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Bioengineering

Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo utilizza il gonfiore dell'agarosio come tecnica potente e generalizzabile per incorporare proteine di membrana integrali (PIM) in vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV), come descritto qui per la ricostituzione della proteina del recettore della serotonina 1A umana (5-HT1AR), una delle classi di recettori accoppiati a proteine G farmacologicamente importanti.

Abstract

Robuste indagini in vitro sulla struttura e la funzione delle proteine di membrana integrali sono state una sfida a causa delle complessità della membrana plasmatica e dei numerosi fattori che influenzano il comportamento delle proteine nelle cellule vive. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono un sistema modello in vitro biomimetico e altamente sintonizzabile per studiare le interazioni proteina-membrana e sondare il comportamento proteico in modo preciso e dipendente dallo stimolo. In questo protocollo, presentiamo un metodo economico ed efficace per fabbricare GUV con il recettore umano della serotonina 1A (5-HT1AR) stabilmente integrato nella membrana. Fabbrichiamo GUV utilizzando un metodo di rigonfiamento dell'idrogel modificato; depositando un film lipidico sopra una miscela di agarosio e 5-HT1AR e quindi idratando l'intero sistema, si possono formare vescicole con 5-HT1AR opportunamente orientato e funzionale incorporato nella membrana. Questi GUV possono quindi essere utilizzati per esaminare le interazioni proteina-membrana e il comportamento di localizzazione tramite microscopia. In definitiva, questo protocollo può far progredire la nostra comprensione della funzionalità delle proteine di membrana integrali, fornendo una profonda comprensione fisiologica.

Introduction

Le membrane modello sintetiche sono potenti strumenti nello studio delle proprietà e delle funzioni fondamentali delle biomembrane. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono una delle piattaforme più importanti per studiare una varietà di proprietà della membrana plasmatica e possono essere progettate per imitare diverse condizioni fisiologiche1,2,3,4,5,6,7,8. È ben noto che la membrana plasmatica e la sua organizzazione svolgono un ruolo chiave in una moltitudine di processi cellulari, come la trasduzione del segnale, l'adesione, l'endocitosi e il trasporto9,10,11,12,13,14,15.

I GUV sono stati fabbricati utilizzando vari metodi, tra cui idratazione delicata16, gonfiore dell'idrogel17, elettroformazione18, tecniche microfluidiche19,20,21,22, jetting23 e scambio di solventi24,25,26. A causa delle difficoltà nella gestione delle proteine integrali di membrana (PIM), le piattaforme in vitro per studiarle sono state limitate. I GUV presentano una piattaforma semplificata per lo studio degli IMP in un ambiente che imita il loro ambiente nativo. Sebbene ci siano stati diversi approcci per la ricostituzione proteica nei GUV, le sfide derivano dall'incorporazione di proteine con il corretto orientamento e dal mantenimento della funzionalità proteica27.

La ricostituzione proteica di maggior successo nei GUV richiede il metodo di scambio del detergente; che comporta la solubilizzazione delle proteine dal loro ambiente nativo mediante detergenti, seguita dalla purificazione delle proteine, e quindi la sostituzione delle molecole detergenti con lipidi attraverso vari metodi28. Mentre i detergenti servono a stabilizzare la struttura terziaria degli PIM durante la purificazione, le micelle detergenti sono un ambiente relativamente innaturale per queste proteine, che sono meglio stabilizzate, in particolare per gli studi funzionali, in doppiostrati lipidici28,29,30. Inoltre, incorporare proteine transmembrana funzionali nel doppio strato lipidico utilizzando le tradizionali tecniche di fabbricazione GUV è stato difficile a causa delle dimensioni, della delicatezza di queste proteine e delle fasi aggiuntive di scambio di detergenti che sarebbero necessarie27,31,32,33. L'uso di solventi organici per rimuovere i detergenti provoca aggregazione proteica e denaturazione34. Un metodo migliorato mediato dal detergente è stato promettente, tuttavia, è necessaria cautela per la fase di rimozione del detergente e potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione per proteine specifiche31,35. Inoltre, i metodi che utilizzano l'elettroformazione potrebbero limitare la scelta delle proteine e potrebbero non essere adatti a tutte le composizioni lipidiche, in particolare i lipidi caricati31,36,37. Un'altra tecnica che è stata utilizzata è la fusione indotta da peptidi di grandi vescicole unilamellari (LUV) contenenti la proteina desiderata con GUV, sebbene sia risultata laboriosa e possa portare all'inserimento di molecole estranee- i peptidi fusogenici33,38,39. Le vescicole giganti della membrana plasmatica (GPMV), che derivano da cellule viventi, possono essere utilizzate per superare alcuni di questi problemi, tuttavia consentono un controllo minimo della composizione lipidica e proteica risultante14,40,41. Pertanto, l'integrazione di PIM nello strato bilipidico dei GUV utilizzando il nostro metodo di gonfiore dell'agarosio modificato presenta un metodo affidabile per esaminare ulteriormente queste proteine nell'ambiente di membrana42,43,44,45.

