Summary
Dobbel harpiksstøping av mikro-beregnet tomografi, eller DUCT, muliggjør visualisering, digitalisering og segmentering av to rørformede systemer samtidig for å lette 3D-analyse av organarkitektur. DUCT kombinerer ex vivo-injeksjon av to radiopakke harpikser etterfulgt av mikro-beregnet tomografiskanning og segmentering av tomografiske data.
Abstract
Leveren er det største indre organet hos mennesker og mus, og høy autofluorescens utgjør en betydelig utfordring for å vurdere organets tredimensjonale (3D) arkitektur på hele organnivå. Leverarkitektur er preget av flere forgrening lumeniserte strukturer, som kan fylles med harpiks, inkludert vaskulære og biliære trær, og etablerer et svært stereotypt mønster i det ellers hepatocyttrike parenchyma. Denne protokollen beskriver rørledningen for å utføre dobbel harpiksstøping av mikroberegnet tomografi, eller "DUCT". DUCT innebærer å injisere portalvenen og vanlig gallekanal med to forskjellige radiopakke syntetiske harpikser, etterfulgt av vevsfiksering. Kvalitetskontroll ved å fjerne en lobe, eller hele leveren, med et optisk clearingmiddel, gjør det mulig å forhåndsscreene passende injiserte prøver. I den andre delen av DUCT-rørledningen kan en lobe eller hele leveren brukes til mikro-beregnet tomografi (microCT) skanning, (semi-)automatisert segmentering og 3D-gjengivelse av portalens venøse og biliære nettverk. MicroCT resulterer i 3D-koordinatdata for de to harpiksene som muliggjør kvalitativ og kvantitativ analyse av de to systemene og deres romlige forhold. DUCT kan brukes på postnatal og voksen mus lever og kan videre utvides til andre rørformede nettverk, for eksempel vaskulære nettverk og luftveier i lungene.
Introduction
Organharpiksstøping er en teknikk som dateres tilbake til 1600-tallet1. Et av de første eksemplene på moderne harpiksstøping ble utført på den menneskelige leveren fra en obduksjon. Intrahepatiske gallekanaler ble fylt med et kontrastmiddel blandet med gelatin, etterfulgt av avbildning med røntgen CT-skanning2. Målet med DUCT-teknikken er å visualisere, digitalisere og analysere to rørformede harpiksstøpte nettverk, i tandem, i 3D.
DUCT er basert på den omfattende eksisterende kunnskapen om leverharpiksstøping i ett system3,4,5,6,7,8 og strekker seg til samtidig 3D-visualisering og analyse av to systemer9. DUCT avanserte enkeltharpiksstøping til dobbel harpiksstøping ved å blande to røntgentette harpikser med forskjellig kontrast og injisere disse harpiksene i to forskjellige nettverk, spesielt den vanlige gallekanalen og portalvenen. DUCT kan påføres unge postnatale mus med reproduserbare resultater så tidlig som postnatal dag 15 (P15). Sammenlignet med mikroskopibaserte avbildningsteknikker, er den største fordelen at DUCT er raskere, antistofffri, og levervevs autofluorescens forstyrrer ikke avbildning. Videre gir DUCT kvantitative data som beskriver lumeniseringsstatus, intern diameter, nettverkstilkobling og perfusjon. Differensiering mellom tilstedeværelsen av lumendannende celler og deres de facto morfogenese i rør er avgjørende for å analysere organer der kanalceller er til stede, men ikke danner rør, som det kan være tilfelle i Alagille syndrom10. Den største ulempen ved DUCT er den begrensede penetrasjonen av harpiksen, som er viskøs og ikke kommer inn i rør med et lite kaliber (<5 μm). DUCT kan brukes på hvilken som helst rørformet struktur etter å ha bestemt injeksjonsinngangspunktet, for eksempel arterielle og venøse sirkulasjonssystemer, luftveier, ekstrahepatisk gallekanal eller lymfatiske kar. Det kan dermed legge til rette for hel organarkitekturanalyse av andre vev som lunger og bukspyttkjertel.
MikroCT-segmenterte bilder kan behandles ved hjelp av kommersielt tilgjengelig bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ, eller spesialskrevne rørledninger (f.eks. Den harpiksinjiserte leveren kan analyseres kvalitativt for nettverksutvidelse og tilkobling eller kvantitativt for volum, lengde, forgrening, tortuositet av et enkelt system, og samspillet mellom to systemer som avstanden mellom to systemer, eller grenpunktavhengighet (forgrener system 1 seg i nærheten av system 2-forgrening?). DUCT-rørledningen som omfatter harpiksininjeksjon, mikro-CT-skanning og CT-datasegmentering, kombinert med detaljert kvantitativ analyse av arkitektoniske mekanismer i to rørformede systemer, kan gi en standard for hele leveranalyse i dyremodeller.
Protocol
Protokollen beskrevet i denne studien ble godkjent og følger dyrevelferdsreglene og forskriftene til Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Stockholms forskningsetiske styre). Dyrene som ble brukt i denne studien var vill type eller homozygot Jag1H268Q mutantmus på blandet C3H / N og C57bl6J bakgrunn. Både menn og kvinner ble inkludert i studien. Dyrene ble brukt på barseldag 15 eller som voksne mellom 3 - 8 måneder.
1. Doble harpiksininjeksjoner
- Forberedelse
- Forbered harpiksløsning. For dobbeltsystemharpiksininjeksjoner, lag både gule og grønne harpikser som beskrevet i trinn 1.1.2-1.1.4.
- Forbered 1 ml aliquots av fortynnet harpiks per mus.
- Gul harpiks: Fortynn gul silikongummi (høy radiokapasitet) med klar fortynningsmiddel i en 3:1 fortynning for å forberede gul harpiks til injeksjon.
- Grønn harpiks: Bland blå silikongummi (uoppdagelig radiokapasitet) med det klare fortynningsmiddelet i en 1:1 fortynning for å forberede blå harpiks. For å generere grønn harpiks, bland den fortynnede blå harpiksen med fortynnet gul harpiks i forholdet 1:1. Virvel den grønne harpiksen grundig til fargen er homogen.
MERK: Blåharpiks har svært lav radiokapasitet som ikke kan påvises med microCT, noe som derfor nødvendiggjør fortynning med gul harpiks for å skape to harpikser med forskjellige radiokapasiteter.
FORSIKTIG: Harpiks kan inneholde blykromat, som er et kreftfremkallende middel. Det produserer giftige gasser i en brann. Håndter forsiktig og kast harpiksen som farlig avfall. - Forbered to injeksjonssett (injeksjonssett #1 og injeksjonssett #2) med slanger som beskrevet i trinn 1.1.6-1.1.11.
MERK: For voksne mus (>P30 (barseldag 30) = P30 - 2 år), bruk injeksjonssett #1 (PE10 slange med 0,6 mm ytre diameter) for vanlig gallekanalinjeksjon og injeksjonssett #2 (PE50 rør med 0,96 mm ytre diameter) for portalveneinjeksjon. For unge postnatale mus (opptil P30), lag to #1 injeksjonssett, ett for gallekanal og ett for portalveneinjeksjon (ingen injeksjonssett #2 da portalvenen er for smal til å imøtekomme PE50-rør). - For å klargjøre injeksjonssettet #1, kutt 30 cm PE10-slange og strekk den ene enden av slangen for hånd ved å trekke den til den blir så tynn som mulig (figur 1A,B, ca. 0,15 mm diameter, ikke-strukket PE10-slange er 0,6 mm diameter).
- Klipp spissen på de strakte PE10-slangene diagonalt for å lage en skrå spiss (figur 1B).
- Koble den ikke-strakte enden av PE10-slangen til en 30 G nål (figur 1A, injeksjonssett #1).
- For å klargjøre injeksjonssettet #2, kutt 30 cm PE50-slange og strekk den ene enden av slangen for hånd ved å trekke den til den blir tynn nok til å passe inn i portalvenen (figur 1A,B, ca. 0,7 mm, ikke-strukket PE50-slange er 0,96 mm diameter).
- Klipp spissen på de strakte PE50-slangene diagonalt for å lage en skrå spiss (figur 1B).
- Koble den ikke-strakte enden av PE50-slangen til en 23 G kanyle (figur 1A, injeksjonssett #2).
MERK: Hvert injeksjonssett kan bare brukes til én injeksjon siden harpiksen herdes i sprøyten og slangen. Juster størrelsen på den strakte og skråstilte spissen basert på størrelsen på den vanlige gallekanalen og portalvenen på musen, avhengig av alder, genotype og fenotype. Når du er usikker på størrelsen og passformen på slangen, sett slangen i riktig kanal eller kar etter snittet og før slangen er fylt med harpiks. Hvis slangen er for bred til å passe inn i kanalen/karet, strekker du den videre. - Bedøv dyret ved isofluraninnånding (første 4% i induksjonskammeret og ~ 2% ved hjelp av nesekjeglen).
- Plasser musen på en ventilert benk på en disseksjonspute mens musen puster isofluran gjennom nesekjeglen. Kontroller at dyret er bevisstløs ved hjelp av en institutt/IRB-anbefalt metode, for eksempel ved å klemme en av potene.
FORSIKTIG: Isofluran kan forårsake døsighet eller svimmelhet ved innånding og kan forårsake skade på kardiovaskulærsystemet og sentralnervesystemet ved langvarig eller gjentatt eksponering. Ikke inhaler den. Håndter stoffet på en ventilert benk og i godt ventilerte områder.
MERK: Det er mulig å bruke en annen bedøvelsesmetode, så lenge den er kompatibel med hjerteperfusjon. - Når dyret er bevisstløs, spray ventralsiden med 70% etanol for å forhindre forstyrrelser fra pels.
- Bruk hudsaks, kutt huden, fascia og muskellaget som starter på midtlinjen av bukhulen og skjær gjennom til thoracic hulrommet for å eksponere de indre organene.
- Ta tak i xiphoid-prosessen med tang for å løfte brystbenet og kutt membranen og ribbeburet på begge sider for å eksponere hjertet og lungene.
- Fjern ribbeinburet ved å skjære gjennom ribbeina på venstre og høyre side av ribbeina med saks. Vær ekstra forsiktig så du ikke skader leveren, da dette vil føre til lekkasje av harpiksen.
- Bruk rette tang, trekk hjertet mot leveren og kutt bort riktig atrium.
- Sett inn en sommerfuglnål (23 G), koblet til en peristaltisk perfusjonspumpe, i venstre ventrikel. Perfuse musen transcardially med Hanks balansert salt løsning (HBSS) og heparin (1 U / g av musen kroppsvekt). Perfuse i 3 min med en perfusjonshastighet på 5 ml/min.
MERK: Hvis musen blir perfundert riktig, blir de indre organene bleke, spesielt leveren. Hvis lungene i stedet blir hvite, settes nålen inn i høyre ventrikel og skal omplasseres. Etter perfusjon blir musen ekssanguinert og kan fjernes fra nesekjeglen og isofluranen. - Slå av isofluranpumpen.
- Harpiksin injeksjon - Biliary system harpiks støping
- Flytt musen til disseksjonsmikroskopet, magen opp, halen mot eksperimentet, og hodet bort fra eksperimentet. De anatomiske landemerkene av interesse er avbildet i figur 2A.
- Finn den dårligere vena cava (figur 2A) ved å flytte tarmen til siden. Bruk vårsaks til å lage et lite tverrsnitt i den dårligere vena cava for å tillate frigjøring av levervaskulært trykk (figur 2Bi).
- Utsett den vanlige gallekanalen og portalvenen som beskrevet i trinn 1.2.4- 1.2.6.
- Flytt tarmen og bukspyttkjertelen til høyre side (av eksperimentet) ved hjelp av en fosfatbufret saltvann (PBS) fuktet bomullspinne.
- Vend leverens ventrale side mot hjertet ved hjelp av PBS-fuktet bomullspinne for å eksponere den viscerale overflaten og hilarområdet.
- Finn den vanlige gallekanalen som går fra hilar-regionen over bukspyttkjertelen og inn i tarmen ved sphincteren til Oddi (figur 2Bii, vanlig gallekanal skissert med den gule stiplede linjen, svarte pilspisser peker på Sphincter av Oddi).
MERK: Pass på at leveren er fuktig gjennom hele prosedyren ved å drysse den med PBS. - Klart omkringliggende vev (område ~ 5 mm) fra den vanlige gallekanalen ved hjelp av rette tang. Plasser silke suturtråd (størrelse 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm lang) under den vanlige gallekanalen (figur 2Bii) og knytt en løs overhåndsknute rundt den vanlige gallekanalen (figur 2Biii).
MERK: Velg et område for knuten halvveis mellom hilarområdet og sphincter av Oddi og i noen avstand fra portalvenen slik at etter at suturen er strammet rundt den vanlige gallekanalen, vil det ikke forstyrre portalveneinjeksjonen. - Hold vårsaksen flatt mot den vanlige gallekanalen for å gjøre et skrått snitt mot den vanlige gallekanalen på stedet der den vanlige gallekanalen kommer inn i bukspyttkjertelen og tarmen ved siden av sfincteren til Oddi. (Figur 2Biv), skisserer den gule stiplede linjen sphincteren i Oddi-regionen, understreket av svarte pilspisser).
MERK: Dette er et avgjørende skritt. Lag et skrått og ikke et tverrgående kutt, og gjør et snitt; Ikke kutt gallekanalen. Å skjære gjennom hele gallekanalen gjør innsetting av slangen svært utfordrende. - Like før bruk blander du 1 ml av den gule harpiksen med 50 μL herdemiddel (ved å fylle og tømme 1 ml sprøyte) og fylle en 1 ml luersprøyte med harpiksmiddelblandingen.
- Koble den fylte sprøyten til slangen (sett #1). Trykk stempelet for å fylle slangen helt. Påse at harpiks-/herdemiddelblandingen drypper fra tuppen av slangen.
MERK: Unngå og fjern bobler i sprøyten og slangen for best resultat. - Bruk tang til å rette området rundt det vanlige gallekanalens snitt og sett slangen inn i åpningen i den vanlige gallekanalen (figur 2Bv), med den lengste kanten av den skråspissen nedover mot den dorsale siden av gallekanalen. Denne retningen sikrer at harpiks kan gå ut av slangeåpningen, som vender oppover, inn i kanalen (figur 2Bv).
- Stram silketrådknuten for å feste slangen inne i den vanlige gallekanalen (figur 2Bvi).
- Injiser harpiksen i den vanlige gallekanalen. Vær oppmerksom på galleblæren og de enkelte leverlobene.
- Masser leveren med en PBS-fuktet bomullspinne for å spre harpiksen likt. Harpiksfylte gallekanalers terminalgrener (i ville mus) er svakt synlige på leveroverflaten.
MERK: Forventet tid til å fylle leveren er 30-100 s. - Slutt å injisere harpiksen når harpiks prikker vises på overflaten av leveren (figur 2Ci, blå pilspisser) eller når motstanden er oppfylt.
MERK: Arbeid så raskt som mulig siden harpiksen begynner å herdes etter å ha tilsendet harpiksherdingsmiddelet. Arbeidstiden fra å legge til herdemiddelet er ca. 15 min. - Fjern slangen ved å trekke den ut av den vanlige gallekanalen og stram raskt silkeknuten ved hjelp av tang for å forhindre at harpiksen lekker ut. Klipp bort de løse endene av silke suturen, slik at de ikke forstyrrer portalveneinjeksjonen.
- Kast slangen som inneholder harpiks og gjenværende harpiks i det farlige avfallet og nålen i slipeavfallet.
- Harpiksin injeksjon - Portal vene harpiks støping
- Fjern portalvenen (område ~ 5 mm) fra det omkringliggende vevet ca 2 cm fra inngangen til leveren ved hjelp av rette tang. Plasser silke suturtråd (størrelse 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm lang) under det ryddede området av portalvenen (figur 2Ci) og knyt en løs overhåndsknute (figur 2Cii).
- Gjør et langsgående snitt i portalvenen distal til leveren og knuten (figur 2Ciii).
- Bland 1 ml grønn harpiks med 50 μL herdemiddel (ved å fylle opp og tømme en 1 ml sprøyte) og fyll 1 ml Luer-sprøyten med harpiksherdemiddelblandingen.
- Koble den fylte sprøyten med slangen (sett #2 for >P30 mus, nytt sett #1 for
MERK: Unngå og fjern bobler i sprøyten og slangen for best resultat. - Bruk tang, rett portalvenen ved å trekke det omkringliggende vevet mot eksperimentatoren og sett inn slangen med den lengste kanten av skråspissen mot dorsalsiden av fartøyet (figur 2Ciii).
- Stram silkegjengen for å feste slangen i portalvenen.
- Injiser harpiksen i portalvenen. Vær oppmerksom på at blodårene fylles opp med harpiks. Masser leveren med en PBS-fuktet bomullspinne for å spre harpiksen likt (figur 2Civ).
- Slutt å injisere harpiksen når alle blodårene er fylt (ender av portalårene er synlige i leveren periferi) eller når motstand er oppfylt.
MERK: Arbeid raskt siden harpiksen begynner å herdes etter at herdemiddelet er lagt til. Arbeidstiden ved å tilsette herdemiddelet er ca. 15 min injeksjonssett #1 og 25 min til injeksjonssett #2. - Fjern slangen ved å trekke ut slangen fra portalvenen og stram raskt silkeknuten ved hjelp av tang for å forhindre at harpiksen lekker ut.
- Kast slangen som inneholder harpiks og gjenværende harpiks i det farlige avfallet og nålen i slipeavfallet.
- Leveravhandling og fiksering
- Disseker ut hele leveren ved å kutte den bort fra det omkringliggende vevet og membranen.
- Plasser forsiktig hele leveren i et tomt 50 ml konisk rør med ventralsiden vendt opp og dorsalsiden hviler på veggen av det koniske røret for å forhindre deformasjon av leveren. Oppbevar konisk rør horisontalt over natten ved 4 °C for at harpiksen skal herdes helt.
MERK: Alle beholdere som er store nok til å passe leveren, kan brukes i stedet for 50 ml konisk rør. Bruk av en flat bunnbeholder vil øke sannsynligheten for at leveren ikke deformeres. - Del leveren i individuelle lober. Gjør et utvalg av lobene som skal brukes til mikro-CT-analyse (1.4.4-1.4.5) eller kvalitetskontroll (1.4.6-1.4.8). Bruk eventuelt hele leveren til både optisk rydding og mikro-CT uten å dele den inn i individuelle lober.
MERK: Leverarkitekturen til de biliære og vaskulære systemene er forskjellig i hver lobe, og matchede lobeanalyser er derfor nødvendig. Den optiske avregningen forstyrrer ikke mikro-CT-skanningen, og loben(e) som brukes til kvalitetskontroll, kan skannes deretter med microCT. På den annen side kan prøver som skannes med microCT, deretter fjernes optisk for sammenligning. Hele leveranalysen er dermed mulig. I villtype mus (C3H / C57bl6 genetisk bakgrunn) fylles høyre medial lobe først av harpiksininjeksjoner, noe som gjør dette til en passende lobe for mikro-CT-analyse, med høyest reproduserbarhet. Venstre lateral lobe er den største lobe, der det derfor er enkelt å forhåndsskjerme for injeksjonskvalitet. Valget av lobe (eller hel lever) som brukes til kvalitetskontroll og mikro-CT-skanning er avhengig av dyremodellen og forskningsspørsmålet. - I en ventilert hette, lag 4% formaldehydoppløsning (10-20 ml per rør). Fest lobene som brukes til microCT med 4% formaldehyd over natten ved 4 °C og vask deretter én gang med PBS (10-20 ml per rør).
- Samle formaldehydavfall i en separat beholder. Hold leverlobeene i PBS ved 4 °C for korttidslagring eller 70 % etanol for langtidslagring. Fortsett med avsnitt 2: Mikroberegnet tomografi.
FORSIKTIG: Formaldehyd forårsaker akutt toksisitet ved svelging, innånding eller i kontakt med huden. Formaldehyd er en brannfarlig væske og damp. Det forårsaker alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Kan forårsake en allergisk hudreaksjon. Dødelig ved innånding (konsentrert eller i pulver). Kan forårsake irritasjon i luftveiene. Mistenkt for å forårsake genetiske feil. Kan forårsake kreft. Forårsaker skade på organer (øyne, sentralnervesystemet). Forholdsregler - hold deg borte fra varme, varme overflater, gnister, åpne flammer og andre tenningskilder. Ingen røyking. Bruk vernehansker og verneklær. Ved søl, ta straks av alle klær som var forurenset. Hvis du kommer i kontakt med huden: Skyll det forurensede området med vann. Ved innånding: Fjern personen til frisk luft og overvåk pusten hvis den er komfortabel. Ring umiddelbart et giftsenter / lege. Hvis i øynene: Skyll øynene med vann i flere minutter. Fjern kontaktlinser hvis det er til stede og mulig. - For kvalitetskontroll, fest de resterende lobes (minst en) med 50% metanol (blandet med deionisert vann) i minst 4 timer, gynge ved romtemperatur, etterfulgt av 100% metanol over natten gynge ved romtemperatur. Samle metanolavfall i en separat beholder.
FORSIKTIG: Metanol forårsaker akutt toksisitet ved svelging, innånding eller i kontakt med huden. Metanol er en brannfarlig væske og damp. Bruk vernehansker og klær. Unngå å puste ved håndtering og hold deg unna ild og varme. Vask huden grundig etter bruk. Ved søl, ta straks av alle forurensede klær. Skyll huden med vann. Ved innånding: Fjern personen til frisk luft og hold deg komfortabel med å puste. Ved innånding, svelging eller eksponert, ring et giftsenter/lege. - I en ventilert hette, lag benzylalkohol og benzylbenzoat (BA: BB, 1:2) (5-10 ml per lobe) oppløsning.
- Plasser leverlobenet i et 15- eller 50 ml polypropylenrør (avhengig av størrelsen på loben) som inneholder BABB-oppløsning. La den gynge ved romtemperatur til den er gjennomsiktig. Dette trinnet kan ta mellom 2-16 timer, avhengig av størrelsen på loben.
MERK: BABB-løsningen løser opp visse typer plast. Det er trygt å lagre prøvene i polypropylenrør eller glassbeholdere.
FORSIKTIG: Benzylbenzoat kan forårsake akutt toksisitet ved svelging. Det er giftig for vannlevende liv med langvarige effekter. Forholdsregler: Vask huden grundig etter håndtering. Det er skadelig når det svelges, i kontakt med huden eller inhaleres. Unngå innånding av røyk/damp. Vask hendene grundig etter håndtering. Ikke spis, drikk eller røyk når du bruker dette produktet. Ved svelging - ring et giftsenter/lege hvis det er uvel Bruk i ventilerte områder. Samle søl. Kast innhold/beholder på et godkjent avfallsdeponi. - Inspiser kvaliteten på injeksjonen. Bare godt injisert lever skal skannes med microCT.
2. Mikro-beregnet tomografi
- Prøvepreparering
- Forbered 1% agarose gel ved å blande 100 ml destillert vann og 1 g agarosepulver. Legg blandingen i en mikrobølgeovn og kok løsningen til agarosepulveret oppløses.
- Temperer 1% agarose gel til ~ 40 °C for å unngå termisk skade på leverprøven.
- Plasser lobe(er) av interesse i et 15 ml konisk rør og fyll det med 1% agarose gel til ca. 2/3 av det totale volumet av røret. Dette trinnet minimerer uønsket prøvebevegelse under CT-måling.
- CT-måling
MERK: Følgende trinn er CT-enhetsavhengige, og spesifikke innstillinger og handlinger kan variere for forskjellige CT-enheter og produsenter. I denne protokollen var den mikroberegnede tomografiskanneren som ble brukt utstyrt med et nanofokus røntgenrør (180 kV / 15 W) og flatskjerm dynamisk 41|100 (4048 px x 4048 px, pikselstørrelse 100 mm med binning 2) for CT-målingene.- Monter det koniske røret på 15 ml med prøven på rotasjonsstadiet til en CT-enhet og la den tilpasse seg målekammeret termisk i minst 1 time.
- Når prøven er termisk tilpasset, midtstiller du den i synsfeltet (FOV).
