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Bioengineering

Construcción de membranas lipídicas modelo que incorporan receptores acoplados a proteínas G (GPCR)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo utiliza la hinchazón de agarosa como una técnica poderosa y generalizable para incorporar proteínas de membrana integral (IMP) en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUV), como se describe aquí para la reconstitución de la proteína receptora de serotonina 1A humana (5-HT1AR), una de las clases de receptores acoplados a proteínas G farmacológicamente importantes.

Abstract

Las investigaciones robustas in vitro de la estructura y función de las proteínas de membrana integral han sido un desafío debido a las complejidades de la membrana plasmática y los numerosos factores que influyen en el comportamiento de las proteínas en las células vivas. Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) son un sistema modelo in vitro biomimético y altamente sintonizable para investigar las interacciones proteína-membrana y sondear el comportamiento de las proteínas de una manera precisa y dependiente del estímulo. En este protocolo, presentamos un método económico y eficaz para fabricar GUVs con el receptor humano de serotonina 1A (5-HT1AR) integrado de forma estable en la membrana. Fabricamos GUV utilizando un método de hinchazón de hidrogel modificado; al depositar una película lipídica sobre una mezcla de agarosa y 5-HT1AR y luego hidratar todo el sistema, se pueden formar vesículas con 5-HT1AR adecuadamente orientado y funcional incorporado a la membrana. Estos GUV se pueden usar para examinar las interacciones proteína-membrana y el comportamiento de localización a través de microscopía. En última instancia, este protocolo puede avanzar en nuestra comprensión de la funcionalidad de las proteínas de membrana integral, proporcionando una visión fisiológica profunda.

Introduction

Las membranas modelo sintéticas son herramientas poderosas en la investigación de las propiedades y funciones fundamentales de las biomembranas. Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) son una de las plataformas más prominentes para estudiar una variedad de propiedades de la membrana plasmática y pueden diseñarse para imitar diferentes condiciones fisiológicas1,2,3,4,5,6,7,8. Está bien establecido que la membrana plasmática y su organización juegan un papel clave en multitud de procesos celulares, como la transducción de señales, la adhesión, la endocitosis y el transporte9,10,11,12,13,14,15.

Los GUV se han fabricado utilizando diversos métodos, incluyendo hidratación suave16, hinchazón de hidrogel17, electroformación18, técnicas microfluídicas19,20,21,22, chorro23 e intercambio de disolventes24,25,26. Debido a los desafíos en el manejo de proteínas integrales de membrana (IMP), las plataformas in vitro para estudiarlas han sido limitadas. Los GUV presentan una plataforma simplificada para estudiar IMP en un entorno que imita su entorno nativo. Aunque han existido varios enfoques para la reconstitución de proteínas en los GUV, surgen desafíos al incorporar proteínas con la orientación correcta y mantener la funcionalidad de las proteínas27.

La reconstitución de proteínas más exitosa en los GUV requiere el método de intercambio de detergente; lo que implica la solubilización de las proteínas de su entorno nativo mediante detergentes, seguido de la purificación de proteínas, y luego la sustitución de las moléculas de detergente por lípidos a través de diversos métodos28. Mientras que los detergentes sirven para estabilizar la estructura terciaria de los IMP durante la purificación, las micelas detergentes son un ambiente relativamente antinatural para estas proteínas, que se estabilizan mejor, particularmente para estudios funcionales, en bicapas lipídicas28,29,30. Además, la incorporación de proteínas transmembrana funcionales en la bicapa lipídica utilizando técnicas tradicionales de fabricación de GUV ha sido difícil debido al tamaño, la delicadeza de estas proteínas y los pasos adicionales de intercambio de detergente que se necesitarían27,31,32,33. El uso de disolvente orgánico para eliminar detergentes provoca la agregación y desnaturalización de proteínas34. Un método mejorado mediado por detergente ha sido prometedor, sin embargo, se necesita precaución para el paso de eliminación de detergente y la optimización podría ser necesaria para proteínas específicas31,35. Además, los métodos que utilizan electroformación podrían restringir la elección de la proteína y pueden no ser adecuados para todas las composiciones lipídicas, especialmente los lípidos cargados31,36,37. Otra técnica que se ha utilizado es la fusión inducida por péptidos de grandes vesículas unilamelares (LUV) que contienen la proteína deseada con GUVs, aunque se encontró que es laboriosa y puede conducir a la inserción de moléculas extrañas: los péptidos fusogénicos33,38,39. Las vesículas gigantes de membrana plasmática (GPPV), que se derivan de células vivas, se pueden utilizar para superar algunos de estos problemas, sin embargo, permiten un control mínimo de la composición lipídica y proteica resultante14,40,41. Por lo tanto, la integración de IMPs en la capa bilipída de GUVs utilizando nuestro método de hinchazón de agarosa modificada presenta un método confiable para examinar más a fondo estas proteínas en el entorno de membrana42,43,44,45.

La señalización y comunicación celular involucra una familia de proteínas conocidas como receptores acoplados a proteínas G (GPCR); Los GPCR se encuentran entre la mayor familia de proteínas y se asocian con la modulación del estado de ánimo, el apetito, la presión arterial, la función cardiovascular, la respiración y el sueño, entre muchas otras funciones fisiológicas46. En este estudio, utilizamos el receptor humano de serotonina 1A (5-HT1AR) que es un miembro prototípico de la familia GPCR. 5-HT1AR se puede encontrar en el sistema nervioso central (SNC) y los vasos sanguíneos; influye en numerosas funciones como las cardiovasculares, gastrointestinales, endocrinas, además de participar en la regulación del estado de ánimo47. Una gran barrera para la investigación de GPCR surge de su compleja estructura anfifílica, y los GUV presentan una plataforma prometedora para la investigación de diversas propiedades de interés, que van desde la funcionalidad de la proteína, las interacciones lípido-proteína y las interacciones proteína-proteína. Se han utilizado diversos enfoques para estudiar las interacciones lípido-proteína como la resonancia de plasmón de superficie (SPR)48,49, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)50,51, el ensayo de superposición de lípidos proteicos (PLO)51,52,53,54, la espectrometría de masas nativa55, la calorimetría de titulación isotérmica (ITC)56,57 y el liposoma ensayo de sedimentación58,59. Nuestro laboratorio ha utilizado el enfoque SIMPLIFICADO de GUV para investigar el efecto de las interacciones lípido-proteína en la funcionalidad de la proteína mediante la incapsulación de BODIPY-GTPγS, que se une con la subunidad Giα en el estado activo del receptor. Su unión desengancha el fluoróforo produciendo una señal de fluorescencia que podría detectarse con el tiempo45. Además, varios estudios investigaron las interacciones lípido-proteína y el papel de las proteínas en la detección o estabilización de la curvatura de la membrana60,61, y la utilización de un enfoque FACTIBLE de GUV podría ser una ventaja clave.

Este protocolo demuestra un método sencillo para incorporar GPCR en la membrana de los GUV utilizando un sistema de hidrogel de agarosa modificado17,42. Además, sobre la base de nuestro trabajo anterior, nuestro método podría ser adecuado para imprentas que pueden soportar una exposición a corto plazo a 30-40 °C. Brevemente, extendemos una fina película de agarosa combinada con fragmentos de membrana que contienen el GPCR de interés. Después de la gelificación de esta capa, depositamos una solución lipídica sobre la agarosa y permitimos que el disolvente se evapore. La rehidratación del sistema se realizó entonces con un tampón acuoso, dando como resultado la formación de GUVs con proteína incorporada en la bicapa lipídica.

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Protocol

1. Etiquetado de proteínas

  1. Permita que NHS-Rhodamine, fragmentos de membrana 5-HT1A y una columna de desalinización de espín de 7 K MWCO se equilibren a temperatura ambiente.
  2. Disolver 1 mg de NHS-rhodamine en 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO).
  3. Agregue 5 μL de solución de bicarbonato de sodio 1 M para aumentar el pH de la solución de 5-HT1AR a pH 8.
  4. Añadir 3,66 μL de la solución de NHS-rodamina a 50 μL de la solución de 5-HT1AR y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo en un tubo de microcentrífuga.
    NOTA: Asegúrese de tener al menos 10 veces más de molar en exceso de NHS-rhodamine.
  5. Mantenga la mezcla protegida de la luz y coloque el rotador a temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Lave una columna de centrifugado MWCO de 7 k con 200 μL de solución salina tampón de fosfato 1x (1x PBS) tres veces durante 1,5 min a 1,5 RCF por cada lavado.
  7. Agregue la proteína marcada a una columna y equilibre la cantidad en otro tubo de microcentrífuga.
  8. Gire hacia abajo la proteína marcada una vez durante 5 minutos a 1.5 RCF.
  9. Tome un espectro UV-vis utilizando un espectrofotómetro de nanodrop a 280 nm y 554 nm y calcule la eficiencia de etiquetado siguiendo el manual del fabricante.
  10. Guarde la proteína marcada cubierta a 5 °C hasta su uso posterior. La solución es estable durante aproximadamente una semana después del etiquetado.

2. GUVs con 5-HT 1A incorporado por membrana

  1. Preparación de materiales y reactivos
    1. Permita que la proteína, los lípidos y la BSA (albúmina sérica bovina) se equilibren a temperatura ambiente.
    2. Durante este tiempo, limpie las fundas colocándolas en metanol y sonicando durante 30 min a 40 °C. Asegúrese de que el metanol cubra completamente los cubrehojas y que el nivel de agua en el baño de agua esté por encima del nivel del metanol en el recipiente.
      NOTA: El metanol es tóxico y debe manipularse en la campana química adecuada.
    3. Seque el exceso de metanol en las cubiertas con una suave corriente de aire. Coloque la rejilla de la cubierta cubierta en un horno de 40 °C durante 15 minutos para asegurarse de que el exceso de fundas se seque.
    4. Comience el proceso de limpieza por plasma. Primero, coloque las cubiertas en el limpiador de plasma y cierre la válvula de admisión de aire para evacuar todo el aire dentro de la cámara.
    5. Una vez que la cámara esté bajo vacío, limpie las cubiertas durante 5 minutos con un ajuste de alta potencia de RF y un vacío casi completo, con solo una ligera entrada de aire en la cámara de vacío. Para garantizar el nivel adecuado de plasma, ajuste la abertura de la cámara de vacío de modo que el color resultante del plasma sea un rosa constante y brillante.
      NOTA: Es crucial cuando se usa aire que el plasma permanezca de un color rosa brillante durante la duración del paso del tratamiento con plasma, ya que un color púrpura más oscuro indica que hay una cantidad inadecuada de aire en la cámara y dará como resultado un tratamiento de plasma subóptimo.
    6. Una vez transcurridos los 5 min, apaga la potencia de RF y suelta el vacío.
      NOTA: Al retirarla de la cámara de plasma, asegúrese de que las cubiertas permanezcan cubiertas.
  2. Preparación de hidrogel
    1. Combine 6 mg de agarosa a temperatura de fusión ultra baja con 300 μL de agua ultrapura (es decir, 2% (p/v) de agarosa).
      NOTA: Se utilizará agarosa al 2% para hacer GUV sin proteínas. La solución de agarosa se puede mantener a 45 °C durante dos días.
    2. Combine 9 mg de agarosa a temperatura ultrabaja con 300 μL de agua ultrapura para 3 p/v% de agarosa según lo preparado en la etapa 3.1. Se utilizará agarosa al 3% para hacer GUV incorporados en proteínas.
    3. Vórtice la solución brevemente antes de colocarlos en el bloque de calor de 90 °C durante 10 min. Luego, vórtice el tubo nuevamente antes de transferirlo a un bloque de calor de 45 ° C para mantenerlo en forma fundida hasta su uso posterior.
  3. Mezcla de agarosa y proteínas
    1. Mezclar 21 μL de agarosa al 3% con los 7 μL de fragmentos de membrana 5-HT1AR. Pipete hacia arriba y hacia abajo lentamente muchas veces para garantizar una mezcla adecuada. Luego, incubar a 45 °C durante 1 min.
  4. Hidrogel y deposición de lípidos
    1. Para GUV sin proteínas: Haga una película delgada en fundas recién limpiadas con plasma usando 20 μL de agarosa al 2%. Deje caer rápidamente otra funda en la parte superior de la gota de agarosa y deslice suavemente las hojas de cubierta para hacer una película delgada en ambas hojas.
      NOTA: Este paso es complicado ya que el deslizamiento de la gota debe ocurrir mientras la agarosa todavía está en forma fundida.
    2. Para guV incorporados a proteínas: Pipetee la mezcla de proteína / agarosa hacia arriba y hacia abajo una vez más, y luego deposite 20 μL de la agarosa al 2% en un cubrehojas limpiado con plasma. Siga las instrucciones de fundición deslizante como se describió anteriormente.
    3. Deje que la agarosa se gelifique protegida de la luz durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    4. Deposite los lípidos gota a gota en la parte superior de la capa de agarosa. Utilice un total de 10 μL de 2 mg/ml de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) con 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE) marcado con ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (o mezcla lipídica de interés) en cloroformo en la parte superior de la película de agarosa. Deposite las gotas con una aguja de cromatografía de gases y extienda una gota a la vez a través de una corriente de aire suave.
      NOTA: Se necesita precaución con este paso para hacer una capa relativamente uniforme de lípidos en la parte superior del hidrogel. Además, el cloroformo es tóxico y debe manipularse en una campana química adecuada.
    5. Ensamble las cámaras Sykes-Moore (S-M) colocando una junta tórica en la parte superior de la cubierta y, a continuación, colocando el componente superior de la cámara en la parte superior de la junta tórica. Utilice la llave proporcionada por el fabricante para ensamblar la cámara atornillando los componentes de la cámara para sellar la cámara y evitar cualquier fuga.
      NOTA: La parte superior de la cámara debe apretarse en la junta tórica, pero se debe tener precaución para garantizar que la cubierta permanezca intacta, ya que la cubierta puede agrietarse si la junta tórica no se asienta correctamente en la cámara. Además, asegúrese de que la cámara esté sellada lo suficientemente hermética como para que la cámara no tenga fugas cuando se agrega la solución de hinchazón. Si no se aprieta lo suficiente la cámara, se producirán fugas y pérdida de muestra.
  5. Hinchazón y cosecha de vesículas
    1. Hidrate todo el sistema canalizando suavemente 450 μL de sacarosa de 200 mM en 1x PBS y golpeando suavemente las cámaras para garantizar una cobertura tampón adecuada de las capas de hidrogel-lípido.
      NOTA: La solución de sacarosa se puede reemplazar con un tampón de rehidratación que contiene sondas biológicas de interés.
    2. Coloque las cámaras a 45 °C y cubra la parte superior de la cámara con una funda para evitar la evaporación. Deje que la muestra se hinche, protegida de escombros y luz durante 1 h.
    3. Agregue 100 μL de 1 mg/ml de BSA en agua ultrapura en cada pozo de una placa de 96 pocillos destinada a ser utilizada. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Lavar tres veces con agua ultrapura y una vez con sacarosa de 200 mM en 1x PBS.
    5. Finalmente, agregue 200 mM de glucosa en 1x PBS hasta la adición de la solución de muestra de GUV.
      NOTA: BSA se utilizó para bloquear la adsorción de GUV.
    6. Después de permitir que el hidrogel se hinche, agite suavemente y golpee la cámara para desalojar cualquier GUV que pueda permanecer adherido a la superficie del hidrogel. Luego, pipetee cuidadosamente la solución de sacarosa GUV.
      NOTA: Como paso opcional para garantizar que todas las vesículas estén separadas de la superficie, pipetee suavemente parte de la suspensión de sacarosa sobre la superficie del hidrogel.
    7. Mueva la suspensión a un tubo de microcentrífuga previamente preparado que contenga 700 μL de glucosa de 200 mM en 1x PBS.
      NOTA: El gradiente de densidad conducirá a la sedimentación de las vesículas en la parte inferior del tubo de la centrífuga.
    8. Deje que las vesículas se asienten durante otra hora para asegurarse de que las vesículas puedan hundirse en el fondo del tubo de la microcentrífuga, lo que permite una recolección óptima.
    9. Después de la sedimentación de los GUV en glucosa, transfiera 300 μL desde el fondo del tubo de la centrífuga (las vesículas asentadas) a la placa de 96 pocillos previamente preparada y tratada con BSA para examinar las vesículas bajo el microscopio confocal.
      NOTA: Asegúrese de evitar la parte inferior del tubo de la microcentrífuga para minimizar la cantidad de desechos recolectados en la muestra final.
  6. Revise las muestras bajo el microscopio.
    1. Hacer brillar un láser de 488 nm sobre la muestra (que nos permite visualizar la membrana, ya que la bicapa ha sido etiquetada con ATTO-488-DPPE).
    2. Hacer brillar un láser de 561 nm sobre la muestra (que nos permite visualizar la proteína, ya que ha sido etiquetada con NHS-Rhodamine).
      NOTA: Se necesita precaución al tomar imágenes de la muestra, ya que la fotooxidación puede desestabilizar las vesículas. Las vesículas fueron observadas el mismo día.

Figure 1
Figura 1: Ilustración de los pasos detallados del protocolo. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Se midió la concentración de proteína y se calculó el grado de etiquetado como la relación molar entre el colorante y la proteína para ser 1:1. Al examinar los GUV utilizando microscopía confocal, pudimos confirmar la formación exitosa y la integración de proteínas de las vesículas. Los lípidos se marcaron con 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, y la proteína se marcó covalentemente a través de la modificación del éster NHS de rodamina de las aminas primarias. La Figura 2a y la Figura 2b muestran una vesícula incorporada a proteínas en los canales ATTO 488 y rodamina, respectivamente. Todas las micrografías han sido corregidas de corriente oscura y campo plano. La Figura 2c y la Figura 2d muestran un GUV de control negativo sin proteína incorporada. La Figura 3a y la Figura 3b muestran una proteína INCORPORADA GUV con perfiles de intensidad de línea dados por la línea blanca discontinua de la misma vesícula en ambos canales. El perfil de intensidad de línea muestra una gráfica bidimensional de las intensidades de los píxeles a lo largo de la línea blanca dibujada dentro de la imagen. El eje x es la distancia a lo largo de la línea y el eje y es la intensidad de píxeles. Se utilizó el software ImageJ para trazar la intensidad del perfil de la línea indicada.

Figure 2
Figura 2: Micrografías que comparan guVs incorporados de proteínas y GUVs sin proteína (control). Las micrografías (a) y (b) muestran la fluorescencia GUV incorporada a proteínas con los respectivos canales ATTO 488 y rodamina, respectivamente. Las micrografías (c) y (d) muestran una proteína GUV omitida cuando se excita con canales ATTO 488 y rodamina, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La fila superior muestra micrografías de GUV de proteínas incorporadas en los canales ATTO 488 (a) y rodamina (b). Los perfiles de intensidad de línea para las líneas discontinuas blancas indicadas se encuentran a continuación. El análisis se realizó utilizando el software ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos identificado dos pasos que son críticos para el éxito del protocolo general: el tratamiento con plasma y la deposición de lípidos. La limpieza con plasma de las cubiertas es esencial para garantizar que haya una cobertura y adhesión adecuadas del hidrogel de agarosa a la cubierta de vidrio. La limpieza por plasma logra dos cosas: primero, elimina rastros de materia orgánica de la superficie del vidrio; en segundo lugar, activa la superficie de la cubierta, lo que permite un aumento de la humectabilidad a medida que aumenta la hidrofilicidad de la superficie de vidrio62,63. Tocar la superficie de la cubierta posterior a la limpieza por plasma inactivará y contaminará la superficie ultralimpia y se desaconseja encarecidamente. Nuestra recomendación es tocar únicamente los bordes y la parte inferior de la cubierta cuando se manipulen las cubiertas para el paso de fundición deslizante de agarosa. El segundo paso crítico es la deposición de lípidos en la superficie seca del hidrogel. Este método utiliza una deposición lipídica en gota, que requiere una aguja de cromatografía de gases (GC) y una corriente de aire para depositar unos pocos microlitros de solución lipídica a la vez, lo que permite un control preciso de la cantidad de lípidos agregados y la colocación de la película lipídica en la superficie del hidrogel. El inconveniente de este método es que si no se hace con cuidado, puede dar lugar a unas pocas áreas seleccionadas con una película lipídica más gruesa, lo que resulta en rendimientos reducidos de GUV. Por lo tanto, es fundamental asegurarse de que haya una capa lipídica lo más uniformemente delgada posible en la superficie de la agarosa.

Uno de los beneficios más significativos de este protocolo es la flexibilidad de la propia plataforma; este método se presta muy bien a los cambios en la composición de proteínas y lípidos, así como a las modificaciones de encapsulación y amortiguación. Este protocolo puede, en principio, incluir cualquier proteína transmembrana, ya que hemos sido capaces de incorporar con éxito una serie de diferentes proteínas transmembrana, que van desde el receptor de adenosina (A2AR) hasta las acuaporinas vegetales sin sacrificar la funcionalidad42,45,64. Tradicionalmente, las proteínas se han incorporado a los GUV tras la solubilización por detergentes o la incorporación en proteo-liposomas o pequeñas vesículas unilamelares que posteriormente pueden integrarse en un GUV65 preformado. La ventaja de nuestro método de hinchazón de hidrogel modificado es que elimina la dependencia de detergentes o vesículas intermedias y proporciona un andamio hidratado intermedio. Los beneficios de esto son dobles: podemos incorporar de manera estable GPCR funcionales en la membrana en un tampón fisiológicamente más relevante sin depender de métodos de intercambio de detergente que requieren más preparación y cuidado con respecto a la concentración de dichos detergentes, y que el proceso por el cual los GUV brotan de la superficie del hidrogel permite la orientación correcta de las proteínas en la bicapa66 . Hemos demostrado que el proceso de brotación de GUV implica la coalescencia de muchas vesículas más pequeñas a escala nanométrica en vesículas más grandes a escala de micras, lo que fomenta la orientación correcta de las proteínas desde el principio. Hemos demostrado que este es el caso en nuestro trabajo anterior; en resumen, etiquetamos covalentemente un anticuerpo dirigido a un asa citosólica específica del receptor de adenosina e incubamos el anticuerpo marcado con la proteína, y luego incorporamos la proteína marcada en GUV marcados con colorante lipídico utilizando el método de hinchazón de hidrogel modificado. Luego expusimos las vesículas incorporadas a proteínas a un silenciador cargado, que no puede cruzar la bicapa. Posteriormente vemos una reducción del 50% en la fluorescencia del colorante lipídico, pero la fluorescencia de la proteína marcada no se ve afectada por el quencher, demostrando una orientación adecuada44.

Trabajos previos de nuestro laboratorio han investigado el papel que la carga del grupo de cabeza lipídica, los lípidos zwitteriónicos y con carga neta iónica, así como las propiedades tampón e hidrogel como el pH, la fuerza iónica, la osmolaridad y la concentración de hidrogel tienen en la dinámica de la formación de GUV67. En resumen, la carga lipídica no afecta en gran medida la formación de GUV, mientras que las propiedades tampón, como los aumentos en la concentración de sacarosa (por ejemplo, 500 mM de sacarosa en el tampón PBS de fuerza iónica de 185 mM) afectan negativamente la formación de GUV, lo que resulta en vesículas de forma irregular que probablemente no se prestarán fácilmente a la cosecha. Las soluciones ácidas (pH = 3) aumentan la tasa de formación, mientras que una solución más básica (pH = 8) suprime la tasa de formación de GUV. Los GUV todavía se forman tanto en los tampones ácidos como en los básicos, con solo diferencias marginales en el tamaño de la vesícula. Las bajas concentraciones de agarosa (~ 0.1-1 p / v%) también afectan negativamente la formación de GUV debido a la falta de cobertura superficial homogénea y una disminución en la hinchazón del hidrogel, una fuerza necesaria en la coalescencia y brotación de GUV fuera de la superficie del hidrogel. Por lo tanto, hemos determinado que una concentración final de agarosa de 2 p/v% con una solución de sacarosa/glucosa de 100-200 mM, combinada con una fuerza iónica tampón de 185 mM PBS a pH 7.4 logra un buen equilibrio de hinchazón de agarosa, tasa de formación de GUV y el tamaño posterior de la vesícula. Para las vesículas que contienen proteínas, el aumento de la concentración inicial de agarosa a 3 p/v% permite una concentración final de agarosa de 2 p/v% después de la adición de la solución proteica. Además de la dinámica de formación, el sistema tampón de sacarosa/glucosa también facilita la sedimentación y posterior recolección de guVs formados, así como la visualización bajo microscopía de contraste de fase65,68.

Hay algunos puntos de precaución con respecto a este protocolo, específicamente con respecto a la agarosa y la selección de vesículas. Por ejemplo, mientras usamos una agarosa de temperatura de fusión ultrabaja, la suspensión de agarosa-agua debe alcanzar al menos 60 ° C para fundirse, y la mezcla de agarosa y proteína se incuba a 45 ° C.  En nuestra experiencia, esta temperatura no elimina la actividad de 5-HT1AR, pero se justifica la precaución para otras proteínas. En general, la agarosa que utilizamos comienza a gelificarse a 20 °C y, por lo tanto, la reacción de hinchazón puede tener lugar a temperaturas superiores a 20 °C, pero este proceso no puede funcionar por debajo de esa temperatura. También debe tenerse en cuenta que cuanto más se acerca la temperatura a 20 ° C, menos eficiente se vuelve el paso de hinchazón, lo que lleva a disminuciones posteriores en los rendimientos de GUV. La agarosa también puede presentar un problema durante los pasos de asentamiento y visualización, ya que puede persistir en la parte inferior del tubo de sedimentación / recolección como escombros. Por lo tanto, se requiere precaución para la temperatura requerida para mantener la agarosa fundida y asegurarse de que dicha temperatura no desnaturalizará la proteína de interés, así como aspirar la solución de sedimentación para evitar que cualquier exceso de agarosa suspendida se incluya en la muestra final. Este método en su estado actual también da como resultado un tamaño de población GUV heterogéneo, con algunas vesículas que muestran multilamelaridad y otros fenómenos de vesículas defectuosas, como vesículas dentro de las vesículas. Esto es típico de los métodos comunes de formación de GUV y requiere vigilancia y discreción al seleccionar vesículas para microscopía y análisis. Los GUV que muestran niveles inusualmente altos de fluorescencia tampoco se recomiendan para el análisis, ya que la agarosa se puede encontrar en el interior de algunas de estas vesículas. Un trabajo inédito de nuestro laboratorio ha podido ejecutar experimentos de aspiración de micropipetas utilizando vesículas hechas con esta técnica, lo que ilustra que el método de la agarosa produce vesículas sin agarosa que altere la mecánica en la luz.

Dejando a un lado las limitaciones, este protocolo presenta un método robusto y sencillo para generar GUV incorporados en proteínas. Puede generar altos rendimientos de GUV en condiciones fisiológicamente relevantes que incorporan proteínas transmembrana correctamente orientadas en la bicapa sin comprometer su funcionalidad. Esto es una desviación de otros métodos de formación de vesículas, que involucran corrientes eléctricas o hidratación suave, que dañarían significativamente la estructura de la proteína y la harían no funcional o requerirían más solubilización de detergente y pasos de eliminación. Dado que los GPCR representan más de un tercio de todos los objetivos farmacéuticos, existe un interés significativo en poder estudiar esta familia de proteínas en una plataforma biomimética altamente sintonizable y de alto rendimiento. Más específicamente, las aplicaciones de este trabajo van desde el estudio de las interacciones proteína-lípido, cómo el microambiente lipídico influye en la funcionalidad y localización de la proteína, y otras preguntas biofísicas básicas que pueden informar el desarrollo y descubrimiento de fármacos farmacéuticos. Un ejemplo de esto se puede encontrar en el trabajo realizado dentro de nuestro laboratorio, que ha sido capaz de discernir las variaciones en la funcionalidad del receptor como resultado de la oxidación de lípidos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Matthew Blosser por su valiosa discusión y consejo. Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Investigación Naval (N00014-16-1-2382) y la Fundación Nacional de Ciencias (PHY-1915017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

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Bioingeniería Número 180
Construcción de membranas lipídicas modelo que incorporan receptores acoplados a proteínas G (GPCR)
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Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

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