Summary
Dobbelt harpiksstøbning mikro-computertomografi, eller DUCT, muliggør visualisering, digitalisering og segmentering af to rørformede systemer samtidigt for at lette 3D-analyse af orgel arkitektur. DUCT kombinerer ex vivo injektion af to radiopaque harpikser efterfulgt af mikro-computertomografi scanning og segmentering af tomografi data.
Abstract
Leveren er det største indre organ hos mennesker og mus, og høj auto-fluorescens udgør en betydelig udfordring for vurderingen af den tredimensionelle (3D) arkitektur af orgelet på hele organniveau. Leverarkitektur er kendetegnet ved flere forgrenede lumeniserede strukturer, som kan fyldes med harpiks, herunder vaskulære og galdetræer, hvilket etablerer et meget stereotyp mønster i det ellers hepatocytrige parenkym. Denne protokol beskriver rørledningen til udførelse af dobbelt harpiksstøbning mikro-computertomografi, eller "DUCT". DUCT indebærer indsprøjtning portalvene og fælles galdegang med to forskellige radiopaque syntetiske harpikser, efterfulgt af vævsfiksering. Kvalitetskontrol ved at rydde en lap, eller hele leveren, med en optisk clearing agent, giver mulighed for pre-screening af passende injicerede prøver. I den anden del af DUCT-rørledningen kan en lap eller hele leveren bruges til mikro-computertomografi (microCT) scanning, (semi-)automatiseret segmentering og 3D-gengivelse af portalen venøse og galdenetværk. MicroCT resulterer i 3D-koordinatdata for de to harpikser, der giver mulighed for kvalitativ såvel som kvantitativ analyse af de to systemer og deres rumlige forhold. DUCT kan anvendes på postnatal og voksen muselever og kan yderligere udvides til andre rørformede netværk, for eksempel vaskulære netværk og luftveje i lungerne.
Introduction
Organharpiksstøbning er en teknik, der går tilbage til det 17. århundrede1. Et af de første eksempler på moderne harpiksstøbning blev udført på den menneskelige lever fra en obduktion. Intrahepatiske galdegange blev fyldt med et kontrastmiddel blandet med gelatine, efterfulgt af billeddannelse med en røntgen CT-scanning2. Formålet med DUCT teknikken er at visualisere, digitalisere og analysere to rørformede harpiksstøbte netværk, i tandem, i 3D.
DUCT er baseret på den omfattende eksisterende viden om enkeltsystem leverharpiks støbning3,4,5,6,7,8 og strækker sig til samtidig 3D visualisering og analyse af to systemer9. DUCT avanceret enkelt harpiks støbning til dobbelt harpiks støbning ved at blande to radiopaque harpikser af forskellig kontrast og injicere disse harpikser i to forskellige netværk, specielt den fælles galdegang og portal vene. DUCT kan anvendes på unge postnatale mus med reproducerbare resultater så tidligt som efternatal dag 15 (P15). Sammenlignet med mikroskopi-baserede billeddannelse teknikker, den største fordel er, at DUCT er hurtigere, antistof-fri, og levervæv autofluorescence ikke forstyrrer billeddannelse. Desuden indeholder DUCT kvantitative data, der beskriver lumeniseringsstatus, intern diameter, netværksforbindelse og perfusion. At skelne mellem tilstedeværelsen af lumendannende celler og deres de facto morfogenese i rør er afgørende for at analysere organer, hvor duklære celler er til stede, men ikke danner rør, som det kan være tilfældet i Alagille syndrom10. Den største ulempe ved DUCT er den begrænsede penetration af harpiksen, som er tyktflydende og ikke kommer ind i rør med en lille kaliber (<5 μm). DUCT kan anvendes til enhver rørformet struktur efter bestemmelse af injektion indgangspunktet, såsom arteriel og venøse kredsløbssystemer, luftveje, den ekstrahepatiske galdegang, eller lymfekar. Det kunne således lette hele organ arkitektur analyse af andre væv såsom lunger og bugspytkirtel.
MicroCT-segmenterede billeder kan behandles ved hjælp af kommercielt tilgængelig billedbehandlingssoftware, f.eks. Den harpiks-injicerede lever kan analyseres kvalitativt for netværksudvidelse og tilslutningsmuligheder eller kvantitativt for volumen, længde, forgrening, tortuositet af et enkelt system, og samspillet mellem to systemer såsom afstanden mellem to systemer, eller branchpoint afhængighed (gør system 1 filial i nærheden af system 2 forgrening?). DUCT-rørledningen, der omfatter harpiksindsprøjtning, microCT-scanning og CT-datasegmentering kombineret med detaljeret kvantitativ analyse af arkitektoniske mekanismer i to rørformede systemer, kunne give en standard for hele leveranalyse i dyremodeller.
Protocol
Den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse, blev godkendt og følger dyrevelfærdsreglerne og -reglerne fra Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Stockholm animal research ethics board). De dyr, der blev anvendt i denne undersøgelse, var vilde eller homozygode Jag1H268Q mutantmus på en blandet C3H/N og C57bl6J-baggrund. Både mænd og kvinder var inkluderet i undersøgelsen. Dyrene blev brugt på postnatal dag 15 eller som voksne mellem 3 - 8 måneder.
1. Dobbeltharpiks injektioner
- Præparation
- Forbered harpiksopløsning. For dobbelt system harpiks injektioner, forberede både gule og grønne harpikser som beskrevet i trin 1.1.2-1.1.4.
- Forbered 1 ML aliquots af fortyndet harpiks pr mus.
- Gul harpiks: Fortynd gul silikonegummi (høj radiopacitet) med det klare fortyndingsvand i en fortynding på 3:1 for at forberede gul harpiks til injektion.
- Grøn harpiks: Bland blå silikonegummi (målbart radiopacitet) med det klare fortyndingsvand i en 1:1 fortynding for at forberede blå harpiks. For at generere grøn harpiks blandes den fortyndede blå harpiks med den fortyndede gule harpiks i et forhold på 1:1. Vortex den grønne harpiks grundigt, indtil farven er homogen.
BEMÆRK: Blå harpiks har meget lav radiopacitet, der ikke kan påvises med microCT, hvilket derfor kræver fortynding med gul harpiks for at skabe to harpikser med forskellige radiopaciteter.
