Summary
Оптогенетика является мощным инструментом с широким спектром применения. Этот протокол демонстрирует, как достичь индуцируемой светом экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио с использованием системы TAEL/C120, реагирующей на синий свет.
Abstract
Индуцируемые системы экспрессии генов являются бесценным инструментом для изучения биологических процессов. Оптогенетические системы экспрессии могут обеспечить точный контроль над временем экспрессии генов, местоположением и амплитудой, используя свет в качестве индуцированного агента. В этом протоколе оптогенетическая система экспрессии используется для достижения светоиндуцируемой экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио. Эта система опирается на инженерный фактор транскрипции под названием TAEL, основанный на естественном светоактивированном факторе транскрипции от бактерии E. litoralis. При освещении синим светом TAEL димеризуется, связывается со своим родственным регуляторным элементом, называемым C120, и активирует транскрипцию. Этот протокол использует трансгенные эмбрионы рыбок данио, которые экспрессируют фактор транскрипции TAEL под контролем вездесущего промотора ubb. В то же время регуляторный элемент C120 управляет экспрессией флуоресцентного репортерного гена (GFP). Используя простую светодиодную панель для подачи активирующего синего света, индукция экспрессии GFP может быть сначала обнаружена после 30 минут освещения и достигает пика более чем 130-кратной индукции после 3 ч световой обработки. Индукция экспрессии может быть оценена с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и флуоресцентной микроскопии. Этот метод является универсальным и простым в использовании подходом к экспрессии оптогенетических генов.
Introduction
Индуцируемые системы экспрессии генов помогают контролировать количество, время и местоположение экспрессии генов. Однако достижение точного пространственного и временного контроля в многоклеточных организмах было сложной задачей. Временное управление чаще всего достигается путем добавления маломолекулярных соединений1 или активации промоутеров теплового шока2. Тем не менее, оба подхода уязвимы для вопросов времени, силы индукции и нецелевых стрессовых реакций. Пространственный контроль в основном достигается за счет использования тканеспецифических промоторов3,но такой подход требует подходящего промотора или регуляторного элемента, которые не всегда доступны, и это не способствует индукции субтафезневого уровня.
В отличие от таких традиционных подходов, активированные светом оптогенетические транскрипционные активаторы обладают потенциалом для более тонкого пространственного и временного контроля экспрессии генов4. Система TAEL/C120, реагирующая на синий свет, была разработана и оптимизирована для использования в эмбрионах рыбокданио5,6. Эта система основана на эндогенном светоактивированном транскрипционном факторе от бактерии E. litoralis7,8. Система TAEL/C120 состоит из транскрипционного активатора под названием TAEL, который содержит домен трансактивации Kal-TA4, чувствительный к синему свету домен LOV (измерение напряжения света-кислорода) и домен связывающей ДНК спирали-поворота-спирали (HTH)5. При освещении домены LOV претерпевают конформационное изменение, которое позволяет двум молекулам TAEL димеризоваться, связываться с TAEL-чувствительным промотором C120 и инициировать транскрипцию нижестоящего гена, представляющий интерес5,8. Система TAEL/C120 демонстрирует быструю и надежную индукцию с минимальной токсичностью и может быть активирована несколькими различными способами подачи света. Недавно были усовершенствования в системе TAEL/C120 путем добавления сигнала ядерной локализации в TAEL (TAEL-N) и соединения регулирующего элемента C120 с базальным промоутером cFos (C120F)(рисунок 1A). Эти модификации улучшили уровни индукции более чем в 15 разв 6раз.
В этом протоколе простая светодиодная панель используется для активации системы TAEL/C120 и индуцирования повсеместной экспрессии репортерного гена GFP. Индукцию экспрессии можно качественно контролировать, наблюдая интенсивность флуоресценции, или количественно путем измерения уровней транскриптов с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Этот протокол продемонстрирует систему TAEL/C120 как универсальный, простой в использовании инструмент, который обеспечивает надежную регуляцию экспрессии генов in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Калифорнийского университета в Мерседе.
1. Скрещивание рыбок данио и сбор эмбрионов
- Поддерживайте отдельные трансгенные линии рыбок данио, содержащие либо транскрипционный активатор TAEL, либо контролируемый C120 репортерный ген, чтобы свести к минимуму ложную активацию.
- Скрещивать 6-8 взрослых рыбок данио с каждой линии, используя стандартные методы9, для получения двойных трансгенных эмбрионов, которые содержат как компоненты TAEL, так и C120(рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, оба компонента могут быть экспрессированы временно посредством микроинъекции мРНК или плазмидной ДНК с использованием стандартных методов10. - Соберите эмбрионы в чашки Петри, содержащие яичную воду (60 мкг / мл морской соли Instant Ocean, растворенной в дистиллированной воде), с примерно 30 эмбрионами на каждое условие, которое будет протестировано.
- Поместите посуду в светонепроницаемый ящик или накройте алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму непреднамеренную активацию окружающим светом (см. Таблицу 1).
2. Глобальная индукция света
- Используйте светодиодную панель синего света (465 нм) для доставки активирующего синего света к нескольким эмбрионам одновременно.
- Расположите светодиодную панель относительно чашек Петри, содержащих эмбрионы, таким образом, чтобы фактическая мощность света, получаемого эмбрионами, составляла приблизительно 1,5 мВт/см2, измеренная измерителем мощности и энергии света(рисунок 2А).
- Пульсируйте свет с интервалом 1 ч в/1 ч выключения с помощью реле таймера при освещении более 3 ч, чтобы снизить риск фотоповреждения к транскрипционному активатору TAEL5,8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точную продолжительность освещения, возможно, потребуется оптимизировать для конкретных применений. В этом протоколе приведены примеры продолжительности освещения 30 мин, 1 ч, 3 ч и 6 ч. - Снимите крышки чашки Петри, чтобы свести к минимуму рассеяние света от конденсации.
- Поместите чашки Петри, содержащие контрольные эмбрионы, в светонепроницаемую коробку или накройте алюминиевой фольгой для темных элементов управления.
3. Количественная оценка индукции методом qRT-PCR
- Удалите эмбрионы из освещения после желаемой продолжительности активации.
- Извлеките общую РНК из 30-50 светоактивированных и 30-50 темных эмбрионов с помощью комплекта изоляции РНК в соответствии с инструкциями набора.
- Перенесите эмбрионы в микроцентрифужную трубку 1,5 мл и удалите лишнюю яичную воду. Добавьте буфер лизиса и гомогенизируйте эмбрионы пластиковым пестиком.
- Перенесите лисат в графу, предусмотренную комплектом, и продолжите работу с инструкциями по набору. Немедленно перейдите к шагу 3.3 или сохраните очищенную РНК при -20 °C до -80 °C.
- Используйте 1 мкг общей РНК для синтеза кДНК с использованием набора для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями набора.
- Возьмите тонкостенный ПЦР-трубку 0,2 мл, добавьте 1 мкг РНК к 4 мкл 5-кратной реакционной мастер-смеси кДНК (содержащей оптимизированный буфер, олиго-dT и случайные праймеры и дзНТП), 1 мкл 20-кратного раствора обратной транскриптазы и воду без нуклеазы до общего объема 20 мкл.
- Поместите трубку в термоциклер, запрограммированную следующим образом: 22 °C в течение 10 мин, 42 °C в течение 30 мин, 85 °C в течение 5 мин, а затем держите при 4 °C. Немедленно перейдите к шагу 3.4 или сохраните кДНК при -20 °C.
- Готовят реакции qPCR, содержащие смесь зеленых ферментов SYBR, 5-кратную разбавленую кДНК (этап 3.3) и 325 нМ каждого праймера для GFP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Букварь используется в этом протоколе следующим образом. GFP вперед: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP реверс: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a вперед 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a реверс: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - Проводите qPCR-реакции в аппарате ПЦР в режиме реального времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа ПЦР: начальная активация при 95 °C в течение 10 мин, затем 40 циклов по 30 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 1 мин при 72 °C. - Выполните анализ кривой расплава после завершения ПЦР для определения специфичности реакции. Выполните три технические реплики для каждого образца.
- Рассчитайте индукцию, активируемую светом, как изменение складки относительно эмбрионов, удержированных в темноте, используя метод2 -ΔΔCt 11. Статистическая значимость может быть определена с помощью пакета статистического программного обеспечения.
4. Качественная оценка индукции флуоресцентной микроскопией
- Удалите эмбрионы из иллюминации после желаемой продолжительности активации.
- Иммобилизуйте эмбрионы для визуализации в 3% метилцеллюлозе, содержащей 0,01% трикаина в стеклянных депрессивных слайдах.
- Получайте флуоресцентные и яркие изображения на флуоресцентном стереомикроскопе, подключенном к цифровой камере, с помощью стандартных настроек фильтра GFP. Используйте одинаковые настройки получения изображений для всех образцов.
- Объединяйте изображения яркого поля и флуоресценции после получения с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для этой демонстрации реагирующая на C120 репортерная линия GFP(Tg(C120F:GFP)ucm107)была скрещена трансгенной линией, которая повсеместно экспрессирует TAEL-N из промотора ubiquitin b (ubb)(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113))для получения двойных трансгенных эмбрионов, содержащих оба элемента. Через 24 ч после оплодотворения эмбрионы подвергались воздействию активации синего света, пульсирующего с частотой 1 ч вкл/1 ч выключения. Индукцию экспрессии GFP количественно оценивали с помощью qRT-PCR через 30 мин, 1 ч, 3 ч и 6 ч после активации(рисунок 2B и таблица 1). По сравнению с контрольными эмбрионами братьев и сестер, хранящихся в темноте, индукция экспрессии GFP была обнаружена уже через 30 минут после воздействия синего света. Затем уровни экспрессии GFP продолжали неуклонно увеличиваться до 6 ч после активации.
Индукция GFP также была качественно оценена путем изучения интенсивности флуоресценции в то же время в точках постактивации(рисунок 2C-F). Флуоресценция GFP выше фоновых уровней впервые наблюдалась через 3 ч после активации и стала заметно ярче через 6 ч после активации. Напротив, контрольные эмбрионы для всех временных точек, которые содержались в темноте, не проявляли какой-либо заметной флуоресценции GFP(рисунок 2G-J).
Рисунок 1:Схема функции TAEL/C120 и экспериментальный дизайн. (A) Система TAEL/C120 состоит из транскрипционного активатора под названием TAEL, сплавленного с сигналом ядерной локализации (TAEL-N), и TAEL-реагирующего регуляторного элемента под названием C120, связанного с базальным промотором cFos (C120F), стимулирующим экспрессию интересующего гена. TAEL-зависимая транскрипция активна в присутствии синего света, но не в темноте. NLS, сигнал ядерной локализации. (B) В этом протоколе трансгенная линия экспрессирует TAEL-N повсеместно (Tg(ubb: TAEL-N)) пересекается с репортерной линией GFP, управляемой C120 (Tg (C120F: GFP)для получения двойных трансгенных эмбрионов. Начиная с 24 л.с.ф., эмбрионы подвергаются воздействию активирующего синего света в течение различной продолжительности до 6 ч-иллюстраций, созданных с помощью веб-инструмента научной иллюстрации (см. Таблицу материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Репрезентативные результаты экспрессии генов, активированных светом, с TAEL/C120. (A)Типичная установка активации света включает в себя источник синего светодиодного света, размещенный в инкубаторе. Чашки Петри, содержащие эмбрионы рыбок данио, расположены относительно источника света так, что получаемая мощность света составляет примерно 1,5 мВт/см2 (пунктирная линия). Крышки чашки Петри снимаются во время активации света, чтобы свести к минимуму рассеяние света. (B)Количественная оценка уровней мРНК GFP с помощью qRT-PCR в указанные моменты времени после активации синим светом. Данные представлены в виде индукции складки GFP относительно контрольных эмбрионов братьев и сестер, хранящихся в темноте. Точки представляют собой биологические реплики (кладки). Сплошные горизонтальные полосы представляют среднее значение. Полосы погрешности, стандартное отклонение. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Односторонний ANOVA определил значения p. (C-J) Репрезентативные изображения, показывающие интенсивность флуоресценции GFP эмбрионов, подвергшихся воздействию синего света(C-F)или хранящихся в темноте(G-J). Флуоресцентные изображения (зеленый) были объединены с соответствующими изображениями яркого поля (оттенки серого): шкала, 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| GFP Fold Индукция Синий свет (465 нм) |
GFP Fold Индукция Окружающее освещение |
||||||
| Время после освещения | Значить | Верхний предел | Нижний предел | Значить | Верхний предел | Нижний предел | Значение p |
| 30 мин | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1 ч | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 ч | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 ч | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
Таблица 1: Сравнение экспрессии, вызванной TAEL/C120, синим и окружающим светом. Сворачивая индукцию уровней мРНК GFP после воздействия активирующего синего света (465 нм) или окружающего света в течение указанного количества времени, нормализуется для контроля эмбрионов братьев и сестер, удерживающихся в темноте. Уровни мРНК количественно оценивались с помощью qRT-PCR. Данные сообщаются как средний индукционный сгиб +/- верхний и нижний пределы. Значения p определялись несколькими t-тестами. n = 3 сцепления для всех временных точек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает использование оптогенетической системы TAEL/C120 для достижения экспрессии генов, индуцируемой синим светом. Эта система состоит из транскрипционного активатора TAEL, который димеризуется при освещении синим светом и активирует транскрипцию интересующего гена после регуляторного элемента C120. Индуцированная экспрессия репортера GFP может быть обнаружена всего через 30 минут светового воздействия, что говорит о том, что этот подход обладает относительно быстрой и отзывчивой кинетикой.
Несколько факторов могут влиять на уровни индукции. Наиболее важными являются длина волны и мощность активации света. В этом протоколе использовались 465 нм светодиодные фонари, поставляемые со скоростью1,5 Вт/см2. Более короткие и длинные волны (фиолетовый и зеленый свет соответственно) и более низкая мощность света не активируют экспрессию эффективно (данные не показаны). С другой стороны, большая мощность света увеличивает риск фотовредения эмбрионов. Таким образом, для успешного использования системы TAEL активирующий свет должен быть (1) в синем диапазоне спектра видимого света и (2) при достаточной мощности, чтобы сбалансировать эффективную активацию TAEL с уменьшенным риском фотопоражеспособности. Эффективная мощность света может варьироваться в зависимости от экспериментальных условий и поэтому может потребоваться эмпирически определить. Следует также позаботиться о защите эмбрионов от окружающего света, содержащего некоторое количество синего света, перед активацией. Было обнаружено, что TAEL/C120-зависимая экспрессия может быть индуцирована окружающим светом широкого спектра, хотя и на гораздо более низких уровнях по сравнению только с синим светом(таблица 1).
Хотя экспрессия GFP может быть сначала обнаружена qPCR после 30 минут освещения, уровни экспрессии не являются устойчивыми. Тем не менее, они продолжают расти до достижения пика через 3 ч светового лечения, после чего эти высокие уровни экспрессии сохраняются до 6 ч. Эти результаты свидетельствуют о том, что в дополнение к длине волны и мощности света уровни экспрессии, индуцированные TAEL/C120, также зависят от продолжительности освещения, по крайней мере, до тех пор, пока система не достигнет максимального или насыщенного состояния. В отличие от этих результатов qPCR, мы не наблюдаем качественно заметной флуоресценции GFP до 3 ч освещения, а интенсивность флуоресценции продолжает увеличиваться до 6 ч освещения. Расхождение между наблюдениями qPCR и интенсивности флуоресценции, вероятно, объясняется дополнительным временем, необходимым для синтеза, сворачивания и созревания GFP-факторов, которые, вероятно, будут варьироваться в зависимости от интересующего гена. Поэтому может потребоваться некоторая оптимизация продолжительности освещения в зависимости от применения.
Этот протокол представлял собой самый простой метод активации системы TAEL/C120 с использованием светодиодной панели синего света для освещения эмбрионов рыбок данио во всем мире. Такой подход имеет преимущества как простоты использования, так и экономической эффективности. Тем не менее, активация света также может контролироваться пространственно, если это необходимо. Ранее было продемонстрировано, что taEL-индуцированная экспрессия может быть пространственно ограничена с использованием нескольких модальностей для доставки определяемого пользователем пространственно узорчатого синего света5. Дополнительная пространственная специфичность может быть достигнута с использованием тканеспецифических промоторов для регулирования экспрессии транскрипционного активатора TAEL6.
По сравнению с системами экспрессии, индуцируемыми лекарственным или тепловым шоком, оптогенетические системы экспрессии потенциально предлагают лучший пространственный и временной контроль сверхэкспрессии, используя свет в качестве индуцированного агента. В дополнение к TAEL/C120 были разработаны и другие светоактивированные транскрипционные системы12,13,14,15. Тем не менее, TAEL/C120 может быть особенно хорошо приспособлен для использования у рыбок данио (и, возможно, других многоклеточных систем) по нескольким причинам. Во-первых, транскрипционный активатор TAEL функционирует как гомодимер, что упрощает количество необходимых компонентов. Кроме того, LOV-домен-содержащие белки, такие как TAEL, требуют флавинового хромофора для поглощения света16. Этот кофактор эндогенно присутствует в клетках животных, устраняя необходимость добавления экзогенного хромофора, как и в других системах. Наконец, активированный TAEL, по прогнозам, будет иметь относительно короткий период полураспада около 30 с в отсутствие синего света8,что позволяет более точно управлять включением / выключением. Однако этот короткий период полураспада также означает, что долгосрочная или хроническая экспрессия потребует долгосрочного освещения эмбрионов, что может быть или не быть желательным в зависимости от обстоятельств.
Таким образом, этот протокол демонстрирует, что система TAEL/C120 представляет собой систему экспрессии генов, активируемую синим светом, которая проста в использовании, обладает быстрой и отзывчивой кинетикой и особенно хорошо подходит для приложений in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никаких конфликтов интересов объявлено не было.
Acknowledgments
Мы благодарим Стефана Матерну и членов лабораторий Woo и Materna за полезные предложения и комментарии по этому протоколу. Мы благодарим Анну Рид, Кевина Гарднера и Лору Мотта-Мена за ценную дискуссию и понимание при разработке этого протокола. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH; R03 DK106358) и Координационный комитет по исследованию рака Калифорнийского университета (CRN-20-636896) в S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
