Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Konstruksjon av modell lipidmembraner som inkorporerer G-proteinkoblede reseptorer (GPCRs)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen benytter agarose hevelse som en kraftig og generaliserbar teknikk for å inkorporere integrerte membranproteiner (IMPs) i gigantiske unilamellar lipid vesicles (GUVs), som beskrevet her for rekonstituering av humant 1A serotoninreseptorprotein (5-HT1AR), en av klassene av farmakologisk viktige G protein-koblede reseptorer.

Abstract

Robuste in vitro-undersøkelser av strukturen og funksjonen til integrerte membranproteiner har vært en utfordring på grunn av kompleksiteten i plasmamembranen og de mange faktorene som påvirker proteinadferd i levende celler. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er et biomimetisk og svært justerbart in vitro-modellsystem for å undersøke proteinmembraninteraksjoner og undersøke proteinadferd på en presis, stimulusavhengig måte. I denne protokollen presenterer vi en billig og effektiv metode for å fremstille GUVer med den menneskelige serotonin 1A-reseptoren (5-HT1AR) stabilt integrert i membranen. Vi fremstiller GUVs ved hjelp av en modifisert hydrogel hevelse metode; ved å deponere en lipidfilm på toppen av en blanding av agarose og 5-HT1AR og deretter hydrere hele systemet, kan vesikler dannes med riktig orientert og funksjonell 5-HT1AR innlemmet i membranen. Disse GUVene kan deretter brukes til å undersøke proteinmembraninteraksjoner og lokaliseringsatferd via mikroskopi. Til syvende og sist kan denne protokollen fremme vår forståelse av funksjonaliteten til integrerte membranproteiner, noe som gir dyp fysiologisk innsikt.

Introduction

Syntetiske modellmembraner er kraftige verktøy i undersøkelsen av biomembranes grunnleggende egenskaper og funksjoner. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er en av de mest fremtredende plattformene for å studere en rekke plasmamembranegenskaper og kan konstrueres for å etterligne forskjellige fysiologiske forhold1,2,3,4,5,6,7,8. Det er godt fastslått at plasmamembranen og dens organisasjon spiller en nøkkelrolle i en rekke cellulære prosesser, for eksempel signaltransduksjon, vedheft, endokytose og transport9,10,11,12,13,14,15.

GUVer har blitt fremstilt ved hjelp av ulike metoder, inkludert skånsom hydrering16, hydrogel hevelse17, elektroformasjon18, mikrofluidiske teknikker19,20,21,22, jetting23 og løsningsmiddelutveksling24,25,26. På grunn av utfordringer med å håndtere integrerte membranproteiner (IMPer), har in vitro-plattformer for å studere dem vært begrenset. GUVer presenterer en forenklet plattform for å studere IMPer i et miljø som etterligner deres opprinnelige miljø. Selv om det har vært flere tilnærminger for proteinrekonstituering i GUVer, oppstår utfordringer ved å inkorporere proteiner med riktig orientering og opprettholde proteinfunksjonalitet27.

Mest vellykket proteinrekonstituering i GUVer krever vaskemiddelutvekslingsmetoden; som innebærer å løse proteinene fra sitt opprinnelige miljø av vaskemidler, etterfulgt av proteinrensing, og deretter erstatte vaskemiddelmolekylene med lipider gjennom ulike metoder28. Mens vaskemidler tjener til å stabilisere den tertiære strukturen til IMPer under rensing, er vaskemiddel micelles et relativt unaturlig miljø for disse proteinene, som er bedre stabilisert, spesielt for funksjonelle studier, i lipid bilayers28,29,30. Videre har det vært vanskelig å innlemme funksjonelle transmembranproteiner i lipidbilayeren ved hjelp av tradisjonelle GUV-fabrikasjonsteknikker på grunn av størrelsen, delikatessen til disse proteinene og de ekstra rengjøringsmiddelutvekslingstrinnene som trengs27,31,32,33. Bruk av organisk løsningsmiddel for å fjerne vaskemidler forårsaker proteinaggregering og denaturing34. En forbedret vaskemiddelmediert metode har vært lovende, men forsiktighet er nødvendig for rengjøringsmiddel fjerning trinn og optimalisering kan være nødvendig for spesifikke proteiner31,35. I tillegg kan metoder som bruker elektroformasjon begrense valg av protein og er kanskje ikke egnet for alle lipidsammensetninger spesielt ladede lipider31,36,37. En annen teknikk som har blitt brukt er peptidindusert fusjon av store unilamellar vesikler (LUVer) som inneholder ønsket protein med GUVs, selv om det ble funnet å være arbeidskrevende og kan føre til innsetting av fremmede molekyler - de fusogene peptidene33,38,39. Giant plasmamembran vesicles (GPMVs), som er avledet fra levende celler, kan brukes til å overvinne noen av disse problemene, men de tillater minimal kontroll av den resulterende lipid- og proteinsammensetningen14,40,41. Derfor presenterer integrasjonen av IMPer i bilipidlaget av GUVer ved hjelp av vår modifiserte agarose hevelsesmetode en pålitelig metode for å undersøke disse proteinene i membranmiljøet ytterligere42,43,44,45.