FORSIGTIG: Harpiks kan indeholde blykromat, som er kræftfremkaldende. Det producerer giftige gasser i en brand. Håndter med omhu og kassér harpiksen som farligt affald. - Der forberedes to injektionssæt (injektionssæt nr. 1 og injektionssæt nr. 2) med slanger som beskrevet i trin 1.1.6-1.1.11.
BEMÆRK: For voksne mus (>P30 (postnatal dag 30) = P30 - 2 år), skal du bruge injektionssættet #1 (PE10 slange med 0,6 mm ydre diameter) til almindelig galdegangsindsprøjtning og injektionssæt #2 (PE50 slange med 0,96 mm ydre diameter) til portalveindsprøjtning. For unge postnatal mus (op til P30), forberede to # 1 injektion sæt, en for galdegang og en for portal vene injektion (ingen injektion sæt # 2 som portalen venen er for smal til at rumme PE50 slanger). - For at forberede injektionssættet # 1, skæres 30 cm PE10 slanger og strække den ene ende af slangen i hånden ved at trække det, indtil det bliver så tyndt som muligt (Figur 1A, B, ca. 0,15 mm diameter, ikke-strakt PE10 slange er 0,6 mm diameter).
- Skær spidsen af den strakte PE10 slange diagonalt for at skabe en skrå spids (Figur 1B).
- Tilslut den ikke-strakte ende af PE10 slangen til en 30 G nål (Figur 1A, Injektion sæt # 1).
- For at forberede injektionssættet # 2, skæres 30 cm PE50 slanger og strække den ene ende af slangen i hånden ved at trække det, indtil det bliver tyndt nok til at passe ind i portalen vene (Figur 1A,B, ca 0,7 mm, ikke-strakt PE50 slanger er 0,96 mm diameter).
- Skær spidsen af den strakte PE50 slange diagonalt for at skabe en skrå spids (Figur 1B).
- Tilslut den ikke-strakte ende af PE50 slangen til en 23 G nål (Figur 1A, injektionssæt #2).
BEMÆRK: Hvert injektionssæt kan kun bruges til én injektion, da harpiksen hærder i sprøjten og slangen. Juster størrelsen af den strakte og skrå spids baseret på størrelsen af den fælles galdegang og portal vene af musen, afhængigt af dens alder, genotype, og fænotype. Når du er usikker på slangens størrelse og pasform, skal slangen indsættes i den relevante kanal eller beholder efter snittet, og før slangen er fyldt med harpiks. Hvis slangen er for bred til at kunne være i kanalen/beholderen, skal den strækkes yderligere. - Bedøve dyret ved isoflurane indånding (første 4% i induktionskammeret og ~ 2% ved hjælp af næsekeglen).
- Placer musen på en ventileret bænk på en dissektion pad, mens musen trækker isoflurane gennem næsen kegle. Kontroller, at dyret er bevidstløs ved en institut/IRB-anbefalet metode, f.eks. ved at klemme en af poterne.
FORSIGTIG: Isofluran kan forårsage døsighed eller svimmelhed ved indånding og kan forårsage skade på hjerte-kar-systemet og centralnervesystemet gennem langvarig eller gentagen eksponering. Inhaler den ikke. Håndter stoffet på en ventileret bænk og i godt ventilerede områder.
BEMÆRK: Det er muligt at bruge en anden bedøvelsesmetode, så længe det er kompatibelt med hjerteperfusion. - Når dyret er bevidstløst, spray den ventrale side med 70% ethanol for at forhindre interferens fra pels.
- Brug hud saks, skære huden, fascia, og muskel lag starter ved midterlinjen af bughulen og skære igennem til brysthulen for at udsætte de indre organer.
- Grib xiphoid processen med sammentævringer til at løfte brystbenet og skære mellemgulvet og ribben bur på begge sider for at udsætte hjerte og lunger.
- Fjern brystkassen ved at skære gennem ribbenene på venstre og højre side af brystkassen med en saks. Vær ekstra forsigtig med ikke at beskadige leveren, da dette vil resultere i lækage af harpiksen.
- Brug lige sammentrækninger, træk hjertet mod leveren og skær væk højre atrium.
- Indsæt en sommerfuglnål (23 G), der er tilsluttet en peristaltisk perfusionspumpe, i venstre ventrikel. Gennemgå musen transcardially med Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) og heparin (1 U / g af musen kropsvægt). Gennemsyv i 3 min med en perfusionshastighed på 5 mL/min.
BEMÆRK: Hvis musen gennemsyres korrekt, vil de indre organer blive blege, især leveren. Hvis lungerne i stedet bliver hvide, indsættes nålen i højre ventrikel og skal flyttes. Efter perfusion er musen exsanguinated og kan fjernes fra næsekeglen og isoflurane. - Sluk for isofluranepumpen.
- Harpiks injektion - Galde system harpiks støbning
- Flyt musen til dissektion mikroskop, maven op, hale mod eksperimentatoren, og hovedet væk fra eksperimentatoren. De anatomiske vartegn af interesse er afbildet i figur 2A.
- Find den ringere vena cava (Figur 2A) ved at flytte tarmen til siden. Brug fjedersaks til at lave et lille tværgående snit i den ringere vena cava for at tillade frigivelse af leverta kar-tryk (Figur 2Bi).
- Den fælles galdegang og portalvene som beskrevet i trin 1.2.4- 1.2.6.
- Flyt tarmen og bugspytkirtlen til højre side (af eksperimentatoren) ved hjælp af en fosfat-buffered saltvand (PBS)-fugtet vatpind.
- Vend den ventrale side af leveren mod hjertet ved hjælp af pbs-fugtet vatpind til at udsætte visceral overflade og hilar regionen.
- Find den fælles galdegang, der løber fra hilar-regionen på tværs af bugspytkirtlen og ind i tarmen ved lukkemusklen i Oddi (Figur 2Bii, almindelig galdegang skitseret med den gule stiplede linje, sorte pilespidser peger på Sphincter af Oddi).
BEMÆRK: Sørg for, at leveren er fugtig under hele proceduren ved at drysse den med PBS. - Ryd omgivende væv (område ~ 5 mm) fra den fælles galdegang ved hjælp af lige sammenkrumper. Placer silke suturtråd (størrelse 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm lang) under den fælles galdegang (Figur 2Bii) og bind en løs overhåndsknude omkring den fælles galdegang (Figur 2Biii).
BEMÆRK: Vælg et område til knuden halvvejs mellem hilar-regionen og lukkemusklen i Oddi og i en vis afstand fra portalvenen, så den ikke forstyrrer portalåreindsprøjtningen, når suturen er strammet rundt om den fælles galdegang. - Hold fjedersaksen flad mod den fælles galdegang for at lave et skråt snit til den fælles galdegang på det sted, hvor den fælles galdegang kommer ind i bugspytkirtlen og tarmen ved siden af lukkemusklen i Oddi. (Figur 2Biv), gul prikket linje skitserer lukkemusklen i Oddi-området, understreget af sorte pilespidser).
BEMÆRK: Dette er et afgørende skridt. Lav en skrå og ikke en tværgående snit, og gøre et snit; ikke afskære galdegangen. Skære gennem hele galdegangen gør indsættelse af slangen meget udfordrende. - Lige før brug blandes 1 mL af den gule harpiks med 50 μL af hærdemidlet (ved påfyldning og tømning af 1 mL sprøjten) og fyld en 1 mL Luer sprøjte med harpiks - hærdningsmiddel blandingen.
- Tilslut den fyldte sprøjte med slangen (sæt #1). Tryk på stemplet for at fylde slangen helt. Sørg for, at harpiks/hærdningsmiddel blandes drypper fra spidsen af slangen.
BEMÆRK: Undgå og fjern bobler i sprøjten og slangen for at opnå de bedste resultater. - Ved hjælp af knolden rettes området omkring det fælles galdegangs snit og sætter slangen i åbningen i den fælles galdegang (Figur 2Bv), med den længste kant af den skrå spids nedad mod galdegangens dorsale side. Denne orientering sikrer, at harpiks kan forlade slangeåbningen, som vender opad, ind i kanalen (Figur 2Bv).
- Stram silketrådsknuden for at fastgøre slangen inde i den fælles galdegang (Figur 2Bvi).
- Indsprøjt harpiksen i den fælles galdegang. Overhold galdeblæren og de enkelte leverlapper.
- Massér leveren med en PBS-fugtet vatpind for at hjælpe med at sprede harpiksen ligeligt. Harpiksfyldte galdeganges terminalgrene (i mus af vildtypen) er svagt synlige på leveroverfladen.
BEMÆRK: Forventet tid til at fylde leveren er 30 -100 s. - Stop injektion af harpiksen, når prikker af harpiks vises på overfladen af leveren (Figur 2Ci, blå pilespidser), eller når modstanden er opfyldt.
BEMÆRK: Arbejd så hurtigt som muligt, da harpiksen begynder at hærde efter tilsætning af harpikshærdende middel. Arbejdstiden fra tilsætning af hærdningsmidlet er ca. 15 min. - Fjern slangen ved at trække den ud af den fælles galdegang og stram hurtigt silkeknuden ved hjælp af sammenkrulninger for at forhindre harpiksen i at lække ud. Skær de løse ender af silke suturen væk, så de ikke forstyrrer portalåreindsprøjtningen.
- Smid slangen indeholdende harpiks og den resterende harpiks i det farlige affald og nålen i skarpe affald.
- Harpiks injektion - Portal vene harpiks støbning
- Ryd portalvenen (område ~ 5 mm) fra det omgivende væv ca. 2 cm fra dens indtræden i leveren ved hjælp af lige sammentak. Placer silke suturtråd (størrelse 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm lang) under portalvenens ryddede område (Figur 2Ci) og bind en løs overhåndsknude (Figur 2Cii).
- Lav et langsgående snit i portalvenen distal til leveren og knuden (Figur 2Ciii).
- Bland 1 mL af den grønne harpiks med 50 μL af hærdningsmidlet (ved påfyldning og tømning af en 1 mL sprøjte) og fyld 1 mL Luer sprøjten med harpikshærdende agent blandingen.
- Tilslut den fyldte sprøjte med slangen (sæt # 2 til >P30 mus, nyt sæt # 1 til
BEMÆRK: Undgå og fjern bobler i sprøjten og slangen for at opnå de bedste resultater. - Ved hjælp af sammenkrump rettes portalvenen ved at trække det omgivende væv mod eksperimentatoren og indsætte slangen med den længste kant af den skrå spids mod beholderens rygside (Figur 2Ciii).
- Stram silketråden for at fastgøre slangen i portalvenen.
- Indsprøjt harpiksen i portalvenen. Overhold blodkarrene fyldes op med harpiks. Massér leveren med en PBS-fugtet vatpind for at hjælpe med at sprede harpiksen ligeligt (Figur 2Civ).
- Stop injektion af harpiksen, når alle blodkar er fyldt (enderne af portal vener er synlige i leveren periferien), eller når modstanden er opfyldt.
BEMÆRK: Arbejd hurtigt, da harpiksen begynder at hærde efter tilsætning af hærdningsmidlet. Arbejdstiden fra tilsætning af hærdningsmidlet er ca. 15 min for injektionssæt # 1 og 25 min for injektionssæt # 2. - Fjern slangen ved at trække slangen ud af portalvenen og stram hurtigt silkeknuden ved hjælp af sammenkøjere for at forhindre harpiksen i at lække ud.
- Smid slangen indeholdende harpiks og den resterende harpiks i det farlige affald og nålen i skarpe affald.
- Lever dissektion og fiksering
- Dissekere hele leveren ved at skære det væk fra det omgivende væv og mellemgulvet.
- Placer forsigtigt hele leveren i et tomt 50 mL konisk rør med den ventrale side vendt op og rygsiden hviler på væggen i det koniske rør for at forhindre deformation af leveren. Det koniske rør opbevares vandret natten over ved 4 °C, for at harpiksen hærder helt.
