Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol maakt gebruik van agarose zwelling als een krachtige en generaliseerbare techniek voor het opnemen van integrale membraaneiwitten (GMP's) in gigantische unilamellaire lipide blaasjes (GUVs), zoals hier beschreven voor de reconstructie van het menselijke 1A serotoninereceptoreiwit (5-HT1AR), een van de klassen van farmacologisch belangrijke G-eiwit-gekoppelde receptoren.

Abstract

Robuust in vitro onderzoek naar de structuur en functie van integrale membraaneiwitten is een uitdaging geweest vanwege de complexiteit van het plasmamembraan en de vele factoren die het eiwitgedrag in levende cellen beïnvloeden. Giant unilamellar blaasjes (GUVs) zijn een biomimetisch en zeer afstembaar in vitro modelsysteem voor het onderzoeken van eiwit-membraaninteracties en het onderzoeken van eiwitgedrag op een precieze, stimulusafhankelijke manier. In dit protocol presenteren we een goedkope en effectieve methode voor het fabriceren van GUVs met de menselijke serotonine 1A-receptor (5-HT1AR) stabiel geïntegreerd in het membraan. We fabriceren GUVs met behulp van een gemodificeerde hydrogel-zwellingsmethode; door een lipidefilm af te zetten bovenop een mengsel van agarose en 5-HT1AR en vervolgens het hele systeem te hydrateren, kunnen blaasjes worden gevormd met goed georiënteerde en functionele 5-HT1AR opgenomen in het membraan. Deze GUVs kunnen vervolgens worden gebruikt om eiwit-membraaninteracties en lokalisatiegedrag via microscopie te onderzoeken. Uiteindelijk kan dit protocol ons begrip van de functionaliteit van integrale membraaneiwitten bevorderen, wat diepgaande fysiologische inzichten oplevert.

Introduction

Synthetische modelmembranen zijn krachtige hulpmiddelen bij het onderzoeken van de fundamentele eigenschappen en functies van biomembranen. Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) zijn een van de meest prominente platforms om een verscheidenheid aan plasmamembraaneigenschappen te bestuderen en kunnen worden ontworpen om verschillende fysiologische omstandigheden na te bootsen1,2,3,4,5,6,7,8. Het is algemeen bekend dat het plasmamembraan en zijn organisatie een sleutelrol spelen in een groot aantal cellulaire processen, zoals signaaltransductie, adhesie, endocytose en transport9,10,11,12,13,14,15.

GUV's zijn vervaardigd met behulp van verschillende methoden, waaronder zachte hydratatie16, hydrogel zwelling17, elektroformatie18, microfluïdische technieken19,20,21,22, jetting23 en oplosmiddeluitwisseling24,25,26. Vanwege uitdagingen bij het omgaan met integrale membraaneiwitten (GMP's), zijn in vitro platforms om ze te bestuderen beperkt. GUV's bieden een vereenvoudigd platform voor het bestuderen van GMP's in een omgeving die hun oorspronkelijke omgeving nabootst. Hoewel er verschillende benaderingen zijn geweest voor eiwitreconstitutie in GUV's, ontstaan er uitdagingen door het opnemen van eiwitten met de juiste oriëntatie en het behoud van eiwitfunctionaliteit27.

De meest succesvolle eiwitreconstitutie in GUV's vereist de detergentenuitwisselingsmethode; waarbij de eiwitten uit hun oorspronkelijke omgeving worden opgelost door detergentia, gevolgd door eiwitzuivering en vervolgens de wasmiddelmoleculen via verschillende methoden worden vervangen door lipiden28. Terwijl detergentia dienen om de tertiaire structuur van GMP's tijdens de zuivering te stabiliseren, zijn wasmiddelmicellen een relatief onnatuurlijke omgeving voor deze eiwitten, die beter gestabiliseerd zijn, met name voor functionele studies, in lipide bilayers28,29,30. Bovendien was het opnemen van functionele transmembraaneiwitten in de lipide bilayer met behulp van traditionele GUV-fabricagetechnieken moeilijk vanwege de grootte, de delicatesse van deze eiwitten en de extra reinigingsmiddeluitwisselingsstappen die nodig zouden zijn27,31,32,33. Het gebruik van organisch oplosmiddel om reinigingsmiddelen te verwijderen veroorzaakt eiwitaggregatie en denaturering34. Een verbeterde detergent-gemedieerde methode is veelbelovend, maar voorzichtigheid is geboden voor de reinigingsmiddelverwijderingsstap en optimalisatie kan nodig zijn voor specifieke eiwitten31,35. Bovendien kunnen methoden die elektroformatie gebruiken de keuze van eiwitten beperken en mogelijk niet geschikt zijn voor alle lipidesamenstellingen, met name geladen lipiden31,36,37. Een andere techniek die is gebruikt, is peptide-geïnduceerde fusie van grote unilamellaire blaasjes (LUVs) die het gewenste eiwit met GUVs bevatten, hoewel het bewerkelijk bleek te zijn en kan leiden tot het inbrengen van vreemde moleculen - de fusogene peptiden33,38,39. Gigantische plasmamembraanblaasjes (GPMV's), die zijn afgeleid van levende cellen, kunnen worden gebruikt om sommige van deze problemen te overwinnen, maar ze maken minimale controle mogelijk over de resulterende lipide- en eiwitsamenstelling14,40,41. Daarom biedt de integratie van GMP's in de bilipide laag van GUVs met behulp van onze gemodificeerde agarose-zwellingsmethode een betrouwbare methode om deze eiwitten in de membraanomgeving verder te onderzoeken42,43,44,45.

Cellulaire signalering en communicatie omvat een familie van eiwitten die bekend staat als G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's); GPCR's behoren tot de grootste familie van eiwitten en worden geassocieerd met het moduleren van stemming, eetlust, bloeddruk, cardiovasculaire functie, ademhaling en slaap onder vele andere fysiologische functies46. In deze studie gebruikten we de menselijke serotonine 1A-receptor (5-HT1AR), een prototypisch lid van de GPCR-familie. 5-HT1AR kan worden gevonden in het centrale zenuwstelsel (CZS) en bloedvaten; het beïnvloedt tal van functies zoals cardiovasculaire, gastro-intestinale, endocriene functies, evenals deelname aan de regulatie van mood47. Een grote barrière voor GPCR-onderzoek komt voort uit hun complexe amfifiele structuur en GUVs bieden een veelbelovend platform voor het onderzoek naar verschillende interessante eigenschappen, variërend van eiwitfunctionaliteit, lipide-eiwitinteracties en eiwit-eiwitinteracties. Verschillende benaderingen zijn gebruikt om lipide-eiwitinteracties te bestuderen, zoals oppervlakteplasmonresonantie (SPR)48,49, nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (NMR)50,51, eiwitlipidenoverlay (PLO) assay51,52,53,54, inheemse massaspectrometrie55, isotherme titratiecalorimetrie (ITC)56,57 en liposoom sedimentatietest58,59. Ons laboratorium heeft de vereenvoudigde GUV-benadering gebruikt om het effect van lipide-eiwitinteracties op de eiwitfunctionaliteit te onderzoeken door BODIPY-GTPγS in te kapselen, dat bindt met de Giα-subeenheid in de actieve toestand van de receptor. Hun binding maakt de fluorofoor los en produceert een fluorescentiesignaal dat in de loop van de tijd kan worden gedetecteerd45. Bovendien onderzochten verschillende studies lipide-eiwitinteracties en de rol van eiwitten bij het detecteren of stabiliseren van membraankromming60,61, en het gebruik van een haalbare GUV-aanpak zou een belangrijk voordeel kunnen zijn.