La segnalazione e la comunicazione cellulare coinvolgono una famiglia di proteine note come recettori accoppiati alla proteina G (GPCR); I GPCR fanno parte della più grande famiglia di proteine e sono associati alla modulazione dell'umore, dell'appetito, della pressione sanguigna, della funzione cardiovascolare, della respirazione e del sonno tra molte altre funzioni fisiologiche46. In questo studio, abbiamo utilizzato il recettore umano della serotonina 1A (5-HT1AR) che è un membro prototipico della famiglia GPCR. 5-HT1AR può essere trovato nel sistema nervoso centrale (SNC) e nei vasi sanguigni; influenza numerose funzioni come le funzioni cardiovascolari, gastrointestinali, endocrine, oltre a partecipare alla regolazione dell'umore47. Una grande barriera alla ricerca GPCR deriva dalla loro complessa struttura anfifila e i GUV presentano una piattaforma promettente per lo studio di varie proprietà di interesse, che vanno dalla funzionalità proteica, alle interazioni lipidico-proteina e alle interazioni proteina-proteina. Vari approcci sono stati utilizzati per studiare le interazioni lipidico-proteina come la risonanza plasmonica di superficie (SPR)48,49, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)50,51, il saggio di sovrapposizione lipidica proteica (PLO)51,52,53,54, la spettrometria di massa nativa55, la calorimetria di titolazione isotermica (ITC)56,57 e il liposoma saggio di sedimentazione58,59. Il nostro laboratorio ha utilizzato l'approccio GUV semplificato per studiare l'effetto delle interazioni lipidico-proteina sulla funzionalità proteica incapsulando BODIPY-GTPγS, che si lega con la subunità Giα nello stato attivo del recettore. Il loro legame incanta il fluoroforo producendo un segnale di fluorescenza che potrebbe essere rilevato nel tempo45. Inoltre, vari studi hanno studiato le interazioni lipidico-proteina e il ruolo delle proteine nel rilevare o stabilizzare la curvatura della membrana60,61, e l'utilizzo di un approccio GUV fattibile potrebbe essere un vantaggio chiave.

Questo protocollo dimostra un metodo semplice per incorporare i GPCR nella membrana dei GUV utilizzando un sistema di idrogel di agarosio modificato17,42. Inoltre, sulla base del nostro lavoro precedente, il nostro metodo potrebbe essere adatto per i PIM che possono sopportare un'esposizione a breve termine a 30-40 °C. In breve, abbiamo diffuso un sottile film di agarosio combinato con frammenti di membrana contenenti il GPCR di interesse. Dopo la gelificazione di questo strato, depositiamo una soluzione lipidica sopra l'agarosio e lasciamo evaporare il solvente. La reidratazione del sistema è stata quindi eseguita con un tampone acquoso, con conseguente formazione di GUV con proteine incorporate nel doppio strato lipidico.

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Protocol

1. Etichettatura delle proteine

  1. Consentire a NHS-Rhodamine, ai frammenti di membrana 5-HT1A e a una colonna di dissalazione di spin 7 K MWCO di equilibrarsi a temperatura ambiente.
  2. Sciogliere 1 mg di NHS-rodamina in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO).
  3. Aggiungere 5 μL di soluzione di bicarbonato di sodio 1 M per aumentare il pH della soluzione 5-HT1AR a pH 8.
  4. Aggiungere 3,66 μL della soluzione NHS-rodamina a 50 μL della soluzione 5-HT1AR e pipettare delicatamente su e giù in un tubo microcentrifugale.
    NOTA: Assicurarsi di avere almeno 10x eccesso molare di NHS-rodamina.
  5. Tenere la miscela al riparo dalla luce e mettere il rotatore a temperatura ambiente per 1 ora.
  6. Lavare una colonna di centrifuga MWCO da 7 k con 200 μL di 1x soluzione salina tampone fosfato (1x PBS) tre volte per 1,5 minuti a 1,5 RCF per ogni lavaggio.
  7. Aggiungere la proteina etichettata a una colonna e bilanciare la quantità in un altro tubo di microcentrifuga.
  8. Abbassare la proteina marcata una volta per 5 minuti a 1,5 RCF.
  9. Prendi uno spettro UV-vis usando uno spettrofotometro nanodrop a 280 nm e 554 nm e calcola l'efficienza di etichettatura seguendo il manuale del produttore.
  10. Conservare la proteina etichettata coperta a 5 °C fino a nuovo utilizzo. La soluzione è stabile per circa una settimana dopo l'etichettatura.