BEMÆRK: Enhver beholder, der er stor nok til at passe leveren, kan bruges i stedet for 50 mL konisk rør. Brug af en flad bund beholder vil øge sandsynligheden for, at leveren ikke er deformeret. - Adskil leveren i individuelle lapper. Foretage et udvalg af de lapper, der skal anvendes til mikroct-analyse (1.4.4-1.4.5) eller kvalitetskontrol (1.4.6-1.4.8). Eventuelt bruge hele leveren til både optisk clearing og microCT uden at adskille det i individuelle lapper.
BEMÆRK: Leverarkitekturen i galde- og karsystemerne er forskellig i hver lap, og der kræves derfor matchede lobeanalyser. Den optiske clearing forstyrrer ikke microCT-scanningen, og den lap(e), der anvendes til kvalitetskontrol, kan efterfølgende scannes med microCT. Omvendt kan prøver, der scannes med microCT, efterfølgende optisk ryddes til sammenligning. Hele leveranalysen er således mulig. I mus af vildt typen (C3H/C57bl6 genetisk baggrund) fyldes den højre mediale lap først af harpiksindsprøjtninger, hvilket gør dette til en egnet lap til mikroCT-analyse med den højeste reproducerbarhed. Den venstre laterale lap er den største lap, hvor det derfor er ligetil at pre-screen for injektion kvalitet. Udvælgelsen af lap (eller hele leveren), der anvendes til kvalitetskontrol og microCT scanning er afhængig af dyremodellen og forskningsspørgsmål. - I en ventileret hætte skal du forberede 4% formaldehydopløsning (10 -20 mL pr. Rør). Fastgør de lapper, der anvendes til microCT, med 4 % formaldehyd natten over ved 4 °C og derefter vask en gang med PBS (10-20 mL pr. rør).
- Saml formaldehydaffald i en separat beholder. Opbevar leverflipperne i PBS ved 4 °C til kortvarig opbevaring eller 70 % ethanol til langtidsopbevaring. Fortsæt med afsnit 2: Mikro-computertomografi.
FORSIGTIG: Formaldehyd forårsager akut toksicitet, hvis det sluges, indåndes eller kommer i kontakt med huden. Formaldehyd er en brandfarlig væske og damp. Det forårsager alvorlige hudforbrændinger og øjenskader. Kan forårsage en allergisk hudreaktion. Dødelig, hvis den indåndes (koncentreret eller i pulver). Kan forårsage åndedrætsirritation. Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. Kan forårsage kræft. Forårsager skader på organer (øjne, centralnervesystemet). Forsigtighedserklæringer - hold dig væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Ingen rygning. Brug beskyttelseshandsker og beskyttelsesbeklædning. I tilfælde af spild skal du straks tage alt tøj, der var forurenet. Hvis du er i kontakt med huden: skyl det forurenede område med vand. Hvis inhaleres: fjern personen til frisk luft og overvåge vejrtrækning, hvis det er behageligt. Ring straks til et giftcenter / læge. Hvis i øjnene: skyl øjnene med vand i flere minutter. Hvis det er muligt, skal du fjerne kontaktlinser. - For kvalitetskontrol skal du fastgøre de resterende lapper (mindst en) med 50% methanol (blandet med deioniseret vand) i mindst 4 timer, vuggende ved stuetemperatur, efterfulgt af 100% methanol natten over vuggende ved stuetemperatur. Saml methanolaffald i en separat beholder.
FORSIGTIG: Methanol forårsager akut toksicitet, hvis det sluges, indåndes eller kommer i kontakt med huden. Methanol er en brandfarlig væske og damp. Brug beskyttelseshandsker og tøj. Undgå at trække vejret ved håndtering og holde dig væk fra ild og varme. Vask huden grundigt efter brug. I tilfælde af spild skal du straks tage alt forurenet tøj af. Skyl huden med vand. Hvis inhaleret: Fjern personen til frisk luft og holde sig behageligt for vejrtrækning. Hvis inhaleret, slugt, eller udsat, ringe til en gift center / læge. - I en ventileret hætte fremstilles benzylalkohol og benzylbenoat (BA: BB, 1:2) (5 -10 mL pr. lap) opløsning.
- Placer leverelappen i et 15- eller 50- mL polypropylenrør (afhængigt af lobens størrelse), der indeholder BABB-opløsning. Lad det gynge ved stuetemperatur, indtil det er gennemsigtigt. Dette trin kan tage mellem 2-16 timer afhængigt af lobens størrelse.
BEMÆRK: BABB-opløsningen opløser visse typer plast. Det er sikkert at opbevare prøverne i polypropylenrør eller glasbeholdere.
FORSIGTIG: Benzylbenzoat kan forårsage akut toksicitet, når det sluges. Det er giftigt for vandlevende liv med langvarige virkninger. Forsigtighedserklæringer: Vask huden grundigt efter håndtering. Det er skadeligt, når det sluges, i kontakt med huden eller indåndes. Undgå indånding af røg/dampe. Vask hænderne grundigt efter håndtering. Du må ikke spise, drikke eller ryge, når du bruger dette produkt. Hvis slugt - ring til et giftcenter / læge, hvis du er syg Brug i ventilerede områder. Saml spild. Indhold/beholder bortskaffes til et godkendt affaldsbortskaffelsesanlæg. - Undersøg kvaliteten af injektionen. Kun godt injiceret lever bør scannes med microCT.
2. Mikro-computertomografi
- Prøveforberedelse
- Forbered 1% agarose gel ved at blande 100 mL destilleret vand og 1 g agarose pulver. Anbring blandingen i en mikrobølgeovn og kog opløsningen, indtil agarosepulveret er opløst.
- Hærde 1% agarosegelen til ~40 °C for at undgå termiske skader på leverprøven.
- Placer lobe (r) af interesse i en 15 mL konisk rør og fylde det med 1% agarose gel til ca 2/3 af den samlede volumen af røret. Dette trin minimerer uønsket prøvebevægelse under CT-måling.
- CT-måling
BEMÆRK: Følgende trin er afhængige af CT-enheder, og specifikke indstillinger og handlinger kan variere for forskellige CT-enheder og producenter. I denne protokol var den anvendte mikro-computertomografiscanner udstyret med et nanofokus røntgenrør (180 kV/15 W) og flat-panel dynamisk 41|100 (4048 px x 4048 px, pixelstørrelse 100 mm med binning 2) til CT-målingerne.- Monter det 15 mL koniske rør med prøven på rotationsstadiet af en CT-anordning, og lad det termisk tilpasse sig målekammeret i mindst 1 time.