Cellulær signalering og kommunikasjon innebærer en familie av proteiner kjent som G protein-koblede reseptorer (GPCRs); GPCRs er blant de største familien av proteiner og er forbundet med modulerende humør, appetitt, blodtrykk, kardiovaskulær funksjon, åndedrett og søvn blant mange andre fysiologiske funksjoner46. I denne studien brukte vi human serotonin 1A reseptor (5-HT1AR) som er et prototypisk medlem av GPCR-familien. 5-HT1AR finnes i sentralnervesystemet (CNS) og blodårene; det påvirker mange funksjoner som kardiovaskulære, gastrointestinale, endokrine funksjoner, samt deltakelse i regulering av humør47. En stor barriere mot GPCR-forskning oppstår fra deres komplekse amfifile struktur, og GUVer presenterer en lovende plattform for undersøkelse av ulike egenskaper av interesse, alt fra proteinfunksjonalitet, lipidproteininteraksjoner og proteinproteininteraksjoner. Ulike tilnærminger har blitt brukt til å studere lipidproteininteraksjoner som overflateplasmonresonans (SPR)48,49, kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR)50,51, protein lipidoverlegg (PLO) assay51,52,53,54, innfødt massespektrometri55, isotermisk titreringskalorimetri (ITC)56,57 og liposom sedimenteringsanalyse58,59. Laboratoriet vårt har brukt den forenklede GUV-tilnærmingen for å undersøke effekten av lipidproteininteraksjoner på proteinfunksjonalitet ved å inkapsulere BODIPY-GTPγS, som binder seg til Giα-underenheten i reseptorens aktive tilstand. Deres binding løsner fluoroforen som produserer et fluorescenssignal som kan oppdages over tid45. Videre undersøkte ulike studier Lipid-proteininteraksjoner og proteinenes rolle i å registrere eller stabilisere membrankurvatur60,61, og bruk av en mulig GUV-tilnærming kan være en viktig fordel.

Denne protokollen demonstrerer en enkel metode for å inkorporere GPCRs i membranen til GUVer ved hjelp av et modifisert agarose hydrogelsystem17,42. Videre, basert på vårt tidligere arbeid, kan vår metode være egnet for IMPer som kan bære kortsiktig eksponering for 30-40 °C. Kort sagt sprer vi en tynn film av agarose kombinert med membranfragmenter som inneholder GPCR av interesse. Etter gelering av dette laget legger vi en lipidløsning på toppen av agarose og lar løsningsmidlet fordampe. Rehydrering av systemet ble deretter utført med en vandig buffer, noe som resulterte i dannelse av GUVer med protein innlemmet i lipidbilayeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proteinmerking

