Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה משתמש נפיחות agarose כטכניקה רבת עוצמה להכללה לשילוב חלבונים ממברנה אינטגרלית (IMPs) לתוך שלפוחיות שומנים חד-צדדיות ענקיות (GUVs), כפי שתואר כאן עבור שחזור של חלבון קולטן סרוטונין האדם 1A (5-HT1AR), אחד מסוגי קולטני חלבון G חשובים מבחינה פרמקולוגית.

Abstract

חקירות במבחנה איתנה של המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה אינטגרליים היוו אתגר בשל המורכבות של קרום הפלזמה והגורמים הרבים המשפיעים על התנהגות החלבון בתאים חיים. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם מערכת מודל מימטיקה וטופילית מאוד במבחנה לחקירת אינטראקציות בין קרום חלבון וחיקור התנהגות חלבונים באופן מדויק ותלוי גירוי. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה זולה ויעילה לייצור GUVs עם קולטן סרוטונין 1A האנושי (5-HT1AR) משולב ביציבות בממברנה. אנו מייצרים ג'וונים בשיטת נפיחות הידרוג'ל מותאמת; על ידי הפקדת סרט שומנים על גבי תערובת של agarose ו 5-HT1AR ולאחר מכן לחות המערכת כולה, שלל ניתן ליצור עם כוון כראוי ופונקציונלי 5-HT1AR משולב לתוך הממברנה. לאחר מכן ניתן להשתמש ב- GUVs אלה כדי לבחון אינטראקציות בין קרום חלבון והתנהגות לוקליזציה באמצעות מיקרוסקופיה. בסופו של דבר, פרוטוקול זה יכול לקדם את הבנתנו את הפונקציונליות של חלבוני ממברנה אינטגרליים, ומספק תובנה פיזיולוגית עמוקה.

Introduction

ממברנות מודל סינתטי הם כלים רבי עוצמה בחקירה של המאפיינים הבסיסיים ואת הפונקציות של biomembranes. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם אחת הפלטפורמות הבולטות ביותר לחקר מגוון תכונות קרום פלזמה וניתן להנדסן כדי לחקות מצבים פיזיולוגיים שונים1,2,3,4,5,6,7,8. הוא מבוסס היטב כי קרום הפלזמה והארגון שלה לשחק תפקיד מפתח בהמון של תהליכים תאיים, כגון העברת אותות, הידבקות, אנדוציטוזיס, ותחבורה9,10,11,12,13,14,15.

GUVs כבר מפוברק בשיטות שונות, כולל הידרציה עדינה16, נפיחות הידרוג'ל17, electroformation18, טכניקות מיקרופלואידיות19,20,21,22, jetting23, וחילופי ממס24,25,26. בשל אתגרים בטיפול בחלבוני ממברנה אינטגרליים (IMPs), פלטפורמות במבחנה לחקור אותם הוגבלו. GUVs מציגים פלטפורמה פשוטה לחקר IMPs בסביבה המחקה את הסביבה המקורית שלהם. למרות שהיו מספר גישות לחזרת חלבונים ב- GUVs, אתגרים נובעים משלב חלבונים עם הכיוון הנכון ושמירה על פונקציונליות חלבון27.

שחזור החלבון המוצלח ביותר ב- GUVs דורש את שיטת החלפת חומרי הניקוי; אשר כרוך solubilizing החלבונים מהסביבה הטבעית שלהם על ידי דטרגנטים, ואחריו טיהור חלבון, ולאחר מכן החלפת מולקולות דטרגנט עם שומנים באמצעות שיטות שונות28. בעוד חומרי ניקוי משמשים לייצוב המבנה שלישוני של IMPs במהלך הטיהור, micelles דטרגנט הם סביבה לא טבעית יחסית עבור חלבונים אלה, אשר מיוצבים טוב יותר, במיוחד עבור מחקרים פונקציונליים, ב bilayers השומנים28,29,30. יתר על כן, שילוב חלבוני טרנסממברן פונקציונליים לתוך bilayer השומנים באמצעות טכניקות ייצור GUV מסורתיות היה קשה בשל הגודל, העדינות של חלבונים אלה, ואת צעדי החלפת דטרגנט נוספים כי יהיה צורך27,31,32,33. השימוש בממס אורגני להסרת חומרי ניקוי גורם לצבירה של חלבונים ודנטורינג34. שיטה משופרת בתיווך דטרגנט מבטיחה, עם זאת, יש צורך בזהירות עבור שלב הסרת חומרי ניקוי ואופטימיזציה עשויה להיות נחוצה עבור חלבונים ספציפיים31,35. בנוסף, שיטות המשתמשות electroformation יכול להגביל את הבחירה של חלבון ולא יכול להיות מתאים לכל הרכבי השומנים טעונים במיוחד שומנים טעונים31,36,37. טכניקה נוספת בה נעשה שימוש היא היתוך המושרה בפפטיד של שלשלות חד-צדדיות גדולות (LUVs) המכילות את החלבון הרצוי עם רכבי שטח, אם כי נמצא כי הוא מייגע ויכול להוביל להכנסת מולקולות זרות - הפפטידים הפוסובגניים33,38,39. שלל קרום פלזמה ענק (GPMVs), אשר נגזרים תאים חיים, ניתן להשתמש כדי להתגבר על חלק מבעיות אלה, אולם הם מאפשרים שליטה מינימלית של השומנים וחלבון התוצאה14,40,41. לכן, שילוב של IMPs בשכבה הדו-ליפידית של GUVs באמצעות שיטת הנפיחות האגרוז המותאמת שלנו מציג שיטה אמינה לבחון עוד יותר חלבונים אלה בסביבת הממברנה42,43,44,45.

איתות ותקשורת תאית כוללת משפחה של חלבונים המכונה קולטנים מצמידי חלבון G (GPCRs); GPCRs הם בין המשפחה הגדולה ביותר של חלבונים והם קשורים עם מצב רוח מווסת, תיאבון, לחץ דם, תפקוד לב וכלי דם, נשימה, ושינה בין פונקציות פיזיולוגיות רבות אחרות46. במחקר זה, השתמשנו קולטן סרוטונין אנושי 1A (5-HT1AR) שהוא חבר טיפוסי של משפחת GPCR. 5-HT1AR ניתן למצוא במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית) וכלי הדם; זה משפיע על פונקציות רבות כגון קרדיווסקולרי, העיכול, תפקודים אנדוקריניים, כמו גם השתתפות ברגולציה של mood47. מחסום גדול למחקר GPCR נובע מהמבנה האמפיפילי המורכב שלהם, ו- GUVs מציגים פלטפורמה מבטיחה לחקירה של תכונות שונות של עניין, החל מפונקציונליות חלבון, אינטראקציות בין חלבון שומנים לחלבון ואינטראקציות חלבון-חלבון. גישות שונות נוצלו לחקר אינטראקציות בין חלבון שומנים לשומנים כגון תהודה פלסמון פני השטח (SPR)48,49, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR)50,51, שכבת-על שומנים חלבונית (אש"ף) 51,52,53,54, ספקטרומטריית מסת מקומית55, קלורימטריה איזותרמית (ITC)56,57, וליפוזום מטען מטען 58,59. המעבדה שלנו השתמשה בגישת ה- GUV הפשוטה כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות חלבון שומנים על פונקציונליות החלבון על ידי תקציר BODIPY-GTPγS, אשר נקשר עם Giα subunit במצב הפעיל של הקולטן. הכריכה שלהם מרוקנת את הפלורופור ומייצרת אות פלואורסצנטי שניתן לזהות לאורך זמן45. יתר על כן, מחקרים שונים חקרו אינטראקציות חלבון השומנים ואת התפקיד של חלבונים חישה או ייצוב עקמומיות ממברנה60,61, וניצול גישת GUV אפשרי יכול להיות יתרון מרכזי.

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה לשלב GPCRs לתוך הממברנה של GUVs באמצעות מערכת הידרוג'ל אגרוז שונה17,42. יתר על כן, בהתבסס על העבודה הקודמת שלנו, השיטה שלנו יכולה להיות מתאימה IMPs שיכול לשאת חשיפה לטווח קצר 30-40 °C (50 °F). בקצרה, אנו מפיצים סרט דק של אגרוז בשילוב עם שברי ממברנה המכילים את GPCR של עניין. לאחר ג'לציה של שכבה זו, אנו מפקידים תמיסת שומנים על גבי agarose ולאפשר ממס להתאדות. התייבשות של המערכת בוצעה אז עם חוצץ מימי, וכתוצאה מכך היווצרות של GUVs עם חלבון משולב bilayer השומנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תיוג חלבונים

  1. אפשר NHS-רודמין, שברי ממברנה 5-HT1A , ועמוד התפלה אחד 7 K MWCO ספין להתפלש בטמפרטורת החדר.
  2. יש להמיס 1 מ"ג NHS-רודמין ב-100 מיקרו-לן של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
  3. הוסף 5 μL של פתרון 1 M נתרן ביקרבונט כדי להגדיל את ה- pH של פתרון 5-HT1AR ל- pH 8.
  4. הוסף 3.66 μL של פתרון NHS-רודמין ל 50 μL של פתרון 5-HT1AR ו pipette בעדינות למעלה ולמטה בצינור microcentrifuge.
    הערה: יש להקפיד על עודף טוחן של NHS-רודמין פי 10 לפחות.
  5. שומרים על התערובת מוגנת מפני אור ומניחים על סיבוב בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
  6. לשטוף עמוד ספין 7 k MWCO עם 200 μL של תמיסת מלח פוספט 1x (1x PBS) שלוש פעמים במשך 1.5 דקות ב 1.5 RCF עבור כל לשטוף.
  7. מוסיפים את החלבון המסומן לעמודה אחת ומאזנים את הכמות בצינור מיקרוצנטריפוגה אחר.
  8. ספין את החלבון המסומן פעם אחת במשך 5 דקות ב 1.5 RCF.
  9. קח ספקטרום UV-vis באמצעות ספקטרופוטומטר ננו טיפה ב 280 ננומטר ו 554 ננומטר ולחשב את יעילות תיוג בעקבות המדריך של היצרן.
  10. יש לאחסן את החלבון המסומן המכוסה ב-5 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הפתרון יציב כשבוע לאחר התיוג.

2. ג'וונים עם 5-HT 1A משולבים בממברנה

  1. הכנת חומרים וריאגנטים
    1. אפשרו לחלבון, שומנים ו-BSA (אלבומין בסרום בקר) להתכווצ לטמפרטורת החדר.
    2. במהלך תקופה זו, לנקות את כיסויים על ידי הצבת אותם מתנול sonicating במשך 30 דקות ב 40 °C (50 °F). ודא כי מתנול מכסה לחלוטין את כיסויים ואת מפלס המים באמבט המים הוא מעל הרמה של מתנול במיכל.
      הערה: מתנול רעיל ויש לטפל בו במכסה כימי מתאים.
    3. יבש את מתנול עודף על כיסויים עם זרם עדין של אוויר. מניחים את מתלה כיסוי מכוסה בתנור 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להבטיח כי כיסויים עודפים להתייבש.
    4. התחל בתהליך ניקוי הפלזמה. ראשית, מניחים את כיסויי הניקוי לתוך מנקה הפלזמה ולסגור את שסתום צריכת האוויר כדי לפנות את כל האוויר בתוך התא.
    5. לאחר התא הוא תחת ואקום, לנקות את כיסויים במשך 5 דקות באמצעות הגדרת כוח RF גבוהה ואקום כמעט שלם, עם צריכת אוויר קלה בלבד לתוך תא הוואקום. כדי להבטיח את הרמה הנכונה של פלזמה, להתאים את הפתיחה של תא ואקום כך צבע התוצאה של הפלזמה הוא יציב, ורוד בהיר.
      הערה: זה חיוני בעת שימוש באוויר כי הפלזמה נשארת צבע ורוד בהיר למשך שלב הטיפול בפלזמה, כמו צבע סגול כהה יותר מציין כי יש כמות לא נכונה של אוויר בתא ויביא לטיפול פלזמה תת-אופטימלית.
    6. לאחר 5 דקות עברו, לכבות את כוח RF ולשחרר את הוואקום.
      הערה: עם ההסרה מתא הפלזמה, אנא ודא כי כיסויים להישאר מכוסה.
  2. הכנת הידרוג'ל
    1. שלבו 6 מ"ג של אגרת התכה נמוכה במיוחד עם 300 מיקרו-אל של מים אולטרה-תותים (כלומר, 2% (w/v) אגרוז).
      הערה: 2% אגרוז ישמש לייצור GUV ללא חלבון. פתרון אגרוז ניתן לשמור על 45 °C (55 °F) במשך יומיים.
    2. שלב 9 מ"ג של אגרוז בטמפרטורה נמוכה במיוחד עם 300 μL של מים אולטרה-תותים עבור 3 w / v% agarose על ידי כפי שהוכן בשלב 3.1. 3% אגרוז ישמש לייצור חלבונים משולבים GUVs.
    3. מערבולת את הפתרון לזמן קצר לפני הצבתם על בלוק חום 90 °C (90 °F) במשך 10 דקות. לאחר מכן, מערבולת הצינור שוב לפני העברתו בלוק חום 45 °C (45 °F) כדי לשמור אותו בצורה מותכת עד לשימוש נוסף.
  3. אגרוז וערבוב חלבונים
    1. לערבב 21 μL של 3% agarose עם 7 μL של 5-HT1AR קרום שברים. פיפטה למעלה ולמטה לאט פעמים רבות כדי להבטיח ערבוב הולם. לאחר מכן, דגירה ב 45 °C (55 °F) במשך 1 דקות.
  4. תצהיר הידרוג'ל ושומנים
    1. עבור GUVs ללא חלבון: לעשות סרט דק על כיסויים פלזמה טריים ניקה באמצעות 20 μL של 2% agarose. שחררו במהירות כיסוי נוסף על גבי טיפת האגורוז והחליקו בעדינות את הכיסויים לגזרים כדי ליצור סרט דק על שני הכיסויים.
      הערה: שלב זה הוא מסובך בכך שהחלקה של טיפה חייבת להתרחש בזמן agarose הוא עדיין בצורה מותכת.
    2. עבור GUVs משולב חלבון: Pipette תערובת חלבון / אגרוז למעלה ולמטה עוד פעם אחת, ולאחר מכן להפקיד 20 μL של 2% agarose על כיסוי ניקה פלזמה. בצע את הוראות הליהוק החלקה כמתואר לעיל.
    3. אפשר לאגורוז לג'ל מוגן מפני אור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. להפקיד את השומנים טיפה על גבי שכבת אגרוז. השתמש בסך הכל 10 μL של 2 מ"ג / מ"ל של 1-פלמיטויל-2-oleoyl-גלייצרו-3-פוסכולין (POPC) עם 0.4 מול% 1,2-דיפלמיטויל-sn-גליצרי-3-פוספוטנולמין (DPPE) המסומן עם ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (או תערובת שומנים של עניין) בכלורופורם על גבי סרט אגרוז. להפקיד את הטיפות באמצעות מחט כרומטוגרפיה גז ולהפיץ טיפה אחת בכל פעם סביב באמצעות זרם אוויר עדין.
      הערה: יש צורך בזהירות עם צעד זה כדי להפוך שכבה אחידה יחסית של שומנים על גבי הידרוג'ל. כמו כן, כלורופורם רעיל ויש לטפל בו במכסה כימי מתאים.
    5. להרכיב את תאי סייקס-מור (S-M) על ידי הצבת טבעת O על גבי כיסוי, ולאחר מכן הצבת הרכיב העליון של התא על גבי טבעת O. השתמש במפתח שסופק על ידי היצרן כדי להרכיב את התא על ידי הברגת רכיבי התא יחד כדי לאטום את התא ולמנוע כל דליפה.
      הערה: יש להדק את החלק העליון של התא על טבעת ה- O אך יש צורך בזהירות כדי להבטיח שהכיסוי יישאר שלם מכיוון שהכיסוי יכול להיסדק אם טבעת ה- O אינה יושבת כראוי בתא. כמו כן, ודא כי התא אטום חזק מספיק, כך התא לא לדלוף כאשר פתרון הנפיחות מתווסף. אי הידוק התא מספיק יגרום דליפות ואובדן מדגם.
  5. נפיחות וקציר של שלפוחיות
    1. יש להרטיב את המערכת כולה על ידי צנרת עדינה של 450 μL של 200 מ"ר סוכרוז ב-1x PBS והקשה עדינה על התאים כדי להבטיח כיסוי חיץ הולם של שכבות השומנים ההידרוג'ל.
      הערה: פתרון סוכרוז ניתן להחליף עם מאגר rehydration המכיל בדיקות ביולוגיות של עניין.
    2. מניחים את התאים ב 45 °C (5 °F) לכסות את החלק העליון של התא עם כיסוי כדי למנוע אידוי. אפשר לדגימה להתנפח, מוגן מפני פסולת ואור במשך שעה.
    3. הוסף 100 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA במים אולטרה-דור לכל באר של צלחת 96 באר שנועדה לשמש. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה.
    4. יש לשטוף שלוש פעמים במים טהורים במיוחד ופעם אחת עם סוכרוז 200 מ"מ ב-1x PBS.
    5. לבסוף, להוסיף 200 mM של גלוקוז ב 1x PBS עד לתוספת של פתרון מדגם GUV.
      הערה: BSA שימש לחסימת ספיעת GUV.
    6. לאחר מתן ההידרוג'ל להתנפח, לנער בעדינות ולהקיש על התא כדי לנטרל את כל GUVs שעשוי להישאר מחובר משטח הידרוג'ל. לאחר מכן, בזהירות pipette את פתרון GUV-סוכרוז.
      הערה: כצעד אופציונלי כדי להבטיח שכל שללנות מנותקות מפני השטח, בעדינות pipette חלק מתלה סוכרוז בחזרה על פני ההידרוג'ל.
    7. העבר את ההשעיה לתוך צינור microcentrifuge שהוכן בעבר המכיל 700 μL של גלוקוז 200 mM ב 1x PBS.
      הערה: שיפוע הצפיפות יוביל ליישב את שלל לתחתית צינור הצנטריפוגה.
    8. אפשר שלשלות להסתפק במשך שעה נוספת כדי להבטיח כי שלל יכול לשקוע לתחתית צינור microcentrifuge, המאפשר איסוף אופטימלי.
    9. לאחר יישוב של GUVs גלוקוז, להעביר 300 μL מתחתית צינור הצנטריפוגה (שלפוחיות התיישבו) לתוך צלחת 96-באר מוכן מראש שטופלו BSA כדי לבחון את שלפוחיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
      הערה: הקפד להימנע מהתחתית של צינור microcentrifuge כדי למזער את כמות הפסולת שנאספו במדגם הסופי.
  6. תבדוק את הדגימות מתחת למיקרוסקופ.
    1. הברק לייזר 488 ננומטר על המדגם (המאפשר לנו לדמיין את הממברנה, כמו bilayer כבר מסומן עם ATTO-488-DPPE).
    2. הברק לייזר 561 ננומטר על המדגם (המאפשר לנו לדמיין את החלבון, שכן הוא כבר מסומן עם NHS-רודמין).
      הערה: יש צורך בזהירות בעת הדמיית המדגם כמו פוטוקסידיקציה יכול לערער את שלפוחיות. שלל נצפו באותו היום.

Figure 1
איור 1: איור של שלבי הפרוטוקול המפורטים. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ריכוז החלבון נמדד, ומידת התיוג חושבה כיחס הטוחנת בין הצבע לחלבון להיות 1:1. על ידי בחינת ה- GUVs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, הצלחנו לאשר היווצרות מוצלחת ושילוב חלבונים של שלשלות. השומנים סומנו עם 0.4 מול% ATTO 488-DPPE, והחלבון תויג באופן קוולנטי באמצעות שינוי רודמין NHS-אסתר של אמינים ראשוניים. איור 2a ואיור 2b מציגים ארסית משולבת חלבונים בערוצי ATTO 488 ורודמין, בהתאמה. כל המיקרוגרפים תוקנו בזרם כהה ושפל השדה תוקנו. איור 2c ואיור 2d מציגים שליטה שלילית ב-GUV ללא חלבון משולב. איור 3a ואיור 3b מציגים GUV משולב בחלבון עם פרופילי עוצמת קו שניתנו על-ידי הקו הלבן המקווקו של אותו ארסיה בשני הערוצים. פרופיל עוצמת הקו מציג התוויה דו-ממדית של עוצמות הפיקסלים לאורך הקו הלבן המצויר בתוך התמונה. ציר ה-x הוא המרחק לאורך הקו וציר ה-y הוא עוצמת הפיקסלים. תוכנת ImageJ שימשה להתוויית עוצמת הפרופיל של הקו שצוין.

Figure 2
איור 2: מיקרוגרפים המשווה בין חלבונים משולבים ב-GUVs וב-GUV ללא חלבון (שליטה). מיקרוגרפים (a) ו-(ב) מראים חלבון משולב פלואורסצנטיות של GUV עם ערוצי ATTO 488 ורודמין בהתאמה. מיקרוגרפים (c) ו-(d) מראים ג'ו-גוב שהושמט מחלבון כאשר הם מתרגשים מערוצי ATTO 488 ורודמין, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השורה העליונה מציגה מיקרוגרפים של חלבונים משולבים בערוצים ATTO 488 (a) ורודמין (ב). פרופילי עוצמת הקו עבור הקווים המסוינים עם מקווים לבנים נמצאים להלן. הניתוח בוצע באמצעות תוכנת ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהינו שני שלבים קריטיים להצלחת הפרוטוקול הכולל: טיפול בפלזמה ותצהיר שומנים. ניקוי פלזמה של כיסויים חיוני כדי להבטיח שיש כיסוי נאות והידבקות של הידרוג'ל אגרוז לכיסוי הזכוכית. ניקוי פלזמה משיג שני דברים: ראשית, הוא מסיר עקבות של חומר אורגני מפני השטח של הזכוכית; שנית, הוא מפעיל את משטח הכיסוי, ומאפשר עלייה בגשימות ככל שהידופיליות משטח הזכוכית עולה 62,63. נגיעה במשטח הכיסוי לאחר הפלזמה תנטרל ותזהם את המשטח האולטרה-דק ומומלץ מאוד נגדו. ההמלצה שלנו היא לגעת רק בקצוות ובחלק התחתון של כיסוי הכיסויים בעת טיפול בכיסויים לשלב הליהוק של אגרוז. הצעד הקריטי השני הוא התצהיר של שומנים על משטח ההידרוג'ל היבש. שיטה זו משתמשת בתצהיר שומנים טיפה, אשר דורש כרומטוגרפיה גז (GC) מחט וזרם אוויר להפקיד כמה microliters של תמיסת שומנים בכל פעם, המאפשר שליטה מדויקת של כמות השומנים הוסיף ואת המיקום של סרט השומנים על פני השטח הידרוג'ל. החיסרון של שיטה זו הוא שאם לא נעשה בזהירות, זה יכול לגרום כמה אזורים נבחרים עם סרט שומנים עבה יותר, וכתוצאה מכך תפוקות GUV מופחת. לכן, זה קריטי כדי להבטיח כי יש רזה אחידה של שכבת השומנים ככל האפשר על פני השטח של האגרוז.

אחד היתרונות המשמעותיים ביותר של פרוטוקול זה הוא הגמישות של הפלטפורמה עצמה; שיטה זו מתאימה מאוד לשינויים בהרכב החלבון והשומנים, כמו גם בשינויי אנקפסולציה וחיץ. פרוטוקול זה יכול, באופן עקרוני, לכלול כל חלבון transmembrane, כפי שהצלחנו לשלב בהצלחה מספר חלבונים transmembrane שונים, החל קולטן אדנוסין (A2AR) לצמח aquaporins מבלי להקריב פונקציונליות42,45,64. באופן מסורתי, חלבונים שולבו ב- GUVs בעקבות solubilization על ידי דטרגנטים או שילוב לתוך פרוטאו-ליפוזומים או שלל חד-צדדי קטן שניתן לשלב לאחר מכן ב- GUV65 מעוצב מראש. היתרון של שיטת הנפיחות ההידרוג'ל המותאמת שלנו הוא שהיא מסירה את התלות של חומרי ניקוי או שלפוחיות ביניים ומספקת פיגום לחות בינוני. היתרונות של זה הם כפולים: אנחנו יכולים לשלב ביציבות GPCRs פונקציונלי לתוך הממברנה במאגר רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית מבלי להסתמך על שיטות החלפת דטרגנט הדורשות הכנה וטיפול יותר לגבי הריכוז של חומרי ניקוי אמר, וכי התהליך שבו GUVs ניצן מעל פני השטח של הידרוג'ל מאפשר את הכיוון הנכון של החלבונים bilayer66 . הראינו כי תהליך ניצני ה- GUV כרוך בהתמזגות של שלל קטן יותר בקנה מידה ננומטרי לשלשלות גדולות יותר בקנה מידה מיקרון, המעודד אוריינטציה נכונה של חלבון מההתחלה. הראינו שזה המקרה בעבודתנו הקודמת; בקיצור, תייגנו נוגדן שמתמקד בלולאה ציטוטוסולית ספציפית של קולטן אדנוסין ודגרנו את הנוגדן המסומן עם החלבון, ואז שילבנו את החלבון המסומן ב-GUVs המסומנים בצבע שומנים בדם בשיטת הנפיחות ההידרוג'ל המותאמת. לאחר מכן חשפנו את שלטי החלבון לקוונצ'ר טעון, שאינו מסוגל לחצות את הדו-שכבתית. לאחר מכן אנו רואים ירידה של 50% בפלואורסצנטיות של צבע השומנים, אך הפלואורסצנטיות של החלבון המסומן אינה מושפעת מהקוונצ'ר, ומדגימה אוריינטציה נכונה44.

עבודה קודמת מתוך המעבדה שלנו חקרה את התפקיד שבו מטען קבוצת ראש שומנים, שומנים טעונים zwitterionic ו נטו-יונית, כמו גם תכונות חיץ הידרוג'ל כגון pH, כוח יוני, osmolarity, ריכוז הידרוג'ל יש על הדינמיקה של היווצרות GUV67. בקיצור, מטען שומנים בדם אינו משפיע במידה רבה על היווצרות GUV, בעוד תכונות חיץ כגון עלייה בריכוז סוכרוז (למשל, 500 מ"מ סוכרוז ב 185 mM כוח יוני PBS חוצץ) להשפיע לרעה על היווצרות GUV, וכתוצאה מכך שלל בצורה לא סדירה כי סביר להניח לא בקלות להשאיל את עצמם קציר. פתרונות חומציים (pH = 3) מגבירים את קצב ההיווצרות, בעוד פתרון בסיסי יותר (pH = 8) מדכא את קצב היווצרות ה- GUV. GUVs עדיין נוצרים הן במאגרים החומציים והן במאגרים הבסיסיים, עם הבדלים שוליים בלבד בגודל ההדבקה. ריכוזי אגרוז נמוכים (~ 0.1-1 w/v%) משפיעים לרעה גם על היווצרות GUV בשל היעדר כיסוי משטח הומוגני וירידה בנפיחות הידרוג'ל, כוח הכרחי בהתמזגות וניצנים של GUVs מפני השטח ההידרוג'ל. לכן, קבענו כי ריכוז אגרוז סופי של 2 w /v% עם תמיסת סוכרוז/גלוקוז של 100-200 מ"מ, בשילוב עם חוזק יוני חיץ של 185 מ"מ PBS ב- pH 7.4 משיג איזון טוב של נפיחות אגרוז, קצב היווצרות GUV, וגודל ארסיות עוקבת. עבור שלל המכיל חלבון, הגדלת ריכוז האגרוז הראשוני ל 3 w / v% מאפשר ריכוז אגרוז סופי של 2 w / v% לאחר תוספת של תמיסת החלבון. בנוסף לדינמיקת היווצרות, מערכת חיץ סוכרוז / גלוקוז גם מקלה על משקעים ואיסוף לאחר מכן של GUVs שנוצרו, כמו גם הדמיה תחת מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה65,68.

ישנן כמה נקודות זהירות לגבי פרוטוקול זה, במיוחד לגבי agarose ואת הבחירה של שלפוחיות. למשל, בעוד אנו משתמשים agarose טמפרטורת נמסה אולטרהלו, התליית מים אגרוז צריך להגיע לפחות 60 °C (60 °F) כדי להיות מותך, ואת תערובת חלבון אגרוז הוא דגירה ב 45 °C (55 °F).  מניסיוננו, טמפרטורה זו אינה מבטלת את הפעילות של 5-HT1AR, אך זהירות מוצדקת לחלבונים אחרים. באופן כללי, agarose אנו משתמשים מתחיל ג'ל ב 20 °C (50 °F) ולכן התגובה נפיחות יכולה להתרחש בטמפרטורות מעל 20 °C (70 °F), אבל תהליך זה לא יכול לתפקד מתחת לטמפרטורה זו. כמו כן יש לציין שככל שהטמפרטורה מתקרבת ל ־ 20 מעלות צלזיוס, כך הופך שלב הנפיחות לפחות יעיל, מה שמוביל לירידות הבאות בתשואות ה- GUV. האגרוז יכול גם להציג בעיה במהלך שלבי ההתיישבות והדמיון, שכן הוא יכול להימשך בתחתית צינור ההתיישבות / האיסוף כפסולת. לכן, נדרשת זהירות עבור הטמפרטורה הנדרשת כדי לשמור על אגרוז מותך ולהבטיח כי הטמפרטורה האמורה לא denature חלבון של עניין, כמו גם שאיפה פתרון ההתיישבות כדי למנוע כל עודף מושעה אגרוז מלהיות כלול במדגם הסופי. שיטה זו במצבה הנוכחי גורמת גם לגודל אוכלוסייה של GUV הטרוגניים, עם כמה שלפוחיות המציגות רב-לאומיות ותופעות ארסיות פגומות אחרות כגון שלפוחיות בתוך שלפוחיות. זה אופייני לשיטות היווצרות GUV נפוצות ודורש דריכות ושיקול דעת בעת בחירת שלל עבור מיקרוסקופיה וניתוח. GUVs המציגים רמות גבוהות במיוחד של פלואורסצנטיות גם אינם מומלצים לניתוח, כמו agarose ניתן למצוא על הפנים של כמה שלל אלה. עבודה שלא פורסמה במעבדה שלנו הצליחה להריץ ניסויי שאיפה של מיקרופיפט באמצעות שלפוחיות שנעשו בטכניקה זו, הממחישה כי שיטת אגרוז מייצרת שלפוחיות ללא אגרוז משנה מכניקה בלומן.

מלבד מגבלות, פרוטוקול זה מציג שיטה חזקה ופשוטה ליצירת ג'וונים משולבים בחלבון. הוא יכול לייצר תשואות גבוהות של ג'ו-וי בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית המשלבים חלבוני טרנס-ממברן מכוונים כראוי לתוך הדו-שכבתי מבלי להתפשר על הפונקציונליות שלהם. זוהי סטייה משיטות אחרות של היווצרות ארסית, הכוללות זרמים חשמליים או הידרציה עדינה, שתפגע באופן משמעותי במבנה החלבון ותהפוך אותו ללא מתפקד או תדרוש צעדי ניקוי והסרה נוספים. בהתחשב בכך GPCRs מייצגים יותר משליש מכל מטרות התרופות, יש עניין משמעותי להיות מסוגל ללמוד משפחה זו של חלבונים בפלטפורמה ביו-מימטית מאוד תפוקה גבוהה, תפוקה גבוהה. ליתר דיוק, היישומים של עבודה זו נעים בין המחקר של אינטראקציות חלבון שומנים, איך microenvironment השומנים משפיע על פונקציונליות חלבון לוקליזציה, ושאלות ביופיסיות בסיסיות אחרות שיכולות ליידע פיתוח תרופות וגילוי. דוגמה לכך ניתן למצוא בעבודה שהושלמה בתוך המעבדה שלנו, אשר הצליח להבחין שונות בפונקציונליות הקולטן כתוצאה של חמצון השומנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למת'יו בלוסר על דיון ועצות יקרות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי המשרד למחקר ימי (N00014-16-1-2382) והקרן הלאומית למדע (PHY-1915017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 180
בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter