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Bioengineering

Konstruktion von Modelllipidmembranen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll nutzt die Agaroseschwellung als eine leistungsfähige und generalisierbare Technik zum Einbau von integralen Membranproteinen (IMPs) in riesige unilamellare Lipidvesikel (GUVs), wie hier für die Rekonstitution des menschlichen 1A-Serotoninrezeptorproteins (5-HT1AR), einer der Klassen pharmakologisch wichtiger G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, beschrieben.

Abstract

Robuste In-vitro-Untersuchungen der Struktur und Funktion integraler Membranproteine waren aufgrund der Komplexität der Plasmamembran und der zahlreichen Faktoren, die das Proteinverhalten in lebenden Zellen beeinflussen, eine Herausforderung. Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) sind ein biomimetisches und hochgradig abstimmbares in vitro Modellsystem zur Untersuchung von Protein-Membran-Interaktionen und zur genauen, reizabhängigen Untersuchung des Proteinverhaltens. In diesem Protokoll stellen wir eine kostengünstige und effektive Methode zur Herstellung von GUVs mit dem menschlichen Serotonin-1A-Rezeptor (5-HT1AR) vor, der stabil in die Membran integriert ist. Wir stellen GUVs mit einer modifizierten Hydrogel-Quellmethode her; Durch Abscheiden eines Lipidfilms auf einer Mischung aus Agarose und 5-HT1AR und anschließender Hydratisierung des gesamten Systems können Vesikel mit richtig ausgerichtetem und funktionellem 5-HT1AR gebildet werden, das in die Membran eingebaut ist. Diese GUVs können dann verwendet werden, um Protein-Membran-Interaktionen und das Lokalisierungsverhalten mittels Mikroskopie zu untersuchen. Letztendlich kann dieses Protokoll unser Verständnis der Funktionalität integraler Membranproteine verbessern und fundierte physiologische Erkenntnisse liefern.

Introduction

Synthetische Modellmembranen sind leistungsfähige Werkzeuge bei der Untersuchung der grundlegenden Eigenschaften und Funktionen von Biomembranen. Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) sind eine der bekanntesten Plattformen zur Untersuchung einer Vielzahl von Plasmamembraneigenschaften und können so konstruiert werden, dass sie verschiedene physiologische Bedingungen nachahmen1,2,3,4,5,6,7,8. Es ist allgemein bekannt, dass die Plasmamembran und ihre Organisation eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen spielen, wie Signaltransduktion, Adhäsion, Endozytose und Transport9,10,11,12,13,14,15.

GUVs wurden mit verschiedenen Methoden hergestellt, darunter sanfte Hydratation16, Hydrogelquellung17, Elektroformation18, mikrofluidische Techniken19,20,21,22, Jetting23 und Lösungsmittelaustausch24,25,26. Aufgrund der Herausforderungen beim Umgang mit integralen Membranproteinen (IMPs) waren die In-vitro-Plattformen, um sie zu untersuchen, begrenzt. GUVs bieten eine vereinfachte Plattform für die Untersuchung von IMPs in einer Umgebung, die ihre native Umgebung nachahmt. Obwohl es mehrere Ansätze für die Proteinrekonstitution in GUVs gibt, ergeben sich Herausforderungen aus der Integration von Proteinen mit der richtigen Ausrichtung und der Aufrechterhaltung der Proteinfunktionalität27.

