Summary
La optogenética es una herramienta poderosa con una amplia gama de aplicaciones. Este protocolo demuestra cómo lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul.
Abstract
Los sistemas de expresión génica inducibles son una herramienta invaluable para estudiar los procesos biológicos. Los sistemas de expresión optogenética pueden proporcionar un control preciso sobre el tiempo, la ubicación y la amplitud de la expresión génica utilizando la luz como agente inductor. En este protocolo, se utiliza un sistema de expresión optogenética para lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra. Este sistema se basa en un factor de transcripción diseñado llamado TAEL basado en un factor de transcripción activado por la luz natural de la bacteria E. litoralis. Cuando se ilumina con luz azul, TAEL se dimeriza, se une a su elemento regulador cognado llamado C120 y activa la transcripción. Este protocolo utiliza embriones transgénicos de pez cebra que expresan el factor de transcripción TAEL bajo el control del omnipresente promotor ubb. Al mismo tiempo, el elemento regulador C120 impulsa la expresión de un gen reportero fluorescente (GFP). Utilizando un panel LED simple para entregar luz azul activadora, la inducción de la expresión de GFP se puede detectar primero después de 30 minutos de iluminación y alcanza un pico de inducción de más de 130 veces después de 3 h de tratamiento de luz. La inducción de la expresión puede evaluarse mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y mediante microscopía de fluorescencia. Este método es un enfoque versátil y fácil de usar para la expresión génica optogenética.
Introduction
Los sistemas de expresión génica inducibles ayudan a controlar la cantidad, el momento y la ubicación de la expresión génica. Sin embargo, lograr un control espacial y temporal exacto en organismos multicelulares ha sido un desafío. El control temporal se logra más comúnmentemediante la adición de compuestos de moléculas pequeñas 1 o la activación de promotores de choquetérmico 2. Aún así, ambos enfoques son vulnerables a problemas de tiempo, fuerza de inducción y respuestas de estrés fuera del objetivo. El control espacial se logra principalmente mediante el uso de promotores específicos de tejidos3, pero este enfoque requiere un promotor o elemento regulador adecuado, que no siempre está disponible, y no es propicio para la inducción a nivel de subsulares.
En contraste con tales enfoques convencionales, los activadores transcripcionales optogenéticos activados por la luz tienen el potencial de un control espacial y temporal más fino de la expresióngénica 4. El sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul fue desarrollado y optimizado para su uso en embriones de pez cebra5,6. Este sistema se basa en un factor de transcripción endógeno activado por la luz de la bacteria E. litoralis7,8. El sistema TAEL/C120 consiste en un activador transcripcional llamado TAEL que contiene un dominio de transactivación Kal-TA4, un dominio LOV (detección de luz-oxígeno-voltaje) sensible a la luz azul y un dominio de unión al ADN de hélice-giro-hélice (HTH)5. Cuando se iluminan, los dominios LOV sufren un cambio conformacional que permite que dos moléculas TAEL se dimericen, se unan a un promotor C120 sensible a TAEL e inicien la transcripción de un gen de interés aguasabajo 5,8. El sistema TAEL/C120 exhibe una inducción rápida y robusta con una toxicidad mínima, y puede ser activado por varias modalidades diferentes de suministro de luz. Recientemente, se realizaron mejoras en el sistema TAEL/C120 agregando una señal de localización nuclear a TAEL (TAEL-N) y acoplando el elemento regulador C120 a un promotor basal cFos (C120F)(Figura 1A). Estas modificaciones mejoraron los niveles de inducción en más de 15 veces6.
En este protocolo, se utiliza un panel LED simple para activar el sistema TAEL/C120 e inducir la expresión ubicua de un gen reportero, GFP. La inducción de la expresión se puede monitorear cualitativamente observando la intensidad de la fluorescencia o cuantitativamente midiendo los niveles de transcripción utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo demostrará el sistema TAEL/C120 como una herramienta versátil y fácil de usar que permite una regulación robusta de la expresión génica in vivo.
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Protocol
Este estudio se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California Merced.
1. Cruce de peces cebra y recolección de embriones
- Mantenga líneas separadas de pez cebra transgénico que contengan el activador transcripcional TAEL o el gen reportero controlado por C120 para minimizar la activación espuria.
- Cruce de 6 a 8 peces cebra adultos de cada línea utilizando métodos estándar9 para producir embriones transgénicos dobles que contengan los componentes TAEL y C120(Figura 1B).
NOTA: Alternativamente, ambos componentes pueden expresarse transitoriamente a través de la microinyección de ARNm o ADN plásmido utilizando métodos estándar10. - Recolectar embriones en placas de Petri que contengan agua de huevo (60 μg / ml de sal marina instantánea del océano disuelta en agua destilada), con aproximadamente 30 embriones por condición para ser probados.
