRT-PCR à 30 min, 1 h, 3 h et 6 h après l’activation(figure 2B et tableau 1). Par rapport aux embryons frères et sœurs témoins maintenus dans l’obscurité, l’induction de l’expression de GFP a été détectée dès 30 minutes après l’exposition à la lumière bleue. Les niveaux d’expression de GFP ont ensuite continué à augmenter jusqu’à 6 heures après l’activation régulièrement.
L’induction de GFP a également été évaluée qualitativement en examinant l’intensité de fluorescence aux mêmes points de temps après l’activation(Figure 2C-F). La fluorescence GFP au-dessus des niveaux de fond a été observée pour la première fois 3 h après l’activation et est devenue sensiblement plus brillante à 6 h après l’activation. En revanche, les embryons témoins pour tous les points temporels qui ont été maintenus dans l’obscurité ne présentaient aucune fluorescence GFP appréciable (Figure 2G-J).
Figure 1: Schéma de la fonction TAEL/C120 et conception expérimentale. (A) Le système TAEL/C120 se compose d’un activateur transcriptionnel appelé TAEL fusionné à un signal de localisation nucléaire (TAEL-N) et d’un élément régulateur sensible au TAEL appelé C120 couplé à un promoteur basal cFos (C120F) conduisant l’expression d’un gène d’intérêt. La transcription dépendante du TAEL est active en présence de lumière bleue mais pas dans l’obscurité. NLS, signal de localisation nucléaire. (B) Dans ce protocole, une lignée transgénique exprime TAEL-N de manière omniprésente (Tg(ubb:TAEL-N)) est croisée à une ligne rapporteurE GFP pilotée par C120 (Tg(C120F:GFP)) pour produire des embryons transgéniques doubles. À partir de 24 hpf, les embryons sont exposés à l’activation de la lumière bleue pendant différentes durées jusqu’à 6 h-illustrations créées avec un outil d’illustration scientifique basé sur le Web (voir Tableau des matériaux). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Résultats représentatifs de l’expression génique activée par la lumière avec TAEL/C120. (A) Une configuration d’activation lumineuse typique comprend une source de lumière LED bleue placée dans un incubateur. Les boîtes de Petri contenant des embryons de poisson zèbre sont positionnées par rapport à la source lumineuse de sorte que la puissance de lumière reçue soit d’environ 1,5 mW/cm2 (ligne pointillée). Les couvercles des boîtes de Petri sont retirés lors de l’activation de la lumière pour minimiser la diffusion de la lumière. (B) Quantification des niveaux d’ARNm GFP par qRT-PCR aux points de temps indiqués après activation à la lumière bleue. Les données sont présentées comme l’induction du pli GFP par rapport aux embryons témoins de frères et sœurs maintenus dans l’obscurité. Les points représentent des répliques biologiques (embrayages). Les barres horizontales pleines représentent la moyenne. Barres d’erreur, écart type. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. L’ANOVA unidirectionnelle a déterminé les valeurs de p. (C-J) Images représentatives montrant l’intensité de fluorescence GFP des embryons exposés à la lumière bleue (C-F) ou maintenus dans l’obscurité (G-J). Les images fluorescentes (vert) ont été fusionnées avec les images en champ clair correspondantes (niveaux de gris): barres d’échelle, 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Induction de pli GFP Lumière bleue (465 nm) |
Induction de pli GFP Lumière ambiante |
||||||
| Temps Post-illumination | Méchant | Limite supérieure | Limite inférieure | Méchant | Limite supérieure | Limite inférieure | Valeur p |
| 30 min | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1 h | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 h | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 h | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
Tableau 1 : Comparaison de l’expression induite par TAEL/C120 par la lumière bleue et ambiante. Induction du pliage des niveaux d’ARNm GFP après exposition à la lumière bleue activatrice (465 nm) ou à la lumière ambiante pendant la durée indiquée, normalisée pour contrôler les embryons frères et sœurs maintenus dans l’obscurité. Les niveaux d’ARNm ont été quantifiés par qRT-PCR. Les données sont rapportées sous forme d’induction moyenne de plis +/- limites supérieures et inférieures. Les valeurs p ont été déterminées par plusieurs tests t. n = 3 embrayages pour tous les points temporels.
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Discussion
Ce protocole décrit l’utilisation du système optogénétique TAEL/C120 pour obtenir une expression génique inductible à la lumière bleue. Ce système est constitué d’un activateur transcriptionnel, TAEL, qui dimérise lors de l’éclairage avec de la lumière bleue et active la transcription d’un gène d’intérêt en aval d’un élément régulateur C120. L’expression induite d’un rapporteur GFP peut être détectée après aussi peu que 30 minutes d’exposition à la lumière, ce qui suggère que cette approche possède une cinétique relativement rapide et réactive.
Plusieurs facteurs peuvent affecter les niveaux d’induction. Les plus critiques sont la longueur d’onde et la puissance d’activation de la lumière. Dans ce protocole, des lumières LED de 465 nm délivrées à 1,5 W/cm2 ont été utilisées. Des longueurs d’onde plus courtes et plus longues (lumière violette et verte, respectivement) et une puissance lumineuse plus faible n’activent pas efficacement l’expression (données non affichées). D’autre part, plus de puissance lumineuse augmente le risque de photodommager les embryons. Ainsi, pour une utilisation réussie du système TAEL, l’activation de la lumière doit être (1) dans la gamme bleue du spectre de la lumière visible et (2) à une puissance suffisante pour équilibrer l’activation efficace de TAEL avec un risque réduit de photodommages. La puissance lumineuse effective peut varier en fonction des conditions expérimentales et peut donc devoir être déterminée empiriquement. Il faut également veiller à protéger les embryons de la lumière ambiante, contenant une certaine quantité de lumière bleue, avant l’activation. Il a été constaté que l’expression dépendante de TAEL/C120 peut être induite par la lumière ambiante à large spectre, bien qu’à des niveaux beaucoup plus faibles que la lumière bleue uniquement (Tableau 1).
Alors que l’expression de GFP peut d’abord être détectée par qPCR après 30 min d’éclairage, les niveaux d’expression ne sont pas stables. Néanmoins, ils continuent à augmenter jusqu’à atteindre un pic à 3 h de traitement par la lumière, après quoi ces niveaux d’expression élevés sont maintenus jusqu’à 6 h. Ces résultats suggèrent qu’en plus de la longueur d’onde et de la puissance lumineuse, les niveaux d’expression induits par TAEL/C120 dépendent également de la durée de l’éclairage, au moins jusqu’à ce que le système atteigne un état maximal ou de saturation. Contrairement à ces résultats de qPCR, nous n’observons qualitativement une fluorescence GFP appréciable qu’après 3 h d’éclairage, et l’intensité de la fluorescence continue d’augmenter jusqu’à 6 h d’éclairage. L’écart entre la qPCR et les observations d’intensité de fluorescence s’explique probablement par le temps supplémentaire nécessaire à la synthèse, au repliement et à la maturation des GFP, qui sont susceptibles de varier en fonction du gène d’intérêt. Par conséquent, une certaine optimisation de la durée d’éclairage peut être nécessaire en fonction de l’application.
Ce protocole présentait la méthode la plus simple pour activer le système TAEL/C120 à l’aide d’un panneau LED à lumière bleue pour éclairer les embryons de poisson-zèbre dans le monde entier. Cette approche présente les avantages d’une facilité d’utilisation et d’une rentabilité. Cependant, l’activation de la lumière peut également être contrôlée spatialement si nécessaire. Il a déjà été démontré que l’expression induite par TAEL pouvait être limitée spatialement en utilisant plusieurs modalités pour fournir une lumière bleue définie par l’utilisateur et à motif spatial5. Une spécificité spatiale supplémentaire peut être obtenue en utilisant des promoteurs spécifiques aux tissus pour réguler l’expression de l’activateur transcriptionnel TAEL6.
Comparés aux systèmes d’expression inductibles par des médicaments ou des chocs thermiques, les systèmes d’expression optogénétique offrent potentiellement un meilleur contrôle spatial et temporel de la surexpression en utilisant la lumière comme agent inducteur. En plus de TAEL/C120, d’autres systèmes transcriptionnels activés par la lumière ont été développés12,13,14,15. Cependant, TAEL/C120 peut être particulièrement bien adapté à une utilisation chez le poisson-zèbre (et potentiellement d’autres systèmes multicellulaires) pour plusieurs raisons. Tout d’abord, l’activateur transcriptionnel TAEL fonctionne comme un homodimère, ce qui simplifie le nombre de composants requis. En outre, les protéines contenant le domaine LOV telles que TAEL nécessitent un chromophore de flavine pour l’absorption de la lumière16. Ce cofacteur est présent de manière endogène dans les cellules animales, éliminant la nécessité d’ajouter un chromophore exogène comme avec d’autres systèmes. Enfin, le TAEL activé devrait avoir une demi-vie relativement courte d’environ 30 s en l’absence de lumière bleue8,permettant un contrôle plus précis de la mise en service et de l’arrêt. Cependant, cette courte demi-vie signifie également que l’expression à long terme ou chronique nécessiterait un éclairage à long terme des embryons, ce qui peut ou non être souhaitable selon les circonstances.
En résumé, ce protocole démontre que le système TAEL/C120 est un système d’expression génique activé par la lumière bleue qui est facile à utiliser, possède une cinétique rapide et réactive, et est particulièrement bien adapté aux applications in vivo.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions Stefan Materna et les membres des laboratoires Woo et Materna pour leurs suggestions et commentaires utiles sur ce protocole. Nous remercions Anna Reade, Kevin Gardner et Laura Motta-Mena pour leurs précieuses discussions et idées lors de l’élaboration de ce protocole. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) et le Comité de coordination de la recherche sur le cancer de l’Université de Californie (CRN-20-636896) à S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
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