- Når prøven er termisk tilpasset, skal du centrere den i FOV (Field of View).
- Optimer kildeprøven og prøvedetektorafstandene (SSD, SDD) for at nå tilstrækkelig voxelopløsning, f.eks. 12 μm til en voksen murinleverprøve eller 6,5 μm til
- Indstil anskaffelsesparametrene (dvs. accelererende spænding og strøm, eksponering, binning, gennemsnit) i kølvandet på CT-enhedsproducentens anbefalinger for at nå et tilstrækkeligt niveau af detekterede signal. Disse parametre er ikke kun CT-enhedsafhængige, men også prøveafhængige og bør optimeres for hver prøve. I Hankeova et al.9 var indstillingerne: 80 kV accelererende spænding, 160 μA accelererende strøm, 400 ms eksponeringstid og 2000 billeder.
- Start en CT-måling. Brug en dedikeret tomografisk rekonstruktionssoftware til at rekonstruere CT-dataene.
3. Analyse og datasegmentering
BEMÆRK: Følgende trin er softwareafhængige til billedbehandling. specifikke indstillinger og handlinger kan variere afhængigt af den anvendte software.
- Indlæs CT-dataene: Vælg kommandoen > Importer >. Et yderligere valg afhænger af det specifikke format for de CT-data, der skal behandles.
- Brug funktionen Surface Determination på det øverste panel til at segmentere harpiksen i dataene ved hjælp af global tærskeling. I dialogvinduet skal du bestemme tærskelværdien med histogrammeevaluering ved at indstille placeringen af den røde "Isovalue"-linje til kun at segmentere de harpiksfyldte fartøjer (dvs. omfattet af den gule linje i det præsenterede "eksempelpanel") (figur 3A).
- I venstre panel skal du vælge modulet Opret INVESTERINGSAFKAST fra Volumen/CAD/Mesh for at skabe et interesseområde (ROI) for de harpiksfyldte fartøjer. Brug indstillingen Opret investeringsafkast fra dækkende i dialogboksen , vælg navnet på den behandlede diskenhed, og bekræft.
- Eliminer fejlagtig segmentering af støjklynger i baggrundsområdet for dette investeringsafkast. Markér dette investeringsafkast i højre panel, højreklik på det, og vælg modulet Split ROI.
- I dialogvinduet skal du angive parameteren Minimum Volume [voxel] for at udelukke alle støjpartiklerne - denne værdi er eksperiment- og dataafhængig og skal optimeres for hver prøve, der skal analyseres (Figur 3B).
- Opret glatte, kontinuerlige og solide kanalmasker uden artefakter i det harpiksstøbte INVESTERINGSAFKAST - f.eks. tilstedeværelsen af luftbobler eller harpikslækage.
- I venstre panel skal du bruge modulet Udjævning, indstille parameteren Udjævningsstyrke til 1 eller 2 (afhængigt af de enkelte data, når højere værdier kan føre til modeldeformation, især når der er tale om fine strukturer). Hvis det er nødvendigt, skal du køre denne proces to gange (Figur 3C).
- Identificere og adskille de enkelte rørformede systemer i den segmenterede harpiks maske.
- Opret et separat investeringsafkast til systemet fyldt med den mere absorptive harpiks (den gule harpiks, der anvendes til den fælles galdegang injektion) med højere intensitet værdier i CT-data. Følg den procedure, der er beskrevet i trin 3.2. (Figur 3Di).
- Markér det nye investeringsafkast og harpiksmasken ROI, højreklik og vælg Træk INVESTERINGSAFKAST(R) fra, og træk det nye investeringsafkast fra harpiksmasken ROI for at oprette et nyt investeringsafkast for det resterende rørformede system (Figur 3Dii, iii).
- Eksporter de resulterende ROI'er til begge rørformede systemer i forskellige formater, baseret på operatørpræferencer, til efterfølgende behandling i forskellige software. Yderligere skal du behandle de resulterende investeringsafkast i en volumengrafiksoftware for at eksportere den endelige visualisering i form af et billede eller en video.
Representative Results
Hvad skal man gøre
Vellykket dobbelt harpiks injektion opnås, når både de intrahepatiske galdegange og portal vene vaskulatur er godt fyldt. Som et kvalitetskontroltrin giver rydning af en lap (for eksempel den venstre laterale lap) mulighed for verifikation af en vellykket injektion efterfulgt af billeddannelse af lapper af interesse. Den optisk ryddede lap kan scannes senere ved hjælp af microCT; derfor er det muligt at optisk rydde hele leveren. I velinsprøjtet muselever skal portalvene vasulatur fyldes med harpiks, indtil leveroverkanten og harpiksen skal være synlig i sidegrene (figur 4), og denne arkitektur er trofast rekapituleret i microCT-scannede og segmenterede data. Endvidere bør velinstrumlede intrahepatiske galdekanaler være synlige ved siden af hovedportalåregrenene, der strækker sig næsten til periferien, og harpiks skal være synlig i de store sidegrene. Hvis kontrollapet passerer kvalitetskontroltrinnet, kan de interessante lapper (inkluderet den optisk ryddede) scannes med microCT. Resultatet af de segmenterede data fra en godt injiceret lever vises for en P15-mus (Figur 4A, B) og en voksen mus (Figur 4C, D).
Hvad man ikke skal gøre
Intakt levervæv er en forudsætning for en vellykket injektion. Vær ekstra forsigtig, når du skærer bughulen og membranen ikke at uheld nick levervævet. Hvis der er fysisk skade på leveren under denne procedure, harpiksen er meget sandsynligt, at lække ud under portal vene injektion (Figur 5A). Det er ikke muligt at opnå en god injektion af det vaskulære system, hvis leveren er fysisk beskadiget.