- Coloque los platos en una caja o cubierta a prueba de luz con papel de aluminio para minimizar la activación involuntaria por la luz ambiental (ver Tabla 1).
2. Inducción de luz global
- Utilice un panel LED de luz azul (465 nm) para administrar luz azul activadora a varios embriones a la vez.
- Coloque el panel LED en relación con las placas de Petri que contienen embriones de modo que la potencia real de la luz recibida por los embriones sea de aproximadamente 1,5 mW / cm2 medida por un medidor de potencia y energía de la luz (Figura 2A).
- Pulsar la luz a intervalos de 1 h encendido/1 h apagado utilizando un relé temporizador si se ilumina durante más de 3 h para reducir el riesgo de fotodaje al activador transcripcional TAEL5,8.
NOTA: Es posible que sea necesario optimizar la duración exacta de la iluminación para aplicaciones específicas. En este protocolo, se proporcionan ejemplos de duración de iluminación de 30 min, 1 h, 3 h y 6 h. - Retire las tapas de las placas de Petri para minimizar la dispersión de la luz de la condensación.
- Coloque las placas de Petri que contienen embriones de control en una caja a prueba de luz o cubra con papel de aluminio para controles oscuros.
3. Evaluación cuantitativa de la inducción por qRT-PCR
- Retire los embriones de la iluminación después de la duración de activación deseada.
- Extraiga el ARN total de 30-50 embriones activados por la luz y 30-50 embriones oscuros utilizando un kit de aislamiento de ARN siguiendo las instrucciones del kit.
- Transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y elimine el exceso de agua de huevo. Añadir tampón de lisis y homogeneizar los embriones con un mortero de plástico.
- Transfiera el lisate a una columna proporcionada por el kit y continúe con las instrucciones del kit. Proceda inmediatamente al paso 3.3 o almacene el ARN purificado a -20 °C a -80 °C.
- Utilice 1 μg de ARN total para la síntesis de ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc siguiendo las instrucciones del kit.
- Tome un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml, agregue 1 μg de ARN a 4 μL de mezcla maestra de reacción de ADNc 5x (que contiene tampón optimizado, oligo-dT y cebadores aleatorios, y dNTP), 1 μL de solución de transcriptasa inversa 20x y agua libre de nucleasa a un volumen total de 20 μL.
- Coloque el tubo en un termociclador programado de la siguiente manera: 22 °C durante 10 min, 42 °C durante 30 min, 85 °C durante 5 min, y luego manténgalo a 4 °C. Proceda inmediatamente al paso 3.4 o almacene el ADNc a -20 °C.
- Prepare reacciones de qPCR que contengan una mezcla maestra de enzimas verdes SYBR, ADNc diluido 5 veces (paso 3.3) y 325 nM de cada imprimación para GFP.
NOTA: Los cebadores utilizados en este protocolo de la siguiente manera. GFP adelante: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP reverso: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverso: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - Realizar reacciones de qPCR en una máquina de PCR en tiempo real.
NOTA: Programa de PCR: activación inicial a 95 °C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C y 1 min a 72 °C. - Realice un análisis de la curva de fusión una vez que se complete la PCR para determinar la especificidad de la reacción. Realice tres réplicas técnicas para cada muestra.
- Calcular la inducción activada por la luz como cambio de pliegue en relación con los embriones mantenidos en la oscuridad utilizando el método2 -ΔΔCt 11. La significación estadística se puede determinar con un paquete de software de estadísticas.
4. Evaluación cualitativa de la inducción por microscopía de fluorescencia
- Retire los embriones de la iluminación después de la duración deseada de la activación.
- Inmovilizar embriones para obtener imágenes en metilcelulosa al 3% que contiene 0,01% de tricaína en portaobjetos de depresión de vidrio.
- Adquiera imágenes de fluorescencia y campo brillante en un estereomicroscópica fluorescente conectado a una cámara digital utilizando la configuración estándar del filtro GFP. Utilice una configuración de adquisición de imágenes idéntica para todas las muestras.
- Fusione imágenes de campo brillante y fluorescencia después de la adquisición con el software de procesamiento de imágenes.
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Representative Results
Para esta demostración, se cruzó una línea reportera GFP sensible aC120 ( Tg (C120F: GFP)ucm107) )con una línea transgénica que expresa TAEL-N ubicuamente desde el promotor de ubiquitina b (ubb) (Tg (ubb: TAEL-N)ucm113)) para producir embriones transgénicos dobles que contienen ambos elementos. 24 h después de la fertilización, los embriones fueron expuestos a la activación de la luz azul, pulsados a una frecuencia de 1 h encendido / 1 h apagado. La inducción de la expresión de GFP se cuantificó mediante qRT-PCR a los 30 min, 1 h, 3 h y 6 h después de la activación(Figura 2B y Tabla 1). En comparación con los embriones hermanos de control mantenidos en la oscuridad, la inducción de la expresión de GFP se detectó tan pronto como 30 minutos después de la exposición a la luz azul. Los niveles de expresión de GFP continuaron aumentando hasta 6 h después de la activación de manera constante.
La inducción de GFP también se evaluó cualitativamente examinando la intensidad de la fluorescencia en los mismos puntos de tiempo posteriores a la activación(Figura 2C-F). La fluorescencia GFP por encima de los niveles de fondo se observó por primera vez a las 3 h después de la activación y se volvió notablemente más brillante a las 6 h después de la activación. En contraste, los embriones de control para todos los puntos de tiempo que se mantuvieron en la oscuridad no exhibieron ninguna fluorescencia GFP apreciable(Figura 2G-J).
Figura 1: Esquema de la función TAEL/C120 y diseño experimental. (A) El sistema TAEL/C120 consiste en un activador transcripcional llamado TAEL fusionado a una señal de localización nuclear (TAEL-N) y un elemento regulador sensible a TAEL llamado C120 acoplado a un promotor basal cFos (C120F) que impulsa la expresión de un gen de interés. La transcripción dependiente de TAEL está activa en presencia de luz azul, pero no en la oscuridad. NLS: señal de localización nuclear. (B) En este protocolo, una línea transgénica expresa TAEL-N de forma ubicua (Tg(ubb:TAEL-N)) se cruza a una línea de reportero GFP impulsada por C120 (Tg(C120F:GFP)) para producir embriones transgénicos dobles. A partir de 24 hpf, los embriones se exponen a la activación de la luz azul durante varias duraciones hasta 6 h-ilustraciones creadas con una herramienta de ilustración científica basada en la web (ver Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de la expresión génica activada por la luz con TAEL/C120. (A) Una configuración típica de activación de luz incluye una fuente de luz LED azul colocada en una incubadora. Las placas de Petri que contienen embriones de pez cebra se colocan en relación con la fuente de luz de modo que la potencia de luz recibida es de aproximadamente 1,5 mW / cm2 (línea punteada). Las tapas de las placas de Petri se retiran durante la activación de la luz para minimizar la dispersión de la luz. (B) Cuantificación de los niveles de ARNm de GFP mediante qRT-PCR en los puntos de tiempo indicados después de la activación con luz azul. Los datos se presentan como inducción de pliegue gFP en relación con embriones de control hermanos mantenidos en la oscuridad. Los puntos representan réplicas biológicas (nidadas). Las barras horizontales sólidas representan la media. Barras de error, desviación estándar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. ANOVA unidireccional determinó los valores de p. (C-J) Imágenes representativas que muestran la intensidad de fluorescencia GFP de embriones expuestos a la luz azul (C-F) o mantenidos en la oscuridad (G-J). Las imágenes fluorescentes (verde) se han fusionado con las imágenes de campo brillante correspondientes (escala de grises): barras de escala, 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Inducción de pliegue GFP Luz azul (465 nm) |
Inducción de pliegue GFP Luz ambiental |
||||||
| Tiempo post-iluminación | Significar | Límite superior | Límite inferior | Significar | Límite superior | Límite inferior | valor p |
| 30 minutos | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1 h | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 h | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 h | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
Tabla 1: Comparación de la expresión inducida por TAEL/C120 por el azul y la luz ambiental. Inducción de pliegues de los niveles de ARNm de GFP después de la exposición a la activación de la luz azul (465 nm) o la luz ambiental durante el tiempo indicado, normalizado para controlar embriones hermanos mantenidos en la oscuridad. Los niveles de ARNm se cuantificaron mediante qRT-PCR. Los datos se informan como inducción de pliegue promedio +/- límites superior e inferior. Los valores de p se determinaron mediante múltiples pruebas t. n = 3 embragues para todos los puntos de tiempo.
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Discussion
Este protocolo describe el uso del sistema optogenético TAEL/C120 para lograr la expresión génica inducible por la luz azul. Este sistema consiste en un activador transcripcional, TAEL, que se dimeriza al iluminar con luz azul y activa la transcripción de un gen de interés aguas abajo de un elemento regulador C120. La expresión inducida de un reportero GFP se puede detectar después de tan solo 30 minutos de exposición a la luz, lo que sugiere que este enfoque posee una cinética relativamente rápida y receptiva.
Varios factores pueden afectar los niveles de inducción. Lo más crítico es la longitud de onda y el poder de activación de la luz. En este protocolo, se utilizaron luces LED de 465 nm entregadas a 1,5 W/cm2. Las longitudes de onda más cortas y más largas (luz púrpura y verde, respectivamente) y la menor potencia de la luz no activan la expresión de manera efectiva (datos no mostrados). Por otro lado, una mayor potencia de la luz aumenta el riesgo de fotodamagiar los embriones. Por lo tanto, para un uso exitoso del sistema TAEL, la activación de la luz debe estar (1) en el rango azul del espectro de luz visible y (2) a la potencia suficiente para equilibrar la activación efectiva de TAEL con un riesgo de fotodaje reducido. La potencia de la luz efectiva puede variar dependiendo de las condiciones experimentales y, por lo tanto, puede ser necesario determinar empíricamente. También se debe tener cuidado para proteger a los embriones de la luz ambiental, que contiene cierta cantidad de luz azul, antes de la activación. Se ha encontrado que la expresión dependiente de TAEL/C120 puede ser inducida por la luz ambiental de amplio espectro, aunque a niveles mucho más bajos en comparación con la luz azul solamente (Tabla 1).
Si bien la expresión de GFP se puede detectar primero mediante qPCR después de 30 minutos de iluminación, los niveles de expresión no son estables. Aún así, continúan subiendo hasta alcanzar un pico a las 3 h de tratamiento con luz, después de lo cual estos altos niveles de expresión se mantienen hasta 6 h. Estos resultados sugieren que, además de la longitud de onda y la potencia de la luz, los niveles de expresión inducidos por TAEL/C120 también dependen de la duración de la iluminación, al menos hasta que el sistema alcance un estado máximo o de saturación. En contraste con estos resultados de qPCR, no observamos cualitativamente una fluorescencia GFP apreciable hasta después de 3 h de iluminación, y la intensidad de fluorescencia continúa aumentando hasta 6 h de iluminación. La discrepancia entre la qPCR y las observaciones de intensidad de fluorescencia probablemente se explica por el tiempo adicional necesario para la síntesis de GFP, el plegamiento y los factores de maduración que probablemente varíen según el gen de interés. Por lo tanto, puede ser necesaria cierta optimización de la duración de la iluminación dependiendo de la aplicación.
Este protocolo presentó el método más sencillo para activar el sistema TAEL / C120 utilizando un panel LED de luz azul para iluminar embriones de pez cebra a nivel mundial. Este enfoque tiene las ventajas tanto de la facilidad de uso como de la rentabilidad. Sin embargo, la activación de la luz también se puede controlar espacialmente si es necesario. Anteriormente se demostró que la expresión inducida por TAEL podría restringirse espacialmente utilizando múltiples modalidades para entregar luz azul definida por el usuario y con patrones espaciales5. Se puede lograr una especificidad espacial adicional utilizando promotores específicos de tejidos para regular la expresión del activador transcripcional TAEL6.
En comparación con los sistemas de expresión inducibles por fármacos o choque térmico, los sistemas de expresión optogenética ofrecen potencialmente una mejor sobreexpresión de control espacial y temporal mediante el uso de la luz como agente inductor. Además de TAEL/C120, se han desarrollado otros sistemas transcripcionales activados por luz12,13,14,15. Sin embargo, TAEL /C120 puede ser especialmente adecuado para su uso en peces cebra (y potencialmente otros sistemas multicelulares) por varias razones. En primer lugar, el activador transcripcional TAEL funciona como un homodímero, lo que simplifica el número de componentes requeridos. Además, las proteínas que contienen el dominio LOV como TAEL requieren un cromóforo de flavina para la absorción de la luz16. Este cofactor está presente endógenamente dentro de las células animales, eliminando la necesidad de agregar un cromóforo exógeno como con otros sistemas. Finalmente, se predice que el TAEL activado tendrá una vida media relativamente corta de aproximadamente 30 s en ausencia de luz azul8,lo que permite un control de encendido / apagado más preciso. Sin embargo, esta corta vida media también significa que la expresión a largo plazo o crónica requeriría una iluminación a largo plazo de los embriones, lo que puede o no ser deseable dependiendo de las circunstancias.
En resumen, este protocolo demuestra que el sistema TAEL/C120 es un sistema de expresión génica activado por luz azul que es fácil de usar, posee una cinética rápida y receptiva, y es particularmente adecuado para aplicaciones in vivo.
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Disclosures
No se declararon conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Stefan Materna y a los miembros de los laboratorios Woo y Materna por sus útiles sugerencias y comentarios sobre este protocolo. Agradecemos a Anna Reade, Kevin Gardner y Laura Motta-Mena por su valiosa discusión y conocimientos durante el desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH; R03 DK106358) y el Comité Coordinador de Investigación del Cáncer de la Universidad de California (CRN-20-636896) a S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
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