Die erfolgreichste Proteinrekonstitution in GUVs erfordert die Waschmittelaustauschmethode; Dabei werden die Proteine aus ihrer nativen Umgebung durch Detergenzien gelöst, gefolgt von einer Proteinreinigung, und dann die Waschmittelmoleküle durch Lipide durch verschiedene Methoden ersetzt28. Während Detergenzien dazu dienen, die tertiäre Struktur von IMP während der Reinigung zu stabilisieren, sind Waschmittelmizellen eine relativ unnatürliche Umgebung für diese Proteine, die insbesondere für funktionelle Studien in Lipiddoppelschichten besser stabilisiert werden28,29,30. Darüber hinaus war die Integration funktioneller Transmembranproteine in die Lipiddoppelschicht mit herkömmlichen GUV-Herstellungstechniken aufgrund der Größe, der Zartheit dieser Proteine und der zusätzlichen Waschmittelaustauschschritte, die erforderlich wären, schwierig27,31,32,33. Die Verwendung von organischen Lösungsmitteln zur Entfernung von Detergenzien verursacht Proteinaggregation und Denaturierung34. Eine verbesserte waschmittelvermittelte Methode war vielversprechend, jedoch ist Vorsicht beim Reinigungsschritt geboten, und für bestimmte Proteine könnte eine Optimierung erforderlich sein31,35. Darüber hinaus könnten Methoden, die Elektroformation verwenden, die Wahl des Proteins einschränken und sind möglicherweise nicht für alle Lipidzusammensetzungen, insbesondere geladene Lipide, geeignet31,36,37. Eine andere Technik, die verwendet wurde, ist die peptidinduzierte Fusion von großen unilamellaren Vesikeln (LUVs), die das gewünschte Protein mit GUVs enthalten, obwohl es sich als mühsam erwiesen hat und zur Insertion von Fremdmolekülen führen kann - den fusogenen Peptiden33,38,39. Riesige Plasmamembranvesikel (GPMVs), die aus lebenden Zellen gewonnen werden, können verwendet werden, um einige dieser Probleme zu überwinden, aber sie ermöglichen eine minimale Kontrolle der resultierenden Lipid- und Proteinzusammensetzung14,40,41. Daher stellt die Integration von IMP in die Bilipidschicht von GUVs unter Verwendung unserer modifizierten Agarose-Quellmethode eine zuverlässige Methode dar, um diese Proteine in der Membranumgebung weiter zu untersuchen42,43,44,45.

Zelluläre Signalisierung und Kommunikation umfasst eine Familie von Proteinen, die als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bekannt sind. GPCRs gehören zur größten Familie von Proteinen und sind mit der Modulation von Stimmung, Appetit, Blutdruck, Herz-Kreislauf-Funktion, Atmung und Schlaf unter vielen anderen physiologischen Funktionen verbunden46. In dieser Studie verwendeten wir den menschlichen Serotonin-1A-Rezeptor (5-HT1AR), der ein prototypisches Mitglied der GPCR-Familie ist. 5-HT1AR kann im zentralen Nervensystem (ZNS) und blutgefäßen gefunden werden; es beeinflusst zahlreiche Funktionen wie kardiovaskuläre, gastrointestinale, endokrine Funktionen sowie die Beteiligung an der Regulation der Stimmung47. Eine große Barriere für die GPCR-Forschung ergibt sich aus ihrer komplexen amphiphilen Struktur, und GUVs stellen eine vielversprechende Plattform für die Untersuchung verschiedener interessanter Eigenschaften dar, die von Proteinfunktionalität, Lipid-Protein-Interaktionen und Protein-Protein-Interaktionen reichen. Verschiedene Ansätze wurden verwendet, um Lipid-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)48,49, Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)50,51, Proteinlipid-Overlay (PLO)-Assay51,52,53,54, native Massenspektrometrie55, isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)56,57 und Liposom Sedimentationstest58,59. Unser Labor hat den vereinfachten GUV-Ansatz verwendet, um die Wirkung von Lipid-Protein-Interaktionen auf die Proteinfunktionalität zu untersuchen, indem BODIPY-GTPγS eingeschlossen wurde, das im aktiven Zustand des Rezeptors an die Giα-Untereinheit bindet. Ihre Bindung löst das Fluorophor und erzeugt ein Fluoreszenzsignal, das im Laufe der Zeit nachgewiesen werden könnte45. Darüber hinaus untersuchten verschiedene Studien Lipid-Protein-Interaktionen und die Rolle von Proteinen bei der Erfassung oder Stabilisierung der Membrankrümmung60,61, und die Verwendung eines praktikablen GUV-Ansatzes könnte ein entscheidender Vorteil sein.

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Integration von GPCRs in die Membran von GUVs unter Verwendung eines modifizierten Agarose-Hydrogel-Systems17,42. Darüber hinaus könnte unsere Methode auf der Grundlage unserer bisherigen Arbeiten für IMP geeignet sein, die ein kurzfristiges Engagement bei 30-40 °C aushalten können. Kurz gesagt, wir verteilen einen dünnen Film aus Agarose in Kombination mit Membranfragmenten, die die GPCR von Interesse enthalten. Nach dem Gelieren dieser Schicht legen wir eine Lipidlösung auf der Agarose ab und lassen das Lösungsmittel verdampfen. Die Rehydratation des Systems wurde dann mit einem wässrigen Puffer durchgeführt, was zur Bildung von GUVs mit Protein führte, das in die Lipiddoppelschicht eingebaut war.

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Protocol

1. Proteinkennzeichnung

  1. Lassen Sie NHS-Rhodamin, 5-HT1A-Membranfragmente und eine 7 K MWCO-Spinentsalzungssäule bei Raumtemperatur ausgleichen.
  2. 1 mg NHS-Rhodamin in 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen.
  3. Fügen Sie 5 μL 1 M Natriumbicarbonatlösung hinzu, um den pH-Wert der 5-HT1AR-Lösung auf einen pH-Wert von 8 zu erhöhen.
  4. 3,66 μL der NHS-Rhodaminlösung zu 50 μL der 5-HT1AR-Lösung geben und in einem Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig auf und ab pipettieren.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens 10x molaren Überschuss an NHS-Rhodamin haben.
  5. Halten Sie die Mischung vor Licht geschützt und setzen Sie den Rotator bei Raumtemperatur für 1 h auf.
  6. Waschen Sie eine 7 k MWCO Spinsäule mit 200 μL 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (1x PBS) dreimal für 1,5 min bei 1,5 RCF für jede Wäsche.
  7. Fügen Sie das markierte Protein zu einer Säule hinzu und gleichen Sie die Menge in einem anderen Mikrozentrifugenröhrchen aus.
  8. Drehen Sie das markierte Protein einmal für 5 minuten bei 1,5 RCF herunter.
  9. Nehmen Sie ein UV-Vis-Spektrum mit einem Nanodrop-Spektralphotometer bei 280 nm und 554 nm und berechnen Sie die Kennzeichnungseffizienz gemäß dem Handbuch des Herstellers.
  10. Lagern Sie das markierte Protein bedeckt bei 5 °C bis zur weiteren Verwendung. Die Lösung ist nach dem Etikettieren etwa eine Woche lang stabil.

2. GUVs mit membranintegriertem 5-HT 1A

  1. Aufbereitung von Materialien und Reagenzien
    1. Lassen Sie das Protein, die Lipide und BSA (Bovine Serum Albumin) auf Raumtemperatur ausgleichen.
    2. Während dieser Zeit reinigen Sie die Deckgläser, indem Sie sie in Methanol legen und 30 min bei 40 °C beschallen. Stellen Sie sicher, dass das Methanol die Deckgläser vollständig bedeckt und der Wasserstand im Wasserbad über dem Niveau des Methanols im Behälter liegt.
      HINWEIS: Methanol ist giftig und sollte in einer geeigneten chemischen Haube gehandhabt werden.
    3. Trocknen Sie das überschüssige Methanol auf den Deckgläsern mit einem sanften Luftstrom ab. Stellen Sie das Deckglas für 15 min in einen 40 °C warmen Ofen, um sicherzustellen, dass die überschüssigen Deckgläser abtrocknen.
    4. Beginnen Sie mit der Plasmareinigung. Legen Sie zuerst die Deckgläser in den Plasmareiniger und schließen Sie das Lufteinlassventil ab, um die gesamte Luft in der Kammer zu evakuieren.
    5. Sobald die Kammer unter Vakuum steht, reinigen Sie die Deckgläser für 5 Minuten mit hoher HF-Leistungseinstellung und einem nahezu vollständigen Vakuum, mit nur einem leichten Lufteinlass in die Vakuumkammer. Um das richtige Plasmaniveau zu gewährleisten, stellen Sie die Öffnung der Vakuumkammer so ein, dass die resultierende Farbe des Plasmas ein gleichmäßiges, helles Rosa ist.
      HINWEIS: Bei der Verwendung von Luft ist es wichtig, dass das Plasma für die Dauer des Plasmabehandlungsschritts eine leuchtend rosa Farbe behält, da eine dunklere violette Farbe anzeigt, dass sich eine falsche Luftmenge in der Kammer befindet und zu einer suboptimalen Plasmabehandlung führt.
    6. Sobald die 5 Minuten vergangen sind, schalten Sie die HF-Leistung aus und lassen Sie das Vakuum los.
      HINWEIS: Bitte stellen Sie beim Entfernen aus der Plasmakammer sicher, dass die Deckgläser bedeckt bleiben.
  2. Hydrogel-Vorbereitung
    1. Kombinieren Sie 6 mg Agarose mit extrem niedriger Schmelztemperatur mit 300 μL Reinstwasser (dh 2% (w / v) Agarose).
      HINWEIS: 2% Agarose wird verwendet, um proteinfreie GUVs herzustellen. Agaroselösung kann zwei Tage lang bei 45 °C aufbewahrt werden.
    2. 9 mg Ultratieftemperatur-Agarose mit 300 μL Reinstwasser für 3 W/V%-Agarose wie in Schritt 3.1 hergestellt zu kombinieren. 3% Agarose wird verwendet, um proteinintegrierte GUVs herzustellen.
    3. Wirbeln Sie die Lösung kurz vor, bevor Sie sie für 10 min auf den 90 °C heißen Wärmeblock legen. Dann wirbeln Sie das Röhrchen erneut, bevor Sie es in einen 45 ° C heißen Wärmeblock überführen, um es bis zur weiteren Verwendung in der geschmolzenen Form zu halten.
  3. Agarose und Proteinmischung
    1. Mischen Sie 21 μL 3% Agarose mit den 7 μL 5-HT1AR-Membranfragmenten. Viele Male langsam auf und ab pipettieren, um eine ausreichende Mischung zu gewährleisten. Dann bei 45 °C für 1 min inkubieren.
  4. Hydrogel- und Lipidablagerung
    1. Für proteinfreie GUVs: Machen Sie einen dünnen Film auf frisch plasmagereinigten Deckgläsern mit 20 μL 2% Agarose. Lassen Sie schnell einen weiteren Deckglas auf den Agarosetropfen fallen und schieben Sie die Deckgläser vorsichtig auseinander, um einen dünnen Film auf beiden Deckgläsern zu bilden.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist insofern schwierig, als das Gleiten des Tröpfchens erfolgen muss, während die Agarose noch in der geschmolzenen Form vorliegt.
    2. Für proteinintegrierte GUVs: Pipettieren Sie die Protein/Agarose-Mischung noch einmal nach oben und unten und geben Sie dann 20 μL der 2% igen Agarose auf einem plasmagereinigten Deckglas ab. Folgen Sie den Slip-Casting-Anweisungen wie oben beschrieben.
    3. Lassen Sie die Agarose 30 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt gelieren.
    4. Lagern Sie die Lipide tropfenweise auf der Agaroseschicht ab. Insgesamt sind 10 μL 2 mg/ml 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC) mit 0,4 Mol%1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DPPE) zu verwenden, das mit ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (oder Lipidmischung von Interesse) in Chloroform auf dem Agarosefilm markiert ist. Lagern Sie die Tröpfchen mit einer Gaschromatographienadel ab und verteilen Sie einen Tropfen nach dem anderen über einen sanften Luftstrom.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt ist Vorsicht geboten, um eine relativ gleichmäßige Lipidschicht auf dem Hydrogel herzustellen. Außerdem ist Chloroform giftig und sollte in einer geeigneten chemischen Haube gehandhabt werden.
    5. Montieren Sie die Sykes-Moore (S-M) Kammern, indem Sie einen O-Ring auf den Deckslip legen und dann die obere Komponente der Kammer auf den O-Ring legen. Verwenden Sie den vom Hersteller bereitgestellten Schlüssel, um die Kammer zusammenzubauen, indem Sie die Kammerkomponenten zusammenschrauben, um die Kammer abzudichten und Leckagen zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Oberseite der Kammer sollte am O-Ring festgezogen werden, aber Vorsicht ist geboten, um sicherzustellen, dass der Deckglas intakt bleibt, da der Deckglas reißen kann, wenn der O-Ring nicht richtig in der Kammer sitzt. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Kammer dicht genug verschlossen ist, so dass die Kammer nicht ausläuft, wenn die Quelllösung hinzugefügt wird. Wenn die Kammer nicht ausreichend angezogen wird, führt dies zu Leckagen und Probenverlust.
  5. Schwellung und Ernte von Vesikeln
    1. Hydratisieren Sie das gesamte System, indem Sie 450 μL 200 mM Saccharose in 1x PBS sanft pipettieren und sanft auf die Kammern klopfen, um eine ausreichende Pufferabdeckung der Hydrogel-Lipid-Schichten zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die Saccharoselösung kann durch einen Rehydratationspuffer ersetzt werden, der biologische Sonden von Interesse enthält.
    2. Stellen Sie die Kammern bei 45 °C auf und bedecken Sie den oberen Teil der Kammer mit einem Deckglas, um eine Verdunstung zu verhindern. Lassen Sie die Probe 1 h lang vor Schmutz und Licht geschützt aufquellen.
    3. Geben Sie 100 μL 1 mg/ml BSA in Reinstwasser in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, die verwendet werden soll. Bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
    4. Dreimal mit Reinstwasser und einmal mit 200 mM Saccharose in 1x PBS waschen.
    5. Schließlich 200 mM Glucose in 1x PBS bis zur Zugabe der GUV-Probenlösung zugegeben.
      HINWEIS: BSA wurde verwendet, um die GUV-Adsorption zu blockieren.
    6. Nachdem Sie das Hydrogel anschwellen lassen, schütteln und klopfen Sie vorsichtig auf die Kammer, um alle GUVs zu entfernen, die an der Hydrogeloberfläche haften bleiben können. Dann die GUV-Saccharoselösung vorsichtig pipettieren.
      HINWEIS: Als optionalen Schritt, um sicherzustellen, dass sich alle Vesikel von der Oberfläche lösen, pipettieren Sie vorsichtig einen Teil der Saccharosesuspension zurück auf die Hydrogeloberfläche.
    7. Die Suspension wird in ein zuvor hergestelltes Mikrozentrifugenröhrchen mit 700 μL 200 mM Glucose in 1x PBS bewegt.
      HINWEIS: Der Dichtegradient führt dazu, dass sich die Vesikel am Boden des Zentrifugenrohrs absetzen.
    8. Lassen Sie die Vesikel sich für eine weitere Stunde absetzen, um sicherzustellen, dass die Vesikel auf den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens sinken können, um eine optimale Entnahme zu ermöglichen.
    9. Nach dem Absetzen von GUVs in Glukose werden 300 μL vom Boden des Zentrifugenröhrchens (die abgesetzten Vesikel) in die zuvor hergestellte und BSA-behandelte 96-Well-Platte übertragen, um die Vesikel unter dem konfokalen Mikroskop zu untersuchen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu vermeiden, um die Menge an Ablagerungen zu minimieren, die in der endgültigen Probe gesammelt werden.
  6. Überprüfen Sie die Proben unter dem Mikroskop.
    1. Leuchten Sie einen 488-nm-Laser auf die Probe (der es uns ermöglicht, die Membran sichtbar zu machen, da die Doppelschicht mit ATTO-488-DPPE markiert wurde).
    2. Leuchten Sie einen 561-nm-Laser auf die Probe (der es uns ermöglicht, das Protein zu visualisieren, da es mit NHS-Rhodamin markiert wurde).
      HINWEIS: Bei der Abbildung der Probe ist Vorsicht geboten, da die Photooxidation die Vesikel destabilisieren kann. Vesikel wurden am selben Tag beobachtet.

Figure 1
Abbildung 1: Darstellung der detaillierten Protokollschritte. Erstellt mit BioRender.com Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Representative Results

Die Proteinkonzentration wurde gemessen und der Grad der Markierung wurde als molares Verhältnis zwischen dem Farbstoff und dem Protein auf 1:1 berechnet. Durch die Untersuchung der GUVs mittels konfokaler Mikroskopie konnten wir die erfolgreiche Bildung und Proteinintegration der Vesikel bestätigen. Die Lipide wurden mit 0,4 Mol-% ATTO 488-DPPE markiert, und das Protein wurde kovalent über rhodaminische NHS-Ester-Modifikation von primären Aminen markiert. Abbildung 2a und Abbildung 2b zeigen ein proteinintegriertes Vesikel in den Kanälen ATTO 488 bzw. Rhodamin. Alle Mikroaufnahmen wurden dunkelstrom- und flachfeldkorrigiert. Abbildung 2c und Abbildung 2d zeigen eine Negativkontroll-GUV ohne eingebautes Protein. Abbildung 3a und Abbildung 3b zeigen ein proteinintegriertes GUV mit Linienintensitätsprofilen, die durch die gestrichelte weiße Linie desselben Vesikels in beiden Kanälen gegeben sind. Das Linienintensitätsprofil zeigt ein zweidimensionales Diagramm der Intensitäten der Pixel entlang der weiß gezeichneten Linie innerhalb des Bildes. Die x-Achse ist der Abstand entlang der Linie und die y-Achse ist die Pixelintensität. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die Profilintensität der angezeigten Linie darzustellen.

Figure 2
Abbildung 2: Mikroaufnahmen, die proteinintegrierte GUVs und GUVs ohne Protein vergleichen (Kontrolle). Die Mikroaufnahmen (a) und (b) zeigen proteinintegrierte GUV-Fluoreszenz mit den jeweiligen ATTO 488- bzw. Rhodaminkanälen. Die Mikroaufnahmen (c) und (d) zeigen ein Protein, das GUV weggelassen hat, wenn es mit ATTO 488 bzw. Rhodaminkanälen angeregt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die obere Reihe zeigt Mikroaufnahmen von proteinintegrierten GUVs in ATTO 488 (a) und Rhodamin (b) Kanälen. Linienintensitätsprofile für die angezeigten weiß gestrichelten Linien sind unten. Die Analyse wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Wir haben zwei Schritte identifiziert, die für den Erfolg des Gesamtprotokolls entscheidend sind: Plasmabehandlung und Lipidablagerung. Die Plasmareinigung der Deckgläser ist unerlässlich, um eine ausreichende Abdeckung und Haftung des Agarose-Hydrogels auf dem Glasdeckglas zu gewährleisten. Die Plasmareinigung bewirkt zwei Dinge: Erstens entfernt sie Spuren organischer Substanz von der Glasoberfläche; Zweitens aktiviert es die Deckglasoberfläche, was eine Erhöhung der Benetzbarkeit ermöglicht, wenn die Hydrophilie der Glasoberfläche zunimmt62,63. Das Berühren der Deckglasoberfläche nach der Plasmareinigung wird die ultrareine Oberfläche inaktivieren und kontaminieren und wird dringend davon abgeraten. Wir empfehlen, beim Umgang mit den Deckgläsern für den Agarose-Gleitgussschritt nur die Kanten und Unterseiten des Deckglases zu berühren. Diese Methode verwendet eine tropfenweise Lipidablagerung, die eine Gaschromatographie (GC) -Nadel und einen Luftstrom erfordert, um einige Mikroliter Lipidlösung gleichzeitig abzuscheiden, was eine präzise Kontrolle der zugesetzten Lipidmenge und die Platzierung des Lipidfilms auf der Hydrogeloberfläche ermöglicht. Der Nachteil dieser Methode ist, dass sie, wenn sie nicht sorgfältig durchgeführt wird, zu einigen ausgewählten Bereichen mit einem dickeren Lipidfilm führen kann, was zu reduzierten GUV-Ausbeuten führt.

Einer der wichtigsten Vorteile dieses Protokolls ist die Flexibilität der Plattform selbst; Diese Methode eignet sich sehr gut für Änderungen der Protein- und Lipidzusammensetzung sowie für Verkapselungs- und Puffermodifikationen. Dieses Protokoll kann im Prinzip jedes Transmembranprotein umfassen, da wir erfolgreich eine Reihe verschiedener Transmembranproteine integrieren konnten, die vom Adenosinrezeptor (A2AR) bis zu pflanzlichen Aquaporinen reichen, ohne die Funktionalität zu beeinträchtigen42,45,64. Traditionell wurden Proteine nach der Solubilisierung durch Detergenzien oder der Einarbeitung in Proteo-Liposomen oder kleine unilamellare Vesikel, die anschließend in ein vorgeformtes GUV65 integriert werden können, in GUVs eingebaut. Der Vorteil unserer modifizierten Hydrogel-Quellmethode besteht darin, dass sie die Abhängigkeit von Detergenzien oder Zwischenvesikeln aufhebt und ein zwischengeschaltetes hydratisiertes Gerüst bereitstellt. Die Vorteile davon sind zweifach: Wir können funktionelle GPCRs stabil in die Membran in einem physiologisch relevanteren Puffer integrieren, ohne uns auf Waschmittelaustauschmethoden zu verlassen, die mehr Vorbereitung und Sorgfalt hinsichtlich der Konzentration der genannten Detergenzien erfordern, und dass der Prozess, durch den GUVs von der Oberfläche des Hydrogels knospen, die korrekte Orientierung der Proteine in der Doppelschicht ermöglicht66 . Wir haben gezeigt, dass der GUV-Knospungsprozess die Verschmelzung vieler kleinerer nanometergroßer Vesikel zu größeren, mikrometergroßen Vesikeln beinhaltet, was von Anfang an die korrekte Proteinorientierung fördert. Wir haben gezeigt, dass dies in unseren früheren Arbeiten der Fall ist; Kurz gesagt, wir haben kovalent einen Antikörper markiert, der auf eine spezifische zytosolische Schleife des Adenosinrezeptors abzielt, den markierten Antikörper mit dem Protein inkubiert und dann das markierte Protein mit der modifizierten Hydrogel-Quellmethode in Lipidfarbstoff-markierte GUVs eingebaut. Dann setzten wir die proteininkorporierten Vesikel einem geladenen Quencher aus, der die Doppelschicht nicht überqueren kann. Anschließend sehen wir eine 50%ige Reduktion der Fluoreszenz des Lipidfarbstoffs, aber die Fluoreszenz des markierten Proteins bleibt vom Quencher nicht betroffen, was die richtige Orientierung zeigt44.

Frühere Arbeiten aus unserem Labor haben untersucht, welche Rolle Lipidkopfgruppenladung, zwitterionische und nettoionische geladene Lipide sowie Puffer- und Hydrogeleigenschaften wie pH-Wert, Ionenstärke, Osmolarität und Hydrogelkonzentration auf die Dynamik der GUV-Bildung haben67. Kurz gesagt, die Lipidladung beeinflusst die GUV-Bildung nicht weitgehend, während Puffereigenschaften wie die Erhöhung der Saccharosekonzentration (z. B. 500 mM Saccharose in 185 mM Ionenstärke PBS-Puffer) die GUV-Bildung negativ beeinflussen, was zu unregelmäßig geformten Vesikeln führt, die sich höchstwahrscheinlich nicht leicht für die Ernte eignen. Saure Lösungen (pH = 3) erhöhen die Bildungsrate, während eine basischere Lösung (pH = 8) die Rate der GUV-Bildung unterdrückt. GUVs bilden sich immer noch sowohl an den sauren als auch an den basischen Puffern, mit nur marginalen Unterschieden in der Vesikelgröße. Niedrige Agarosekonzentrationen (~0,1-1 w/v%) wirken sich auch negativ auf die GUV-Bildung aus, da es an homogener Oberflächenabdeckung mangelt und die Hydrogelquellung abnimmt, eine notwendige Kraft bei der Koaleszenz und Knospung von GUVs von der Hydrogeloberfläche. So haben wir festgestellt, dass eine Endagarosekonzentration von 2 w/v% mit einer Saccharose/Glukose-Lösung von 100-200 mM, kombiniert mit einer Pufferionenstärke von 185 mM PBS bei pH 7,4, ein gutes Gleichgewicht zwischen Agaroseschwellung, GUV-Bildungsrate und nachfolgender Vesikelgröße erreicht. Bei proteinhaltigen Vesikeln ermöglicht die Erhöhung der anfänglichen Agarosekonzentration auf 3 w/v% eine endgültige Agarosekonzentration von 2 w/v% nach Zugabe der Proteinlösung. Neben der Formationsdynamik erleichtert das Saccharose/Glukose-Puffersystem auch die Sedimentation und anschließende Sammlung von gebildeten GUVs sowie die Visualisierung unter Phasenkontrastmikroskopie65,68.

Es gibt einige Vorsichtsmaßnahmen in Bezug auf dieses Protokoll, insbesondere in Bezug auf die Agarose und die Auswahl der Vesikel. Während wir beispielsweise eine extrem niedrige Schmelztemperatur von Agarose verwenden, muss die Agarose-Wasser-Suspension mindestens 60 ° C erreichen, um geschmolzen zu werden, und das Agarose-Protein-Gemisch wird bei 45 ° C inkubiert.  Nach unserer Erfahrung eliminiert diese Temperatur nicht die Aktivität von 5-HT1AR, aber bei anderen Proteinen ist Vorsicht geboten. Im Allgemeinen beginnt die von uns verwendete Agarose bei 20 ° C zu gelieren und somit kann die Quellreaktion bei Temperaturen über 20 ° C stattfinden, aber dieser Prozess kann unterhalb dieser Temperatur nicht funktionieren. Es sollte auch beachtet werden, dass je näher die Temperatur an 20 °C kommt, desto weniger effizient wird der Quellschritt, was zu einer späteren Abnahme der GUV-Ausbeute führt. Die Agarose kann auch während der Absetz- und Visualisierungsschritte ein Problem darstellen, da sie am Boden des Absetz-/Sammelrohrs als Ablagerungen bestehen bleiben kann. Daher ist Vorsicht geboten bei der Temperatur, die erforderlich ist, um die geschmolzene Agarose aufrechtzuerhalten und sicherzustellen, dass die genannte Temperatur das interessierende Protein nicht denaturiert, sowie bei der Absauglösung, um zu vermeiden, dass überschüssige suspendierte Agarose in die endgültige Probe aufgenommen wird. Diese Methode führt in ihrem derzeitigen Zustand auch zu einer heterogenen GUV-Populationsgröße, wobei einige Vesikel Mehrschichtigkeit und andere fehlerhafte Vesikelphänomene wie Vesikel in Vesikeln aufweisen. Dies ist typisch für gängige GUV-Bildungsmethoden und erfordert Wachsamkeit und Diskretion bei der Auswahl von Vesikeln für Mikroskopie und Analyse. GUVs, die ungewöhnlich hohe Fluoreszenzwerte aufweisen, werden ebenfalls nicht für die Analyse empfohlen, da Agarose im Inneren einiger dieser Vesikel zu finden ist. Unveröffentlichte Arbeiten aus unserem Labor konnten Mikropipetten-Aspirationsexperimente mit Vesikeln durchführen, die mit dieser Technik hergestellt wurden, was zeigt, dass die Agarose-Methode Vesikel ohne mechanisch verändernde Agarose im Lumen erzeugt.

Abgesehen von den Einschränkungen stellt dieses Protokoll eine robuste und unkomplizierte Methode zur Erzeugung von proteinintegrierten GUVs dar. Es kann hohe Ausbeuten von GUVs unter physiologisch relevanten Bedingungen erzeugen, die richtig ausgerichtete Transmembranproteine in die Doppelschicht integrieren, ohne ihre Funktionalität zu beeinträchtigen. Dies ist eine Abweichung von anderen Methoden der Vesikelbildung, die elektrische Ströme oder sanfte Hydratation beinhalten, die die Struktur des Proteins erheblich schädigen und es funktionsunfähig machen oder weitere Reinigungs- und Entfernungsschritte erfordern würden. Angesichts der Tatsache, dass GPCRs mehr als ein Drittel aller pharmazeutischen Targets ausmachen, besteht ein erhebliches Interesse daran, diese Proteinfamilie in einer hochgradig abstimmbaren biomimetischen Plattform mit hohem Durchsatz untersuchen zu können. Genauer gesagt reichen die Anwendungen dieser Arbeit von der Untersuchung von Protein-Lipid-Interaktionen, wie die Lipidmikroumgebung die Proteinfunktionalität und -lokalisation beeinflusst, bis hin zu anderen grundlegenden biophysikalischen Fragen, die die Pharmazeutische Arzneimittelentwicklung und -entdeckung beeinflussen können. Ein Beispiel dafür ist die in unserem Labor durchgeführte Arbeit, die in der Lage war, Varianzen in der Rezeptorfunktionalität als Folge der Lipidoxidation zu erkennen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken Matthew Blosser für die wertvolle Diskussion und Beratung. Diese Arbeit wurde vom Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) und der National Science Foundation (PHY-1915017) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

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Bioengineering Ausgabe 180
Konstruktion von Modelllipidmembranen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)
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Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

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