En af de almindelige fejl er underfyldning leveren med harpiks, der kan føre til udfordringer for visualisering eller analyse. En af årsagerne til systemets underfyldning er harpikshærdning for tidligt i nålen eller spidsen af slangen, før injektionen er afsluttet (Figur 5B, blå pilespidser, beslag skildrer store bobler). En god praksis er at bruge et injektionssæt pr. dyr og arbejde hurtigt, efter at hærdemidlet er tilsat harpiksen. Hvis harpiksen hærder under injektionen (som kan observeres af et halvt fyldt system, her eksemplificeret med en halvfyldt portal vene vaskulatur) fjerne slangen, skære spidsen af slangen (altid diagonalt for at skabe en skrå spids), og skubbe stemplet. Hvis harpiks begynder at dryppe igen, skal slangen forsigtigt indsættes igen og fastgøres med suturen. Hvis harpiksen er hærdet i nålen, skal du udskifte slangen helt, fylde den med harpiks (undgå bobler), forsigtigt indsætte slangen igen og fastgør den med suturen. Det kan være udfordrende at erstatte slangen, især hos unge postnatale mus
Omvendt bliver et eller begge af systemerne overfyldt med harpiks (figur 5D). Det er nødvendigt at visuelt overvåge leveren under hele injektionen. Galde system støbning med harpiks er mere udfordrende end portal vene harpiks støbning, da harpiksfyldte kanaler er kun svagt synlige på leverens overflade, og det er svært at vurdere, hvornår systemet er næsten fuld, og hvornår man skal stoppe. Når små gule harpiks prikker vises på leveren overflade (Figur 2Ci, blå pilespids), dette er et tegn på, at galdesystemet er helt fyldt, og harpiksen er begyndt at lække ud af kanalerne. Mindre harpikslækage kan korrigeres manuelt under segmentering af microCT-data (Figur 5D, højre paneler).
Hvis injektionstrykket er for højt, kan det medføre brud på fartøjer eller kanaler (figur 5E), uigenkaldeligt beskadigende kar- eller kanalarkitektur. Leveren vil ikke være egnet til microCT scanning eller analyse. For at undgå harpiks overfyldning, optimere den rigtige volumen og tryk, der anvendes til injektion i hver musemodel. Når du arbejder med mus, der er blevet udfordret med en giftig kost, genetisk modifikation, eller leverskade, der påvirker galde eller venøse systemer, eller lever stivhed, injektionstrykket og volumen kan være nødvendigt at justere som volumen og tryk tolereret kan være forskellig fra den vilde type mus. Denne protokol beskriver den manuelle injektion af de to systemer, men det er muligt at tilslutte sprøjten til en pumpe for at standardisere injektionstrykket. Bobler er en anden meget almindelig injektion artefakt, der fører til sparsom påfyldning af de rørformede netværk (Figur 5F-H, blå pilespidser). For at undgå bobledannelse skal du sørge for, at sprøjten og slangen ikke indeholder bobler, er helt fyldt med harpiks, og harpiksen drypper fra spidsen af slangen før injektion. Små bobler, der vises som negative områder på microCT-dataene, kan korrigeres manuelt under efterbehandlingstrin, selvom dette er besværligt.
Frisk er den bedste
Brug af frisk gul harpiks er en afgørende faktor, der i væsentlig grad påvirker kontrasten mellem de to harpikser og microCT data segmentering. Når den nyåbnede harpiks anvendes (figur 6A), er der en klar forskel i modsætning mellem de gule harpiksindsprøjtede galdekanaler (lysehvide) og de grønne harpiksindsprøjtede portalårer (lysegrå). Lever, der injiceres med frisk harpiks, behandles let ved hjælp af automatiseret global fortærsering. Med langvarig opbevaring bunder harpiksen ud, og kontrasten mindskes. Efter 3 måneders opbevaring kan kontrasten stadig være tilstrækkelig til at skelne portalvenen fra galdegangen (figur 6B), men nedbør påvirker blandingen af de to harpikser, som er synlig som en heterogen uigennemsigtighed i den fyldte portalåre (Fig. 6B, blå pilespidser). Heterogen kontrast påvirker den automatiserede tærskel negativt og kræver manuelle rettelser, hvilket øger behandlingstiden. Hvis harpiksen er ældre end seks måneder, er kontrasten forringet til et punkt, hvor det ikke er muligt at skelne den gulsprøjtede galdegang fra den grønsprøjtede portalåre alene baseret på deres kontrast (figur 6C). I dette tilfælde skal galdegangen og portalvenen segmenteres manuelt baseret på deres diameter og position i hilar-regionen og følges manuelt i hele microCT-dataene. Denne procedure er ekstremt tidskrævende og bedst undgås.