2. GUV con membrana incorporata 5-HT 1A

  1. Preparazione di materiali e reagenti
    1. Lasciare che le proteine, i lipidi e la BSA (albumina sierica bovina) si equilibrino a temperatura ambiente.
    2. Durante questo periodo, pulire i coperchi mettendoli in metanolo e sonicandoli per 30 minuti a 40 °C. Assicurarsi che il metanolo copra completamente i coperchi e che il livello dell'acqua nel bagno d'acqua sia superiore al livello del metanolo nel contenitore.
      NOTA: il metanolo è tossico e deve essere maneggiato in un cappuccio chimico appropriato.
    3. Asciugare il metanolo in eccesso sulle coperture con un leggero flusso d'aria. Posizionare il rack coverslip coperto in un forno a 40 °C per 15 minuti per assicurarsi che i coverslip in eccesso si asciughino.
    4. Iniziare il processo di pulizia al plasma. In primo luogo, posizionare i coperchi nel pulitore al plasma e chiudere la valvola di aspirazione dell'aria per evacuare tutta l'aria all'interno della camera.
    5. Una volta che la camera è sotto vuoto, pulire i coverslip per 5 minuti utilizzando l'impostazione di potenza RF elevata e un vuoto quasi completo, con solo una leggera presa d'aria nella camera a vuoto. Per garantire il corretto livello di plasma, regolare l'apertura della camera a vuoto in modo tale che il colore risultante del plasma sia un rosa costante e brillante.
      NOTA: È fondamentale quando si utilizza l'aria che il plasma rimanga di un colore rosa brillante per tutta la durata della fase di trattamento al plasma, poiché un colore viola più scuro indica che c'è una quantità impropria di aria nella camera e si tradurrà in un trattamento al plasma non ottimale.
    6. Una volta trascorsi i 5 minuti, spegnere l'alimentazione RF e rilasciare il vuoto.
      NOTA: Al momento della rimozione dalla camera al plasma, assicurarsi che i coperchi rimangano coperti.
  2. Preparazione idrogel
    1. Combinare 6 mg di agarosio a bassissima temperatura di fusione con 300 μL di acqua ultrapura (cioè 2% (p/v) di agarosio).
      NOTA: il 2% di agarosio sarà utilizzato per produrre GUV privi di proteine. La soluzione di agarosio può essere conservata a 45 °C per due giorni.
    2. Combinare 9 mg di agarosio a bassissima temperatura con 300 μL di acqua ultrapura per 3 p/v% di agarosio come preparato al punto 3.1. Il 3% di agarosio sarà utilizzato per produrre GUV incorporati in proteine.
    3. Ruotare brevemente la soluzione prima di posizionarla sul blocco termico a 90 °C per 10 minuti. Quindi, ruotare nuovamente il tubo prima di trasferirlo in un blocco di calore a 45 °C per mantenerlo nella forma fusa fino a un ulteriore utilizzo.
  3. Miscelazione di agarosio e proteine
    1. Mescolare 21 μL di agarosio al 3% con i 7 μL di frammenti di membrana 5-HT1AR. Pipettare su e giù lentamente molte volte per garantire un'adeguata miscelazione. Quindi, incubare a 45 °C per 1 min.
  4. Idrogel e deposizione lipidica
    1. Per i GUV privi di proteine: fare un film sottile su coperchi appena puliti al plasma usando 20 μL di agarosio al 2%. Lascia cadere rapidamente un altro coverslip sopra la goccia di agarosio e fai scorrere delicatamente i coverslips per creare un film sottile su entrambi i coverslip.
      NOTA: Questo passaggio è complicato in quanto lo scorrimento della goccia deve avvenire mentre l'agarosio è ancora nella forma fusa.
    2. Per i GUV incorporati in proteine: pipettare la miscela proteina/agarosio su e giù ancora una volta, quindi depositare 20 μL dell'agarosio al 2% su una coverslip pulita al plasma. Seguire le indicazioni di scorrimento come descritto sopra.
    3. Lasciare gelificare l'agarosio al riparo dalla luce per 30 minuti a temperatura ambiente.
    4. Depositare i lipidi a goccia sopra lo strato di agarosio. Utilizzare un totale di 10 μL di 2 mg/mL di 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) con 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DPPE) etichettato con ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (o miscela lipidica di interesse) in cloroformio sopra il film di agarosio. Depositare le goccioline usando un ago per gascromatografia e distribuire una goccia alla volta attraverso un flusso d'aria delicato.
      NOTA: è necessaria cautela con questo passaggio per creare uno strato relativamente uniforme di lipidi sulla parte superiore dell'idrogel. Inoltre, il cloroformio è tossico e deve essere maneggiato in un cappuccio chimico appropriato.
    5. Assemblare le camere Sykes-Moore (S-M) posizionando un O-ring sopra il coperchio e quindi posizionando il componente superiore della camera sopra l'O-ring. Utilizzare la chiave fornita dal produttore per assemblare la camera avvitando i componenti della camera insieme per sigillare la camera e prevenire eventuali perdite.
      NOTA: la parte superiore della camera deve essere serrata sull'O-ring, ma è necessaria cautela per garantire che il coverslip rimanga intatto poiché il coverslip può rompersi se l'O-ring non si trova correttamente nella camera. Inoltre, assicurarsi che la camera sia sigillata abbastanza ermeticamente in modo che la camera non perda quando viene aggiunta la soluzione di gonfiore. Il mancato serraggio sufficiente della camera comporterà perdite e perdita di campione.
  5. Gonfiore e raccolta delle vescicole
    1. Idratare l'intero sistema pipettando delicatamente 450 μL di 200 mM di saccarosio in 1x PBS e picchiettando delicatamente le camere per garantire un'adeguata copertura tampone degli strati idrogel-lipidici.
      NOTA: La soluzione di saccarosio può essere sostituita con un tampone di reidratazione contenente sonde biologiche di interesse.
    2. Posizionare le camere a 45 °C e coprire la parte superiore della camera con un coperchio per evitare l'evaporazione. Lasciare che il campione si gonfi, al riparo da detriti e luce per 1 ora.
    3. Aggiungere 100 μL di 1 mg/mL di BSA in acqua ultrapura in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti destinata ad essere utilizzata. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
    4. Lavare tre volte con acqua ultrapura e una volta con 200 mM di saccarosio in 1x PBS.
    5. Infine, aggiungere 200 mM di glucosio in 1x PBS fino all'aggiunta della soluzione campione GUV.
      NOTA: BSA è stato utilizzato per bloccare l'adsorbimento GUV.
    6. Dopo aver lasciato che l'idrogel si gonfiasse, scuotere delicatamente e picchiettare la camera per rimuovere eventuali GUV che potrebbero rimanere attaccati alla superficie dell'idrogel. Quindi, pipettare con cura la soluzione GUV-saccarosio.
      NOTA: come passaggio opzionale per garantire che tutte le vescicole siano staccate dalla superficie, pipettare delicatamente parte della sospensione di saccarosio sulla superficie dell'idrogel.
    7. Spostare la sospensione in un tubo microcentrifuga precedentemente preparato contenente 700 μL di 200 mM di glucosio in 1x PBS.
      NOTA: Il gradiente di densità porterà all'assestamento delle vescicole sul fondo del tubo della centrifuga.
    8. Lasciare riposare le vescicole per un'altra ora per assicurarsi che le vescicole possano affondare sul fondo del tubo del microcentrifuga, consentendo una raccolta ottimale.
    9. Dopo la decantazione dei GUV in glucosio, trasferire 300 μL dal fondo del tubo della centrifuga (le vescicole stabilizzate) nella piastra a 96 pozzetti precedentemente preparata e trattata con BSA per esaminare le vescicole al microscopio confocale.
      NOTA: Assicurarsi di evitare il fondo del tubo di microcentrifuga per ridurre al minimo la quantità di detriti raccolti nel campione finale.
  6. Controllare i campioni al microscopio.
    1. Brillare un laser a 488 nm sul campione (che ci consente di visualizzare la membrana, poiché il doppio strato è stato etichettato con ATTO-488-DPPE).
    2. Brillare un laser a 561 nm sul campione (che ci permette di visualizzare la proteina, poiché è stata etichettata con NHS-Rhodamine).
      NOTA: è necessaria cautela durante l'imaging del campione poiché la fotoossidazione può destabilizzare le vescicole. Le vescicole sono state osservate lo stesso giorno.

Figure 1
Figura 1: Illustrazione dei passaggi dettagliati del protocollo. Creato con BioRender.com Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

La concentrazione di proteine è stata misurata e il grado di etichettatura è stato calcolato come il rapporto molare tra il colorante e la proteina per essere 1: 1. Esaminando i GUV utilizzando la microscopia confocale, siamo stati in grado di confermare la formazione e l'integrazione proteica delle vescicole. I lipidi sono stati etichettati con 0,4 mol% ATTO 488-DPPE e la proteina è stata etichettata covalentemente tramite la modifica dell'estere NHS della rodamina delle ammine primarie. La Figura 2a e la Figura 2b mostrano una vescicola incorporata in proteine nei canali ATTO 488 e rodamina, rispettivamente. Tutte le micrografie sono state corrette a corrente scura e campo piatto. La Figura 2c e la Figura 2d mostrano un GUV di controllo negativo senza proteine incorporate. La Figura 3a e la Figura 3b mostrano una proteina incorporata GUV con profili di intensità della linea dati dalla linea bianca tratteggiata della stessa vescicola in entrambi i canali. Il profilo di intensità della linea mostra un grafico bidimensionale delle intensità dei pixel lungo la linea bianca disegnata all'interno dell'immagine. L'asse x è la distanza lungo la linea e l'asse y è l'intensità dei pixel. Il software ImageJ è stato utilizzato per tracciare l'intensità del profilo della linea indicata.

Figure 2
Figura 2: Micrografie che confrontano i GUV incorporati nelle proteine e i VAV senza proteine (controllo). Le micrografie (a) e (b) mostrano la fluorescenza GUV incorporata nella proteina con i rispettivi canali ATTO 488 e rodamina, rispettivamente. Le micrografie (c) e (d) mostrano una proteina omessa GUV quando eccitata con i canali ATTO 488 e rodamina, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: La riga superiore mostra le micrografie dei GUV incorporati nelle proteine nei canali ATTO 488 (a) e rodamina (b). I profili di intensità della linea per le linee tratteggiate bianche indicate sono riportati di seguito. L'analisi è stata eseguita utilizzando il software ImageJ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo identificato due passaggi fondamentali per il successo del protocollo complessivo: il trattamento al plasma e la deposizione lipidica. La pulizia al plasma dei coverslip è essenziale per garantire che vi sia un'adeguata copertura e adesione dell'idrogel di agarosio al coperchio di vetro. La pulizia al plasma realizza due cose: in primo luogo, rimuove tracce di materia organica dalla superficie del vetro; in secondo luogo, attiva la superficie del coverslip, consentendo un aumento della bagnabilità all'aumentare dell'idrofilia della superficie del vetro62,63. Toccare la superficie del coperchio dopo la pulizia al plasma inattiverà e contaminerà la superficie ultrapulenta ed è fortemente sconsigliato. La nostra raccomandazione è di toccare solo i bordi e le parti inferiori del coperchio quando si maneggiano i coperchi per la fase di colata di agarosio. Il secondo passo critico è la deposizione di lipidi sulla superficie dell'idrogel secco. Questo metodo utilizza una deposizione lipidica a goccia, che richiede un ago per gascromatografia (GC) e un flusso d'aria per depositare pochi microlitri di soluzione lipidica alla volta, consentendo un controllo preciso della quantità di lipidi aggiunti e il posizionamento del film lipidico sulla superficie dell'idrogel. Lo svantaggio di questo metodo è che, se non eseguito con attenzione, può risultare in alcune aree selezionate con un film lipidico più spesso, con conseguente riduzione delle rese di GUV. Pertanto, è fondamentale garantire che vi sia uno strato lipidico il più uniformemente sottile possibile sulla superficie dell'agarosio.

Uno dei vantaggi più significativi di questo protocollo è la flessibilità della piattaforma stessa; questo metodo si presta molto bene ai cambiamenti nella composizione proteica e lipidica, nonché all'incapsulamento e alle modifiche del buffer. Questo protocollo può, in linea di principio, includere qualsiasi proteina transmembrana, in quanto siamo stati in grado di incorporare con successo una serie di diverse proteine transmembrana, che vanno dal recettore dell'adenosina (A2AR) alle acquaporine vegetali senza sacrificare la funzionalità42,45,64. Tradizionalmente, le proteine sono state incorporate nei GUV in seguito alla solubilizzazione mediante detergenti o all'incorporazione in proteo-liposomi o piccole vescicole unilamellari che possono essere successivamente integrate in un GUV65 preformato. Il vantaggio del nostro metodo di rigonfiamento in idrogel modificato è che rimuove la dipendenza da detergenti o vescicole intermedie e fornisce un'impalcatura idratata intermedia. I vantaggi di questo sono duplici: possiamo incorporare stabilmente GPCR funzionali nella membrana in un tampone più fisiologicamente rilevante senza fare affidamento su metodi di scambio detergente che richiedono maggiore preparazione e cura per quanto riguarda la concentrazione di detti detergenti e che il processo mediante il quale i GUV germogliano dalla superficie dell'idrogel consente il corretto orientamento delle proteine nel doppio strato66 . Abbiamo dimostrato che il processo di gemmazione GUV comporta la coalescenza di molte vescicole più piccole su scala nanometrica in vescicole più grandi e micron, che incoraggiano il corretto orientamento proteico fin dall'inizio. Abbiamo dimostrato che questo è il caso nel nostro lavoro precedente; in breve, abbiamo etichettato covalentemente un anticorpo mirato a uno specifico ciclo citosolico del recettore dell'adenosina e incubato l'anticorpo marcato con la proteina, quindi incorporato la proteina etichettata in GUV con colorante lipidico utilizzando il metodo di gonfiore dell'idrogel modificato. Abbiamo quindi esposto le vescicole incorporate nelle proteine a un quencher carico, che non è in grado di attraversare il doppio strato. Successivamente vediamo una riduzione del 50% della fluorescenza del colorante lipidico, ma la fluorescenza della proteina marcata rimane inalterata dal quencher, dimostrando un corretto orientamento44.

Precedenti lavori del nostro laboratorio hanno studiato il ruolo in cui la carica del gruppo lipidico, i lipidi carichi zwitterionici e net-ionici, nonché le proprietà tampone e idrogel come pH, forza ionica, osmolarità e concentrazione di idrogel hanno sulla dinamica della formazione di GUV67. In breve, la carica lipidica non influisce in gran parte sulla formazione di GUV, mentre le proprietà tampone come l'aumento della concentrazione di saccarosio (ad esempio, 500 mM di saccarosio in 185 mM di tampone PBS di forza ionica) influenzano negativamente la formazione di GUV, con conseguente vescicole di forma irregolare che molto probabilmente non si prestano prontamente alla raccolta. Le soluzioni acide (pH = 3) aumentano il tasso di formazione, mentre una soluzione più basica (pH = 8) sopprime il tasso di formazione di GUV. I GUV si formano ancora sia nei tamponi acidi che in quelli basici, con differenze solo marginali nella dimensione delle vescicole. Basse concentrazioni di agarosio (~0,1-1 p/v%) influenzano negativamente anche la formazione di GUV a causa della mancanza di copertura superficiale omogenea e di una diminuzione del gonfiore dell'idrogel, una forza necessaria nella coalescenza e nel germogliamento dei GUV dalla superficie dell'idrogel. Pertanto, abbiamo determinato che una concentrazione finale di agarosio del 2 p / v% con una soluzione di saccarosio / glucosio di 100-200 mM, combinata con una forza ionica tampone di 185 mM PBS a pH 7,4 raggiunge un buon equilibrio di gonfiore di agarosio, velocità di formazione di GUV e successiva dimensione delle vescicole. Per le vescicole che contengono proteine, l'aumento della concentrazione iniziale di agarosio al 3 p/v% consente una concentrazione finale di agarosio del 2 p/v% dopo l'aggiunta della soluzione proteica. Oltre alla dinamica di formazione, il sistema tampone saccarosio/glucosio facilita anche la sedimentazione e la successiva raccolta di GUV formati, nonché la visualizzazione al microscopio a contrasto di fase65,68.

Ci sono alcuni punti di cautela riguardo a questo protocollo, in particolare per quanto riguarda l'agarosio e la selezione delle vescicole. Ad esempio, mentre usiamo un'agarosio a temperatura di fusione ultrabassa, la sospensione di agarosio-acqua deve raggiungere almeno 60 °C per diventare fusa e la miscela di agarosio-proteina viene incubata a 45 °C.  Nella nostra esperienza, questa temperatura non elimina l'attività di 5-HT1AR, ma la cautela è giustificata per altre proteine. In generale, l'agarosio che usiamo inizia a gelificare a 20 °C e quindi la reazione di gonfiore può avvenire a temperature superiori a 20 °C, ma questo processo non può funzionare al di sotto di quella temperatura. Va inoltre notato che più la temperatura si avvicina a 20 °C, meno efficiente diventa la fase di rigonfiamento, con conseguente diminuzione delle rese di GUV. L'agarosio può anche presentare un problema durante le fasi di assestamento e visualizzazione, in quanto può persistere sul fondo del tubo di decantazione/raccolta come detriti. Pertanto, è necessaria cautela per la temperatura necessaria per mantenere l'agarosio fuso e garantire che detta temperatura non denatura la proteina di interesse, nonché aspirare la soluzione di sedimentazione per evitare che qualsiasi eccesso di agarosio sospeso venga incluso nel campione finale. Questo metodo nel suo stato attuale si traduce anche in una dimensione eterogenea della popolazione GUV, con alcune vescicole che mostrano multilamellarità e altri fenomeni di vescicole difettose come vescicole all'interno di vescicole. Questo è tipico dei comuni metodi di formazione GUV e richiede vigilanza e discrezione nella selezione delle vescicole per la microscopia e l'analisi. Anche i GUV che mostrano livelli insolitamente elevati di fluorescenza non sono raccomandati per l'analisi, poiché l'agarosio può essere trovato all'interno di alcune di queste vescicole. Un lavoro non pubblicato dal nostro laboratorio è stato in grado di eseguire esperimenti di aspirazione di micropipette utilizzando vescicole realizzate con questa tecnica, dimostrando che il metodo dell'agarosio produce vescicole senza agarosio che altera meccanicamente nel lume.

Limitazioni a parte, questo protocollo presenta un metodo robusto e semplice per generare GUV incorporati in proteine. Può generare alte rese di GUV in condizioni fisiologicamente rilevanti che incorporano proteine transmembrana correttamente orientate nel doppio strato senza comprometterne la funzionalità. Questo è un allontanamento da altri metodi di formazione delle vescicole, che comportano correnti elettriche o idratazione delicata, che danneggerebbero significativamente la struttura della proteina e la renderebbero non funzionale o richiederebbero ulteriori solubilizzazioni e passaggi di rimozione del detergente. Dato che i GPCR rappresentano oltre un terzo di tutti i bersagli farmaceutici, c'è un interesse significativo nel poter studiare questa famiglia di proteine in una piattaforma biomimetica altamente sintonizzabile, ad alto rendimento. Più specificamente, le applicazioni di questo lavoro vanno dallo studio delle interazioni proteina-lipidi, come il microambiente lipidico influenza la funzionalità e la localizzazione delle proteine e altre domande biofisiche di base che possono informare lo sviluppo e la scoperta di farmaci farmaceutici. Un esempio di questo può essere trovato nel lavoro completato all'interno del nostro laboratorio, che è stato in grado di discernere le varianze nella funzionalità del recettore a seguito dell'ossidazione lipidica.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Ringraziamo Matthew Blosser per la preziosa discussione e i consigli. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) e dalla National Science Foundation (PHY-1915017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

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Bioingegneria Numero 180
Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)
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Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

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