  1. Tillat NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragmenter og en 7 K MWCO spin desalting kolonne å likevektere ved romtemperatur.
  2. Løs opp 1 mg NHS-rhodamin i 100 μL dimetylsulfoksid (DMSO).
  3. Tilsett 5 μL 1 M natriumbikarbonatoppløsning for å øke pH-en til 5-HT1AR-oppløsningen til pH 8.
  4. Tilsett 3,66 μL av NHS-rhodaminoppløsningen til 50 μL av 5-HT1AR-oppløsningen og pipetten forsiktig opp og ned i et mikrosenterrør.
    MERK: Sørg for å ha minst 10x molar overskudd av NHS-rhodamin.
  5. Hold blandingen beskyttet mot lys og sett på rotator ved romtemperatur i 1 time.
  6. Vask en 7 k MWCO spinnkolonne med 200 μL 1x fosfatbuffer saltvann (1x PBS) tre ganger i 1,5 min ved 1,5 RCF for hver vask.
  7. Tilsett det merkede proteinet i en kolonne og balanser mengden i et annet mikrosenterrør.
  8. Spinn ned det merkede proteinet en gang i 5 min ved 1,5 RCF.
  9. Ta et UV-vis-spektrum ved hjelp av et nanodrop spektrofotometer på 280 nm og 554 nm og beregn merkingseffektiviteten i henhold til produsentens bruksanvisning.
  10. Oppbevar det merkede proteinet som er tildekket ved 5 °C til videre bruk. Løsningen er stabil i omtrent en uke etter merking.