Figur 1: Injektionssæt til harpiksstøbning. (A) Injektion sæt # 1 består af en 30 G nål og PE10 slanger, der er ~ 30 cm lang. Injektion sæt # 2 består af en 23 G nål og PE50 slanger ~ 30 cm lang. (B) Spidsen af slangen strækkes og skæres i en vinkel for at skabe en skrå spids. Linealen i A og B er en centimeter lineal med større trin på 1 cm, mellemliggende trin på 5 mm og mindre trin på 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dobbelt harpiksstøbningsplan. (A) Skematisk, der viser det mørke venøse kredsløb og hjertet med fremhævet højre atrium, som skal skæres væk før perfusion, og den venstre ventrikel, hvori nålen skal indsættes for perfusion for at vaske blodet væk fra kredsløbssystemet. Den ringere vena cava bør afskåret under nyrerne for at lindre vaskulært tryk. (B) Galdegang harpiks injektionsdiagram. (i) Zoom billede af (A) skildrer, hvor at afskære IVC. (ii) Billede, der viser den almindelige galdegang (gul prikket linje) fra leverfælveområdet til lukkemusklen Oddis (sorte pilespidser) med suturtråd under den ryddede fælles galdegang. iii) Passende position til løs overhåndsknude omkring fælles galdegang. iv) Den gule stiplede linje og de sorte pilespidser angiver Oddis lukkemuskel, der viser den skrå vinkel for snit, og hvordan åbningen skal se ud efter det skrå vinkel snit. v) Skematisk, der viser pe10-slangens facetåbningsretning (opad) ved indsættelsen. — gul harpiks, der tilføres; harpiks skal nemt passere løst bundet knude. IVC, ringere vena cava; CBD, almindelig galdegang. (C) Portal vene harpiks injektionsdiagram. i) Den grønne stiplede linje markerer portalåren fra hilar-regionen. De blå pilespidser mærker det overfyldte galdesystem. (ii) Passende sted for løs overhånd knude omkring portalen vene. iii) Skematisk, der demonstrerer facetåbningen (opad) ved indsættelsen. iv) Udseende af lever ved injektion af grøn harpiks og gul harpiks det harpiksfyldte blodkar i leverens periferi. Pv, portalåre. Figur 2A blev oprettet med Biorender.com. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mikro CT databehandling i volumengrafiksoftware. (A) Overfladebestemmelse, (i) overvurderet isoværdi (aktuel forhåndsvisning af udvælgelse er vist i gul farve), (ii) undervurderet isoværdi, (iii) optimalt valg af isoværdi for korrekt overfladebestemmelse af portalvene og galdekanaler. (B) Opdeling område af interesse (ROI) skabt af overfladebestemmelse, (i) indstille værdien i dialogvinduet højt nok, at kun ét segment (den største) vil forblive, (ii) i gule rammer de mindre (udelukkede) partikler er vist. (C) Overfladeudjævning af dataene, (i) udjævningsfunktionen er på venstre panel, (ii) indstil udjævningsstyrken til 1 (maks. 2) og skaber nye udjævnede INVESTERINGSAFKAST, (iii) udjævnede data. (D) Adskillelse af de enkelte rørformede systemer, i) i overfladebestemmelsesfunktionen angiver isoværdien, således at kun galdesystemet er inkluderet i udvælgelsen (aktuel forhåndsvisning af udvælgelse er vist i gul farve), ii) markere roi af begge systemer og ROI af kun galdesystemet og trække galdesystemet ROI fra ROI af begge systemer, iii) Portalåre vist med grå, galdesystemet vist med grønt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Velinst injicerede galdegang (BD) og portal vene (PV) systemer. (A) Optisk ryddet højre mediale lap (RML) af postnatal dag 15 (P15) lever injiceret med to harpikser i de to systemer. Skalastang 1 mm. (B) 3D-gengivelse af P15 RML vist i (A) skildrer portal vene vaskulatur i hvidt og galdesystem i grønt. Skalastang 1 mm. (C) Optisk ryddet RML af voksen lever injiceret med to harpikser i de to systemer. Skalastang 1 mm. (D) 3D-gengivelse af voksen RML vist i (C) skildrer portal vene vaskulatur i hvid og galde system i grøn. H = hilar, P = perifer. Skalastang 1 mm. Paneler A, B, D tilpasses med tilladelse fra Hankeova et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Almindelige udfordringer ved dobbeltharpiks lever injektioner. (A) Billedet skildrer en lever, der ved et uheld blev hugget under den første åbning af bughulen, og harpiksen lækker gennem snittet (blå pilespids). (B) Dårligt injiceret portal vene system på grund af harpiks hærdning. Blå pilespidser mærker tomme terminalgrene, og røde beslag mærker store bobler. Skalastang 1 mm. (C) Dårligt injiceret portalvenesystem på grund af dårlig transcardial perfusion. Blå pilespidser mærker blod synligt i terminalgrenene. Skalastang 1 mm. (D) Overfyldt galdesystem manifesteret af isolerede kugler af harpiks. De venstre paneler viser den optisk ryddede lever, og de rigtige paneler viser 3D microCT gengivet billede. De blå stiplede konturer viser zoom-in-områder. De sorte pilespidser mærker en del af leveren, der blev beskadiget under den optiske clearing efter microCT-scanning. Skalastang 1 mm. (E) Højt tryk under harpiksindsprøjtning kan forårsage brud på portalvenen (dyret i dette panel bærer en Jag1H268Q-mutation), præget af blå pilespidser. Skalastang 1 mm. (F) Bobler i harpiksen under portalåreindsprøjtning (blå pilespidser) og (G) galdesystemindsprøjtning (blå pilespids), skalastang 1 mm. (H) MicroCT-scanning af bobler (blå pilespids), dårligt fyldte terminalgrene (røde beslag) og harpikslækage (gul pilespids), skalastang 1 mm. Klik her for at se en større version af figuren.
Figur 6: Differentialharpiks kontrast. (A) Friskåbnet gul harpiks genererer tilstrækkelig kontrast til at skelne harpiks injiceret portal vene (grå) og galdegange (hvid). B) Tre måneders opbevaring af gul harpiks fører til udfældning af harpiksen, hvilket resulterer i heterogen uigennemsigtighed (gråhvid portalvene, blå pilespids). (C) Langvarig opbevaring (>6 måneder) af gul harpiks mindsker kontrasten mellem portalvenen (grå) og galdegangene (grå). Skalalinje 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Flere kritiske trin bestemmer DUCT-succesen, fra prøveforberedelse til parametrene for CT-enheden. For at opnå de bedste resultater skal godt kontrasteret, godt injiceret og boblefri harpiks bruges til at tillade enkel digital behandling med automatiseret tærskel for at opnå 3D-data, billeder og film. Med træning og efter denne protokol er 90% af injektionerne vellykkede og resulterer i reproducerbare data. Det er vigtigt at bruge frisk gul harpiks for at opnå den bedste kontrast mellem de to injicerede systemer. Den gule harpiks har en meget stærk radiopacitet, mens den blå harpiks har målbart radiopacitet. Topresultater opnås inden for de første tre måneder efter åbningen af en ny gul harpiksflaske. Med tiden, harpiks bundfald, og efter længere opbevaring (>6 måneder), vil de gule og de grønne harpikser ikke længere kunne skelnes i CT-scanninger. Billeder med dårlig kontrast kræver omfattende og tidskrævende manuel sporing og segmentering af de to systemer. Dernæst er velspændt slanger uundværlig for at passe ind i den fælles galdegang af voksne mus og fælles galdegang og portalåre af postnatale mus. Indgangspunktet for injektionen skal oprettes med omhu. Hvis den fælles galdegang skæres åben på transversalt, det er sandsynligt, at løsrive sig fra det omgivende væv, forhindrer en vellykket indtræden af slangen. Dette trin er især delikat for postnatal mus, hvor den fælles galdegang trækker sig tilbage og "krøller op", hvis den har løsrevet sig fra det omgivende væv, hvilket gør indsættelsen af slangen ekstremt udfordrende. Den fælles galdegang indrejse og injektion kan kræve en vis praksis. Mens du forbereder slangen med harpiks og under hele injektionen, undgå bobledannelse, da bobler vil skabe negativ plads i CT-billederne og kræve tidskrævende manuel korrektion. Det er vigtigt at forsigtigt massere leveren ved at rulle over overfladen med en fugtet vatpind under og efter injektionsproceduren, da dette letter selv harpiksspredning. Efter afslutningen af injektion og fjernelse af slangen skal silke suturknuden strammes hurtigt og omhyggeligt, så harpiksen ikke strømmer ud af leveren, før den polymeriserer helt. For vellykket microCT-billeddannelse skal prøven være korrekt fastgjort på plads med agarose og termisk tilpasset for at eliminere bevægelsesartefakter i CT-dataene. Anskaffelsesindstillingerne er også af afgørende betydning, som bør optimeres for at nå frem til en passende rumlig opløsning til at løse fine strukturer.
Der kan foretages tekniske ændringer af injektionsproceduren for at opnå injektion hos yngre mus. I øjeblikket harpiks støbning af yngre muselever er begrænset af tilgængeligheden af tilstrækkeligt tynde slanger, med PE10 er den mindste kommercielt tilgængelige slanger. Tanimizu et al. med succes injiceres kulstof blæk i embryonale dag 17 (E17) fælles galdegang ved hjælp af glas kapillærer11. Fremtidige test af, om harpiks kan leveres via glas kapillær ville derfor være af interesse. DUCT blev yderligere tilpasset til at injicere andre rørformede systemer såsom luftvejene og lungepulsåren vaskulat af lungerne9. Den dobbelte harpiks injektion kunne også ændres til at blive brugt sammen med andre kommercielt tilgængelige harpikser, eller denne protokol kan bruges til injektioner med kulstof blæk.
En af de vigtigste begrænsende faktorer i DUCT-rørledningen er harpiksviskositeten. DUCT kan kun bruges til harpiksstøbning af rørformede strukturer over en diameter på 5 μm. I dette datasæt kan harpiksen trænge ind i rør med den mindste diameter på 5 μm9. Denne størrelsesbegrænsning udelukker analyse af fine duktuer og små kapillærer. For yderligere at fremme DUCT-rørledningen til mindre kaliberbeholdere bør andre kommercielt tilgængelige harpikser testes, eller udviklingen af nye radiopaquemidler med lav viskositet kan forbedre lumenindtrængningen.
I Hankeova et al.9 blev DUCT sammenlignet med to andre almindeligt anvendte teknikker, dobbelt carbon blæk injektioner efterfulgt af væv clearing og standard fotografering, og iDISCO + med farvning af blodkarrene med alfa-glat muskel celle actin og galde kanaler med cytokeratin 7, efterfulgt af 3D-billeddannelse9. DUCT udkonkurrerede de to andre metoder med hensyn til dobbelt analyse (hvilket var udfordrende for iDISCO+ på grund af høj lever autofluorescence), 3D-billeddannelse og kvantificering (ikke mulig med kulstofblækindsprøjtning) og lumenisering (DUCT leverer data for den interne lumenarkitektur og systemperfusion). Som nævnt ovenfor er den primære begrænsning af DUCT den mindste lumenstørrelse, der kan injiceres og analyseres (5 μm grænse), en parameter, hvor både kulstofblækindsprøjtning og iDISCO+ klarede sig bedre. DUCT er overlegen i forhold til enkelt system harpiks støbning3,5,6 fordi det giver mulighed for analyse af hver injiceret system separat og letter også dobbelt 3D undersøgelse for at studere det arkitektoniske forhold mellem de to systemer.
DUCT kan anvendes til at studere to rørformede netværk i 3D. Som bevis på princippet, DUCT blev brugt til at visualisere leveren galde og portal vene systemer og lungearterie vaskulatur og luftveje i lung9. De intrahepatiske galdegange udvikler sig ved siden af portalvenen, og portalvenen giver en strukturel skabelon og signalcenter, der regulerer væksten og differentieringen af galdetræet12. I Hankeova et al.9 udforskede DUCT galde regenerering i en musemodel for den menneskelige pædiatriske sygdom Alagille syndrom. DUCT afslørede tidligere urapporterede arkitektoniske mekanismer, som galdesystemet brugte til at opnå en vild typelignende volumen9. Alagille syndrom mus udnyttet to forskellige strategier: (1) i hilar og centrale regioner af leveren, galdesystemet øget sin forgrening, og (2) i leveren periferien, de novo-genererede galdegange var meget tortuous. Disse to faktorer kombineret til at give en næsten normal galde system volumen, på trods af den unormale arkitektur. Desuden, DUCT opdaget unormal galdegang forgrening, der opstod uafhængigt af portal vene forgrening og galdegange danner forbinder broer mellem to portal vener9. Disse fænotyper ville være umuligt at opdage i enkelt harpiks støbning og kunne fejlfortolkes i 2D histologiske sektioner som galdegang spredning. DUCT leverer således data, der beskriver 3D-arkitekturen i to rørformede netværk på hele organ- eller lobeniveau med mulighed for kvalitativ og dybdegående kvantitativ analyse. DUCT kunne være en ny standard for postnatal leverudvikling og leverregenereringsanalyser i forskellige dyremodeller.
Disclosures
Et separat projekt i ERA laboratoriet er finansieret af ModeRNA. ModeRNA havde ingen rolle i det projekt/protokol, der er beskrevet her.
Acknowledgments
Vi takker Kari Huppert og Stacey Huppert for deres ekspertise og hjælp til galdegang cannulation og deres laboratorie gæstfrihed. Vi takker også Nadja Schultz og Charlotte L. Mattsson for deres hjælp med fælles galdegang cannulation.
Vi takker følgende bevillingsagenturer for deres støtte:
For arbejde i ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse 20170723 (2019-01350).
For arbejde i JK Lab: Vi anerkender CzechNanoLab Research Infrastructure støttet af MEYS CR (LM2018110). J.K. takket være støtten fra tilskud FSI-S-20-6353.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G needle | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
- Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
- Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
- Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).
- Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
- Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
- Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).
