Summary
Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.
Abstract
İntegral membran proteinlerinin yapısı ve işlevinin sağlam in vitro incelemeleri, plazma zarının karmaşıklığı ve canlı hücrelerde protein davranışını etkileyen çok sayıda faktör nedeniyle zor olmuştur. Dev unilamellar vesicles (GUVs), protein-membran etkileşimlerini araştırmak ve protein davranışını kesin, uyarana bağlı bir şekilde araştırmak için biyomimetik ve yüksek oranda tonlanabilir bir in vitro model sistemidir. Bu protokolde, membrana saplanmış insan serotonin 1A reseptörü (5-HT1AR) ile GUV'ların üretimi için ucuz ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Modifiye hidrojel şişme yöntemi kullanarak GUV'lar imal ediyoruz; agarose ve 5-HT1AR karışımının üzerine bir lipid filmi biriktirerek ve daha sonra tüm sistemi nemlendirerek, membran içine dahil edilmiş düzgün yönlendirilmiş ve fonksiyonel 5-HT1AR ile vezikliler oluşturulabilir. Bu GUV'lar daha sonra mikroskopi ile protein-membran etkileşimlerini ve lokalizasyon davranışını incelemek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol, derin fizyolojik içgörü sağlayarak integral membran proteinlerinin işlevselliği hakkındaki anlayışımızı ilerletebilir.
Introduction
Sentetik model membranlar, biyomembranların temel özelliklerinin ve işlevlerinin araştırılmasında güçlü araçlardır. Dev unilamellar veziküller (GUV'ler) çeşitli plazma membran özelliklerini incelemek için en belirgin platformlardan biridir ve farklı fizyolojik durumları taklit etmek için tasarlanmış olabilir1,2,3,4,5,6,7,8. Plazma membranının ve organizasyonunun sinyal transdüksiyonu, yapışıklık, endositoz ve transport9,10,11,12,13,14,15 gibi çok sayıda hücresel işlemde kilit rol oynadığı iyi belirlenmiştir.
GUV'lar nazik hidrasyon16, hidrojel şişme17, elektroformasyon18, mikroakışkan teknikler19,20,21,22, jetting23 ve solvent değişimi24,25,26 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak üretilmiştir. İntegral membran proteinlerinin (IMP) işlenmesindeki zorluklar nedeniyle, bunları incelemek için in vitro platformlar sınırlı olmuştur. GUV'ler, IMP'leri yerel ortamlarını taklit eden bir ortamda incelemek için basitleştirilmiş bir platform sunar. GUV'lerde protein rekonsesi için çeşitli yaklaşımlar olmasına rağmen, proteinlerin doğru oryantasyonla birleştirilmesi ve protein işlevselliğinin korunmasından kaynaklanan zorluklar ortaya çıkmaktadır27.
GUV'larda en başarılı protein rekonsesi deterjan değişim yöntemini gerektirir; proteinlerin deterjanlarla kendi çevrelerinden çözünür hale getirilmesini, ardından protein saflaştırılmasını ve daha sonra deterjan moleküllerinin çeşitli yöntemlerle lipitlerle değiştirilmesini içerir28. Deterjanlar saflaştırma sırasında IMP'lerin üçüncül yapısını stabilize etmeye hizmet ederken, deterjan miselleri lipid bilayers28,29,30'da özellikle fonksiyonel çalışmalar için daha iyi stabilize edilen bu proteinler için nispeten doğal olmayan bir ortamdır. Ayrıca, geleneksel GUV imalat teknikleri kullanılarak fonksiyonel transmembran proteinlerinin lipid bilayer içine dahil edilmesi, bu proteinlerin büyüklüğü, inceliği ve ihtiyaç duyulacak ek deterjan değişim adımları nedeniyle zor olmuştur27,31,32,33. Deterjanları çıkarmak için organik çözücü kullanımı protein toplama ve denatüre edilmesine neden olur34. Geliştirilmiş deterjan aracılı bir yöntem umut vericidir, ancak deterjan giderme adımı için dikkatli olunması ve belirli proteinler için optimizasyon gerekebilir31,35. Ek olarak, elektroformasyon kullanan yöntemler protein seçimini kısıtlayabilir ve özellikle yüklü lipitler için tüm lipit bileşimleri için uygun olmayabilir31,36,37. Kullanılan bir diğer teknik, istenen proteini içeren büyük unilameller vesicles'in (LUV) PEPTİD kaynaklı füzyonudur, ancak zahmetli olduğu ve yabancı moleküllerin yerleştirilmesine yol açabileceği bulunmuştur-fusojenik peptitler33,38,39. Canlı hücrelerden elde edilen dev plazma membran veziklikleri (GPMV'ler) bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için kullanılabilir, ancak ortaya çıkan lipit ve protein bileşiminin minimum kontrolüne izin verir14,40,41. Bu nedenle, modifiye agarose şişme yöntemimizi kullanarak IMP'lerin GUV'lerin bilipid tabakasına entegrasyonu, bu proteinleri membran ortamında daha fazla incelemek için güvenilir bir yöntem sürmektedir42,43,44,45.
Hücresel sinyalizasyon ve iletişim, G protein bağlantılı reseptörler (GPCR) olarak bilinen bir protein ailesini içerir; GPCR'ler en büyük protein ailesi arasındadır ve diğer birçok fizyolojik fonksiyon arasında ruh hali, iştah, kan basıncı, kardiyovasküler fonksiyon, solunum ve uyku modülasyonu ile ilişkilidir46. Bu çalışmada GPCR ailesinin prototipik bir üyesi olan insan serotonin 1A reseptörü (5-HT1AR) kullanıldı. 5-HT1AR merkezi sinir sistemi (CNS) ve kan damarlarında bulunabilir; kardiyovasküler, gastrointestinal, endokrin fonksiyonlar gibi çok sayıda işlevi etkiler ve mood47'nin düzenlenmesine katılır. GPCR araştırmalarının önündeki büyük bir engel karmaşık amfifilik yapılarından kaynaklanmaktadır ve GUV'lar protein işlevselliği, lipid-protein etkileşimleri ve protein-protein etkileşimleri gibi çeşitli ilgi çekici özelliklerin araştırılması için umut verici bir platform sunun. Yüzey plazmon rezonansı (SPR)48,49, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR)50,51, protein lipid kaplaması (FKÖ) tahlil51,52,53,54, yerli kütle spektrometresi55, izotermal titrasyon kalorimetresi (ITC)56,57 ve lipozom sedimentasyon tahlil58,59. Laboratuvarımız, reseptörün aktif durumunda Giα alt birliğine bağlanan BODIPY-GTPφS'yi yalıtarak lipid-protein etkileşimlerinin protein işlevselliği üzerindeki etkisini araştırmak için basitleştirilmiş GUV yaklaşımını kullanmıştır. Bağlamaları, zaman içinde tespit edilebilen bir floresan sinyali üreten floroforu çözer45. Ayrıca, çeşitli çalışmalar Lipid-protein etkileşimlerini ve proteinlerin membran eğriliğini algılama veya stabilize etmedeki rolünü araştırdı60,61 ve uygulanabilir bir GUV yaklaşımı kullanmak önemli bir avantaj olabilir.
Bu protokol, modifiye edilmiş bir agarose hidrojel sistemi17,42 kullanarak GPCR'leri GUV'lerin membranına dahil etmek için basit bir yöntem göstermektedir. Ayrıca, önceki çalışmalarımıza dayanarak, yöntemimiz 30-40 ° C'ye kısa süreli maruz kalabilen IMP'ler için uygun olabilir. Kısaca, ilgi GPCR'sini içeren membran parçalarıyla birlikte ince bir agarose filmi yaydık. Bu tabakanın jelasyonunu takiben, agarose üzerine bir lipit çözeltisi biriktiriyoruz ve çözücüyün buharlaşmasını sağlıyoruz. Sistemin yeniden sulanması daha sonra sulu bir tampon ile gerçekleştirildi ve lipid bilayer'e dahil protein içeren GUV'lerin oluşumuna neden oldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protein etiketleme
- NHS-Rhodamine, 5-HT1A membran parçaları ve bir adet 7 K MWCO spin tuzdan arındırma kolonunun oda sıcaklığında dengede olmasını sağlar.
- 100 μL dimetil sülfit (DMSO) içinde 1 mg NHS-rhodamin çözün.
- pH 8'e 5-HT1AR çözeltisinin pH'ını artırmak için 5 μL 1 M sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin.
- 5-HT1AR çözeltisinin 50 μL'sine 3,66 μL NHS-rhodamin çözeltisi ekleyin ve pipet bir mikrosantrifüj tüpünde hafifçe yukarı ve aşağı.
NOT: NHS-rhodamine'nin en az 10x azı dişi fazlalığına sahip olduğundan emin olun. - Karışımı ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca rotatora koyun.
- 7 k MWCO spin sütununu 200 μL 1x fosfat tampon salin (1x PBS) ile üç kez 1,5 RCF'de 1,5 RCF'de yıkayın.
- Etiketli proteini bir sütuna ekleyin ve başka bir mikrosantrifüj tüpündeki miktarı dengeleyin.
- Etiketli proteini 1,5 RCF'de 5 dakika boyunca bir kez aşağı çevirin.
- 280 nm ve 554 nm'de bir nanodrop spektrofotometre kullanarak bir UV-vis spektrumu alın ve üreticinin el kitabını izleyerek etiketleme verimliliğini hesaplayın.
- Etiketli proteini 5 °C'de bir sonraki kullanıma kadar saklayın. Çözelti etiketlemeden sonra yaklaşık bir hafta boyunca kararlıdır.
2. Membran dahil 5-HT 1A ile GUV'ler
- Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması
- Proteinin, lipitlerin ve BSA'nın (Sığır serum albümini) oda sıcaklığına eşdeğer hale girmesine izin verin.
- Bu süre zarfında, kapakları metanol içine yerleştirerek ve 40 ° C'de 30 dakika sonicating yaparak temizleyin. Metanol kapakları tamamen kaplar ve su banyosundaki su seviyesinin kaptaki metanol seviyesinin üzerinde olduğundan emin olun.
NOT: Metanol toksiktir ve uygun kimyasal başlıkta ele alınmalıdır. - Kapaklardaki fazla metanolleri yumuşak bir hava akışı ile kurulayın. Fazla kapak örtülerinin kurumasını sağlamak için kapak rafını 40 °C fırında 15 dakika boyunca yerleştirin.
- Plazma temizleme işlemine başlayın. İlk olarak, kapakları plazma temizleyicisine yerleştirin ve odanın içindeki tüm havayı boşaltmak için hava giriş vanasını kapatın.
- Oda vakum altında kaldıktan sonra, kapakları yüksek RF güç ayarı ve neredeyse tam bir vakum kullanarak 5 dakika boyunca temizleyin, vakum odasına sadece hafif bir hava girişi ile. Uygun plazma seviyesini sağlamak için, vakum odasının açılmasını plazmanın elde ettiği rengin sabit, parlak pembe olacak şekilde ayarlayın.
NOT: Hava kullanırken plazmanın plazma tedavisi adımı süresince parlak pembe bir renk olarak kalması çok önemlidir, çünkü daha koyu mor bir renk odada yanlış miktarda hava olduğunu ve yetersiz plazma tedavisine neden olacağını gösterir. - 5 dakika geçtikten sonra RF gücünü kapatın ve vakumun serbest bırakılmasını kesin.
NOT: Plazma odasından çıkarıldıktan sonra lütfen kapak örtülerinin kapalı kaldığından emin olun.
- Hidrojel hazırlama
- 6 mg ultra düşük erime sıcaklığında agarose ile 300 μL ultra saf su (yani% 2 (w/v) agarose) ile birleştirin.
NOT: Proteinsiz GUV'ler yapmak için % 2 agarose kullanılacaktır. Agarose çözeltisi iki gün boyunca 45 ° C'de tutulabilir. - 9 mg ultra düşük sıcaklık agarose'u 300 μL ultra saf su ile 3 w/v agarose için 3.1 adımda hazırlandığı gibi birleştirin. Protein içeren GUV'lar yapmak için% 3 agarose kullanılacaktır.
- Vortex çözeltisini 90 °C ısı bloğuna yerleştirmeden önce 10 dakika boyunca kısa bir süre. Daha sonra, tüpü daha fazla kullanıma kadar erimiş formda tutmak için 45 ° C ısı bloğuna aktarmadan önce tekrar girdaplayın.
- 6 mg ultra düşük erime sıcaklığında agarose ile 300 μL ultra saf su (yani% 2 (w/v) agarose) ile birleştirin.
- Agarose ve protein karıştırma
- %3 agarose'un 21 μL'sini 7 μL 5-HT1AR membran parçalarıyla karıştırın. Pipet yeterli karıştırma sağlamak için birçok kez yavaşça yukarı ve aşağı. Ardından, 45 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hidrojel ve lipid birikimi
- Protein içermeyen GUV'lar için: %2 agarose'un 20 μL'sini kullanarak taze plazma ile temizlenmiş kapaklar üzerinde ince bir film yapın. Agarose damlacığın üzerine hızlı bir şekilde başka bir kapak kapağı bırakın ve her iki kapakta ince bir film yapmak için kapak kapaklarını hafifçe kaydırın.
NOT: Bu adım, agarose hala erimiş formdayken damlacık kaymasının gerçekleşmesi gerektiği için zordur. - Protein içeren GUV'lar için: Protein/ agarose karışımını bir kez daha yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından plazma ile temizlenmiş bir kapak parçasına% 2 agarose'un 20 μL'sini biriktirin. Yukarıda açıklandığı gibi kayma döküm talimatlarını izleyin.
- Agarose'un oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ışıktan korunmasına izin verin.
- Lipitleri agarose tabakasının üzerine damla damla yatırın. 0.4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl ile 1-palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin (POPC) toplam 10 μL 2 mg/mL kullanın agarose filminin üstünde kloroform olarak ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (veya ilginin lipid karışımı) ile etiketlenmiş sn-glisero-3-fosfotanolamin (DPPE). Damlacıkları bir gaz kromatografi iğnesi kullanarak biriktirin ve hafif bir hava akımı aracılığıyla bir seferde bir damlacık yayın.
NOT: Hidrojel üzerine nispeten düzgün bir lipit tabakası yapmak için bu adımda dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, kloroform toksiktir ve uygun kimyasal başlıkta ele alınmalıdır. - Sykes-Moore (S-M) odalarını kapak kapağının üzerine bir O-halkası yerleştirerek ve ardından odanın üst bileşenini O-halkasının üzerine yerleştirerek monte edin. Hazneyi kapatmak ve herhangi bir sızıntıyı önlemek için hazne bileşenlerini birbirine vidalayarak hazneyi monte etmek için üretici tarafından sağlanan anahtarı kullanın.
NOT: Odanın üst kısmı O halkasında sıkılmalıdır, ancak O-ring haznede düzgün oturmazsa kapak kapağı çatlayabilir diye kapak kapağının sağlam kalmasını sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, şişkinlik çözeltisi eklendiğinde odanın sızmayacağı kadar sıkı bir şekilde kapatıldığından emin olun. Haznenin yeterince sıkılaştırılmaması sızıntılara ve numune kaybına neden olacaktır.
- Protein içermeyen GUV'lar için: %2 agarose'un 20 μL'sini kullanarak taze plazma ile temizlenmiş kapaklar üzerinde ince bir film yapın. Agarose damlacığın üzerine hızlı bir şekilde başka bir kapak kapağı bırakın ve her iki kapakta ince bir film yapmak için kapak kapaklarını hafifçe kaydırın.
- Veziklin şişmesi ve hasadı
- 1x PBS'de 450 μL 200 mM sakkaroz borusunu hafifçe pipetleyarak ve hidrojel lipit katmanlarının yeterli tampon kapsamını sağlamak için odalara hafifçe dokunarak tüm sistemi nemlendirin.
NOT: Sakkaroz çözeltisi, biyolojik problar içeren bir rehidrasyon tamponu ile değiştirilebilir. - Odaları 45 °C'ye yerleştirin ve buharlaşmayı önlemek için odanın üst kısmını bir kapakla örtün. Numunenin şişmesine izin verin, 1 saat boyunca enkaz ve ışıktan korunun.
- Kullanılması amaçlanan 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna ultra saf suya 100 μL 1 mg/mL BSA ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Ultra saf suyla üç kez ve 1x PBS'de 200 mM sakkarozla bir kez yıkayın.
- Son olarak, GUV örnek çözeltisi eklenene kadar 1x PBS'de 200 mM glikoz ekleyin.
NOT: GUV adsorpsiyonun engellenmesi için BSA kullanılmıştır. - Hidrojel şişmesine izin verdikten sonra, hidrojel yüzeyine bağlı kalabilecek HERHANGI bir GUV'yi yerinden çıkarmak için odayı hafifçe sallayın ve dokunun. Ardından, GUV-sakkaroz çözeltisini dikkatlice pipetle.
NOT: Tüm veziklinlerin yüzeyden ayrılmasını sağlamak için isteğe bağlı bir adım olarak, sakkaroz süspansiyonunun bir kısmını hidrojel yüzeye hafifçe borulayın. - Süspansiyonu, 1x PBS'de 700 μL 200 mM glikoz içeren daha önce hazırlanmış bir mikrosantrifüj tüpüne taşıyın.
NOT: Yoğunluk gradyanı, veziklitlerin santrifüj tüpünün dibine yerleşmesine yol açacaktır. - Veziklilerin mikrosantrifüj tüpünün dibine batmasını sağlamak için veziklinlerin bir saat daha yerleşmesine izin verin ve optimum toplama için izin verin.
- GUV'ların glikoz içine yerleştirilmesinden sonra, konfokal mikroskop altındaki veziklileri incelemek için santrifüj tüpünün altından (yerleşik veziklinler) daha önce hazırlanmış ve BSA ile işlenmiş 96 kuyu plakasına 300 μL aktarın.
NOT: Son numunede toplanan döküntü miktarını en aza indirmek için mikrosantrifüj tüpünün en altından kaçındığından emin olun.
- 1x PBS'de 450 μL 200 mM sakkaroz borusunu hafifçe pipetleyarak ve hidrojel lipit katmanlarının yeterli tampon kapsamını sağlamak için odalara hafifçe dokunarak tüm sistemi nemlendirin.
- Mikroskop altındaki örnekleri kontrol edin.
- Numuneye 488 nm lazer parlatın (bu, bilayer ATTO-488-DPPE ile etiketlenmiş olduğu için zarı görselleştirmemizi sağlar).
- Numuneye 561 nm lazer parlatın (NHS-Rhodamine ile etiketlenmiş olduğundan proteini görselleştirmemizi sağlar).
NOT: Fotooksidasyon veziklin dengesini bozabileceğinden numuneyi görüntülemede dikkatli olunması gerekir. Aynı gün vesicles gözlendi.
Şekil 1: Ayrıntılı protokol adımlarının çizimi. BioRender.com ile oluşturuldu Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein konsantrasyonu ölçüldü ve etiketleme derecesi boya ile protein arasındaki azı dişi oranı olarak 1:1 olarak hesaplandı. Konfokal mikroskopi kullanarak GUV'ları inceleyerek veziklin başarılı oluşumunu ve protein entegrasyonunu doğrulayabildik. Lipitler %0.4 atto 488-DPPE ile etiketlendi ve protein rhodamine NHS-ester birincil aminlerin modifikasyonu ile birlikte etiketlendi. Şekil 2a ve Şekil 2b sırasıyla ATTO 488 ve rhodamin kanallarında protein içeren bir veziklin göstermektedir. Tüm mikrografiler koyu akımlı ve düz alan düzeltildi. Şekil 2c ve Şekil 2d , protein dahil olmayan negatif kontrol GUV'lerini göstermektedir. Şekil 3a ve Şekil 3b , her iki kanalda da aynı vezikliğin kesikli beyaz çizgisi tarafından verilen çizgi yoğunluğu profillerine sahip GUV içeren bir protein göstermektedir. Çizgi yoğunluğu profili, görüntü içindeki beyaz çizilmiş çizgi boyunca piksellerin yoğunluklarının iki boyutlu bir çizimini gösterir. x ekseni çizgi boyunca mesafedir ve y ekseni piksel yoğunluğudur. Belirtilen satırın profil yoğunluğunu çizmek için ImageJ yazılımı kullanıldı.
Şekil 2: Proteini karşılaştıran mikrografiler, proteinsiz (kontrol) GUV'ları ve GUV'leri içerir. Mikrografiler (a) ve (b) proteinin sırasıyla ilgili ATTO 488 ve rhodamin kanalları ile GUV floresanını içerdiğini göstermektedir. Mikrografiler (c) ve (d) sırasıyla ATTO 488 ve rhodamin kanalları ile heyecanlandıklarında GUV atlanmış bir protein gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Üst sırada ATTO 488 (a) ve rhodamin (b) kanallarında protein içeren GUV'lerin mikro grafikleri gösterilmiştir. Belirtilen beyaz kesikli çizgiler için çizgi yoğunluğu profilleri aşağıdadır. Analiz ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genel protokolün başarısı için kritik olan iki adım belirledik: plazma tedavisi ve lipid birikimi. Kapak kapaklarının plazma temizliği, agarose hidrojelinin cam kapak kapağına yeterli kapsama alanı ve yapıştırılmasının sağlanmasında esastır. Plazma temizliği iki şeyi gerçekleştirir: birincisi, cam yüzeyinden organik madde izlerini temizler; ikinci olarak, kapak yüzeyini aktive eder, cam yüzey hidrofilizliği arttıkça ıslanabilirlikte bir artış sağlar62,63. Kapak yüzeyi sonrası temizlemeye dokunmak ultraklek yüzeyi devre dışı ve kirletir ve şiddetle tavsiye edilir. Önerimiz, agarose kayma döküm adımı için kapakları işlerken sadece kapak altlarına ve altlarına dokunmaktır. İkinci kritik adım, lipitlerin kuru hidrojel yüzeye birikmesidir. Bu yöntem, bir gaz kromatografisi (GC) iğnesi ve bir anda birkaç mikrolitre lipid çözeltisi biriktirmek için bir hava akımı gerektiren damla gibi bir lipid birikimi kullanır ve eklenen lipit miktarının hassas bir şekilde kontrol altına alınmasını ve lipid filminin hidrojel yüzeye yerleştirilmesini sağlar. Bu yöntemin dezavantajı, dikkatli bir şekilde yapılmazsa, daha kalın bir lipit filme sahip birkaç seçilmiş alanla sonuçlanabilmesidir, bu da GUV veriminin azalmasına neden olur. Bu nedenle, agarose yüzeyinde mümkün olduğunca düzgün bir şekilde ince bir lipit tabakası olduğundan emin olmak önemlidir.
Bu protokolün en önemli faydalarından biri platformun esnekliğidir; bu yöntem protein ve lipit bileşimindeki değişikliklerin yanı sıra kapsülleme ve tampon modifikasyonlarına çok iyi katkıda bulunur. Bu protokol, prensip olarak, adenozin reseptöründen (A2AR) bitki akvaryumlarına kadar bir dizi farklı transmembran proteinini işlevsellikten ödün vermeden başarıyla dahil edebildiğimiz için herhangi bir transmembran proteinini içerebilir42,45,64. Geleneksel olarak, proteinler deterjanlar veya proteo lipozomlar veya daha sonra önceden biçimlendirilmiş bir GUV65'e entegre edilebilen küçük unilamellar veziküller içine dahil edilerek çözünür hale getirildi. Modifiye hidrojel şişme yöntemimizin avantajı, deterjanların veya ara veziküllerin bağımlılığını ortadan kaldırması ve ara hidratlı bir iskele sağlamasıdır. Bunun yararları iki yönlüdür: fonksiyonel GPCR'leri, ilgili deterjanların konsantrasyonu ile ilgili daha fazla hazırlık ve bakım gerektiren deterjan değişim yöntemlerine dayanmadan daha fizyolojik olarak ilgili bir tamponda membrana bıçaklayarak dahil edebiliriz ve GUV'lerin hidrojel yüzeyinden tomurcuklanma süreci, bilayer66'daki proteinlerin doğru yönlendirilmesine izin verir. . GUV tomurcuklanma sürecinin, birçok küçük nanometre ölçekli veziküllerin, en başından beri doğru protein yönelimini teşvik eden daha büyük, mikron ölçekli veziküllerde birleşmesini içerdiğini gösterdik. Daha önceki çalışmalarımızda da böyle olduğunu göstermiştik; kısacası, Adenozin reseptörünün belirli bir sitosolik döngüsünü hedef alan bir antikoru birlikte etiketledik ve etiketli antikoru proteinle kuluçkaya yatırdık ve daha sonra etiketli proteini modifiye hidrojel şişme yöntemini kullanarak lipid boya etiketli SUV'lara dahil ettik. Daha sonra protein içeren veziklinleri, bilayer'i geçemeyen yüklü bir quencher'a maruz kaldık. Daha sonra lipid boyasının floresanında% 50 azalma görüyoruz, ancak etiketli proteinin floresanları quencher'dan etkilenmeden kalıyor ve uygun oryantasyon gösteriyor44.
Laboratuvarımızın önceki çalışmaları lipid kafa grubu şarjının, zwitteriyonik ve net-iyonik yüklü lipitlerin yanı sıra pH, iyonik mukavemet, ozmolarite ve hidrojel konsantrasyonu gibi tampon ve hidrojel özelliklerinin GUV formasyonunun dinamikleri üzerindeki rolünü araştırmıştır67. Kısacası, lipid yükü GUV oluşumunu büyük ölçüde etkilemezken, sakkaroz konsantrasyonundaki artışlar (örneğin, 185 mM iyonik mukavemetli PBS tamponunda 500 mM Sakkaroz) gibi tampon özellikleri GUV oluşumunu olumsuz yönde etkiler ve bu da büyük olasılıkla kendilerini hasata kolayca ödünç vermeyecek düzensiz şekilli veziküllerle sonuçlanır. Asidik çözeltiler (pH = 3) oluşum hızını artırırken, daha temel bir çözelti (pH = 8) GUV oluşum oranını baskılar. GUV'ler hala hem asidik hem de temel tamponlarda oluşur ve vesicle boyutunda sadece marjinal farklılıklar vardır. Düşük agarose konsantrasyonları (~0.1-1 w/v%), homojen yüzey kapsama alanı eksikliği ve hidrojel şişmesinde azalma, GUV'lerin hidrojel yüzeyinden birleşiminde ve tomurcuklanmasında gerekli bir güç nedeniyle GUV oluşumunu da olumsuz yönde etkiler. Böylece, pH 7.4'te 185 mM PBS tampon iyonik mukavemeti ile birlikte 100-200 mM'lik bir sakkaroz / glikoz çözeltisine sahip% 2 w / v nihai agarose konsantrasyonunun iyi bir agarose şişmesi, GUV oluşum oranı ve sonraki vezikül büyüklüğü dengesine sahip olduğunu belirledik. Protein içeren veziniküller için, ilk agarose konsantrasyonunun% 3 w / v'ye çıkarılması, protein çözeltisinin eklenmesinden sonra% 2 w / v'lik son bir agarose konsantrasyonuna izin verir. Oluşum dinamiklerine ek olarak, sakkaroz/glikoz tampon sistemi, oluşan GUV'lerin çökeltilmesini ve daha sonra toplanmasını ve faz kontrastı mikroskopisi altında görselleştirmeyi de kolaylaştırır65,68.
Bu protokolle ilgili, özellikle agarose ve veziküllerin seçimi ile ilgili bazı dikkat çekici noktalar vardır. Örneğin, ultra düşük erime sıcaklığında bir agarose kullanırken, agarose-su süspansiyonunun erimesi için en az 60 ° C'ye ulaşması gerekir ve agarose-protein karışımı 45 ° C'de inkübe edilir. Deneyimlerimize göre, bu sıcaklık 5-HT1AR aktivitesini ortadan kaldırmaz, ancak diğer proteinler için dikkatli olunması gerekir. Genel olarak, kullandığımız agarose 20 ° C'de jelleşmeye başlar ve böylece şişme reaksiyonu 20 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda meydana gelebilir, ancak bu işlem bu sıcaklığın altında çalışamaz. Ayrıca, sıcaklığın 20 ° C'ye yaklaştıkça, şişme adımının daha az verimli hale geldiği ve GUV veriminde daha sonra düşüşlere yol açtığı belirtilmelidir. Agarose, çökeltme / toplama tüpünün dibinde enkaz olarak devam edebileceğinden, yerleşme ve görselleştirme adımları sırasında da bir sorun sunabilir. Bu nedenle, erimiş agarose'u korumak için gereken sıcaklık için dikkatli olmak ve bu sıcaklığın ilgi proteinini denatüre etmeyeceğinden emin olmak ve aşırı askıya alınmış agarozların son örneğe dahil edilmesini önlemek için çökeltme çözeltisini epire etmek gerekir. Mevcut durumundaki bu yöntem aynı zamanda heterojen bir GUV popülasyon büyüklüğü ile sonuçlanır, bazı veziküller çok yönlülük ve veziküller içindeki veziküller gibi diğer kusurlu vezikül fenomenlerini gösterir. Bu, yaygın GUV oluşum yöntemlerinin tipik bir örneğidir ve mikroskopi ve analiz için veziklin seçerken uyanıklık ve sağduyu gerektirir. Alışılmadık derecede yüksek floresan seviyeleri gösteren GUV'lar da analiz için önerilmez, çünkü agarose bu veziklinlerin bazılarının iç kısmında bulunabilir. Laboratuvarımız dışında yayınlanmamış çalışmalar, bu teknik kullanılarak yapılan vezikülleri kullanarak mikropipette aspirasyon deneyleri yapabildi ve agarose yönteminin lümen içinde mekanik değiştiren agarose olmadan vezikler ürettiğini gösterdi.
Sınırlamalar bir yana, bu protokol protein dahilLI GUV'lar üretmek için sağlam ve basit bir yöntem sunar. İşlevselliklerinden ödün vermeden bilayer içine düzgün yönlendirilmiş transmembran proteinlerini içeren fizyolojik olarak ilgili koşullarda yüksek miktarda GUV üretebilir. Bu, elektrik akımları veya nazik hidrasyon içeren, proteinin yapısına önemli ölçüde zarar verecek ve işlevsiz hale getirecek veya daha fazla deterjan çözünürlüğü ve çıkarma adımları gerektirecek diğer vezikül oluşum yöntemlerinden ayrılmadır. GPCR'lerin tüm farmasötik hedeflerin üçte birini temsil ettiği göz önüne alındığında, bu protein ailesini yüksek tonlanabilir, yüksek verimli, biyomimetik bir platformda inceleyebilmek için önemli bir ilgi vardır. Daha spesifik olarak, bu çalışmanın uygulamaları protein-lipit etkileşimlerinin incelenmesinden, lipid mikroçevronmentinin protein işlevselliğini ve lokalizasyonunu nasıl etkilediğine ve farmasötik ilaç geliştirme ve keşfini bilgilendirebilecek diğer temel biyofiziksel sorulara kadar uzanmaktadır. Lipid oksidasyonu sonucunda reseptör işlevselliğindeki farkları fark edebilen laboratuvarımız bünyesinde tamamlanan çalışmalarda bunun bir örneğine rastlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Matthew Blosser'a değerli tartışmalar ve tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deniz Araştırmaları Ofisi (N00014-16-1-2382) ve Ulusal Bilim Vakfı (PHY-1915017) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850375C-25mg | |
| TI-Eclipse inverted microscope | Nikon, Melville, NY | Eclipse Ti | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850355C-25mg | |
| 13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings | Sterling Seal & Supply, Neptune, IN | 5-003-8770 | |
| 16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera | Photometrics, Huntington Beach, CA | Cascade II 512 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
| 50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm | Coherent, Santa Clara, CA | 488/561-50-LS | |
| 5-HT1AR membrane fragments | Perkin Elmer, Waltham, MA | RBHS1AM400UA | |
| ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) | ATTO-TEC, Siegen, Germany | AD 488-155 | |
| Bench top plasma cleaner | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-32G | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
| chloroform (CHCl3) | Millipore Sigma, Burlington, MA | CX1055 | |
| Cholesterol (Chol) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | C8667-5G | |
| Corning 96-well Flat Clear Bottom | Corning, Corning, NY | 3904 | |
| Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic | Elma, Singen, Germany | [no longer sold on main website] | |
| glucose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G7528 | |
| methanol (MeOH) | Millipore Sigma, Burlington, MA | MX0485 | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ND-1000 | |
| NHS-Rhodamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 46406 | |
| phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) | Corning, Corning, NY | 21-040 | |
| spinning-disc CSUX confocal head | Yokogawa,Tokyo, Japan | CSU-X1 | |
| standard 25 mm no. 1 glass coverslips | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
| sucrose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S7903 | |
| Sykes-Moore chambers | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
| Ultra-low melting temperature agarose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5030 | |
| VWR Analog Heatblock | VWR International, Radnor, PA | [no longer sold on main website] | |
| VWR Tube Rotator | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |
References
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
- Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
- Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
- Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
- Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
- Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
- Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
- Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
- Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S.
- Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
- Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
- Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
- Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
- le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
- Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
- Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
- Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
- Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
- Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
- Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
- López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
- Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
- Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
- Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Nichols, D. E., Nichols, C. D.
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
- Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
- Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
- Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
- Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
- Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
- Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
- Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
- Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
- Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
- Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
- Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
- Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
- Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
- Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
- Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
- Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
- Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
- Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
- Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).
