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Bioengineering

मॉडल लिपिड झिल्ली का निर्माण जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) को शामिल करना

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल अभिन्न झिल्ली प्रोटीन (आईएमपी) को विशाल यूनिलैमेलर लिपिड पुटिकाओं (जीयूवी) में शामिल करने के लिए एक शक्तिशाली और सामान्य तकनीक के रूप में एगारोज़ सूजन का उपयोग करता है, जैसा कि मानव 1 ए सेरोटोनिन रिसेप्टर प्रोटीन (5-HT1AR) के पुनर्गठन के लिए यहां वर्णित है, जो औषधीय रूप से महत्वपूर्ण जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के वर्गों में से एक है।

Abstract

अभिन्न झिल्ली प्रोटीन की संरचना और कार्य की मजबूत इन विट्रो जांच प्लाज्मा झिल्ली की जटिलताओं और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन व्यवहार को प्रभावित करने वाले कई कारकों के कारण एक चुनौती रही है। विशालकाय यूनिलैमेलर पुटिकाएं (GUVs) प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन की जांच करने और एक सटीक, उत्तेजना-निर्भर तरीके से प्रोटीन व्यवहार की जांच करने के लिए एक बायोमिमेटिक और अत्यधिक ट्यूनेबल इन विट्रो मॉडल सिस्टम हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम मानव सेरोटोनिन 1 ए रिसेप्टर (5-HT1AR) के साथ GUVs को बनाने के लिए एक सस्ती और प्रभावी विधि प्रस्तुत करते हैं जो झिल्ली में स्थिर रूप से एकीकृत होता है। हम एक संशोधित हाइड्रोजेल सूजन विधि का उपयोग करके जीयूवी का निर्माण करते हैं; agarose और 5-HT1AR के मिश्रण के शीर्ष पर एक लिपिड फिल्म जमा करके और फिर पूरे सिस्टम को हाइड्रेट करके, पुटिकाओं को झिल्ली में शामिल ठीक से उन्मुख और कार्यात्मक 5-HT1AR के साथ बनाया जा सकता है। इन GUVs का उपयोग तब माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन और स्थानीयकरण व्यवहार की जांच करने के लिए किया जा सकता है। आखिरकार, यह प्रोटोकॉल अभिन्न झिल्ली प्रोटीन की कार्यक्षमता की हमारी समझ को आगे बढ़ा सकता है, जो गहन शारीरिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

Introduction

सिंथेटिक मॉडल झिल्ली बायोमेम्ब्रेन के मौलिक गुणों और कार्यों की जांच में शक्तिशाली उपकरण हैं। विशालकाय यूनिलैमेलर पुटिकाएं (GUVs) प्लाज्मा झिल्ली गुणों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए सबसे प्रमुख प्लेटफार्मों में से एक हैं और विभिन्न शारीरिक स्थितियों की नकल करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है1,2,3,4,5,6,7,8। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि प्लाज्मा झिल्ली और इसका संगठन सेलुलर प्रक्रियाओं की एक भीड़ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे कि सिग्नल ट्रांसडक्शन, आसंजन, एंडोसाइटोसिस, और परिवहन 9,10,11,12,13,14,15।

GUVs को कोमल जलयोजन 16, हाइड्रोजेल सूजन 17, इलेक्ट्रोफॉर्मेशन 18, माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक19,20,21,22, जेटिंग 23, और विलायक एक्सचेंज 24,25,26 सहित विभिन्न तरीकों का उपयोग करके गढ़ा गया है। अभिन्न झिल्ली प्रोटीन (आईएमपी) को संभालने में चुनौतियों के कारण, उनका अध्ययन करने के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म सीमित हैं। GUVs एक ऐसे वातावरण में आईएमपी का अध्ययन करने के लिए एक सरलीकृत मंच प्रस्तुत करते हैं जो उनके मूल वातावरण की नकल करता है। यद्यपि GUVs में प्रोटीन पुनर्गठन के लिए कई दृष्टिकोण रहे हैं, लेकिन सही अभिविन्यास के साथ प्रोटीन को शामिल करने और प्रोटीन कार्यक्षमता को बनाए रखने से चुनौतियां उत्पन्न होती हैं27।

जीयूवी में सबसे सफल प्रोटीन-पुनर्गठन के लिए डिटर्जेंट विनिमय विधि की आवश्यकता होती है; जिसमें डिटर्जेंट द्वारा अपने मूल वातावरण से प्रोटीन को घुलनशील बनाना शामिल है, इसके बाद प्रोटीन शुद्धिकरण, और फिर डिटर्जेंट अणुओं को विभिन्न तरीकों के माध्यम से लिपिड के साथ बदलना। जबकि डिटर्जेंट शुद्धिकरण के दौरान आईएमपी की तृतीयक संरचना को स्थिर करने के लिए काम करते हैं, डिटर्जेंट मिसेल इन प्रोटीनों के लिए एक अपेक्षाकृत अप्राकृतिक वातावरण हैं, जो लिपिड बाईलेयर 28,29,30 में विशेष रूप से कार्यात्मक अध्ययन के लिए बेहतर स्थिर होते हैं। इसके अलावा, पारंपरिक जीयूवी निर्माण तकनीकों का उपयोग करके लिपिड बाईलेयर में कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को शामिल करना आकार, इन प्रोटीनों की विनम्रता और अतिरिक्त डिटर्जेंट विनिमय चरणों के कारण मुश्किल हो गया है जो 27,31,32,33 की आवश्यकता होगी। डिटर्जेंट को हटाने के लिए कार्बनिक विलायक का उपयोग प्रोटीन एकत्रीकरण और विकृतीकरण का कारण बनता है34। एक बेहतर डिटर्जेंट-मध्यस्थता विधि आशाजनक रही है, हालांकि, डिटर्जेंट हटाने के चरण के लिए सावधानी बरतने की आवश्यकता है और विशिष्ट प्रोटीन 31,35 के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफॉर्मेशन का उपयोग करने वाले तरीके प्रोटीन की पसंद को प्रतिबंधित कर सकते हैं और सभी लिपिड रचनाओं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं, विशेष रूप से चार्ज किए गए लिपिड 31,36,37। एक और तकनीक जिसका उपयोग किया गया है वह है पेप्टाइड-प्रेरित बड़े यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एलयूवी) का संलयन जिसमें जीयूवी के साथ वांछित प्रोटीन होता है, हालांकि यह श्रमसाध्य पाया गया था और विदेशी अणुओं के सम्मिलन का कारण बन सकता है- फ्यूसोजेनिक पेप्टाइड्स 33,38,39। विशाल प्लाज्मा झिल्ली पुटिकाओं (जीपीएमवी), जो जीवित कोशिकाओं से व्युत्पन्न होते हैं, का उपयोग इन मुद्दों में से कुछ को दूर करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि वे परिणामी लिपिड और प्रोटीन संरचना के न्यूनतम नियंत्रण की अनुमति देते हैं14,40,41। इसलिए, हमारे संशोधित agarose सूजन विधि का उपयोग कर GUVs की bilipid परत में IMPs का एकीकरण झिल्ली पर्यावरण में इन प्रोटीनों की आगे की जांच करने के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रस्तुत करता है42,43,44,45.

सेलुलर सिग्नलिंग और संचार में प्रोटीन का एक परिवार शामिल है जिसे जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) के रूप में जाना जाता है; GPCRs प्रोटीन के सबसे बड़े परिवार में से एक हैं और कई अन्य शारीरिक कार्यों के बीच मनोदशा, भूख, रक्तचाप, हृदय समारोह, श्वसन और नींद को मॉड्युलेट करने के साथ जुड़े हुए हैं। इस अध्ययन में, हमने मानव सेरोटोनिन 1 ए रिसेप्टर (5-एचटी 1 एआर) का उपयोग किया जो जीपीसीआर परिवार का एक प्रोटोटाइप सदस्य है। 5-HT1AR केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और रक्त वाहिकाओं में पाया जा सकता है; यह कार्डियोवैस्कुलर, जठरांत्र संबंधी, अंतःस्रावी कार्यों जैसे कई कार्यों को प्रभावित करता है, साथ ही साथ मूड 47 के विनियमन में भाग लेता है। जीपीसीआर अनुसंधान के लिए एक बड़ी बाधा उनकी जटिल एम्फीफिलिक संरचना से उत्पन्न होती है, और जीयूवी प्रोटीन कार्यक्षमता, लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन से लेकर ब्याज के विभिन्न गुणों की जांच के लिए एक आशाजनक मंच प्रस्तुत करते हैं। लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया गया है जैसे कि सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) 48,49, परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर)50,51, प्रोटीन लिपिड ओवरले (पीएलओ) परख51,52,53,54, देशी मास स्पेक्ट्रोमेट्री 55, समतापी अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) 56,57, और लिपोसोम अवसादन परख58,59. हमारी प्रयोगशाला ने प्रोटीन कार्यक्षमता पर लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रभाव की जांच करने के लिए सरलीकृत जीयूवी दृष्टिकोण का उपयोग किया है, जो कि BODIPY-GTPπS को शामिल करके, जो रिसेप्टर की सक्रिय स्थिति में Giα सबयूनिट के साथ बांधता है। उनके बंधन एक प्रतिदीप्ति संकेत है कि समय के साथ पता लगाया जा सकता है का उत्पादन fluorophore unquanches. इसके अलावा, विभिन्न अध्ययनों ने लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच की और झिल्ली वक्रता 60,61 को संवेदन या स्थिर करने में प्रोटीन की भूमिका, और एक व्यवहार्य जीयूवी दृष्टिकोण का उपयोग करना एक महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है।

यह प्रोटोकॉल एक संशोधित agarose हाइड्रोजेल system17,42 का उपयोग करके GUVs की झिल्ली में GPCRs को शामिल करने के लिए एक सरल विधि प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, हमारे पिछले काम के आधार पर, हमारी विधि आईएमपी के लिए उपयुक्त हो सकती है जो 30-40 डिग्री सेल्सियस तक अल्पकालिक जोखिम सहन कर सकती है। संक्षेप में, हम ब्याज के GPCR युक्त झिल्ली टुकड़े के साथ संयुक्त agarose की एक पतली फिल्म फैल. इस परत के जेलेशन के बाद, हम एगारोज़ के ऊपर एक लिपिड समाधान जमा करते हैं और विलायक को वाष्पित करने की अनुमति देते हैं। सिस्टम का पुनर्जलीकरण तब एक जलीय बफर के साथ किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप लिपिड बाईलेयर में शामिल प्रोटीन के साथ जीयूवी का गठन हुआ था।

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Protocol

1. प्रोटीन लेबलिंग

  1. NHS-Rhodamine, 5-HT1A झिल्ली टुकड़े, और एक 7 K MWCO स्पिन desalting स्तंभ कमरे के तापमान पर संतुलित करने के लिए अनुमति दें।
  2. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 100 μL में एनएचएस-रोडामाइन के 1 मिलीग्राम को भंग करें।
  3. 5-HT1AR समाधान के pH को pH 8 तक बढ़ाने के लिए 1 M सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के 5 μL जोड़ें।
  4. 5-HT1AR समाधान के 50 μL के लिए NHS-rhodamine समाधान के 3.66 μL जोड़ें और एक microcentrifuge ट्यूब में धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट।
    नोट: एनएचएस-रोडामाइन की कम से कम 10x दाढ़ की अधिकता सुनिश्चित करें।
  5. मिश्रण को प्रकाश से सुरक्षित रखें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए रोटेटर पर रखें।
  6. प्रत्येक धोने के लिए 1.5 आरसीएफ पर 1.5 मिनट के लिए 1.5 मिनट के लिए 1.5 मिनट के लिए 1x फॉस्फेट बफर खारा (1x पीबीएस) के 200 μL के साथ एक 7 k MWCO स्पिन स्तंभ धोएं।
  7. एक स्तंभ के लिए लेबल प्रोटीन जोड़ें और एक और microcentrifuge ट्यूब में राशि संतुलन.
  8. लेबल किए गए प्रोटीन को 1.5 आरसीएफ पर 5 मिनट के लिए एक बार नीचे स्पिन करें।
  9. 280 एनएम और 554 एनएम पर एक नैनोड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके यूवी-विज़ स्पेक्ट्रम लें और निर्माता के मैनुअल के बाद लेबलिंग दक्षता की गणना करें।
  10. लेबल किए गए प्रोटीन को आगे के उपयोग तक 5 डिग्री सेल्सियस पर कवर करें। लेबलिंग के बाद समाधान लगभग एक सप्ताह के लिए स्थिर है।

2. झिल्ली के साथ GUVs-शामिल 5-HT 1A

  1. सामग्री और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. प्रोटीन, लिपिड और बीएसए (गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन) को कमरे के तापमान पर संतुलित करने की अनुमति दें।
    2. इस समय के दौरान, कवरलिप्स को मेथनॉल में रखकर और 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए sonicating करके साफ करें। सुनिश्चित करें कि मेथनॉल पूरी तरह से कवरलिप्स को कवर करता है और पानी के स्नान में पानी का स्तर कंटेनर में मेथनॉल के स्तर से ऊपर है।
      नोट: मेथनॉल विषाक्त है और उचित रासायनिक हुड में संभाला जाना चाहिए।
    3. हवा की एक कोमल धारा के साथ coverslips पर अतिरिक्त मेथनॉल बंद सूखी. कवरस्लिप रैक को 15 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस ओवन में कवरस्लिप रैक रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अतिरिक्त कवरलिप्स सूख जाएं।
    4. प्लाज्मा सफाई प्रक्रिया शुरू करें। सबसे पहले, कवरलिप्स को प्लाज्मा क्लीनर में रखें और कक्ष के अंदर सभी हवा को खाली करने के लिए हवा के सेवन वाल्व को बंद कर दें।
    5. एक बार जब कक्ष वैक्यूम के तहत होता है, तो उच्च आरएफ पावर सेटिंग और एक पूर्ण वैक्यूम का उपयोग करके 5 मिनट के लिए कवरलिप्स को साफ करें, वैक्यूम चैंबर में केवल एक मामूली हवा का सेवन करें। प्लाज्मा के उचित स्तर को सुनिश्चित करने के लिए, वैक्यूम कक्ष के उद्घाटन को समायोजित करें ताकि प्लाज्मा का परिणामी रंग एक स्थिर, उज्ज्वल गुलाबी हो।
      नोट: हवा का उपयोग करते समय यह महत्वपूर्ण है कि प्लाज्मा उपचार चरण की अवधि के लिए प्लाज्मा एक उज्ज्वल गुलाबी रंग बना हुआ है, क्योंकि एक गहरा बैंगनी रंग इंगित करता है कि कक्ष में हवा की अनुचित मात्रा है और इसके परिणामस्वरूप एक सबऑप्टिमल प्लाज्मा उपचार होगा।
    6. एक बार जब 5 मिनट बीत जाते हैं, तो आरएफ पावर को बंद कर दें और वैक्यूम जारी करें।
      नोट: प्लाज्मा कक्ष से हटाने पर, कृपया सुनिश्चित करें कि coverslips कवर रहते हैं।
  2. हाइड्रोजेल तैयारी
    1. अल्ट्राप्योर पानी के 300 μL (यानी, 2% (डब्ल्यू / वी) agarose) के साथ अल्ट्रा-कम पिघलने वाले तापमान agarose के 6 मिलीग्राम गठबंधन।
      नोट: प्रोटीन मुक्त GUVs बनाने के लिए 2% agarose का उपयोग किया जाएगा। Agarose समाधान दो दिनों के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
    2. 300 μL अल्ट्राप्योर पानी के साथ अल्ट्रा-कम तापमान agarose के 9 मिलीग्राम को 3 w / v% agarose के लिए संयोजित करें जैसा कि चरण 3.1 में तैयार किया गया है। 3% agarose प्रोटीन शामिल GUVs बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    3. 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर रखने से पहले संक्षेप में समाधान भंवर। फिर, ट्यूब को फिर से 45 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में स्थानांतरित करने से पहले इसे आगे के उपयोग तक पिघले हुए रूप में रखने के लिए भंवर करें।
  3. Agarose और प्रोटीन मिश्रण
    1. 5-HT1AR झिल्ली टुकड़े के 7 μL के साथ 3% agarose के 21 μL मिश्रण. पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कई बार धीरे-धीरे पिपेट ऊपर और नीचे। फिर, 1 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. हाइड्रोजेल और लिपिड निक्षेपण
    1. प्रोटीन मुक्त GUVs के लिए: 2% agarose के 20 μL का उपयोग कर ताजा प्लाज्मा-साफ कवरलिप्स पर एक पतली फिल्म बनाएं। जल्दी से agarose बूंद के शीर्ष पर एक और coverslip ड्रॉप और धीरे से दोनों coverslips पर एक पतली फिल्म बनाने के लिए अलग coverlips स्लाइड.
      नोट:: यह चरण मुश्किल है कि ड्रॉपलेट की स्लाइडिंग होना चाहिए, जबकि agarose अभी भी पिघला हुआ रूप में है।
    2. प्रोटीन-शामिल GUVs के लिए: पिपेट प्रोटीन / एगारोज़ मिश्रण को एक और बार ऊपर और नीचे करें, और फिर प्लाज्मा-साफ कवरस्लिप पर 2% एगारोज़ के 20 μL जमा करें। ऊपर वर्णित स्लिप-कास्टिंग निर्देशों का पालन करें।
    3. agarose कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित जेल करने के लिए अनुमति दें।
    4. agarose परत के शीर्ष पर ड्रॉपवाइज लिपिड जमा. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) के 2 mg/mL के कुल 10 μL का उपयोग 0.4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (या ब्याज का लिपिड मिश्रण) के साथ ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (या ब्याज का लिपिड मिश्रण) के साथ क्लोरोफॉर्म में करें। एक गैस क्रोमैटोग्राफी सुई का उपयोग करके बूंदों को जमा करें और एक कोमल हवा की धारा के माध्यम से एक समय में एक बूंद फैलाएं।
      नोट: हाइड्रोजेल के शीर्ष पर लिपिड की अपेक्षाकृत समान परत बनाने के लिए इस चरण के साथ सावधानी बरतने की आवश्यकता है। इसके अलावा, क्लोरोफॉर्म विषाक्त है और इसे उचित रासायनिक हुड में संभाला जाना चाहिए।
    5. कवरस्लिप के शीर्ष पर एक ओ-रिंग रखकर साइक्स-मूर (एस-एम) कक्षों को इकट्ठा करें, और फिर ओ-रिंग के शीर्ष पर कक्ष के शीर्ष घटक को रखें। चैंबर को सील करने और किसी भी रिसाव को रोकने के लिए चैंबर घटकों को एक साथ खराब करके चैंबर को इकट्ठा करने के लिए निर्माता द्वारा प्रदान की गई कुंजी का उपयोग करें।
      नोट: कक्ष के शीर्ष को ओ-रिंग पर कस दिया जाना चाहिए, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरतने की आवश्यकता है कि कवरस्लिप बरकरार रहे क्योंकि यदि ओ-रिंग कक्ष में ठीक से नहीं बैठता है तो कवरस्लिप क्रैक कर सकता है। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि कक्ष को पर्याप्त तंग सील कर दिया गया है जैसे कि सूजन समाधान जोड़ने पर कक्ष रिसाव नहीं करता है। कक्ष को पर्याप्त रूप से कसने में विफलता के परिणामस्वरूप रिसाव और नमूने का नुकसान होगा।
  5. पुटिकाओं की सूजन और कटाई
    1. 1x PBS में 200 mM सुक्रोज के 450 μL को धीरे से पाइप करके और हाइड्रोजेल-लिपिड परतों के पर्याप्त बफर कवरेज को सुनिश्चित करने के लिए धीरे से कक्षों को टैप करके पूरे सिस्टम को हाइड्रेट करें।
      नोट: सुक्रोज समाधान को ब्याज की जैविक जांच वाले पुनर्जलीकरण बफर के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    2. कक्षों को 45 डिग्री सेल्सियस पर रखें और वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक कवरस्लिप के साथ कक्ष के शीर्ष भाग को कवर करें। नमूने को सूजन की अनुमति दें, मलबे और प्रकाश से 1 घंटे के लिए संरक्षित करें।
    3. एक 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में अल्ट्राप्योर पानी में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के 100 μL जोड़ें जिसका उपयोग करने का इरादा है। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ तीन बार धोएं और एक बार 1x पीबीएस में 200 एमएम सुक्रोज के साथ।
    5. अंत में, जीयूवी नमूना समाधान के अतिरिक्त तक 1x पीबीएस में ग्लूकोज के 200 mM जोड़ें।
      नोट: BSA GUV सोखना को अवरुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    6. हाइड्रोजेल को सूजन की अनुमति देने के बाद, धीरे-धीरे हिलाएं और किसी भी जीयूवी को हटाने के लिए कक्ष को टैप करें जो हाइड्रोजेल सतह से जुड़ा रह सकता है। फिर, जीयूवी-सुक्रोज समाधान को ध्यान से पिपेट करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए एक वैकल्पिक कदम के रूप में कि सभी पुटिकाओं को सतह से अलग कर दिया गया है, धीरे से हाइड्रोजेल सतह पर कुछ सुक्रोज निलंबन को वापस कर दिया जाता है।
    7. निलंबन को पहले से तैयार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ले जाएं जिसमें 1x PBS में 200 mM ग्लूकोज के 700 μL होते हैं।
      नोट: घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के नीचे पुटिकाओं के निपटान के लिए नेतृत्व करेंगे।
    8. पुटिकाओं को एक और घंटे के लिए बसने की अनुमति दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पुटिकाएं माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के नीचे डूब सकती हैं, जिससे इष्टतम संग्रह की अनुमति मिलती है।
    9. ग्लूकोज में GUVs के निपटान के बाद, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (बसे हुए पुटिकाओं) के नीचे से 300 μL को पहले से तैयार और बीएसए-उपचारित 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें ताकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत पुटिकाओं की जांच की जा सके।
      नोट: अंतिम नमूने में एकत्र किए गए मलबे की मात्रा को कम करने के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के बहुत नीचे से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. माइक्रोस्कोप के नीचे नमूनों की जांच करें।
    1. नमूने पर एक 488 एनएम लेजर शाइन करें (जो हमें झिल्ली की कल्पना करने की अनुमति देता है, क्योंकि बाईलेयर को एटीटीओ -488-डीपीपीई के साथ लेबल किया गया है)।
    2. नमूने पर एक 561 एनएम लेजर चमकें (जो हमें प्रोटीन की कल्पना करने की अनुमति देता है, क्योंकि इसे एनएचएस-रोडामाइन के साथ लेबल किया गया है)।
      नोट: फोटोऑक्सीडेशन पुटिकाओं को अस्थिर कर सकता है के रूप में नमूना इमेजिंग करते समय सावधानी की आवश्यकता है। पुटिकाओं को उसी दिन देखा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: विस्तृत प्रोटोकॉल चरणों का चित्रण। BioRender.com के साथ बनाया गया कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

प्रोटीन की एकाग्रता को मापा गया था, और लेबलिंग की डिग्री की गणना डाई और प्रोटीन के बीच दाढ़ अनुपात के रूप में 1: 1 के रूप में की गई थी। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके GUVs की जांच करके, हम पुटिकाओं के सफल गठन और प्रोटीन एकीकरण की पुष्टि करने में सक्षम थे। लिपिड को 0.4 मोल% एटीटीओ 488-डीपीपीई के साथ लेबल किया गया था, और प्रोटीन को प्राथमिक अमीनों के रोडामाइन एनएचएस-एस्टर संशोधन के माध्यम से सहसंयोजक रूप से लेबल किया गया था। चित्रा 2a और चित्रा 2b क्रमशः ATTO 488 और rhodamine चैनलों में एक प्रोटीन-शामिल पुटिका दिखाते हैं। सभी माइक्रोग्राफ डार्क करंट और फ्लैटफील्ड को सही किया गया है। चित्रा 2c और चित्रा 2d कोई प्रोटीन शामिल के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण GUV दिखाते हैं. चित्रा 3a और चित्रा 3b दोनों चैनलों में एक ही पुटिका की धराशायी सफेद रेखा द्वारा दी गई रेखा तीव्रता प्रोफाइल के साथ एक प्रोटीन शामिल GUV दिखाते हैं। रेखा तीव्रता प्रोफ़ाइल छवि के भीतर सफेद खींची गई रेखा के साथ पिक्सेल की तीव्रता का एक दो आयामी प्लॉट दिखाता है। x-अक्ष रेखा के साथ दूरी है और y-अक्ष पिक्सेल तीव्रता है। ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग इंगित लाइन की प्रोफ़ाइल तीव्रता को प्लॉट करने के लिए किया गया था।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटीन की तुलना करने वाले माइक्रोग्राफ ने प्रोटीन (नियंत्रण) के बिना जीयूवी और जीयूवी को शामिल किया। माइक्रोग्राफ (ए) और (बी) क्रमशः संबंधित एटीटीओ 488 और रोडामाइन चैनलों के साथ प्रोटीन शामिल जीयूवी प्रतिदीप्ति दिखाते हैं। माइक्रोग्राफ (सी) और (डी) क्रमशः एटीटीओ 488 और रोडामाइन चैनलों के साथ उत्साहित होने पर एक प्रोटीन छोड़े गए जीयूवी दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: शीर्ष पंक्ति ATTO 488 (ए) और rhodamine (बी) चैनलों में शामिल प्रोटीन शामिल GUVs के माइक्रोग्राफ से पता चलता है. संकेतित सफेद-धराशायी लाइनों के लिए रेखा तीव्रता प्रोफाइल नीचे दिए गए हैं। विश्लेषण ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमने दो चरणों की पहचान की है जो समग्र प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं: प्लाज्मा उपचार और लिपिड जमाव। कवरस्लिप की प्लाज्मा सफाई यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि ग्लास कवरस्लिप के लिए एगारोज़ हाइड्रोजेल का पर्याप्त कवरेज और आसंजन है। प्लाज्मा सफाई दो चीजों को पूरा करती है: पहला, यह कांच की सतह से कार्बनिक पदार्थों के निशान को हटा देता है; दूसरा, यह कवरस्लिप सतह को सक्रिय करता है, जिससे कांच की सतह हाइड्रोफिलिसिटी बढ़ने के कारण भिनभिनाहट में वृद्धि होती है62,63. कवरस्लिप सतह को छूने के बाद प्लाज्मा सफाई अल्ट्राक्लीन सतह को निष्क्रिय और दूषित कर देगी और इसके खिलाफ दृढ़ता से सलाह दी जाती है। हमारी सिफारिश केवल एगरोज स्लिप कास्टिंग चरण के लिए कवरस्लिप को संभालते समय कवरस्लिप के बहुत किनारों और अंडरसाइड्स को छूने की है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम सूखी हाइड्रोजेल सतह पर लिपिड का जमाव है। यह विधि एक ड्रॉपवाइज लिपिड जमाव का उपयोग करती है, जिसके लिए एक गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) सुई और एक समय में लिपिड समाधान के कुछ माइक्रोलीटर जमा करने के लिए एक वायु प्रवाह की आवश्यकता होती है, जिससे जोड़ा गया लिपिड की मात्रा और हाइड्रोजेल सतह पर लिपिड फिल्म के प्लेसमेंट के सटीक नियंत्रण की अनुमति मिलती है। इस विधि का दोष यह है कि यदि सावधानीपूर्वक नहीं किया जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप एक मोटी लिपिड फिल्म के साथ कुछ चुनिंदा क्षेत्र हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप जीयूवी की पैदावार कम हो सकती है। इस प्रकार, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि एगारोज़ की सतह पर जितना संभव हो सके लिपिड परत का समान रूप से पतला हो।

इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण लाभों में से एक मंच का लचीलापन है; यह विधि प्रोटीन और लिपिड संरचना में परिवर्तन के साथ-साथ एनकैप्सुलेशन और बफर संशोधनों के लिए खुद को बहुत अच्छी तरह से उधार देती है। यह प्रोटोकॉल, सिद्धांत रूप में, किसी भी ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को शामिल कर सकता है, क्योंकि हम कई अलग-अलग ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को सफलतापूर्वक शामिल करने में सक्षम हैं, एडेनोसिन रिसेप्टर (ए 2 ए आर) से लेकर कार्यक्षमता 42,45,64 का त्याग किए बिना एक्वापोरिन लगाने तक। परंपरागत रूप से, प्रोटीन को डिटर्जेंट द्वारा घुलनशीलता के बाद जीयूवी में शामिल किया गया है या प्रोटियो-लिपोसोम या छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं में शामिल किया गया है जिसे बाद में एक पूर्वनिर्मित जीयूवी 65 में एकीकृत किया जा सकता है। हमारे संशोधित हाइड्रोजेल सूजन विधि का लाभ यह है कि यह डिटर्जेंट या मध्यवर्ती पुटिकाओं की निर्भरता को हटा देता है और एक मध्यवर्ती हाइड्रेटेड पाड़ प्रदान करता है। इसके लाभ दो गुना हैं: हम डिटर्जेंट विनिमय विधियों पर भरोसा किए बिना अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक बफर में झिल्ली में कार्यात्मक जीपीसीआर को स्थिर रूप से शामिल कर सकते हैं, जिन्हें उक्त डिटर्जेंट की एकाग्रता के बारे में अधिक तैयारी और देखभाल की आवश्यकता होती है, और यह कि जिस प्रक्रिया से जीयूवी हाइड्रोजेल की सतह से बाहर निकलते हैं, वह बाईलेयर में प्रोटीन के सही अभिविन्यास के लिए अनुमति देता है666 . हमने दिखाया है कि जीयूवी नवोदित प्रक्रिया में कई छोटे नैनोमीटर-स्केल पुटिकाओं का बड़े, माइक्रोन-स्केल पुटिकाओं में सम्मिलन शामिल है, जो शुरुआत से ही सही प्रोटीन अभिविन्यास को प्रोत्साहित करता है। हमने इसे अपने पिछले काम में मामला दिखाया है; संक्षेप में, हमने एडेनोसिन रिसेप्टर के एक विशिष्ट साइटोसोलिक लूप को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी को सहसंयोजक रूप से लेबल किया और प्रोटीन के साथ लेबल किए गए एंटीबॉडी को इनक्यूबेट किया, और फिर संशोधित हाइड्रोजेल सूजन विधि का उपयोग करके लिपिड-डाई-लेबल वाले जीयूवी में लेबल किए गए प्रोटीन को शामिल किया। फिर हमने प्रोटीन-शामिल पुटिकाओं को एक चार्ज क्वेन्चर में उजागर किया, जो बाईलेयर को पार करने में असमर्थ है। हम बाद में लिपिड डाई के प्रतिदीप्ति में 50% की कमी देखते हैं, लेकिन लेबल किए गए प्रोटीन की प्रतिदीप्ति बुझाने वाले से अप्रभावित रहती है, जो उचित अभिविन्यास का प्रदर्शन करती है।

हमारी प्रयोगशाला से बाहर पिछले काम ने उस भूमिका की जांच की है जिसमें लिपिड हेडग्रुप चार्ज, ज़विटेरियोनिक और नेट-आयनिक चार्ज किए गए लिपिड, साथ ही साथ बफर और हाइड्रोजेल गुण जैसे पीएच, आयनिक ताकत, ऑस्मोलेरिटी और हाइड्रोजेल एकाग्रता जीयूवी गठन की गतिशीलता पर हैं67। संक्षेप में, लिपिड चार्ज काफी हद तक जीयूवी गठन को प्रभावित नहीं करता है, जबकि बफर गुण जैसे कि सुक्रोज एकाग्रता में वृद्धि (उदाहरण के लिए, 185 एमएम आयनिक शक्ति पीबीएस बफर में 500 एमएम सुक्रोज) जीयूवी गठन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनियमित आकार के पुटिकाएं होती हैं जो सबसे अधिक संभावना है कि खुद को कटाई के लिए आसानी से उधार नहीं देंगी। अम्लीय समाधान (पीएच = 3) गठन की दर को बढ़ाते हैं, जबकि एक अधिक बुनियादी समाधान (पीएच = 8) जीयूवी गठन की दर को दबा देता है। GUVs अभी भी अम्लीय और बुनियादी बफर दोनों पर बनते हैं, पुटिका के आकार में केवल मामूली अंतर के साथ। कम agarose सांद्रता (~ 0.1-1 w / v%) भी नकारात्मक रूप से समरूप सतह कवरेज की कमी और हाइड्रोजेल सूजन में कमी के कारण जीयूवी गठन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करती है, हाइड्रोजेल सतह से जीयूवी के सम्मिलन और नवोदित में एक आवश्यक बल। इस प्रकार, हमने निर्धारित किया है कि 100-200 mM के सुक्रोज / ग्लूकोज समाधान के साथ एक 2 w / v% अंतिम agarose एकाग्रता, पीएच 7.4 पर 185 mM PBS की बफर आयनिक ताकत के साथ संयुक्त agarose सूजन, GUV गठन दर, और बाद के पुटिका आकार का एक अच्छा संतुलन प्राप्त करता है। प्रोटीन वाले पुटिकाओं के लिए, प्रारंभिक एगारोज़ एकाग्रता को 3 डब्ल्यू / वी% तक बढ़ाने से प्रोटीन समाधान के अलावा 2 डब्ल्यू / वी% की अंतिम एगारोज़ एकाग्रता की अनुमति मिलती है। गठन गतिशीलता के अलावा, सुक्रोज / ग्लूकोज बफर सिस्टम भी अवसादन और बाद में गठित जीयूवी के संग्रह की सुविधा प्रदान करता है, साथ ही साथ चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी 65,68 के तहत विज़ुअलाइज़ेशन भी करता है।

इस प्रोटोकॉल के बारे में सावधानी के कुछ बिंदु हैं, विशेष रूप से एगारोज़ और पुटिकाओं के चयन के बारे में। उदाहरण के लिए, जब हम एक अल्ट्रालो पिघलने वाले तापमान एगारोज़ का उपयोग करते हैं, तो एगारोज़-पानी के निलंबन को पिघला हुआ बनने के लिए कम से कम 60 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की आवश्यकता होती है, और एगारोज़-प्रोटीन मिश्रण को 45 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जाता है।  हमारे अनुभव में, यह तापमान 5-HT1AR की गतिविधि को समाप्त नहीं करता है, लेकिन अन्य प्रोटीनों के लिए सावधानी बरती जाती है। सामान्य तौर पर, हम जिस एगारोज़ का उपयोग करते हैं, वह 20 डिग्री सेल्सियस पर जेल करना शुरू कर देता है और इस प्रकार सूजन प्रतिक्रिया 20 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर हो सकती है, लेकिन यह प्रक्रिया उस तापमान से नीचे काम नहीं कर सकती है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि तापमान 20 डिग्री सेल्सियस के करीब हो जाता है, सूजन कदम उतना ही कम कुशल हो जाता है, जिससे बाद में जीयूवी पैदावार में कमी आती है। एगरोज निपटान और विज़ुअलाइज़ेशन चरणों के दौरान भी एक समस्या पेश कर सकता है, क्योंकि यह मलबे के रूप में निपटान / संग्रह ट्यूब के नीचे बनी रह सकती है। इस प्रकार, पिघले हुए एगारोज़ को बनाए रखने के लिए आवश्यक तापमान के लिए सावधानी बरतने की आवश्यकता होती है और यह सुनिश्चित करने के लिए कि उक्त तापमान ब्याज के प्रोटीन को डीनेचर नहीं करेगा और साथ ही अंतिम नमूने में शामिल होने से किसी भी अतिरिक्त निलंबित एगारोज़ से बचने के लिए निपटान समाधान को एस्पिरेट करेगा। अपनी वर्तमान स्थिति में इस विधि के परिणामस्वरूप एक विषम जीयूवी जनसंख्या आकार भी होता है, जिसमें कुछ पुटिकाएं मल्टीलैमेलरिटी और अन्य दोषपूर्ण पुटिका घटनाओं जैसे पुटिकाओं के भीतर पुटिकाओं को प्रदर्शित करती हैं। यह सामान्य जीयूवी गठन विधियों की विशेषता है और माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण के लिए पुटिकाओं का चयन करते समय सतर्कता और विवेक की आवश्यकता होती है। GUVs जो प्रतिदीप्ति के असामान्य रूप से उच्च स्तर को प्रदर्शित करते हैं, उन्हें भी विश्लेषण के लिए अनुशंसित नहीं किया जाता है, क्योंकि इनमें से कुछ पुटिकाओं के इंटीरियर पर एगरोज पाया जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला से बाहर अप्रकाशित काम इस तकनीक का उपयोग करके किए गए पुटिकाओं का उपयोग करके माइक्रोपिपेट आकांक्षा प्रयोगों को चलाने में सक्षम रहा है, यह दर्शाता है कि एगारोज़ विधि लुमेन में यांत्रिकी-परिवर्तन एगारोज़ के बिना पुटिकाओं का उत्पादन करती है।

सीमाओं के अलावा, यह प्रोटोकॉल प्रोटीन शामिल GUVs उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत और सरल विधि प्रस्तुत करता है। यह शारीरिक रूप से प्रासंगिक परिस्थितियों में GUVs की उच्च पैदावार उत्पन्न कर सकता है जो उनकी कार्यक्षमता से समझौता किए बिना बाईलेयर में ठीक से उन्मुख ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को शामिल करता है। यह पुटिका गठन के अन्य तरीकों से एक प्रस्थान है, जिसमें विद्युत धाराएं या कोमल जलयोजन शामिल हैं, जो प्रोटीन की संरचना को काफी नुकसान पहुंचाएगा और इसे गैर-कार्यात्मक रूप से प्रस्तुत करेगा या आगे डिटर्जेंट घुलनशीलता और हटाने के चरणों की आवश्यकता होगी। यह देखते हुए कि जीपीसीआर सभी फार्मास्युटिकल लक्ष्यों के एक तिहाई से ऊपर का प्रतिनिधित्व करते हैं, प्रोटीन के इस परिवार को अत्यधिक ट्यूनेबल, उच्च-थ्रूपुट, बायोमिमेटिक प्लेटफॉर्म में अध्ययन करने में सक्षम होने में महत्वपूर्ण रुचि है। अधिक विशेष रूप से, इस काम के अनुप्रयोग प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन के अध्ययन से लेकर हैं, लिपिड माइक्रोएन्वायरमेंट प्रोटीन कार्यक्षमता और स्थानीयकरण को कैसे प्रभावित करता है, और अन्य बुनियादी बायोफिजिकल प्रश्न जो दवा दवा विकास और खोज को सूचित कर सकते हैं। इसका एक उदाहरण हमारी प्रयोगशाला के भीतर पूरा किए गए काम में पाया जा सकता है, जो लिपिड ऑक्सीकरण के परिणामस्वरूप रिसेप्टर कार्यक्षमता में विचरण को समझने में सक्षम रहा है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम मूल्यवान चर्चा और सलाह के लिए मैथ्यू Blosser धन्यवाद. इस काम को नौसेना अनुसंधान कार्यालय (N00014-16-1-2382) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (PHY-1915017) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

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Bioengineering अंक 180
मॉडल लिपिड झिल्ली का निर्माण जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) को शामिल करना
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Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

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