Summary
Optogenetikk er et kraftig verktøy med omfattende applikasjoner. Denne protokollen viser hvordan man oppnår lys-induserbart genuttrykk i sebrafiskembryoer ved hjelp av det blå lysresponsive TAEL/C120-systemet.
Abstract
Inducible genuttrykkssystemer er et uvurderlig verktøy for å studere biologiske prosesser. Optogenetiske uttrykkssystemer kan gi presis kontroll over genuttrykkstid, plassering og amplitude ved hjelp av lys som induserende middel. I denne protokollen brukes et optogenetisk uttrykkssystem for å oppnå lys-inducible genuttrykk i sebrafiskembryoer. Dette systemet er avhengig av en konstruert transkripsjonsfaktor kalt TAEL basert på en naturlig forekommende lysaktivert transkripsjonsfaktor fra bakterien E. litoralis. Når den belyses med blått lys, dimmerer TAEL, binder seg til sitt konjakkregulatoriske element kalt C120, og aktiverer transkripsjon. Denne protokollen bruker transgene sebrafiskembryoer som uttrykker TAEL-transkripsjonsfaktoren under kontroll av den allestedsnærværende ubb-promotoren. Samtidig driver C120 regulatorisk element uttrykket av et fluorescerende reportergen (GFP). Ved hjelp av et enkelt LED-panel for å levere aktiverende blått lys, kan induksjon av GFP-uttrykk først oppdages etter 30 min belysning og når en topp på mer enn 130 ganger induksjon etter 3 timers lysbehandling. Uttrykksinduksjon kan vurderes ved kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) og ved fluorescensmikroskopi. Denne metoden er en allsidig og brukervennlig tilnærming for optogenetisk genuttrykk.
Introduction
Inducible genuttrykkssystemer bidrar til å kontrollere mengden, timingen og plasseringen av genuttrykk. Det har imidlertid vært utfordrende å oppnå nøyaktig romlig og tidsmessig kontroll i multicellulære organismer. Temporal kontroll oppnås oftest ved å legge til småmolekylforbindelser1 eller aktivering av varmesjokkpromotorer2. Likevel er begge tilnærmingene sårbare for spørsmål om timing, induksjonsstyrke og stressrespons utenfor målet. Romlig kontroll oppnås hovedsakelig ved bruk av vevsspesifikke promotorer3, men denne tilnærmingen krever en passende promotor eller regulatorisk element, som ikke alltid er tilgjengelige, og det bidrar ikke til sub-vevsnivå induksjon.
I motsetning til slike konvensjonelle tilnærminger har lysaktiverte optogenetiske transkripsjonsaktivatorer potensialet for finere romlig og tidsmessig kontroll av genuttrykk4. Det blå lysresponsive TAEL/C120-systemet ble utviklet og optimalisert for bruk i sebrafiskembryoer5,6. Dette systemet er basert på en endogene lysaktivert transkripsjonsfaktor fra bakterien E. litoralis7,8. TAEL/C120-systemet består av en transkripsjonsaktivator kalt TAEL som inneholder et Kal-TA4-transaktiveringsdomene, et blått lysresponsivt LOV-domene (lys-oksygenspenningssensor) og et helix-turn-helix (HTH) DNA-bindende domene5. Når de belyses, gjennomgår LOV-domenene en konformasjonsendring som gjør at to TAEL-molekyler kan dimme, binde seg til en TAEL-responsiv C120-promotor og initiere transkripsjon av et nedstrøms gen av interesse5,8. TAEL/C120-systemet har rask og robust induksjon med minimal toksisitet, og det kan aktiveres av flere forskjellige lysleveringsmodaliteter. Nylig ble forbedringer av TAEL/C120-systemet gjort ved å legge til et kjernefysisk lokaliseringssignal til TAEL (TAEL-N) og ved å koble C120-forskriftselementet til en cFos basalpromotor (C120F) (figur 1A). Disse endringene forbedret induksjonsnivåene med mer enn 15 ganger6.
I denne protokollen brukes et enkelt LED-panel til å aktivere TAEL / C120-systemet og indusere det allestedsnærværende uttrykket til et reportergen, GFP. Uttrykksinduksjon kan overvåkes kvalitativt ved å observere fluorescensintensitet eller kvantitativt ved å måle transkripsjonsnivåer ved hjelp av kvantitativ sanntids-PCR (qRT-PCR). Denne protokollen vil demonstrere TAEL/C120-systemet som et allsidig, brukervennlig verktøy som muliggjør robust regulering av genuttrykk in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført med godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California Merced.
1. Sebrafiskkryssing og embryosamling
- Oppretthold separate transgene sebrafisklinjer som inneholder enten TAEL-transkripsjonsaktivatoren eller det C120-kontrollerte reportergenet for å minimere falsk aktivering.
- Kryss 6-8 voksne sebrafisk fra hver linje ved hjelp av standardmetode9 for å produsere doble transgene embryoer som inneholder både TAEL- og C120-komponentene (Figur 1B).
MERK: Alternativt kan begge komponentene uttrykkes forbigående gjennom mikroinjeksjon av mRNA eller plasmid DNA ved hjelp av standardmetoder10. - Samle embryoer i Petri-retter som inneholder eggvann (60 μg/ml Instant Ocean havsalt oppløst i destillert vann), med ca. 30 embryoer per tilstand som skal testes.
- Plasser rettene i en lyssikker boks eller deksel med aluminiumsfolie for å minimere utilsiktet aktivering ved omgivelseslys (se tabell 1).
2. Global lysinduksjon
- Bruk et blått lys (465 nm) LED-panel for å levere aktivering av blått lys til flere embryoer samtidig.
- Plasser LED-panelet i forhold til Petri-rettene som inneholder embryoer, slik at den faktiske lyseffekten som mottas av embryoene, er ca. 1,5 mW/cm2 målt ved en lyseffekt og energimåler (Figur 2A).
- Pulser lyset i intervaller på 1 t på/1 t av med et timerrelé hvis du lyser i mer enn 3 timer for å redusere risikoen for fotodamage til TAEL transkripsjonsaktivator5,8.
MERK: Den nøyaktige belysningstiden må kanskje optimaliseres for bestemte bruksområder. I denne protokollen er det gitt eksempler på belysningsvarighet på 30 min, 1 t, 3 t og 6 timer. - Fjern Petri-parabolenlokkene for å minimere lett spredning fra kondens.
- Plasser Petri-retter som inneholder kontrollembryoer i en lystett boks eller deksel med aluminiumsfolie for mørke kontroller.
3. Kvantitativ vurdering av induksjon ved qRT-PCR
- Fjern embryoer fra belysning etter ønsket aktiveringsvarighet.
- Trekk ut totalt RNA fra 30-50 lysaktiverte og 30-50 mørke embryoer ved hjelp av et RNA-isolasjonssett i følge settets instruksjoner.
- Overfør embryoer til et 1,5 ml mikrosenterrør og fjern overflødig eggvann. Tilsett lysisbuffer og homogeniser embryoene med en plastskade.
- Overfør lysatet til en kolonne som følger med settet, og fortsett med instruksjonene i settet. Fortsett umiddelbart til trinn 3.3 eller lagre renset RNA ved -20 °C til -80 °C.
- Bruk 1 μg total RNA for cDNA-syntese ved hjelp av et cDNA-syntesesett i følge instruksjonene i settet.
- Ta et tynnvegget 0,2 ml PCR-rør, tilsett 1 μg RNA til 4 μL 5x cDNA-reaksjonsmasterblanding (som inneholder optimalisert buffer, oligo-dT og tilfeldige primere, og dNTPer), 1 μL 20x omvendt transkripsjonsløsning og nukleasefritt vann til et totalt volum på 20 μL.
- Plasser røret i en termosykler programmert som følger: 22 °C i 10 minutter, 42 °C i 30 minutter, 85 °C i 5 minutter, og hold deretter ved 4 °C. Fortsett umiddelbart til trinn 3.4 eller lagre cDNA ved -20 °C.
- Forbered qPCR-reaksjoner som inneholder SYBR grønn enzymmesterblanding, 5 ganger fortynnet cDNA (trinn 3.3) og 325 nM av hver primer for GFP.
MERK: Primere som brukes i denne protokollen som følger. GFP fremover: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP revers: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a fremover 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a revers: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - Utfør qPCR-reaksjoner i en PCR-maskin i sanntid.
MERK: PCR-program: første aktivering ved 95 °C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 30 s ved 95 °C, 30 s ved 60 °C og 1 min ved 72 °C. - Utfør en smeltekurveanalyse når PCR er fullført for å bestemme reaksjonsspenheten. Utfør tre tekniske replikeringer for hver prøve.
- Beregn lysaktivert induksjon som foldendring i forhold til embryoer som holdes i mørket ved hjelp av 2-ΔΔCt-metoden 11. Statistisk signifikans kan bestemmes med en programvarepakke for statistikk.
4. Kvalitativ vurdering av induksjon ved fluorescensmikroskopi
- Fjern embryoene fra belysning etter ønsket aktiveringsvarighet.
- Immobilisere embryoer for avbildning i 3% metylcellulose som inneholder 0,01% trikain i glassdepresjon lysbilder.
- Skaff deg fluorescens- og brightfield-bilder på et fluorescerende stereomikroskop koblet til et digitalt kamera ved hjelp av standard GFP-filterinnstillinger. Bruk identiske innstillinger for bildeinnhenting for alle eksempler.
- Slå sammen brightfield- og fluorescensbilder etter oppkjøpet med bildebehandlingsprogramvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For denne demonstrasjonen ble en C120-responsiv GFP-reporterlinje (Tg(C120F:GFP)ucm107)krysset med en transgen linje som uttrykker TAEL-N allestedsnærværende fra allestedsnærværende b (ubb) promotor (Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) for å produsere doble transgene embryoer som inneholder begge elementene. 24 timer etter befruktning ble embryoene utsatt for å aktivere det blå lyset, pulsert med en frekvens på 1 t på / 1 time av. Induksjon av GFP-uttrykk ble kvantifisert av qRT-PCR ved 30 min, 1 t, 3 t og 6 t etter aktivering (Figur 2B og Tabell 1). Sammenlignet med kontrollsøskenembryoer holdt i mørket, ble induksjon av GFP-uttrykk oppdaget så snart som 30 minutter etter eksponeringen av blått lys. Nivåer av GFP-uttrykk fortsatte deretter å øke opptil 6 timer etter aktivering jevnt og trutt.
GFP-induksjon ble også kvalitativt vurdert ved å undersøke fluorescensintensiteten samtidig etter aktivering (Figur 2C-F). GFP-fluorescens over bakgrunnsnivåer ble først observert ved 3 timers etteraktivering og ble merkbart lysere ved 6 timers etter aktivering. Kontrollembryoer for alle tidspunkter som ble holdt i mørket viste derimot ingen merkbar GFP-fluorescens (Figur 2G-J).
Figur 1: Skjematisk tael/C120-funksjon og eksperimentell design. (A) TAEL/C120-systemet består av en transkripsjonsaktivator kalt TAEL smeltet sammen til et kjernefysisk lokaliseringssignal (TAEL-N) og et TAEL-responsivt regulatorisk element kalt C120 kombinert med en cFos basal promoter (C120F) kjøreuttrykk av et gen av interesse. TAEL-avhengig transkripsjon er aktiv i nærvær av blått lys, men ikke i mørket. NLS, kjernefysisk lokaliseringssignal. (B) I denne protokollen uttrykker en transgen linje TAEL-N allestedsnærværende (Tg(ubb:TAEL-N)) krysses til en C120-drevet GFP-reporterlinje (Tg(C120F:GFP)) for å produsere doble transgene embryoer. Fra 24 hkf utsettes embryoene for aktivering av blått lys i ulike varigheter opptil 6 t-illustrasjoner laget med et nettbasert vitenskapsillustrasjonsverktøy (se Materialfortegnelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater av lysaktivert genuttrykk med TAEL/C120. (A) Et typisk lysaktiveringsoppsett inkluderer en blå LED-lyskilde plassert i en inkubator. Petri retter som inneholder sebrafisk embryoer er plassert i forhold til lyskilden slik at den mottatte lyskraften er ca. 1,5 mW / cm2 (prikket linje). Petri parabolen lokk fjernes under lysaktivering for å minimere lysspredning. (B) Kvantifisering av GFP mRNA-nivåer med qRT-PCR på de angitte tidspunktene etter aktivering med blått lys. Data presenteres som GFP fold induksjon i forhold til søsken kontroll embryoer holdt i mørket. Prikker representerer biologiske replikeringer (clutcher). Heltrukne vannrette stolper representerer gjennomsnittet. Feilfelt, standardavvik. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Enveis ANOVA bestemte p-verdier. (C-J) Representative bilder som viser GFP fluorescensintensitet av embryoer utsatt for blått lys (C-F) eller holdt i mørket (G-J). Fluorescerende bilder (grønn) er slått sammen med tilsvarende brightfield-bilder (gråtoner): skalalinjer, 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| GFP fold induksjon Blått lys (465 nm) |
GFP fold induksjon Omgivelseslyset |
||||||
| Tid etter belysning | Bety | Øvre grense | Nedre grense | Bety | Øvre grense | Nedre grense | p-verdi |
| 30 min | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1 t | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 timer | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 timer | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
Tabell 1: Sammenligning av TAEL/C120-indusert uttrykk med blått og omgivelseslys. Fold induksjon av GFP mRNA nivåer etter eksponering for aktivering av blått lys (465 nm) eller omgivelseslys for den angitte tiden, normalisert for å kontrollere søsken embryoer holdt i mørket. mRNA-nivåene ble kvantifisert av qRT-PCR. Data rapporteres som gjennomsnittlig foldinduksjon +/- øvre og nedre grenser. p-verdier ble bestemt av flere t-tester. n = 3 clutcher for alle tidspoeng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver bruken av optogenetisk TAEL/C120-system for å oppnå blått lys-induserbart genuttrykk. Dette systemet består av en transkripsjonsaktivator, TAEL, som dimmerer ved belysning med blått lys og aktiverer transkripsjon av et gen av interesse nedstrøms for et C120 regulatorisk element. Indusert uttrykk for en GFP-reporter kan oppdages etter så lite som 30 min lyseksponering, noe som tyder på at denne tilnærmingen har relativt rask og responsiv kinetikk.
Flere faktorer kan påvirke induksjonsnivåene. Mest kritisk er bølgelengden og kraften til å aktivere lys. I denne protokollen ble det brukt 465 nm LED-lys ved 1,5 W/cm2. Kortere og lengre bølgelengder (henholdsvis lilla og grønt lys) og lavere lyseffekt aktiverer ikke uttrykket effektivt (data vises ikke). På den annen side øker mer lyskraft risikoen for fotodamaging av embryoene. For vellykket bruk av TAEL-systemet må aktivering av lys derfor være (1) i det blå området av det synlige lysspekteret og (2) med tilstrekkelig effekt til å balansere effektiv aktivering av TAEL med redusert fotodamagerisiko. Effektiv lyseffekt kan variere avhengig av eksperimentelle forhold, og det kan derfor være nødvendig å bli empirisk bestemt. Det bør også tas hensyn til å beskytte embryoer mot omgivelseslys, som inneholder en viss mengde blått lys, før aktivering. Det er funnet at TAEL/C120-avhengig uttrykk kan induserer ved bredspektret omgivelseslys, om enn på mye lavere nivåer sammenlignet med bare blått lys (Tabell 1).
Mens GFP-uttrykk først kan oppdages av qPCR etter 30 min belysning, er uttrykksnivåene ikke stabile. Likevel fortsetter de å stige til de når en topp på 3 timers lysbehandling, hvoretter disse høye uttrykksnivåene opprettholdes i opptil 6 timer. Disse resultatene tyder på at TAEL/C120-induserte uttrykksnivåer i tillegg til bølgelengde og lyseffekt også er avhengige av belysningsvarighet, i hvert fall til systemet når en maksimums- eller metningstilstand. I motsetning til disse qPCR-resultatene, observerer vi ikke kvalitativt merkbar GFP-fluorescens før etter 3 timers belysning, og fluorescensintensiteten fortsetter å øke i opptil 6 timer belysning. Uoverensstemmelsen mellom qPCR- og fluorescensintensitetsobservasjonene forklares sannsynligvis av den ekstra tiden som trengs for GFP-syntese-, folde- og modningsfaktorer som sannsynligvis vil variere avhengig av genet av interesse. Derfor kan det være nødvendig med noe optimalisering av belysningsvarigheten, avhengig av applikasjonen.
Denne protokollen presenterte den mest enkle metoden for å aktivere TAEL / C120-systemet ved hjelp av et blått lys LED-panel for å belyse sebrafiskembryoer globalt. Denne tilnærmingen har fordelene med både brukervennlighet og kostnadseffektivitet. Lysaktivering kan imidlertid også kontrolleres romlig om nødvendig. Det ble tidligere demonstrert at TAEL-indusert uttrykk kunne begrenses romlig ved hjelp av flere modaliteter for å levere brukerdefinert, romlig mønstret blått lys5. Ytterligere romlig spesifisitet kan oppnås ved hjelp av vevsspesifikke promotorer for å regulere uttrykket til TAEL transkripsjonsaktivator6.
Sammenlignet med legemiddel- eller varmesjokk-induserbare uttrykkssystemer, kan optogenetiske uttrykkssystemer potensielt tilby bedre romlig og tidsmessig kontrollovertrykk ved å bruke lys som induserende middel. I tillegg til TAEL/C120 er det utviklet andre lysaktiverte transkripsjonssystemer12,13,14,15. TAEL/C120 kan imidlertid være spesielt godt egnet for bruk i sebrafisk (og potensielt andre multicellulære systemer) av flere grunner. For det første fungerer TAEL-transkripsjonsaktivatoren som en homodimer, noe som forenkler antall nødvendige komponenter. I tillegg krever LOV domeneholdige proteiner som TAEL en flavin kromofor forlysabsorpsjon 16. Denne kofaktoren er endogent tilstede i dyreceller, og fjerner behovet for å legge til en eksogen kromofor som med andre systemer. Til slutt, aktivert TAEL er spådd å ha en relativt kort halveringstid på ca 30 s i fravær av blått lys8, noe som muliggjør mer presis på / av kontroll. Denne korte halveringstiden betyr imidlertid også at langsiktig eller kronisk uttrykk vil kreve langsiktig belysning av embryoer, noe som kan eller ikke kan være ønskelig avhengig av omstendighetene.
Oppsummert viser denne protokollen at TAEL/C120-systemet er et blått lysaktivert genuttrykkssystem som er enkelt å bruke, har rask og responsiv kinetikk, og er spesielt godt egnet for in vivo-applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter ble erklært.
Acknowledgments
Vi takker Stefan Materna og medlemmer av Woo- og Materna-laboratoriene for nyttige forslag og kommentarer til denne protokollen. Vi takker Anna Reade, Kevin Gardner og Laura Motta-Mena for verdifull diskusjon og innsikt mens vi utvikler denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) og University of California Cancer Research Coordinating Committee (CRN-20-636896) til S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