- Optimaliser kildeprøve- og prøvedetektoravstandene (SSD, SDD) for å nå tilstrekkelig voxeloppløsning, for eksempel 12 μm for en voksen murinleverprøve eller 6,5 μm for
- Still inn anskaffelsesparametrene (dvs. akselererende spenning og strøm, eksponering, binning, gjennomsnitt) etter CT-enhetsprodusentens anbefalinger for å nå et tilstrekkelig nivå av oppdaget signal. Disse parameterne er ikke bare CT-enhetsavhengige, men også utvalgsavhengige og bør optimaliseres for hvert utvalg. I Hankeova et al.9 var innstillingene: 80 kV akselererende spenning, 160 μA akselererende strøm, 400 ms eksponeringstid og 2000 bilder.
- Start en CT-måling. Bruk en dedikert tomografisk rekonstruksjonsprogramvare for å rekonstruere CT-dataene.
3. Analyse og datasegmentering
MERK: Følgende trinn er programvareavhengig for bildebehandling; spesifikke innstillinger og handlinger kan variere avhengig av programvaren som brukes.
- Last inn CT-dataene: Velg Fil > Importer > kommando. Et ytterligere valg avhenger av det spesifikke formatet til CT-dataene som skal behandles.
- Bruk funksjonen Overflatebestemmelse på det øverste panelet til å segmentere harpiksen i dataene ved hjelp av global tersklering. I dialogvinduet bestemmer du terskelverdien med histogramevaluering ved å angi posisjonen til den røde "Isovalue"-linjen for å segmentere bare de harpiksfylte beholderne (dvs. omfattet av den gule linjen i det presenterte "Forhåndsvisningspanelet") (figur 3A).
- På venstre panel velger du modulen Opprett avkastning fra volum/CAD/nett for å opprette en interesseregion (ROI) for de harpiksfylte fartøyene. I dialogvinduet bruker du alternativet Opprett avkastning fra Heldekkende, velger navnet på det behandlede volumet og bekrefter.
- Eliminer feilaktig segmentering av støyklynger i bakgrunnsområdet i denne avkastningen. Merk denne avkastningen på høyre panel, høyreklikk på den og velg modulen Split ROI.
- I dialogvinduet angir du parameteren Minimumsvolum [voxel] for å utelate alle støypartiklene – denne verdien er eksperiment- og dataavhengig og må optimaliseres for hver prøve som skal analyseres (figur 3B).
- Lag glatte, kontinuerlige og solide kanalmasker uten artefakter i harpiksstøpt avkastning - for eksempel tilstedeværelse av luftbobler eller harpikslekkasje.
- På venstre panel bruker du modulen Utjevning, sett utjevningsstyrkeparameteren til 1 eller 2 (avhengig av de enkelte dataene, når høyere verdier kan føre til modelldeformasjon, spesielt når du arbeider med fine strukturer). Kjør om nødvendig denne prosessen to ganger (figur 3C).
- Identifiser og skill de enkelte rørformede systemene i den segmenterte harpiksmasken.
- Lag en egen avkastning for systemet fylt med mer absorptive harpiks (den gule harpiksen som brukes til den vanlige gallekanalinjeksjonen) med høyere intensitetsverdier i CT-dataene. Følg fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 3.2. (Figur 3Di).
- Merk den nye avkastningen og harpiksmasken ROI, høyreklikk og velg Trekk avkastningen(e) og trekk den nye avkastningen fra harpiksmasken ROI for å opprette en ny avkastning for det gjenværende rørformede systemet (figur 3Dii, iii).
- Eksporter de resulterende ROIene for begge rørformede systemer i forskjellige formater, basert på operatørpreferanser, for etterfølgende behandling i annen programvare. Videre kan du behandle de resulterende ROIene i en volumgrafikkprogramvare for å eksportere den endelige visualiseringen i form av et bilde eller en video.
Representative Results
Hva du skal gjøre
Vellykket dobbel harpiksin injeksjon oppnås når både intrahepatiske gallekanaler og portal vene vaskulatur er godt fylt. Som et kvalitetskontrolltrinn tillater rydding av en lobe (for eksempel venstre lateral lobe) verifisering av en vellykket injeksjon, etterfulgt av avbildning av lober av interesse. Den optisk klarerte loben kan skannes senere ved hjelp av microCT; derfor er det mulig å optisk fjerne hele leveren. I godt injisert muselever bør portalvenens vaskulatur fylles med harpiks til leveren periferi og harpiks skal være synlig i sidegrener (figur 4), og denne arkitekturen er trofast rekapitulert i mikro-skannede og segmenterte data. Videre bør godt injiserte intrahepatiske gallekanaler være synlige ved siden av hovedportalvenegrenene som strekker seg nesten til periferien, og harpiks skal være synlig i de store sidegrenene. Hvis kontrollloben passerer kvalitetskontrolltrinnet, kan lobene av interesse (inkludert den optisk fjernede) skannes med microCT. Resultatet av segmenterte data fra en godt injisert lever vises for en P15-mus (figur 4A, B) og en voksen mus (figur 4C, D).
Hva ikke å gjøre
Intakt levervev er en forutsetning for vellykket injeksjon. Vær ekstra forsiktig når du kutter bukhulen og membranen for ikke å ved et uhell nick levervevet. Hvis det er fysisk skade på leveren under denne prosedyren, er det svært sannsynlig at harpiksen lekker ut under portalveneinjeksjon (figur 5A). Det er ikke mulig å oppnå en god injeksjon av det vaskulære systemet hvis leveren er fysisk skadet.
En av de vanlige feilene er å underfylle leveren med harpiks som kan føre til utfordringer for visualisering eller analyse. En av årsakene til systemunderfylling er harpiksherding for tidlig i nålen eller spissen av slangen før injeksjonen er fullført (figur 5B, blå pilspisser, braketter skildrer store bobler). En god praksis er å bruke ett injeksjonssett per dyr og jobbe raskt etter at herdemiddelet er lagt til harpiksen. Hvis harpiksen herdes under injeksjonen (som kan observeres av et halvfylt system, her eksemplifisert med en halvfylt portalvenevaskulatur) fjern slangen, kutt spissen av slangen (alltid diagonalt for å skape en skrå spiss), og skyv stempelet. Hvis harpiks begynner å dryppe igjen, sett forsiktig inn slangen igjen og fest den med suturen. Hvis harpiksen har herdet i nålen, bytt slangen helt ut, fyll den med harpiks (unngå bobler), sett forsiktig inn slangen igjen og fest den med suturen. Det kan være utfordrende å erstatte slangen, spesielt hos unge postnatale mus
Motsatt blir ett eller begge av systemene overfylt med harpiks (figur 5D). Det er nødvendig å visuelt overvåke leveren gjennom hele injeksjonen. Biliært systemstøping med harpiks er mer utfordrende enn portal veneharpiksstøping siden harpiksfylte kanaler bare er svakt synlige på leveroverflaten, og det er vanskelig å vurdere når systemet er nesten fullt og når det skal stoppe. Når små gule harpiks prikker vises på leveroverflaten (Figur 2Ci, blå pilspiss), er dette et tegn på at biliærsystemet er helt fylt, og harpiksen begynner å lekke ut av kanalene. Mindre harpikslekkasje kan korrigeres manuelt under mikro-CT-datasegmentering (figur 5D, høyre paneler).
Hvis injeksjonstrykket er for høyt, kan dette føre til at fartøy eller kanaler brister (figur 5E), irreversibelt skadelig fartøy eller kanalarkitektur. Leveren vil ikke være egnet for mikro-CT-skanning eller analyse. For å unngå overfylling av harpiks, optimaliser riktig volum og trykk som brukes til injeksjon i hver musemodell. Når du arbeider med mus som har blitt utfordret med et giftig kosthold, genetisk modifikasjon eller leverskade som påvirker galle- eller venøse systemer, eller leverstivhet, kan injeksjonstrykket og volumet måtte justeres ettersom volum og trykk tolerert kan være forskjellig fra de ville musene. Denne protokollen beskriver den manuelle injeksjonen av de to systemene, men det er mulig å koble sprøyten til en pumpe for å standardisere injeksjonstrykket. Bobler er en annen svært vanlig injeksjon artefakt som fører til sparsom fylling av rørformede nettverk (Figur 5F-H, blå pilspisser). For å unngå bobledannelse, sørg for at sprøyten og slangen ikke inneholder noen bobler, er helt fylt med harpiks, og harpiksen drypper fra spissen av slangen før injeksjon. Små bobler som vises som negative områder på mikro-CT-dataene, kan korrigeres manuelt under etterbehandlingstrinn, selv om dette er arbeidskrevende.
Frisk er den beste
Bruk av fersk gul harpiks er en avgjørende faktor, noe som betydelig påvirker kontrasten til de to harpiksene og mikro-MIKROCT-datasegmenteringen. Når den nyåpnede harpiksen brukes (figur 6A) er det en klar forskjell i kontrast mellom de gule harpiksinnsprøytede gallekanalene (lyse hvite) og de grønne harpiksinnsprøytede portalårene (lysegrå). Lever som injiseres med fersk harpiks behandles enkelt ved hjelp av automatisert global terskelverdi. Ved langvarig lagring utfelles harpiksen, og kontrasten avtar. Etter 3 måneders lagring kan kontrasten fortsatt være tilstrekkelig til å skille portalvenen fra gallekanalen (figur 6B), men nedbør påvirker blandingen av de to harpiksene, som er synlig som en heterogen opasitet i den fylte portalvenen (fig. 6B, blå pilspisser). Heterogen kontrast påvirker den automatiserte terterskelen negativt og nødvendiggjør manuelle korrigeringer, noe som øker behandlingstiden. Hvis harpiksen er eldre enn seks måneder, har kontrasten blitt dårligere til et punkt der det ikke er mulig å skille den gulinjiserte gallekanalen fra den grønninnsprøytede portalvenen basert på kontrasten alene (figur 6C). I dette tilfellet må gallekanalen og portalvenen segmenteres manuelt basert på diameter og posisjon i hilarområdet og følges manuelt gjennom hele mikroCT-dataene. Denne prosedyren er ekstremt tidkrevende og best unngås.
Figur 1: Injeksjonssett for harpiksstøping. (A) Injeksjonssett #1 består av en 30 G nål og PE10 slange som er ~30 cm lang. Injeksjonssett #2 består av en 23 G nål og PE50 slange ~30 cm lang. (B) Tuppen av slangen strekkes og kuttes i en vinkel for å skape en skrå spiss. Linjalen i A og B er en centimeter linjal, med store trinn på 1 cm, mellomliggende trinn på 5 mm og mindre trinn på 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dobbelt harpiks støping flyt diagram. (A) Skjematisk viser murin venøst sirkulasjonssystem og hjertet med uthevet høyre atrium, som skal kuttes bort før perfusjon, og venstre ventrikel der nålen skal settes inn for perfusjon for å vaske bort blodet fra sirkulasjonssystemet. Den dårligere vena cava bør brytes under nyrene for å lindre vaskulært trykk. (B) Galle kanalharpiks injeksjon strømningsskjema. (i) Zoom bilde av (A) som viser hvor du skal kutte IVC. (ii) Bilde som viser den vanlige gallekanalen (gulprikket linje) fra lever hilar-regionen til sphincter av Oddi (svarte pilspisser), med suturtråd under den ryddede vanlige gallekanalen. (iii) Egnet posisjon for løs overhåndsknute rundt vanlig gallekanal. (iv) Den gule stiplede linjen og de svarte pilspissene merker sphincteren til Oddi, og demonstrerer den skrå vinkelen for snitt og hvordan åpningen skal vises etter skrå vinkelinnsnittet. (v) Skjematisk som viser retningen på PE10-slange skrååpningen (oppover) ved innsetting. (vi) Utseende av gul harpiks som injiseres; harpiks skal lett passere den løst bundet knuten. IVC, dårligere vena cava; CBD, vanlig gallekanal. (C) Portal vene harpiks injeksjon flyt diagram. (i) Den grønne stiplede linjen markerer portalvenen fra hilarområdet. De blå pilspissene merker det overfylte biliære systemet. (ii) Egnet sted for løs overhånds knute rundt portalvenen. (iii) Skjematisk som viser skrå åpningen (oppover) ved innsetting. (iv) Utseende av lever ved injeksjon av grønn harpiks og gul harpiks; legg merke til det harpiksfylte blodkaret i leverperiphery. PV, portalåre. Figur 2A ble opprettet med Biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mikro-CT-databehandling i volumgrafikkprogramvare. (A) Overflatebestemmelse, (i) overvurdert isoverdi (gjeldende forhåndsvisning av seleksjon vises i gul farge), (ii) undervurdert isoverdi, (iii) optimalt utvalg av isoverdi for riktig overflatebestemmelse av portalvene og gallekanaler. (B) Splitting region av interesse (ROI) opprettet av overflatebestemmelse, (i) sette verdien i dialogvinduet høyt nok til at bare ett segment (den største) vil forbli, (ii) i gule rammer de mindre (ekskluderte) partiklene vises. (C) Overflateutjevning av dataene, (i) utjevningsfunksjon er på venstre panel, (ii) sett utjevningsstyrken til 1 (maks. 2) og opprett ny utjevnet avkastning, (iii) utjevnede data. (D) Separasjon av individuelle rørformede systemer, (i) i overflatebestemmelsesfunksjonen, still inn isovaluen slik at bare biliærsystemet er inkludert i utvalget (gjeldende forhåndsvisning av seleksjon er vist i gul farge), (ii) markerer avkastningen til både systemer og avkastning av bare biliærsystemet og trekker gallesystemet ROI fra ROI i begge systemene, (iii) Portalvenen vist i grått, biliærsystemet vist i grønt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Brønninnsprøytet gallekanal (BD) og portalvene (PV) systemer. (A) Optisk ryddet høyre medial lobe (RML) av postnatal dag 15 (P15) lever injisert med to harpikser i de to systemene. Skalastang 1 mm. (B) 3D-gjengivelse av P15 RML vist i (A) som viser portalvenens vaskulatur i hvitt og biliært system i grønt. Skala bar 1 mm. (C) Optisk ryddet RML av voksen lever injisert med to harpikser i de to systemene. Skalastang 1 mm. (D) 3D-gjengivelse av voksen RML vist i (C) som viser portalvenens vaskulatur i hvitt og biliært system i grønt. H = hilar, P = perifer. Skalastang 1 mm. Paneler A, B, D er tilpasset med tillatelse fra Hankeova et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Vanlige utfordringer med leverinjeksjoner med dobbel harpiks. (A) Bildet viser en lever som ved et uhell ble hakket under den første åpningen av bukhulen, og harpiksen lekker gjennom kuttet (blå pilspiss). (B) Dårlig injisert portal vene system på grunn av harpiks herding. Blå pilspisser merker tomme terminalgrener, og røde parenteser merker store bobler. Skalastang 1 mm. (C) Dårlig injisert portal vene system på grunn av dårlig transkardiale perfusjon. Blå pilspisser merker blod som er synlig i terminalgrenene. Skalastang 1 mm. (D) Overfylt biliært system manifestert av isolerte harpikskuler. De venstre panelene viser den optisk ryddede leveren, og de høyre panelene viser det 3D-mikro-gjengitte bildet. De blå prikkede konturene viser zoom-inn-områder. De svarte pilspissene merker en del av leveren som ble skadet under den optiske ryddingen etter mikro-CT-skanning. Skalastang 1 mm. (E) Høyt trykk under harpiksininjeksjon kan forårsake brudd på portalvenen (dyret i dette panelet bærer en Jag1H268Q mutasjon), preget av blå pilspisser. Skalastang 1 mm. (F) Bobler i harpiksen under portalveneinjeksjon (blå pilspisser) og (G) biliær systeminjeksjon (blå pilspiss), skalastang 1 mm. (H) MicroCT-skanning av bobler (blå pilspiss), dårlig fylte terminalgrener (røde braketter) og harpikslekkasje (gul pilspiss), skalastang 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Differensialharpikskontrast. (A) Nyåpnet gul harpiks gir tilstrekkelig kontrast til å skille harpiksinnsprøytet portalvene (grå) og gallekanaler (hvit). (B) Tre måneders lagring av gul harpiks fører til utfelling av harpiksen, noe som resulterer i heterogen opasitet (gråhvit portalåre, blå pilspiss). (C) Langvarig lagring (>6 måneder) med gul harpiks reduserer kontrasten mellom portalvenen (grå) og gallekanaler (grå). Skalalinje 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Flere kritiske trinn bestemmer DUCT-suksess, fra prøvepreparering til parametrene til CT-enheten. For å oppnå de beste resultatene, bør godt kontrasterte, godt injiserte og boblefrie harpiks brukes til å tillate enkel digital behandling med automatisert terskelverdi for å skaffe 3D-data, bilder og filmer. Med opplæring og følg denne protokollen er 90% av injeksjonene vellykkede og resulterer i reproduserbare data. Det er viktig å bruke fersk gul harpiks for å oppnå den beste kontrasten mellom de to injiserte systemene. Den gule harpiksen har en veldig sterk radiokapasitet, mens den blå harpiksen har uoppdagelig radiokapasitet. Toppresultater oppnås i løpet av de første tre månedene etter åpning av en ny gul harpiksflaske. Med tiden utfelles harpiks, og etter lengre lagring (>6 måneder) vil de gule og grønne harpiksene ikke lenger skille seg ut i CT-skanninger. Bilder med dårlig kontrast krever omfattende og tidkrevende manuell sporing og segmentering av de to systemene. Deretter er godt strukket rør uunnværlig for å passe inn i den vanlige gallekanalen til voksne mus og vanlig gallekanal og portalåre av postnatale mus. Inngangspunktet for injeksjonen må opprettes med forsiktighet. Hvis den vanlige gallekanalen er kuttet åpen tverrgående, er det sannsynlig å løsne fra det omkringliggende vevet, og forhindrer vellykket inngang av slangen. Dette trinnet er spesielt delikat for postnatale mus der den vanlige gallekanalen trekker seg tilbake og "krøller seg opp" hvis den har løsnet fra det omkringliggende vevet, noe som gjør innsetting av slangen ekstremt utfordrende. Den vanlige gallekanalen oppføring og injeksjon kan kreve litt øvelse. Mens du forbereder slangen med harpiks og gjennom hele injeksjonen, unngå bobledannelse da bobler vil skape negativ plass i CT-bildene og kreve tidkrevende manuell korreksjon. Det er viktig å forsiktig massere leveren ved å rulle over overflaten med en fuktet bomullspinne under og etter injeksjonsprosedyren, da dette letter jevn harpiksspredning. Etter ferdigstillelse av injeksjon og fjerning av slangen, må silke sutur knuten strammes raskt og forsiktig, slik at harpiksen ikke strømmer ut av leveren før den polymeriserer helt. For vellykket mikro-avbildning må prøven festes riktig med agarose og termisk tilpasset for å eliminere bevegelsesartefakter i CT-dataene. Anskaffelsesinnstillingene er også av avgjørende betydning, som bør optimaliseres for å oppnå en tilstrekkelig romlig løsning for å løse fine strukturer.
Tekniske modifikasjoner på injeksjonsprosedyren kan gjøres for å oppnå injeksjon hos yngre mus. For tiden er harpiksstøping av yngre muselever begrenset av tilgjengeligheten av tilstrekkelig tynne rør, med PE10 som den minste kommersielt tilgjengelige slangen. Tanimizu et al. injiserte vellykket karbonblekk i embryonal dag 17 (E17) vanlig gallekanal ved hjelp av glasskapillærer11. Fremtidig testing av om harpiks kan leveres via glasskapillær vil derfor være av interesse. DUCT ble videre tilpasset for å injisere andre rørformede systemer som luftveiene og lungearteriens vaskulatur i lungene9. Den doble harpiksinjeksjonen kan også modifiseres for bruk sammen med andre kommersielt tilgjengelige harpikser, eller denne protokollen kan brukes til injeksjoner med karbonblekk.
En av de viktigste begrensende faktorene i DUCT-rørledningen er harpiksviskositeten. DUCT kan bare brukes til harpiksstøping av rørformede strukturer over en diameter på 5 μm. I dette datasettet kan harpiksen trenge inn i rør med den minste diameteren på 5 μm9. Denne størrelsesbegrensningen utelukker analyse av fine ductules og små kapillærer. For ytterligere å fremme DUCT-rørledningen til mindre kaliberfartøy, bør andre kommersielt tilgjengelige harpikser testes, eller utviklingen av nye radiopaque-midler med lav viskositet kan forbedre lumenpenetrasjonen.
I Hankeova et al.9 ble DUCT sammenlignet med to andre vanlige teknikker, dobbeltkarbonblekkinjeksjoner etterfulgt av vevsrydding og standardfotografering, og iDISCO+ med farging av blodårene med alfa-glatt muskelcelle actin og gallekanaler med cytokeratin 7, etterfulgt av 3D-avbildning9. DUCT utkonkurrerte de to andre metodene når det gjaldt dobbel analyse (som var utfordrende for iDISCO + på grunn av høy lever autofluorescence), 3D-avbildning og kvantifisering (ikke mulig med karbonblekkinjeksjon), og lumenisering (DUCT gir data for den interne lumenarkitekturen og systemperfusjonen). Som nevnt ovenfor er hovedbegrensningen av DUCT den minste lumenstørrelsen som kan injiseres og analyseres (5 μm grense), en parameter der både karbonblekkinjeksjon og iDISCO + presterte bedre. DUCT er overlegen enkeltsystemharpiksstøping3,5,6 fordi det tillater analyse av hvert injisert system separat og letter også dobbel 3D-undersøkelse for å studere det arkitektoniske forholdet mellom de to systemene.
DUCT kan brukes til å studere to rørformede nettverk i 3D. Som prinsippbevis ble DUCT brukt til å visualisere leverens galle- og portalåresystemer og lungearteriens vaskulatur og luftveier i lung9. De intrahepatiske gallekanalene utvikler seg ved siden av portalvenen, og portalvenen gir en strukturell mal og signalsenter som regulerer veksten og differensiering av biliærtreet12. I Hankeova et al.9 utforsket DUCT biliær regenerering i en musemodell for den menneskelige barnesykdommen Alagille syndrom. DUCT avslørte tidligere urapporterte arkitektoniske mekanismer som biliærsystemet brukte for å oppnå et vilt-type-lignende volum9. Alagille syndrom musene brukte to forskjellige strategier: (1) i hilar og sentrale regioner i leveren, biliærsystemet økte sin forgrening, og (2) i leveren periferi, de novo-genererte gallekanaler var svært tortuous. Disse to faktorene kombinert for å gi et nesten normalt biliært systemvolum, til tross for den unormale arkitekturen. Videre oppdaget DUCT unormal gallekanalgrening som skjedde uavhengig av portalvenegrening og gallekanaler som danner forbindelsesbroer mellom to portalårer9. Disse fenotypene ville være umulige å oppdage i enkeltharpiksstøping og kunne feiltolkes i 2D histologiske seksjoner som gallekanalproliferasjon. DUCT gir dermed data som beskriver 3D-arkitekturen til to rørformede nettverk på hele organ- eller lobenivå med mulighet for kvalitativ og grundig kvantitativ analyse. DUCT kan være en ny standard for postnatal leverutvikling og leverregenereringsanalyser i ulike dyremodeller.
Disclosures
Et eget prosjekt i ERA-laboratoriet er finansiert av ModeRNA. ModeRNA hadde ingen rolle i prosjektet/protokollen som er beskrevet her.
Acknowledgments
Vi takker Kari Huppert og Stacey Huppert for deres ekspertise og hjelp til gallekanalkannasjon og deres laboratoriegjestfrihet. Vi takker også Nadja Schultz og Charlotte L. Mattsson for deres hjelp med vanlig gallekanalkannasjon.
Vi takker følgende tilskuddsbyråer for deres støtte:
For arbeid i ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Svensk stiftelses startstipend), European Association for the Study of the Liver (Daniel Alagille Award), Swedish Heart-Lung Foundation (20170723) og Vetenskapsrådet (2019-01350).
For arbeid i JK Lab: Vi anerkjenner CzechNanoLab Forskningsinfrastruktur støttet av MEYS CR (LM2018110). J.K. takket være støtten fra grant FSI-S-20-6353.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G needle | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
- Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
- Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
- Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).
- Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
- Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
- Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).