Dit protocol demonstreert een eenvoudige methode om GPCR's op te nemen in het membraan van GUVs met behulp van een gemodificeerd agarose hydrogel-systeem17,42. Bovendien zou onze methode, op basis van ons eerdere werk, geschikt kunnen zijn voor GMP's die kortdurende blootstelling aan 30-40 °C kunnen verdragen. Kortom, we verspreiden een dunne film van agarose in combinatie met membraanfragmenten die de GPCR van belang bevatten. Na het doseren van deze laag zetten we een lipideoplossing af bovenop de agarose en laten we het oplosmiddel verdampen. Rehydratatie van het systeem werd vervolgens uitgevoerd met een waterige buffer, wat resulteerde in de vorming van GUVs met eiwit opgenomen in de lipide bilayer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eiwitetikettering

  1. Laat NHS-Rhodamine, 5-HT1A membraanfragmenten en één 7 K MWCO spin ontzoutingskolom bij kamertemperatuur in evenwicht brengen.
  2. Los 1 mg NHS-rhodamine op in 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO).
  3. Voeg 5 μL natriumbicarbonaatoplossing van 1 M toe om de pH van de 5-HT1AR-oplossing te verhogen tot pH 8.
  4. Voeg 3,66 μL van de NHS-rhodamine-oplossing toe aan 50 μL van de 5-HT1AR-oplossing en pipetteer voorzichtig op en neer in een microcentrifugebuis.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u ten minste 10x molaire overmaat nhs-rhodamine heeft.
  5. Houd het mengsel beschermd tegen licht en zet de rotator gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
  6. Was een 7 k MWCO-centrifuge met 200 μL 1x fosfaatbufferzoutoplossing (1x PBS) driemaal gedurende 1,5 minuut bij 1,5 RCF voor elke wasbeurt.
  7. Voeg het gelabelde eiwit toe aan één kolom en balanceer de hoeveelheid in een andere microcentrifugebuis.
  8. Draai het gelabelde eiwit eenmaal gedurende 5 minuten bij 1,5 RCF.
  9. Neem een UV-vis spectrum met behulp van een nanodruppel spectrofotometer op 280 nm en 554 nm en bereken de etiketteringsefficiëntie volgens de handleiding van de fabrikant.
  10. Bewaar het gelabelde eiwit bedekt bij 5 °C tot verder gebruik. De oplossing is stabiel gedurende ongeveer een week na etikettering.