2. GUVer med membraninnarbeidet 5-HT 1A

  1. Fremstilling av materialer og reagenser
    1. La proteinet, lipidene og BSA (Bovine serumalbumin) likevekte til romtemperatur.
    2. I løpet av denne tiden rengjør dekslene ved å plassere dem i metanol og sonikere i 30 min ved 40 °C. Pass på at metanol helt dekker dekslene og vannstanden i vannbadet er over metanolnivået i beholderen.
      MERK: Metanol er giftig og bør håndteres i passende kjemisk hette.
    3. Tørk av overflødig metanol på dekslene med en mild luftstrøm. Plasser dekslene i en 40 °C ovn i 15 minutter for å sikre at de overflødige dekslene tørker av.
    4. Start plasmarengjøringsprosessen. Først plasserer du dekslene i plasmarenseren og lukker luftinntaksventilen for å evakuere all luften inne i kammeret.
    5. Når kammeret er under vakuum, rengjør dekslene i 5 minutter ved hjelp av høy RF-strøminnstilling og et nesten komplett vakuum, med bare et lite luftinntak i vakuumkammeret. For å sikre riktig plasmanivå, juster åpningen av vakuumkammeret slik at plasmaets resulterende farge er en jevn, lys rosa.
      MERK: Det er avgjørende når du bruker luft at plasmaet forblir en lys rosa farge i løpet av plasmabehandlingstrinnet, da en mørkere lilla farge indikerer at det er feil mengde luft i kammeret og vil resultere i en suboptimal plasmabehandling.
    6. Når 5 min har passert, slå av RF-strømmen og slipp vakuumet.
      MERK: Ved fjerning fra plasmakammeret må du sørge for at dekslene forblir tildekket.
  2. Hydrogel forberedelse
    1. Kombiner 6 mg ultra-lav smeltetemperatur agarose med 300 μL ultrapure vann (dvs. 2% (w / v) agarose).
      MERK: 2 % agarose vil bli brukt til å lage proteinfrie GUVer. Agarose oppløsning kan holdes ved 45 °C i to dager.
    2. Kombiner 9 mg ultra-lav temperatur agarose med 300 μL ultrapure vann for 3 m / v% agarose av som tilberedt i trinn 3.1. 3% agarose vil bli brukt til å lage protein innlemmet GUVs.
    3. Virvel oppløsningen kort før du plasserer dem på 90 °C varmeblokken i 10 min. Deretter virveler du røret igjen før du overfører det til en 45 °C varmeblokk for å holde det i smeltet form til videre bruk.
  3. Agarose og proteinblanding
    1. Bland 21 μL 3% agarose med 7 μL 5-HT1AR membranfragmenter. Pipette opp og ned sakte mange ganger for å sikre tilstrekkelig blanding. Deretter inkuberer du ved 45 °C i 1 min.
  4. Hydrogel og lipidavsetning
    1. For proteinfrie GUVer: Lag en tynn film på nykonsentede deksler med 20 μL 2% agarose. Slipp raskt en annen deksler på toppen av agarosedråpen og skyv forsiktig dekslene fra hverandre for å lage en tynn film på begge dekslene.
      MERK: Dette trinnet er vanskelig ved at glidningen av dråpen må skje mens agarose fortsatt er i smeltet form.
    2. For proteininkorporerte GUVer: Pipette protein/agaroseblandingen opp og ned en gang til, og tilsett deretter 20 μL av de 2% agarose på en plasmarengjort coverlip. Følg instruksjonene for slip-casting som beskrevet ovenfor.
    3. La agarose gel beskyttet mot lys i 30 min ved romtemperatur.
    4. Deponer lipidene dråpevis på toppen av agaroselaget. Bruk totalt 10 μL 2 mg/ml 1-palmitoyl-2-oleoyl-glysero-3-fosfokolin (POPC) med 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin (DPPE) merket med ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (eller lipidblanding av interesse) i kloroform på toppen av agarosefilmen. Deponer dråpene ved hjelp av en gasskromatografinål og spred ett dråpe om gangen via en mild luftstrøm.
      MERK: Det er nødvendig med forsiktighet med dette trinnet for å lage et relativt jevnt lag med lipider på toppen av hydrogelen. Kloroform er også giftig og bør håndteres i passende kjemisk hette.
    5. Monter Sykes-Moore (S-M)-kamrene ved å plassere en O-ring på toppen av dekslene, og plasser deretter den øverste delen av kammeret på toppen av O-ringen. Bruk nøkkelen fra produsenten til å montere kammeret ved å skru sammen kammerkomponentene for å forsegle kammeret og forhindre lekkasje.
      MERK: Toppen av kammeret bør strammes på O-ringen, men det er nødvendig med forsiktighet for å sikre at dekslene forblir intakte, da dekslene kan sprekke hvis O-ringen ikke sitter ordentlig i kammeret. Sørg også for at kammeret er forseglet stramt nok til at kammeret ikke lekker når hevelsesløsningen tilsettes. Unnlatelse av å stramme kammeret nok vil føre til lekkasjer og tap av prøve.
  5. Hevelse og høsting av vesicles
    1. Hydrater hele systemet ved å forsiktig pipettere 450 μL 200 mM sukrose i 1x PBS og forsiktig banke kamrene for å sikre tilstrekkelig bufferdekning av hydrogel-lipidlagene.
      MERK: Sukroseløsningen kan erstattes med en rehydreringsbuffer som inneholder biologiske interessesonder.
    2. Plasser kamrene ved 45 °C og dekk den øverste delen av kammeret med en deksleslip for å forhindre fordampning. La prøven svulme, beskyttet mot rusk og lys i 1 time.
    3. Tilsett 100 μL 1 mg/ml BSA i ultrarent vann i hver brønn på en 96-brønnsplate som skal brukes. Inkuber ved romtemperatur i 1 time.
    4. Vask tre ganger med ultra-rent vann og en gang med 200 mM sukrose i 1x PBS.
    5. Til slutt legger du til 200 mM glukose i 1x PBS til tilsetningen av GUV-prøveløsningen.
      MERK: BSA ble brukt til å blokkere GUV-adsorpsjon.
    6. Etter at hydrogelen har svulmet, rist forsiktig og trykk på kammeret for å løsne eventuelle GUVer som kan forbli festet til hydrogeloverflaten. Deretter forsiktig pipette opp GUV-sukrose-løsningen.
      MERK: Som et valgfritt trinn for å sikre at alle vesicles løsnes fra overflaten, rører du forsiktig noe av sukrosefjæringen tilbake på hydrogeloverflaten.
    7. Flytt suspensjonen inn i et tidligere forberedt mikrosenterfugerør som inneholder 700 μL 200 mM glukose i 1x PBS.
      MERK: Tetthetsgradienten vil føre til oppgjør av vesiklene til bunnen av sentrifugerøret.
    8. La vesiklene slå seg ned i en time til for å sikre at vesiklene kan synke til bunnen av mikrocentrifugerøret, noe som gir optimal innsamling.
    9. Etter sedimentering av GUVer i glukose, overfør 300 μL fra bunnen av sentrifugerøret (de avgjorte vesiklene) til den tidligere forberedte og BSA-behandlede 96-brønnsplaten for å undersøke vesiklene under det konfiskere mikroskopet.
      MERK: Pass på at du unngår bunnen av mikrosenterrøret for å minimere mengden rusk som samles inn i den endelige prøven.
  6. Kontroller prøvene under mikroskopet.
    1. Skinn en 488 nm laser på prøven (som lar oss visualisere membranen, da bilayeren er merket med ATTO-488-DPPE).
    2. Skinn en 561 nm laser på prøven (som lar oss visualisere proteinet, siden det har blitt merket med NHS-Rhodamine).
      MERK: Forsiktighet er nødvendig mens du ser på prøven, da fotooksidasjon kan destabilisere vesiklene. Vesicles ble observert samme dag.

Figure 1
Figur 1: Illustrasjon av de detaljerte protokolltrinnene. Opprettet med BioRender.com Klikk her for å se en større versjon av denne illustrasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Konsentrasjonen av protein ble målt, og graden av merking ble beregnet som molarforholdet mellom fargestoffet og proteinet til å være 1: 1. Ved å undersøke GUVene ved hjelp av konfektmikroskopi, kunne vi bekrefte vellykket dannelse og proteinintegrasjon av vesiklene. Lipidene ble merket med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, og proteinet ble kovalent merket via rhodamin NHS-ester modifikasjon av primære aminer. Figur 2a og figur 2b viser en proteininkorporert vesicle i henholdsvis ATTO 488- og rhodaminkanalene. Alle mikrografer har vært mørkestrøm og flatfelt korrigert. Figur 2c og figur 2d viser en negativ kontroll GUV uten protein inkorporert. Figur 3a og figur 3b viser et proteininkorporert GUV med linjeintensitetsprofiler gitt av den stiplede hvite linjen i samme vesicle i begge kanaler. Linjeintensitetsprofilen viser et todimensjonalt plott over intensitetene i bildepunktene langs den hvite tegnede linjen i bildet. X-aksen er avstanden langs linjen, og y-aksen er pikselintensiteten. ImageJ-programvare ble brukt til å plotte profilintensiteten til den angitte linjen.

Figure 2
Figur 2: Mikrografer som sammenligner proteininkorporerte GUVer og GUVer uten protein (kontroll). Mikrografer (a) og (b) viser proteininkorporert GUV fluorescens med henholdsvis de respektive ATTO 488- og rhodaminkanalene. Mikrografer (c) og (d) viser et protein utelatt GUV når de er begeistret for henholdsvis ATTO 488 og rhodaminkanaler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Øverste rad viser mikrografer av proteininkorporerte GUVer i ATTO 488 (a) og rhodamin (b) kanaler. Linjeintensitetsprofiler for de angitte hvite stiplede linjene er under. Analysen ble utført ved hjelp av ImageJ-programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har identifisert to trinn som er avgjørende for suksessen til den overordnede protokollen: plasmabehandling og lipidavsetning. Plasmarengjøring av dekslene er avgjørende for å sikre at det er tilstrekkelig dekning og vedheft av agarose hydrogel til glasslipdekslene. Plasmarengjøring oppnår to ting: for det første fjerner det spor av organisk materiale fra glassoverflaten; For det andre aktiverer den dekslene, noe som gir en økning i fuktbarheten etter hvert som glassoverflatens hydrofilisitet øker62,63. Berøring av dekslene etter plasmarengjøring vil inaktivere og forurense den ultraclean overflaten og frarådes sterkt. Vår anbefaling er å bare berøre kantene og undersiden av dekslene når du håndterer dekslene for agarose slip casting trinn. Det andre kritiske trinnet er avsetning av lipider på den tørre hydrogeloverflaten. Denne metoden bruker en dropwise lipidavsetning, som krever en gasskromatografi (GC) nål og en luftstrøm for å deponere noen mikroliter lipidoppløsning om gangen, noe som gir presis kontroll over mengden lipid tilsatt og plasseringen av lipidfilmen på hydrogeloverflaten. Ulempen med denne metoden er at hvis den ikke gjøres nøye, kan det resultere i noen få utvalgte områder med en tykkere lipidfilm, noe som resulterer i reduserte GUV-utbytter. Dermed er det viktig å sikre at det er så jevnt tynt av et lipidlag som mulig på overflaten av agarose.

En av de viktigste fordelene med denne protokollen er selve plattformens fleksibilitet; denne metoden gir seg veldig godt til endringer i protein- og lipidsammensetning, samt innkapsling og buffermodifikasjoner. Denne protokollen kan i prinsippet omfatte ethvert transmembranprotein, da vi har vært i stand til å innlemme en rekke forskjellige transmembranproteiner, alt fra adenosinreseptoren (A2AR) til plante aquaporiner uten å ofre funksjonalitet42,45,64. Tradisjonelt har proteiner blitt innlemmet i GUVer etter solubilisering av vaskemidler eller inkorporering i proteo-liposomer eller små unilamellar vesikler som senere kan integreres i en forhåndsformet GUV65. Fordelen med vår modifiserte hydrogel hevelse metode er at den fjerner avhengigheten av vaskemidler eller mellomliggende vesicles og gir et mellomliggende hydrert stillas. Fordelene med dette er todelt: Vi kan stabilt innlemme funksjonelle GPCR-er i membranen i en mer fysiologisk relevant buffer uten å stole på vaskemiddelutvekslingsmetoder som krever mer forberedelse og omsorg angående konsentrasjonen av nevnte vaskemidler, og at prosessen som GUVs knopper av overflaten av hydrogelen, gir riktig orientering av proteinene i bilayer66 . Vi har vist at GUV spirende prosessen innebærer koalescens av mange mindre nanometer-skala vesikler i større, mikron-skala vesikler, noe som oppmuntrer til riktig protein orientering fra begynnelsen. Vi har vist at dette er tilfelle i vårt tidligere arbeid; Kort sagt, vi covalently merket et antistoff rettet mot en bestemt cytosolic sløyfe av Adenosine reseptoren og inkuberte merket antistoff med proteinet, og deretter innlemmet merket protein i lipid-farget-merket GUVs ved hjelp av den modifiserte hydrogel hevelse metoden. Vi eksponerte deretter protein-inkorporerte vesicles til en ladet quencher, som ikke er i stand til å krysse bilayeren. Vi ser deretter en 50% reduksjon i fluorescens av lipidfargen, men fluorescensen av det merkede proteinet forblir upåvirket av quencheren, og demonstrerer riktig orientering44.

Tidligere arbeid ut av laboratoriet vårt har undersøkt rollen som lipid hodegruppeladning, zwitterionic og net-ionic ladet lipider, samt buffer- og hydrogelegenskaper som pH, ionisk styrke, osmolaritet og hydrogelkonsentrasjon har på dynamikken i GUV-formasjon67. Kort sagt, lipidladning påvirker ikke i stor grad GUV-dannelsen, mens bufferegenskaper som økning i sukrosekonsentrasjon (f.eks. 500 mM sukrose i 185 mM ionisk styrke PBS-buffer) påvirker GUV-dannelsen negativt, noe som resulterer i uregelmessig formede vesikler som mest sannsynlig ikke lett vil gi seg til høsting. Sure løsninger (pH = 3) øker dannelseshastigheten, mens en mer grunnleggende løsning (pH = 8) undertrykker hastigheten på GUV-dannelsen. GUVer dannes fortsatt ved både sure og grunnleggende buffere, med bare marginale forskjeller i vesicle størrelse. Lave agarosekonsentrasjoner (~0,1-1 m/v%) påvirker også GUV-formasjonen negativt på grunn av mangel på homogen overflatedekning og en reduksjon i hydrogel hevelse, en nødvendig kraft i koalescens og spirende av GUVs av hydrogeloverflaten. Dermed har vi fastslått at en 2 m / v% endelig agarosekonsentrasjon med en sukrose / glukoseløsning på 100-200 mM, kombinert med en bufferionisk styrke på 185 mM PBS ved pH 7,4 oppnår en god balanse mellom agarose hevelse, GUV-formasjonshastighet og påfølgende vesiclestørrelse. For vesikler som inneholder protein, øker den første agarose konsentrasjonen til 3 m / v% gir en endelig agarose konsentrasjon på 2 m / v% etter tilsetning av proteinoppløsningen. I tillegg til formasjonsdynamikken letter sukrose/glukosebuffersystemet også sedimentering og etterfølgende innsamling av dannede GUVer, samt visualisering under fasekontrastmikroskopi65,68.

