Summary
Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.
Abstract
Sistemas de expressão genética indutíveis são uma ferramenta inestimável para estudar processos biológicos. Sistemas de expressão optogenética podem fornecer controle preciso sobre o tempo, localização e amplitude da expressão genética usando a luz como agente indutor. Neste protocolo, um sistema de expressão optogenética é usado para alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish. Este sistema se baseia em um fator de transcrição projetado chamado TAEL baseado em um fator de transcrição ativado pela luz natural da bactéria E. litoralis. Quando iluminado com luz azul, o TAEL escurece, liga-se ao seu elemento regulatório cognato chamado C120 e ativa a transcrição. Este protocolo utiliza embriões transgênicos de zebrafish que expressam o fator de transcrição do TAEL sob o controle do onipresente promotor ubb. Ao mesmo tempo, o elemento regulatório C120 impulsiona a expressão de um gene repórter fluorescente (GFP). Usando um simples painel LED para fornecer luz azul ativante, a indução da expressão GFP pode ser detectada primeiro após 30 minutos de iluminação e atinge um pico de mais de 130 vezes de indução após 3h de tratamento leve. A indução de expressão pode ser avaliada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e por microscopia de fluorescência. Este método é uma abordagem versátil e fácil de usar para a expressão genética optogenética.
Introduction
Sistemas de expressão genética indutíveis ajudam a controlar a quantidade, o tempo e a localização da expressão genética. No entanto, alcançar o controle espacial e temporal exato em organismos multicelulares tem sido desafiador. O controle temporal é mais comumente alcançado adicionando compostos de pequenas moléculas1 ou ativação dos promotores de choque térmico2. Ainda assim, ambas as abordagens são vulneráveis a questões de tempo, força de indução e respostas de estresse fora do alvo. O controle espacial é alcançado principalmente pelo uso de promotores específicos do tecido3,mas essa abordagem requer um promotor adequado ou elemento regulatório, que nem sempre estão disponíveis, e não é propício à indução do nível subsecimento.
Em contraste com tais abordagens convencionais, ativadores transcricionais optogenéticos ativados pela luz têm o potencial de um controle espacial e temporal mais fino da expressãogenética 4. O sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul foi desenvolvido e otimizado para uso em embriões de zebrafish5,6. Este sistema é baseado em um fator de transcrição endógeno ativado pela luz da bactéria E. litoralis7,8. O sistema TAEL/C120 consiste em um ativador transcricional chamado TAEL que contém um domínio de transativação Kal-TA4, um domínio LOV lov (sensor de tensão de luz-oxigênio) azul e um domínio de ligação de DNA helix-turn-helix (HTH)5. Quando iluminados, os domínios LOV sofrem uma alteração conformacional que permite que duas moléculas de TAEL dimerizem, vinculem-se a um promotor C120 responsivo do TAEL e iniciem a transcrição de um gene a jusante de interesse5,8. O sistema TAEL/C120 apresenta indução rápida e robusta com toxicidade mínima, podendo ser ativado por diversas modalidades diferentes de entrega de luz. Recentemente, foram feitas melhorias no sistema TAEL/C120, adicionando um sinal de localização nuclear ao TAEL (TAEL-N) e acoplando o elemento regulatório C120 a um promotor basal cFos (C120F) (Figura 1A). Essas modificações melhoraram os níveis de indução em mais de 15vezes 6.
Neste protocolo, um simples painel LED é usado para ativar o sistema TAEL/C120 e induzir a expressão onipresente de um gene repórter, GFP. A indução de expressão pode ser monitorada qualitativamente observando a intensidade da fluorescência ou quantitativamente medindo os níveis de transcrição usando PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Este protocolo demonstrará o sistema TAEL/C120 como uma ferramenta versátil e fácil de usar que permite uma regulação robusta da expressão genética in vivo.
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Protocol
Este estudo foi realizado com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia Merced.
1. Travessia de zebrafish e coleta de embriões
- Mantenha linhas separadas de zebrafish transgênicos contendo o ativador transcricional TAEL ou o gene repórter controlado pelo C120 para minimizar a ativação espúria.
- Cruze 6-8 zebrafish adultos de cada linha usando métodos padrão9 para produzir embriões transgênicos duplos que contêm os componentes TAEL e C120(Figura 1B).
NOTA: Alternativamente, ambos os componentes podem ser expressos transitoriamente através de microinjeção de mRNA ou DNA plasmídeo usando métodos padrão10. - Coletar embriões em placas de Petri contendo água de ovo (60 μg/mL Sal marinho do Oceano Instantâneo dissolvido em água destilada), com aproximadamente 30 embriões por condição a ser testado.
- Coloque os pratos em uma caixa à prova de luz ou cubra com papel alumínio para minimizar a ativação não intencional por luz ambiente (ver Tabela 1).
2. Indução global de luz
- Use um painel LED de luz azul (465 nm) para fornecer luz azul ativante a vários embriões ao mesmo tempo.
- Posicione o painel LED em relação às placas de Petri contendo embriões de modo que o poder real da luz recebido pelos embriões seja de aproximadamente 1,5 mW/cm2 medido por um medidor de energia e energia leve(Figura 2A).
- Pulso a luz em intervalos de 1 h em/1 h desligando usando um relé de temporizador se iluminar por mais de 3h para reduzir o risco de fotodamagem ao ativador transcricional TAEL5,8.
NOTA: A duração exata da iluminação pode precisar ser otimizada para aplicações específicas. Neste protocolo, são fornecidos exemplos de duração de iluminação de 30 min, 1h, 3 h e 6h. - Remova as tampas da placa de Petri para minimizar a dispersão de luz da condensação.
- Coloque placas de Petri contendo embriões de controle em uma caixa à prova de luz ou cubra com papel alumínio para controles escuros.
3. Avaliação quantitativa da indução por qRT-PCR
- Remova os embriões da iluminação após a duração desejada de ativação.
- Extrair RNA total de 30-50 embriões escuros ativados por luz e 30-50 usando um kit de isolamento de RNA seguindo as instruções do kit.
- Transfira embriões para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e remova o excesso de água dos ovos. Adicione tampão de lise e homogeneize os embriões com um pilão plástico.
- Transfira o lysate para uma coluna fornecida pelo kit e continue com as instruções do kit. Proceda imediatamente para a etapa 3.3 ou armazene o RNA purificado a -20 °C a -80 °C.
- Use 1 μg total de RNA para síntese de cDNA usando um kit de síntese cDNA seguindo as instruções do kit.
- Pegue um tubo PCR de parede fina de 0,2 mL, adicione 1 μg de RNA a 4 μL de 5x cDNA reaction master mix (contendo buffer otimizado, oligo-dT e primers aleatórios, e dNTPs), 1 μL de solução de transcriptase reversa de 20x e água sem nuclease para um volume total de 20 μL.
- Coloque o tubo em um termociclador programado da seguinte forma: 22 °C para 10 min, 42 °C para 30 min, 85 °C por 5 min e, em seguida, mantenha a 4 °C. Proceda imediatamente para a etapa 3.4 ou armazenar cDNA a -20 °C.
- Prepare as reações qPCR contendo mistura mestre de enzimas verdes SYBR, cDNA diluída de 5 vezes (etapa 3.3) e 325 nM de cada primer para GFP.
NOTA: Primers usados neste protocolo da seguinte forma. Avanço GFP: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; Reverso GFP: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverso: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCATCAT-3'). - Realize reações qPCR em uma máquina PCR em tempo real.
NOTA: Programa PCR: ativação inicial a 95 °C por 10 min, seguido por 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 1 min a 72 °C. - Realize uma análise de curva de derretimento assim que o PCR estiver concluído para determinar a especificidade da reação. Realize três réplicas técnicas para cada amostra.
- Calcule a indução ativada pela luz como mudança de dobra em relação aos embriões mantidos no escuro usando o método 2-ΔΔCt 11. A significância estatística pode ser determinada com um pacote de software estatístico.
4. Avaliação qualitativa da indução por microscopia de fluorescência
- Remova os embriões da iluminação após a duração desejada da ativação.
- Imobilize embriões para imagem em 3% de metilcelulose contendo 0,01% de tricaine em lâminas de depressão de vidro.
- Adquira imagens de fluorescência e brightfield em um estereóquio fluorescente conectado a uma câmera digital usando as configurações padrão do filtro GFP. Use configurações idênticas de aquisição de imagens para todas as amostras.
- Mescle imagens de brightfield e fluorescência após a aquisição com software de processamento de imagens.
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Representative Results
Para esta demonstração, uma linha de repórteres GFP responsiva C120 -responsiva (Tg(C120F:GFP)ucm107)foi cruzada com uma linha transgênica que expressa TAEL-N onipresentemente a partir da ubiquitina b (ubb) promotor(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) para produzir embriões transgênicos duplos contendo ambos os elementos. 24 h pós-fertilização, os embriões foram expostos à ativação da luz azul, pulsado a uma frequência de 1 h on/1 h off. A indução da expressão GFP foi quantificada por qRT-PCR em 30 min, 1 h, 3 h e 6 h pós-ativação(Figura 2B e Tabela 1). Em comparação com os embriões de irmãos controlados mantidos no escuro, a indução da expressão GFP foi detectada logo 30 minutos após a exposição à luz azul. Os níveis de expressão GFP continuaram a aumentar até 6 horas após a ativação de forma constante.
A indução de GFP também foi avaliada qualitativamente examinando a intensidade da fluorescência ao mesmo tempo em que os pontos pós-ativação(Figura 2C-F). A fluorescência GFP acima dos níveis de fundo foi observada pela primeira vez em 3 h após a ativação e tornou-se visivelmente mais brilhante em 6 h após a ativação. Em contrapartida, os embriões de controle para todos os pontos de tempo mantidos no escuro não apresentaram nenhuma fluorescência GFP apreciada(Figura 2G-J).
Figura 1: Esquema da função TAEL/C120 e design experimental. (A) O sistema TAEL/C120 consiste em um ativador transcricional chamado TAEL fundido a um sinal de localização nuclear (TAEL-N) e um elemento regulatório sensível ao TAEL chamado C120 acoplado a uma expressão de condução cFos basal (C120F) de um gene de interesse. A transcrição dependente de TAEL está ativa na presença de luz azul, mas não no escuro. NLS, sinal de localização nuclear. (B) Neste protocolo, uma linha transgênica expressa TAEL-N onipresentemente(Tg(ubb:TAEL-N)) é cruzada para uma linha de repórter GFP orientada por C120(Tg(C120F:GFP)para produzir embriões transgênicos duplos. A partir de 24 cvf, os embriões são expostos à ativação da luz azul por várias durações até 6 h-ilustrações criadas com uma ferramenta de ilustração científica baseada na Web (ver Tabela de Materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos da expressão genética ativada pela luz com TAEL/C120. (A) Uma configuração típica de ativação da luz inclui uma fonte de luz LED azul colocada em uma incubadora. As placas de petri contendo embriões de zebrafish são posicionadas em relação à fonte de luz de modo que o poder recebido de luz seja de aproximadamente 1,5 mW/cm2 (linha pontilhada). As tampas da placa de Petri são removidas durante a ativação da luz para minimizar a dispersão da luz. (B) Quantificação dos níveis de MRNA GFP por qRT-PCR nos pontos de tempo indicados após a ativação com luz azul. Os dados são apresentados como indução de dobra GFP em relação aos embriões de controle de irmãos mantidos no escuro. Os pontos representam réplicas biológicas (embreagens). Barras horizontais sólidas representam a média. Barras de erro, desvio padrão. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. A ANOVA de mão única determinou valores p. (C-J) Imagens representativas mostrando a intensidade de fluorescência GFP de embriões expostos à luz azul (C-F) ou mantidos no escuro(G-J). Imagens fluorescentes (verde) foram mescladas com imagens de campo brilhante correspondentes (escala de cinza): barras de escala, 500 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Indução da dobra GFP Luz azul (465 nm) |
Indução da dobra GFP Luz ambiente |
||||||
| Tempo pós-iluminação | Significar | Limite superior | Limite inferior | Significar | Limite superior | Limite inferior | p valor |
| 30 min. | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1h | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 h | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 h | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
Tabela 1: Comparação da expressão induzida por TAEL/C120 por luz azul e ambiente. Indução dobrou os níveis de GFP mRNA após exposição à ativação da luz azul (465 nm) ou luz ambiente durante o tempo indicado, normalizada para controlar embriões irmãos mantidos no escuro. os níveis de mRNA foram quantificados por qRT-PCR. Os dados são relatados como indução média de dobra +/- limites superiores e inferiores. p os valores foram determinados por múltiplost-testes. n = 3 embreagens para todos os pontos de tempo.
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Discussion
Este protocolo descreve o uso do sistema optogenético TAEL/C120 para alcançar a expressão genética indutível da luz azul. Este sistema consiste em um ativador transcricional, TAEL, que escurece após a iluminação com luz azul e ativa a transcrição de um gene de interesse a jusante de um elemento regulatório C120. A expressão induzida de um repórter do GFP pode ser detectada após apenas 30 minutos de exposição à luz, sugerindo que essa abordagem possui cinética relativamente rápida e responsiva.
Vários fatores podem afetar os níveis de indução. O mais crítico são o comprimento de onda e o poder de ativar a luz. Neste protocolo, foram utilizadas luzes LED de 465 nm entregues a 1,5 W/cm2. Comprimentos de onda mais curtos e longos (luz roxa e verde, respectivamente) e menor poder de luz não ativam a expressão efetivamente (dados não mostrados). Por outro lado, mais energia leve aumenta o risco de fotodamificar os embriões. Assim, para o uso bem-sucedido do sistema TAEL, a ativação da luz deve ser (1) na faixa azul do espectro de luz visível e (2) com potência suficiente para equilibrar a ativação efetiva do TAEL com risco reduzido de fotodamagem. A potência de luz eficaz pode variar dependendo das condições experimentais e, portanto, pode precisar ser determinada empiricamente. Deve-se também tomar cuidado para proteger os embriões da luz ambiente, contendo alguma quantidade de luz azul, antes da ativação. Verificou-se que a expressão dependente de TAEL/C120 pode ser induzida por luz ambiente de amplo espectro, embora em níveis muito mais baixos em comparação apenas com a luz azul(Tabela 1).
Embora a expressão GFP possa ser detectada primeiro por qPCR após 30 minutos de iluminação, os níveis de expressão não são estáveis. Ainda assim, eles continuam a subir até atingir um pico de 3h de tratamento leve, após o qual esses altos níveis de expressão são mantidos por até 6h. Esses resultados sugerem que, além do comprimento de onda e da energia da luz, os níveis de expressão induzidos pelo TAEL/C120 também dependem da duração da iluminação, pelo menos até que o sistema atinja um estado máximo ou de saturação. Em contraste com esses resultados qPCR, não observamos qualitativamente a fluorescência gfp apreciável até depois de 3 horas de iluminação, e a intensidade da fluorescência continua a aumentar por até 6 horas de iluminação. A discrepância entre as observações de intensidade de qPCR e fluorescência é provavelmente explicada pelo tempo adicional necessário para a síntese de GFP, dobramento e fatores de maturação que provavelmente variam dependendo do gene de interesse. Portanto, alguma otimização da duração da iluminação pode ser necessária dependendo da aplicação.
Este protocolo apresentou o método mais simples para ativar o sistema TAEL/C120 usando um painel LED de luz azul para iluminar embriões de zebrafish globalmente. Essa abordagem tem as vantagens tanto da facilidade de uso quanto do custo-benefício. No entanto, a ativação da luz também pode ser controlada espacialmente, se necessário. Foi demonstrado anteriormente que a expressão induzida pelo TAEL poderia ser espacialmente restrita usando múltiplas modalidades para fornecer luz azul definida pelo usuário e espacialmente padronizada5. Uma especificidade espacial adicional pode ser alcançada utilizando promotores específicos do tecido para regular a expressão do ativador transcricional TAEL6.
Em comparação com sistemas de expressão indutíveis por choque de calor ou drogas, os sistemas de expressão optogenética potencialmente oferecem melhor superexpressão de controle espacial e temporal usando a luz como agente indutor. Além do TAEL/C120, outros sistemas transcricionais ativados pela luz foram desenvolvidos12,13,14,15. No entanto, o TAEL/C120 pode ser especialmente adequado para uso em zebrafish (e potencialmente outros sistemas multicelulares) por várias razões. Primeiro, o ativador transcricional TAEL funciona como um homodimer, o que simplifica o número de componentes necessários. Além disso, proteínas contendo domínio lov como TAEL requerem um cromoforo flavin para absorção de luz16. Este cofato está endógenamente presente dentro de células animais, removendo a necessidade de adicionar um cromooto exógeno como com outros sistemas. Finalmente, prevê-se que o TAEL ativado tenha uma meia-vida relativamente curta de aproximadamente 30 s na ausência de luz azul8,permitindo um controle mais preciso de on/off. No entanto, essa meia-vida curta também significa que a expressão a longo prazo ou crônica exigiria a iluminação a longo prazo dos embriões, o que pode ou não ser desejável dependendo das circunstâncias.
Em resumo, este protocolo demonstra que o sistema TAEL/C120 é um sistema de expressão genética ativado pela luz azul que é fácil de usar, possui cinética rápida e responsiva e é particularmente adequado para aplicações in vivo.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses foi declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a Stefan Materna e aos membros dos laboratórios Woo e Materna por sugestões úteis e comentários sobre este protocolo. Agradecemos a Anna Reade, Kevin Gardner e Laura Motta-Mena por valiosas discussões e insights enquanto desenvolvem este protocolo. Este trabalho foi apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH; R03 DK106358) e o Comitê Coordenador de Pesquisa do Câncer da Universidade da Califórnia (CRN-20-636896) para s.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