2. GUVs met membraan-ingebouwde 5-HT 1A

  1. Bereiding van materialen en reagentia
    1. Laat het eiwit, de lipiden en BSA (Bovine serum albumine) in evenwicht brengen tot kamertemperatuur.
    2. Reinig gedurende deze tijd de coverslips door ze in methanol te plaatsen en gedurende 30 minuten bij 40 °C te soniceren. Zorg ervoor dat de methanol de dekvloeren volledig bedekt en dat het waterniveau in het waterbad boven het niveau van de methanol in de container ligt.
      OPMERKING: Methanol is giftig en moet worden gehanteerd in de juiste chemische kap.
    3. Droog de overtollige methanol op de deklips af met een zachte luchtstroom. Plaats het dekrek gedurende 15 minuten afgedekt in een oven van 40 °C om ervoor te zorgen dat de overtollige afdekplaten uitdrogen.
    4. Begin met het plasmareinigingsproces. Plaats eerst de afdekplaten in de plasmareiniger en sluit de luchtinlaatklep af om alle lucht in de kamer te evacueren.
    5. Zodra de kamer onder vacuüm is, reinigt u de afdekplaten gedurende 5 minuten met behulp van een hoge RF-vermogensinstelling en een bijna volledige stofzuiger, met slechts een lichte luchtinlaat in de vacuümkamer. Om het juiste plasmaniveau te garanderen, past u de opening van de vacuümkamer zodanig aan dat de resulterende kleur van het plasma een stabiel, helder roze is.
      OPMERKING: Het is cruciaal bij het gebruik van lucht dat het plasma een felroze kleur blijft voor de duur van de plasmabehandelingsstap, omdat een donkerdere paarse kleur aangeeft dat er een onjuiste hoeveelheid lucht in de kamer is en zal resulteren in een suboptimale plasmabehandeling.
    6. Zodra de 5 minuten zijn verstreken, schakelt u de RF-voeding uit en laat u het vacuüm los.
      OPMERKING: Zorg er bij verwijdering uit de plasmakamer voor dat de dekplaten bedekt blijven.
  2. Hydrogel voorbereiding
    1. Combineer 6 mg agarose bij ultralage smelttemperatuur met 300 μL ultrapuur water (d.w.z. 2% (w/v) agarose).
      OPMERKING: 2% agarose zal worden gebruikt om eiwitvrije GUVs te maken. Agarose-oplossing kan gedurende twee dagen bij 45 °C worden bewaard.
    2. Combineer 9 mg agarose bij ultralage temperatuur met 300 μL ultrapuur water voor 3 w/v% agarose zoals bereid in stap 3.1. 3% agarose zal worden gebruikt om eiwit opgenomen GUVs te maken.
    3. Vortex de oplossing kort voordat u ze gedurende 10 minuten op het warmteblok van 90 °C legt. Draai vervolgens de buis opnieuw voordat u deze overbrengt naar een warmteblok van 45 °C om deze in de gesmolten vorm te houden tot verder gebruik.
  3. Agarose en eiwitmenging
    1. Meng 21 μL van 3% agarose met de 7 μL 5-HT1AR membraanfragmenten. Pipetteer vele malen langzaam op en neer om voldoende menging te garanderen. Incubeer vervolgens bij 45 °C gedurende 1 min.
  4. Hydrogel en lipide depositie
    1. Voor eiwitvrije GUVs: Maak een dunne film op vers plasma gereinigde coverslips met 20 μL van 2% agarose. Laat snel nog een coverslip op de agarosedruppel vallen en schuif de coverslips voorzichtig uit elkaar om een dunne film op beide coverslips te maken.
      OPMERKING: Deze stap is lastig omdat het glijden van de druppel moet plaatsvinden terwijl de agarose nog in de gesmolten vorm is.
    2. Voor eiwit-opgenomen GUVs: Pipetteer het eiwit/agarose mengsel nog één keer op en neer en zet vervolgens 20 μL van de 2% agarose af op een plasma-gereinigde coverslip. Volg de aanwijzingen voor het uitglijden zoals hierboven beschreven.
    3. Laat de agarose 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
    4. Zet de lipiden druppelsgewijs af op de agaroselaag. Gebruik in totaal 10 μL van 2 mg/ml 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC) met 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (DPPE) gelabeld met ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (of lipidemengsel van belang) in chloroform bovenop de agarosefilm. Zet de druppels af met een gaschromatografienaald en verspreid één druppel per keer via een zachte luchtstroom.
      OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij deze stap om een relatief uniforme laag lipiden bovenop de hydrogel te maken. Chloroform is ook giftig en moet worden behandeld in de juiste chemische kap.
    5. Monteer de Sykes-Moore (S-M) kamers door een O-ring op de afdekplaat te plaatsen en vervolgens het bovenste onderdeel van de kamer bovenop de O-ring te plaatsen. Gebruik de sleutel van de fabrikant om de kamer te monteren door de kamercomponenten aan elkaar te schroeven om de kamer af te dichten en lekkage te voorkomen.
      OPMERKING: De bovenkant van de kamer moet op de O-ring worden aangedraaid, maar voorzichtigheid is geboden om ervoor te zorgen dat de afdekplaat intact blijft, omdat de afdekplaat kan barsten als de O-ring niet goed in de kamer zit. Zorg er ook voor dat de kamer goed genoeg is afgedicht, zodat de kamer niet lekt wanneer de zwellingsoplossing wordt toegevoegd. Als u de kamer niet voldoende aanspant, zal dit leiden tot lekken en verlies van monster.
  5. Zwelling en oogsten van blaasjes
    1. Hydrateer het hele systeem door voorzichtig 450 μL sucrose van 200 mM in 1x PBS te pipetteren en voorzichtig op de kamers te tikken om een adequate bufferdekking van de hydrogel-lipidelagen te garanderen.
      OPMERKING: De sucrose-oplossing kan worden vervangen door een rehydratatiebuffer met biologische sondes van belang.
    2. Plaats de kamers op 45 °C en bedek het bovenste deel van de kamer met een afdekplaat om verdamping te voorkomen. Laat het monster gedurende 1 uur opzwellen, beschermd tegen vuil en licht.
    3. Voeg 100 μL van 1 mg/ml BSA in ultrapuur water toe aan elke put van een 96-putplaat die bestemd is om te worden gebruikt. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    4. Drie keer wassen met ultrazuiver water en één keer met 200 mM sucrose in 1x PBS.
    5. Voeg ten slotte 200 mM glucose toe in 1x PBS tot de toevoeging van de GUV-monsteroplossing.
      OPMERKING: BSA werd gebruikt om GUV-adsorptie te blokkeren.
    6. Nadat u de hydrogel hebt laten opzwellen, schudt en tikt u voorzichtig op de kamer om eventuele GUVs los te maken die mogelijk aan het hydrogeloppervlak zijn bevestigd. Pipetteer vervolgens voorzichtig de GUV-sucrose-oplossing.
      OPMERKING: Als een optionele stap om ervoor te zorgen dat alle blaasjes van het oppervlak worden losgemaakt, pipetteer voorzichtig een deel van de sucrose-suspensie terug op het hydrogeloppervlak.
    7. Verplaats de suspensie in een eerder voorbereide microcentrifugebuis met 700 μL 200 mM glucose in 1x PBS.
      OPMERKING: De dichtheidsgradiënt zal leiden tot bezinking van de blaasjes naar de bodem van de centrifugebuis.
    8. Laat de blaasjes nog een uur bezinken om ervoor te zorgen dat de blaasjes naar de bodem van de microcentrifugebuis kunnen zinken, waardoor een optimale opvang mogelijk is.
    9. Na de bezinking van GUVs in glucose, breng 300 μL van de bodem van de centrifugebuis (de bezonken blaasjes) over in de eerder bereide en met BSA behandelde 96-well plaat om de blaasjes onder de confocale microscoop te onderzoeken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de bodem van de microcentrifugebuis vermijdt om de hoeveelheid vuil die in het uiteindelijke monster wordt verzameld, te minimaliseren.
  6. Controleer de monsters onder de microscoop.
    1. Laat een 488 nm laser op het monster schijnen (waarmee we het membraan kunnen visualiseren, omdat de dubbellaag is gelabeld met ATTO-488-DPPE).
    2. Schijn een 561 nm laser op het monster (waarmee we het eiwit kunnen visualiseren, omdat het is gelabeld met NHS-Rhodamine).
      OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het afbeelden van het monster, omdat fotooxidatie de blaasjes kan destabiliseren. Blaasjes werden op dezelfde dag waargenomen.