Det er noen punkter med forsiktighet angående denne protokollen, spesielt med hensyn til agarose og valg av vesicles. For eksempel, mens vi bruker en ultralow smeltetemperatur agarose, må agarose-vannfjæringen nå minst 60 °C for å bli smeltet, og agarose-proteinblandingen inkuberes ved 45 °C.  Vår erfaring er at denne temperaturen ikke eliminerer aktiviteten til 5-HT1AR, men forsiktighet er garantert for andre proteiner. Generelt begynner agarose vi bruker å gele ved 20 °C, og dermed kan hevelsesreaksjonen skje ved temperaturer over 20 °C, men denne prosessen kan ikke fungere under den temperaturen. Det skal også bemerkes at jo nærmere temperaturen kommer til 20 °C, jo mindre effektiv blir hevelsestrinnet, noe som fører til påfølgende reduksjoner i GUV-utbyttet. Agarose kan også presentere et problem under sedimenterings- og visualiseringstrinnene, da det kan vedvare på bunnen av sedimenterings-/oppsamlingsrøret som rusk. Dermed er det nødvendig med forsiktighet for temperaturen som kreves for å opprettholde smeltet agarose og sikre at den nevnte temperaturen ikke vil denaturere proteinet av interesse, samt aspirere sedimenteringsløsningen for å unngå at overflødig suspendert agarose blir inkludert i den endelige prøven. Denne metoden i sin nåværende tilstand resulterer også i en heterogen GUV-populasjonsstørrelse, med noen vesikler som viser multilamellaritet og andre feil vesicle fenomener som vesikler i vesiles. Dette er typisk for vanlige GUV-formasjonsmetoder og krever årvåkenhet og diskresjon ved valg av vesicles for mikroskopi og analyse. GUVer som viser uvanlig høye nivåer av fluorescens anbefales heller ikke for analyse, da agarose finnes på innsiden av noen av disse vesiklene. Upublisert arbeid ut av laboratoriet vårt har vært i stand til å kjøre mikropipette aspirasjonseksperimenter ved hjelp av vesicles laget ved hjelp av denne teknikken, noe som illustrerer at agarosemetoden produserer vesicles uten mekanikk-endrende agarose i lumen.

Begrensninger til side, denne protokollen presenterer en robust og grei metode for å generere protein innlemmet GUVs. Det kan generere høye utbytter av GUVs i fysiologisk relevante forhold som inkorporerer riktig orientert transmembrane proteiner i bilayer uten å gå på kompromiss med deres funksjonalitet. Dette er et avvik fra andre metoder for vesicledannelse, som involverer elektriske strømmer eller mild hydrering, som vil skade proteinets struktur betydelig og gjøre det ikke-fungerende eller kreve ytterligere vaskemiddel-solubiliserings- og fjerningstrinn. Gitt at GPCRs representerer oppover en tredjedel av alle farmasøytiske mål, er det betydelig interesse for å kunne studere denne familien av proteiner i en svært justerbar, høy gjennomstrømning, biomimetisk plattform. Mer spesifikt spenner anvendelsene av dette arbeidet fra studiet av protein-lipid interaksjoner, hvordan lipidmikromiljøet påvirker proteinfunksjonalitet og lokalisering, og andre grunnleggende biofysiske spørsmål som kan informere farmasøytisk legemiddelutvikling og oppdagelse. Et eksempel på dette finnes i arbeidet som er fullført i laboratoriet vårt, som har vært i stand til å skjelne varianser i reseptorfunksjonalitet som følge av lipidoksidasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Matthew Blosser for verdifull diskusjon og råd. Dette arbeidet ble støttet av Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) og National Science Foundation (PHY-1915017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Tags

Bioingeniør utgave 180
Konstruksjon av modell lipidmembraner som inkorporerer G-proteinkoblede reseptorer (GPCRs)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter