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Developmental Biology

ऑप्टोजेनेटिक TAEL/C120 सिस्टम का उपयोग कर जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश प्रेरित GFP अभिव्यक्ति

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62818
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

Summary

ऑप्टोजेनेटिक्स व्यापक अनुप्रयोगों के साथ एक शक्तिशाली उपकरण है। यह प्रोटोकॉल नीले प्रकाश-उत्तरदायी TAEL/C120 प्रणाली का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश-अक्षुशील जीन अभिव्यक्ति को कैसे प्राप्त करना दर्शाता है ।

Abstract

अकांक्षित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण हैं। ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति सिस्टम उत्प्रेरण एजेंट के रूप में प्रकाश का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति समय, स्थान और आयाम पर सटीक नियंत्रण प्रदान कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश-अक्षम जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग किया जाता है। यह प्रणाली जीवाणु ई. लिटोरालिससे स्वाभाविक रूप से होने वाले प्रकाश-सक्रिय प्रतिलेखन कारक के आधार पर TAEL नामक एक इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शन कारक पर निर्भर करती है। जब नीली रोशनी से प्रकाशित होता है, तो TAEL dimerizes, C120 नामक अपने कॉग्नेट नियामक तत्व को बांधता है, और प्रतिलेखन को सक्रिय करता है। यह प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग करता है जो सर्वव्यापी यूबीबी प्रमोटर के नियंत्रण में TAEL प्रतिलेखन कारक को व्यक्त करता है। इसके साथ ही सी120 रेगुलेटरी एलिमेंट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन (जीएफपी) की अभिव्यक्ति को ड्राइव करता है । सक्रिय नीली रोशनी देने के लिए एक साधारण एलईडी पैनल का उपयोग करना, GFP अभिव्यक्ति के प्रेरण को पहले 30 मिनट की रोशनी के बाद पता लगाया जा सकता है और प्रकाश उपचार के 3 घंटे के बाद 130 गुना से अधिक प्रेरण के शिखर तक पहुंचता है। अभिव्यक्ति प्रेरण का मूल्यांकन मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है। यह विधि ऑप्टोजेटिक जीन अभिव्यक्ति के लिए एक बहुमुखी और उपयोग में आसान दृष्टिकोण है।

Introduction

अकांक्षित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली जीन अभिव्यक्ति की मात्रा, समय और स्थान को नियंत्रित करने में मदद करती है। हालांकि, बहुकोशिकीय जीवों में सटीक स्थानिक और लौकिक नियंत्रण प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण रहा है। टेम्पोरल कंट्रोल सबसे अधिक छोटे अणु यौगिकों 1 या हीट शॉक प्रमोटरों की सक्रियता2 जोड़कर हासिल कियाजाताहै। फिर भी, दोनों दृष्टिकोण समय, प्रेरण शक्ति, और ऑफ-टारगेट तनाव प्रतिक्रियाओं के मुद्दों के प्रति असुरक्षित हैं । स्थानिक नियंत्रण मुख्य रूप से ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों 3 के उपयोग से प्राप्तहोताहै, लेकिन इस दृष्टिकोण के लिए एक उपयुक्त प्रमोटर या नियामक तत्व की आवश्यकता होती है, जो हमेशा उपलब्ध नहीं होते हैं, और यह उप-ऊतक स्तर प्रेरण के लिए अनुकूल नहीं है।

इस तरह के पारंपरिक दृष्टिकोणों के विपरीत, हल्के सक्रिय ऑप्टोजेनेटिक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर में जीन अभिव्यक्ति4के महीन स्थानिक और लौकिक नियंत्रण की क्षमता होती है। नीली रोशनी-उत्तरदायी TAEL/C120 प्रणाली को जेब्राफिश भ्रूण5,6में उपयोग के लिए विकसित और अनुकूलित किया गया था। यह प्रणाली जीवाणु ई. लिटोरलिस7, 8से एक अंतर्जात प्रकाश-सक्रिय प्रतिलेखन कारक पर आधारित है। TAEL/C120 सिस्टम में एक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर होता है जिसे TAEL कहा जाता है जिसमें काल-TA4 ट्रांसएक्टिवेशन डोमेन, नीली बत्ती-उत्तरदायी लव (लाइट-ऑक्सीजन-वोल्टेज सेंसिंग) डोमेन, और एक हेलिक्स-टर्न-हेलिक्स (एचटीएच) डीएनए-बाध्यकारी डोमेन5शामिल है । जब प्रबुद्ध होते हैं, तो LOV डोमेन एक अनुरूप परिवर्तन से गुजरते हैं जो दो TAEL अणुओं को मंद करने, एक TAEL-उत्तरदायी C120 प्रमोटर से बांधने और ब्याज5, 8के डाउनस्ट्रीम जीन के प्रतिलेखन की शुरुआत करने की अनुमतिदेताहै। TAEL/C120 प्रणाली न्यूनतम विषाक्तता के साथ तेजी से और मजबूत प्रेरण प्रदर्शित करती है, और इसे कई अलग-अलग प्रकाश वितरण तौर-तरीकों से सक्रिय किया जा सकता है। हाल ही में, TAEL/C120 प्रणाली में सुधार TAEL (TAEL-N) के लिए एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत जोड़कर और एक cFos बेसल प्रमोटर (C120F)(चित्रा 1A)के लिए C120 नियामक तत्व युग्मन द्वारा किए गए थे । इन संशोधनों से 15 गुना6से अधिक प्रेरण स्तर में सुधार हुआ ।

इस प्रोटोकॉल में, एक साधारण एलईडी पैनल का उपयोग TAEL/C120 प्रणाली को सक्रिय करने और एक रिपोर्टर जीन, जीएफपी की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए किया जाता है । मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्ट स्तरों को मापकर फ्लोरेसेंस तीव्रता या मात्रात्मक रूप से देख कर अभिव्यक्ति प्रेरण की गुणात्मक निगरानी की जा सकती है। यह प्रोटोकॉल एक बहुमुखी, आसानी से उपयोग करने वाले उपकरण के रूप में TAEL/C120 प्रणाली का प्रदर्शन करेगा जो वीवो मेंजीन अभिव्यक्ति के मजबूत नियमन को सक्षम बनाता है ।

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Protocol

यह अध्ययन कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय मर्सीड की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुमोदन से किया गया था।

1. ज़ेब्राफ़िश क्रॉसिंग और भ्रूण संग्रह

  1. नकली सक्रियण को कम करने के लिए टीएईएल ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर या C120-नियंत्रित रिपोर्टर जीन युक्त अलग ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों को बनाए रखें।
  2. प्रत्येक लाइन से 6-8 वयस्क जेब्राफिश को पार करें मानक तरीकों का उपयोग करके9 डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण का उत्पादन करने के लिए जिसमें TAEL और C120 घटक(चित्रा 1B)दोनों होते हैं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, दोनों घटकों को मानक विधियों का उपयोग करके एमआरएनए या प्लाज्मिड डीएनए के माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से क्षणिक रूप से व्यक्त किया जा सकता है10।
  3. पेट्री व्यंजन में अंडे के पानी युक्त भ्रूण ले लीजिए (६० μg/mL तत्काल महासागर समुद्री नमक आसुत पानी में भंग), लगभग 30 भ्रूण प्रति हालत के साथ परीक्षण किया जाएगा ।
  4. परिवेश प्रकाश द्वारा अनपेक्षित सक्रियण को कम करने के लिए एक लाइटप्रूफ बॉक्स या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर में व्यंजन रखें (तालिका 1देखें)।

2. ग्लोबल लाइट इंडक्शन

  1. एक बार में कई भ्रूण को सक्रिय नीली रोशनी देने के लिए नीली रोशनी (465 एनएम) एलईडी पैनल का उपयोग करें।
  2. भ्रूण युक्त पेट्री व्यंजन के सापेक्ष एलईडी पैनल की स्थिति ताकि भ्रूण द्वारा प्राप्त प्रकाश की वास्तविक शक्ति लगभग १.५ mW/सेमी2 के रूप में एक प्रकाश शक्ति और ऊर्जा मीटर(चित्रा 2A)द्वारा मापा जाता है ।
  3. टीएईएल ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर 5,8 तक फोटोडैमेज के जोखिम को कम करने के लिए 3 घंटे से अधिक समय तक रोशन होने पर टाइमर रिले का उपयोग करके1घंटे के अंतराल पर प्रकाश कोपल्सकरें ।
    नोट: विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए रोशनी की सटीक अवधि को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में, 30 मिनट, 1 घंटे, 3 घंटे और 6 घंटे की रोशनी अवधि के उदाहरण प्रदान किए जाते हैं।
  4. संघनन से प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए पेट्री डिश लिड निकालें।
  5. एक लाइटप्रूफ बॉक्स में नियंत्रण भ्रूण युक्त पेट्री व्यंजन रखें या अंधेरे नियंत्रण के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।

3. क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा शामिल होने का मात्रात्मक आकलन

  1. वांछित सक्रियण अवधि के बाद रोशनी से भ्रूण निकालें।
  2. किट के निर्देशों के बाद एक आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके 30-50 प्रकाश-सक्रिय और 30-50 गहरे भ्रूण से कुल आरएनए निकालें।
    1. भ्रूण को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और अंडे के अतिरिक्त पानी को हटा दें। लाइसिस बफर जोड़ें और प्लास्टिक मूसल के साथ भ्रूण को समरूप करें।
    2. lysate को किट-प्रदान किए गए कॉलम में स्थानांतरित करें और किट के निर्देशों को जारी रखें। तुरंत 3.3 कदम या -20 डिग्री सेल्सियस से -80 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध आरएनए स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें।
  3. किट के निर्देशों का पालन करते हुए सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके सीडीएनए संश्लेषण के लिए 1 माइक्रोन कुल आरएनए का उपयोग करें।
    1. एक पतली दीवार वाली 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब लें, 5x सीडीएनए रिएक्शन मास्टर मिक्स (जिसमें अनुकूलित बफर, ओलिगो-डीटी और रैंडम प्राइमर, और डीएनटीपीएस) के 4 माइक्रोन में आरएनए का 1 माइक्रोन जोड़ें, 20x रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस समाधान का 1 माइक्रोन, और न्यूल्यूलेज-मुक्त पानी कुल मात्रा में 20 माइक्रोन की कुल मात्रा में।
    2. ट्यूब को इस प्रकार प्रोग्राम किए गए थर्मोसाइकिलर में रखें: 10 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ें। तुरंत 3.4 कदम या -20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें।
  4. जीएफपी के लिए एसआईबीआर ग्रीन एंजाइम मास्टर मिक्स, 5 गुना पतला सीडीएनए (चरण 3.3) और प्रत्येक प्राइमर के 325 एनएम युक्त क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में इस प्रकार उपयोग किए जाने वाले प्राइमर। जीएफपी फॉरवर्ड: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; जीएफपी रिवर्स: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a फॉरवर्ड 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a रिवर्स: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCCTAGCAT-3') ।
  5. एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन में क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाओं को पूरा करें।
    नोट: पीसीआर कार्यक्रम: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक सक्रियण, इसके बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 40 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट।
  6. प्रतिक्रिया विशिष्टता निर्धारित करने के लिए पीसीआर पूरा होने के बाद एक पिघल वक्र विश्लेषण करें। प्रत्येक नमूने के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृति प्रदर्शन करते हैं।
  7. 2-ΤCt विधि11का उपयोग कर अंधेरे में रखे भ्रूण के सापेक्ष गुना परिवर्तन के रूप में प्रकाश-सक्रिय प्रेरण की गणना करें। सांख्यिकीय महत्व एक सांख्यिकी सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ निर्धारित किया जा सकता है।

4. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रेरण का गुणात्मक मूल्यांकन

  1. सक्रियण की वांछित अवधि के बाद रोशनी से भ्रूण निकालें।
  2. ग्लास डिप्रेशन स्लाइड्स में 0.01% ट्राइकेन युक्त 3% मिथाइलसेलुलोस में इमेजिंग के लिए भ्रूण को स्थिर करें।
  3. मानक जीएफपी फ़िल्टर सेटिंग्स का उपयोग करके डिजिटल कैमरे से जुड़े फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर फ्लोरेसेंस और ब्राइटफील्ड छवियों को प्राप्त करें। सभी नमूनों के लिए समान छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करें।
  4. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहण के बाद ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस इमेज को मर्ज करें।

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Representative Results

इस प्रदर्शन के लिए, एक C120-उत्तरदायी GFP रिपोर्टर लाइन(Tg (C120F: GFP)ucm107))एक ट्रांसजेनिक लाइन है कि सर्वव्यापक बी (ubb)प्रमोटर(Tg (ubb: TABB: TAEL-N)ucm113)से टीएईएल-एन सर्वव्यापी व्यक्त के साथ पार किया गया था दोनों तत्वों युक्त डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण का उत्पादन करने के लिए । 24 घंटे के बाद निषेचन, भ्रूण नीली रोशनी को सक्रिय करने के लिए उजागर किया गया, पर 1 घंटे की आवृत्ति पर स्पंदित/ जीएफपी एक्सप्रेशन को क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा 30 मिनट, 1 घंटे, 3 घंटे और 6 घंटे के बाद सक्रियण(चित्रा 2B और तालिका 1)में निर्धारित किया गया था। नियंत्रण सहोदर भ्रूण अंधेरे में रखा की तुलना में, GFP अभिव्यक्ति के प्रेरण के रूप में जल्द ही 30 मिनट के रूप में नीली रोशनी जोखिम के बाद पता चला था । जीएफपी अभिव्यक्ति के स्तर तब लगातार 6 घंटे के बाद सक्रियण तक बढ़ना जारी रखा।

जीएफपी इंडक्शन का भी गुणात्मक रूप से मूल्यांकन किया गया था, एक ही समय में फ्लोरेसेंस तीव्रता की जांच करके सक्रियण के बाद(चित्रा 2C-F)। पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर जीएफपी फ्लोरेसेंस को पहली बार 3 घंटे के बाद सक्रियण पर देखा गया था और 6 घंटे के बाद सक्रियण पर काफी उज्जवल हो गया था। इसके विपरीत, अंधेरे में रखे गए सभी समय बिंदुओं के लिए नियंत्रण भ्रूण ने किसी भी प्रशंसनीय जीएफपी फ्लोरेसेंस(चित्रा 2जी-जे)का प्रदर्शन नहीं किया।

Figure 1
चित्रा 1:TAEL/C120 समारोह और प्रयोगात्मक डिजाइन की योजनाबद्ध । (A)TAEL/C120 प्रणाली एक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर के होते है एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत (TAEL-एन) और एक TAEL-उत्तरदायी नियामक तत्व C120 कहा जाता है एक cFos बेसल प्रमोटर (C120F) ब्याज की एक जीन की अभिव्यक्ति ड्राइविंग के लिए जुड़े । TAEL-निर्भर प्रतिलेखन नीली रोशनी की उपस्थिति में सक्रिय है लेकिन अंधेरे में नहीं। एनएलएस, परमाणु स्थानीयकरण संकेत। (ख)इस प्रोटोकॉल में, एक ट्रांसजेनिक लाइन TAEL-N सर्वव्यापी(Tg (ubb: TAEL-N)व्यक्त करता है) एक C120 संचालित GFP रिपोर्टर लाइन(Tg (C120F:GFP)को पार करने के लिए डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण का उत्पादन है । 24 एचपीएफ से शुरू, भ्रूण एक वेब आधारित विज्ञान चित्रण उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ बनाए गए 6 एच-चित्रों तक विभिन्न अवधियों के लिए नीली रोशनी को सक्रिय करने के संपर्क में हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:TAEL/C120 के साथ प्रकाश सक्रिय जीन अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि परिणाम । (A)एक ठेठ प्रकाश सक्रियण सेटअप में एक इनक्यूबेटर में रखा गया नीला एलईडी लाइट स्रोत शामिल है । पेट्री व्यंजन जिसमें जेब्राफिश भ्रूण होते हैं, प्रकाश स्रोत के सापेक्ष तैनात होते हैं ताकि प्रकाश की प्राप्त शक्ति लगभग 1.5 mW/सेमी2 (बिंदीदार रेखा) हो। प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए प्रकाश सक्रियण के दौरान पेट्री डिश लिड हटा दिए जाते हैं। (ख)नीली बत्ती के साथ सक्रिय होने के बाद संकेतित समय बिंदुओं पर क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा जीएफपी एमआरएनए स्तरों का परिमाणीकरण। डेटा को अंधेरे में रखे भाई नियंत्रण भ्रूण के सापेक्ष जीएफपी फोल्ड इंडक्शन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। डॉट्स जैविक प्रतिकृति (शिकंजे) का प्रतिनिधित्व करते हैं। ठोस क्षैतिज सलाखों के मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों, मानक विचलन। * पी < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001। एक तरह से ANOVA निर्धारित पी मूल्यों । (सी-जम्मू) प्रतिनिधि छवियां नीली रोशनी(सी-एफ)के संपर्क में आने वाले भ्रूण की जीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता दिखाते हैं या अंधेरे(जी-जे) में रखे जातेहैं। फ्लोरोसेंट छवियों (हरे) को इसी ब्राइटफील्ड छवियों (ग्रेस्केल) के साथ विलय कर दिया गया है: स्केल बार, 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जीएफपी फोल्ड इंडक्शन
नीली रोशनी (465 एनएम)		 जीएफपी फोल्ड इंडक्शन
परिवेश प्रकाश
समय के बाद रोशनी औसत ऊपरी सीमा कम सीमा औसत ऊपरी सीमा कम सीमा पी मान
30 मिनट 5.363121044 8.15857193 3.525502696 0.661534683 1.097728244 0.398667102 0.005291
1 घंटे 23.44 46.35044081 11.85160592 2.638682529 4.368971424 1.593657823 0.011145
3 घंटे 48.09177693 71.99347359 32.12539822 8.280376038 24.86850106 2.757087255 0.059959
6 घंटे 131.4637117 163.4891638 105.7116392 16.66536842 27.94334716 9.939199585 0.003102

तालिका 1: नीले और परिवेश प्रकाश द्वारा TAEL/C120-प्रेरित अभिव्यक्ति की तुलना । नीले प्रकाश (465 एनएम) या परिवेश प्रकाश को समय की इंगित मात्रा के लिए सक्रिय करने के संपर्क में आने के बाद जीएफपी एमआरएनए स्तरों को गुना करें, अंधेरे में रखे भाई भ्रूण को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत करें। क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा एमआरएनए स्तरों की मात्रा निर्धारित की गई थी। डेटा को औसत गुना प्रेरण +/-ऊपरी और निचली सीमा के रूप में सूचित किया जाता है । पी मानों कई टी-परीक्षणों द्वारा निर्धारित किए गए थे। n = सभी समय अंक के लिए 3 शिकंजे।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल नीली रोशनी-अक्षम जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक TAEL/C120 प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है । इस प्रणाली में एक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर, TAEL होता है, जो नीली रोशनी के साथ रोशनी पर मंद होता है और C120 नियामक तत्व के डाउनस्ट्रीम ब्याज के जीन के प्रतिलेखन को सक्रिय करता है। एक GFP रिपोर्टर की प्रेरित अभिव्यक्ति के रूप में कम के रूप में प्रकाश जोखिम के 30 मिनट के बाद पता लगाया जा सकता है, सुझाव है कि इस दृष्टिकोण अपेक्षाकृत तेजी से और उत्तरदायी काइनेटिक्स के पास ।

कई कारक प्रेरण स्तर को प्रभावित कर सकते हैं। सबसे महत्वपूर्ण तरंगदैर्ध्य और सक्रिय प्रकाश की शक्ति हैं। इस प्रोटोकॉल में 1.5 डब्ल्यू/सेमी2 पर दी गई 465 एनएम एलईडी लाइटों का इस्तेमाल किया गया। छोटी और लंबी तरंगदैर्ध्य (बैंगनी और हरी बत्ती, क्रमशः) और कम प्रकाश शक्ति अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से सक्रिय नहीं करती है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। दूसरी ओर, अधिक हल्की शक्ति भ्रूण को फोटोडैमिंग का खतरा बढ़ा देती है। इस प्रकार, TAEL प्रणाली के सफल उपयोग के लिए, प्रकाश को सक्रिय करना (1) दृश्यमान प्रकाश स्पेक्ट्रम की नीली सीमा में होना चाहिए और (2) पर्याप्त शक्ति पर होना चाहिए ताकि कम फोटोडैमेज जोखिम के साथ TAEL की प्रभावी सक्रियण को संतुलित किया जा सके। प्रभावी प्रकाश शक्ति प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर भिन्न हो सकती है और इसलिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। सक्रियण से पहले, कुछ मात्रा में नीली रोशनी युक्त, परिवेश प्रकाश से भ्रूण की रक्षा के लिए भी देखभाल की जानी चाहिए। यह पाया गया है कि TAEL/C120-निर्भर अभिव्यक्ति व्यापक स्पेक्ट्रम परिवेश प्रकाश द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, हालांकि बहुत कम स्तर पर नीले प्रकाश की तुलना में केवल(तालिका 1)।

जबकि जीएफपी अभिव्यक्ति को पहले क्यूपीसीआर द्वारा 30 मिनट की रोशनी के बाद पता लगाया जा सकता है, अभिव्यक्ति का स्तर स्थिर नहीं है। फिर भी, वे प्रकाश उपचार के 3 घंटे पर एक चोटी तक पहुंचने तक वृद्धि जारी है, जिसके बाद इन उच्च अभिव्यक्ति के स्तर को 6 घंटे तक बनाए रखा जाता है। इन परिणामों से पता चलता है कि, तरंगदैर्ध्य और प्रकाश शक्ति के अलावा, TAEL/C120-प्रेरित अभिव्यक्ति का स्तर भी रोशनी अवधि पर निर्भर हैं, कम से कम जब तक प्रणाली एक अधिकतम या संतृप्ति राज्य तक पहुंचता है । इन क्यूपीसीआर परिणामों के विपरीत, हम 3 घंटे की रोशनी के बाद तक सराहनीय जीएफपी फ्लोरेसेंस का गुणात्मक रूप से पालन नहीं करते हैं, और फ्लोरेसेंस तीव्रता 6 घंटे तक रोशनी के लिए बढ़ती रहती है। क्यूपीसीआर और फ्लोरेसेंस तीव्रता टिप्पणियों के बीच विसंगति की संभावना जीएफपी संश्लेषण, तह, और परिपक्वता-कारकों के लिए आवश्यक अतिरिक्त समय द्वारा समझाया जाता है जो ब्याज के जीन के आधार पर भिन्न होने की संभावना है। इसलिए, आवेदन के आधार पर रोशनी अवधि के कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल ने विश्व स्तर पर जेब्राफिश भ्रूण को रोशन करने के लिए नीली रोशनी वाले एलईडी पैनल का उपयोग करके TAEL/C120 प्रणाली को सक्रिय करने के लिए सबसे सरल विधि प्रस्तुत की । इस दृष्टिकोण का उपयोग करने में आसानी और लागत प्रभावशीलता दोनों के फायदे हैं। हालांकि, जरूरत पड़ने पर लाइट एक्टिवेशन को भी नियंत्रित किया जा सकता है। यह पहले प्रदर्शित किया गया था कि TAEL-प्रेरित अभिव्यक्ति को उपयोगकर्ता-परिभाषित, स्थानिक रूप से पैटर्न वाली नीली रोशनी5देने के लिए कई तौर-तरीकों का उपयोग करके स्थानिक रूप से प्रतिबंधित किया जा सकता है। टीएईएल ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवोर6की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करके अतिरिक्त स्थानिक विशिष्टता प्राप्त की जा सकती है।

दवा या गर्मी सदमे-अक्षम्य अभिव्यक्ति प्रणालियों की तुलना में, ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति सिस्टम संभावित रूप से उत्प्रेरण एजेंट के रूप में प्रकाश का उपयोग करके बेहतर स्थानिक और लौकिक नियंत्रण अतिअव्यक्ति प्रदान करते हैं। TAEL/C120 के अलावा, अन्य प्रकाश सक्रिय प्रतिलेखन प्रणालियोंको 12, 13,14,15विकसित किया गया है। हालांकि, TAEL/C120 कई कारणों से जेब्राफिश (और संभावित रूप से अन्य बहुकोशिकीय प्रणालियों) में उपयोग के लिए विशेष रूप से अनुकूल हो सकता है। सबसे पहले, TAEL ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर एक होमोमर के रूप में कार्य करता है, जो आवश्यक घटकों की संख्या को सरल बनाता है। इसके अलावा, टीएईएल जैसे लव डोमेन युक्त प्रोटीन को हल्के अवशोषण16के लिए फ्लेविन क्रोमोफोर की आवश्यकता होती है। यह कोफैक्टर पशु कोशिकाओं के भीतर अंतर्जात रूप से मौजूद है, जो अन्य प्रणालियों के साथ एक बहिर्जात क्रोमोफोर जोड़ने की आवश्यकता को दूर करता है। अंत में, सक्रिय TAEL नीले प्रकाश8के अभाव में लगभग 30 एस के एक अपेक्षाकृत कम आधा जीवन है, पर अधिक सटीक सक्षम करने की भविष्यवाणी की है/ हालांकि, इस छोटे से आधे जीवन का यह भी मतलब है कि दीर्घकालिक या पुरानी अभिव्यक्ति भ्रूण है, जो हो सकता है या परिस्थितियों के आधार पर वांछनीय नहीं हो सकता है की दीर्घकालिक रोशनी की आवश्यकता होगी ।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि TAEL/C120 प्रणाली एक नीली रोशनी सक्रिय जीन अभिव्यक्ति प्रणाली है कि उपयोग करने के लिए आसान है, तेजी से और उत्तरदायी गतिज के पास है, और विशेष रूप से अच्छी तरह से वीवो अनुप्रयोगों में के लिए अनुकूल है ।

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Disclosures

हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई ।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल पर उपयोगी सुझावों और टिप्पणियों के लिए स्टीफन मैटरा और वू और मैटरनिटी लैब्स के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम इस प्रोटोकॉल को विकसित करते समय मूल्यवान चर्चा और अंतर्दृष्टि के लिए अन्ना रीडे, केविन गार्डनर और लौरा मोट्टा-मेना को धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था; R03 DK106358) और कैलिफोर्निया कैंसर अनुसंधान समन्वय समिति (CRN-20-636896) एसडब्ल्यू के लिए विश्वविद्यालय

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioRender web-based science illustration tool BioRender https://biorender.com/
Color CCD digital camera Lumenara 755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D
Excitation filter, 545 nm Olympus ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit GE Healthcare 95017-491
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
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Methylcellulose Sigma-Aldrich M7140
NEARPOW Programmable digital timer switch Amazon B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix Quantabio 101414-286
Photoshop image procesing software Adobe
Prism graphing and statistics software GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix Quantabio 10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28137
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light source Excelitas 010-00326R Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 174
ऑप्टोजेनेटिक TAEL/C120 सिस्टम का उपयोग कर जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश प्रेरित GFP अभिव्यक्ति
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LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced… More

LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. J. Vis. Exp. (174), e62818, doi:10.3791/62818 (2021).

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