Figure 1
Figuur 1: Illustratie van de gedetailleerde protocolstappen. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De concentratie van eiwit werd gemeten en de mate van etikettering werd berekend als de molaire verhouding tussen de kleurstof en het eiwit op 1:1. Door de GUVs te onderzoeken met behulp van confocale microscopie, konden we een succesvolle vorming en eiwitintegratie van de blaasjes bevestigen. De lipiden werden gelabeld met 0,4 mol% ATTO 488-DPPE en het eiwit werd covalent gelabeld via rhodamine NHS-estermodificatie van primaire amines. Figuur 2a en figuur 2b tonen een eiwit-geïncorporeerd blaasje in respectievelijk de ATTO 488- en rhodaminekanalen. Alle microfoto's zijn donkerstroom en vlakveld gecorrigeerd. Figuur 2c en figuur 2d tonen een negatieve controle GUV zonder eiwit opgenomen. Figuur 3a en figuur 3b tonen een eiwit opgenomen GUV met lijnintensiteitsprofielen gegeven door de onderbroken witte lijn van hetzelfde blaasje in beide kanalen. Het lijnintensiteitsprofiel toont een tweedimensionale plot van de intensiteiten van de pixels langs de wit getekende lijn in de afbeelding. De x-as is de afstand langs de lijn en de y-as is de pixelintensiteit. ImageJ-software werd gebruikt om de profielintensiteit van de aangegeven lijn te plotten.

Figure 2
Figuur 2: Micrografieën waarin eiwit-opgenomen GUVs en GUVs zonder eiwit worden vergeleken (controle). Micrografieën (a) en (b) tonen eiwit-geïncorporeerde GUV-fluorescentie met respectievelijk de respectievelijke ATTO 488- en rhodaminekanalen. Micrografieën (c) en (d) tonen een eiwit weggelaten GUV bij excitatie met respectievelijk ATTO 488 en rhodaminekanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Bovenste rij toont microfoto's van eiwit opgenomen GUVs in ATTO 488 (a) en rhodamine (b) kanalen. Lijnintensiteitsprofielen voor de aangegeven wit-stippellijnen staan hieronder. De analyse werd uitgevoerd met behulp van ImageJ-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben twee stappen geïdentificeerd die van cruciaal belang zijn voor het succes van het algemene protocol: plasmabehandeling en lipideafzetting. Plasmareiniging van de coverslips is essentieel om ervoor te zorgen dat er voldoende dekking en hechting van de agarose hydrogel op de glazen afdekplaat is. Plasmareiniging bereikt twee dingen: ten eerste verwijdert het sporen van organisch materiaal van het glasoppervlak; ten tweede activeert het het dekvloeroppervlak, waardoor de bevochtigbaarheid toeneemt naarmate de hydrofielheid van het glasoppervlak toeneemt62,63. Het aanraken van het coverslipoppervlak na plasmareiniging zal het ultraschone oppervlak inactiveren en verontreinigen en wordt ten zeerste afgeraden. Onze aanbeveling is om alleen de randen en onderkanten van de afdekplaat aan te raken bij het hanteren van de afdekplaten voor de agarose slip gietstap. De tweede kritische stap is het afzetten van lipiden op het droge hydrogeloppervlak. Deze methode maakt gebruik van een druppelsgewijze lipideafzetting, waarvoor een gaschromatografie (GC) naald en een luchtstroom nodig zijn om een paar microliter lipide-oplossing per keer af te zetten, waardoor een nauwkeurige controle mogelijk is van de hoeveelheid toegevoegde lipide en de plaatsing van de lipidefilm op het hydrogeloppervlak. Het nadeel van deze methode is dat als het niet zorgvuldig wordt gedaan, het kan resulteren in een paar geselecteerde gebieden met een dikkere lipidefilm, wat resulteert in verminderde GUV-opbrengsten. Het is dus van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er een zo gelijkmatig dunne lipidelaag mogelijk is op het oppervlak van de agarose.

Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is de flexibiliteit van het platform zelf; deze methode leent zich zeer goed voor veranderingen in eiwit- en lipidensamenstelling, evenals inkapseling en buffermodificaties. Dit protocol kan in principe elk transmembraaneiwit omvatten, omdat we met succes een aantal verschillende transmembraaneiwitten hebben kunnen opnemen, variërend van de adenosinereceptor (A2AR) tot plantaardige aquaporinen zonder in te boeten aan functionaliteit42,45,64. Traditioneel zijn eiwitten opgenomen in GUVs na oplosbaarheid door detergentia of opname in proteo-liposomen of kleine unilamellaire blaasjes die vervolgens kunnen worden geïntegreerd in een voorgevormde GUV65. Het voordeel van onze gemodificeerde hydrogel-zwellingsmethode is dat het de afhankelijkheid van reinigingsmiddelen of tussenblaasjes wegneemt en een tussenliggende gehydrateerde steiger biedt. De voordelen hiervan zijn tweeledig: we kunnen functionele GPCR's stabiel in het membraan opnemen in een meer fysiologisch relevante buffer zonder te vertrouwen op reinigingsmiddeluitwisselingsmethoden die meer voorbereiding en zorg vereisen met betrekking tot de concentratie van de genoemde detergentia, en dat het proces waarmee GUVs van het oppervlak van de hydrogel afkomen, zorgt voor de juiste oriëntatie van de eiwitten in de dubbellaag66 . We hebben aangetoond dat het GUV-ontluikende proces de samensmelting van vele kleinere blaasjes op nanometerschaal in grotere blaasjes op micronschaal omvat, wat vanaf het begin de juiste eiwitoriëntatie bevordert. Dat hebben we in ons vorige werk laten zien; kortom, we hebben covalent een antilichaam gelabeld dat zich richt op een specifieke cytosolische lus van de Adenosinereceptor en het gelabelde antilichaam geïncubeerd met het eiwit, en vervolgens het gelabelde eiwit opgenomen in lipide-kleurstof-gelabelde GUVs met behulp van de gemodificeerde hydrogel-zwellingsmethode. Vervolgens stelden we de eiwit-geïncorporeerde blaasjes bloot aan een geladen quencher, die niet in staat is om de dubbellaag te passeren. We zien vervolgens een vermindering van 50% in fluorescentie van de lipidekleurstof, maar de fluorescentie van het gelabelde eiwit blijft onaangetast door de quencher, wat een goede oriëntatie aantoont44.

Eerder werk uit ons laboratorium heeft de rol onderzocht waarin lipide headgroup charge, zwitterionische en net-ionische geladen lipiden, evenals buffer- en hydrogeleigenschappen zoals pH, ionische sterkte, osmolariteit en hydrogelconcentratie hebben op de dynamiek van GUV-vorming67. Kortom, lipidelading heeft niet grotendeels invloed op GUV-vorming, terwijl buffereigenschappen zoals verhogingen van de sucroseconcentratie (bijv. 500 mM sucrose in 185 mM ionische sterkte PBS-buffer) de GUV-vorming negatief beïnvloeden, wat resulteert in onregelmatig gevormde blaasjes die zich hoogstwaarschijnlijk niet gemakkelijk lenen voor oogsten. Zure oplossingen (pH = 3) verhogen de snelheid van vorming, terwijl een meer basische oplossing (pH = 8) de snelheid van GUV-vorming onderdrukt. GUV's vormen zich nog steeds bij zowel de zure als de basische buffers, met slechts marginale verschillen in blaasjesgrootte. Lage agaroseconcentraties (~ 0,1-1 w / v%) hebben ook een negatieve invloed op guv-vorming als gevolg van een gebrek aan homogene oppervlaktedekking en een afname van hydrogelzwelling, een noodzakelijke kracht in de coalescentie en ontluiking van GUVs van het hydrogeloppervlak. Zo hebben we vastgesteld dat een uiteindelijke agaroseconcentratie van 2 w/ v% met een sucrose/glucose-oplossing van 100-200 mM, gecombineerd met een buffer ionische sterkte van 185 mM PBS bij pH 7,4, een goede balans van agarose zwelling, GUV-vormingssnelheid en daaropvolgende blaasjesgrootte bereikt. Voor blaasjes die eiwit bevatten, zorgt het verhogen van de initiële agaroseconcentratie tot 3 w / v% voor een uiteindelijke agaroseconcentratie van 2 w / v% na de toevoeging van de eiwitoplossing. Naast de formatiedynamiek vergemakkelijkt het sucrose/glucosebuffersysteem ook de sedimentatie en daaropvolgende verzameling van gevormde GUVs, evenals visualisatie onder fasecontrastmicroscopie65,68.

Er zijn enkele aandachtspunten met betrekking tot dit protocol, met name met betrekking tot de agarose en de selectie van blaasjes. Terwijl we bijvoorbeeld een ultralage smelttemperatuur agarose gebruiken, moet de agarose-watersuspensie ten minste 60 °C bereiken om gesmolten te worden en wordt het agarose-eiwitmengsel geïncubeerd bij 45 °C.  In onze ervaring elimineert deze temperatuur de activiteit van 5-HT1AR niet, maar voorzichtigheid is geboden voor andere eiwitten. Over het algemeen begint de agarose die we gebruiken te gelen bij 20 °C en dus kan de zwellingsreactie plaatsvinden bij temperaturen boven 20 °C, maar dit proces kan niet functioneren onder die temperatuur. Er moet ook worden opgemerkt dat hoe dichter de temperatuur bij 20 °C komt, hoe minder efficiënt de zwellingsstap wordt, wat leidt tot daaropvolgende dalingen van de GUV-opbrengsten. De agarose kan ook een probleem vormen tijdens de bezinkings- en visualisatiestappen, omdat het op de bodem van de bezinkings- / verzamelbuis als puin kan blijven bestaan. Voorzichtigheid is dus geboden voor de temperatuur die nodig is om de gesmolten agarose te behouden en ervoor te zorgen dat de genoemde temperatuur het eiwit van belang niet zal denatureren, evenals het aanzuigen van de bezinkoplossing om te voorkomen dat overtollige gesuspendeerde agarose in het uiteindelijke monster wordt opgenomen. Deze methode in zijn huidige staat resulteert ook in een heterogene GUV-populatiegrootte, waarbij sommige blaasjes multilamellariteit vertonen en andere gebrekkige blaasjesverschijnselen zoals blaasjes in blaasjes. Dit is typerend voor gangbare GUV-vormingsmethoden en vereist waakzaamheid en discretie bij het selecteren van blaasjes voor microscopie en analyse. GUV's die ongewoon hoge niveaus van fluorescentie vertonen, worden ook niet aanbevolen voor analyse, omdat agarose te vinden is aan de binnenkant van sommige van deze blaasjes. Ongepubliceerd werk uit ons laboratorium is in staat geweest om micropipette-aspiratie-experimenten uit te voeren met behulp van blaasjes gemaakt met behulp van deze techniek, wat illustreert dat de agarose-methode blaasjes produceert zonder mechanica-veranderende agarose in het lumen.

Afgezien van beperkingen, presenteert dit protocol een robuuste en eenvoudige methode voor het genereren van eiwit opgenomen GUVs. Het kan hoge opbrengsten van GUVs genereren in fysiologisch relevante omstandigheden die goed georiënteerde transmembraaneiwitten in de dubbellaag opnemen zonder hun functionaliteit in gevaar te brengen. Dit is een afwijking van andere methoden van vesikelvorming, waarbij elektrische stromen of zachte hydratatie betrokken zijn, die de structuur van het eiwit aanzienlijk zouden beschadigen en het niet-functioneel zouden maken of verdere reinigingsmiddeloplos- en verwijderingsstappen vereisen. Gezien het feit dat GPCR's meer dan een derde van alle farmaceutische doelen vertegenwoordigen, is er veel interesse in het kunnen bestuderen van deze familie van eiwitten in een zeer afstembaar, high-throughput, biomimetisch platform. Meer specifiek variëren de toepassingen van dit werk van de studie van eiwit-lipide interacties, hoe de lipide micro-omgeving de eiwitfunctionaliteit en lokalisatie beïnvloedt, en andere fundamentele biofysische vragen die de ontwikkeling en ontdekking van farmaceutische geneesmiddelen kunnen informeren. Een voorbeeld hiervan is te vinden in het werk dat in ons laboratorium is voltooid, dat in staat is geweest om variaties in receptorfunctionaliteit te onderscheiden als gevolg van lipide-oxidatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Matthew Blosser voor de waardevolle discussie en het advies. Dit werk werd ondersteund door het Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) en de National Science Foundation (PHY-1915017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Tags

Bio-engineering Nummer 180
Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter