Summary
Se empleó la hibridación multiplex in situ (ISH) para visualizar simultáneamente las transcripciones de dos receptores acoplados a la proteína G y un factor de transcripción en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. Este protocolo podría utilizarse para generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.
Abstract
Este estudio describe un protocolo para la hibridación multiplex in situ (ISH) de los ganglios yugulares-nodosis de ratón, con un énfasis particular en la detección de la expresión de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Los ganglios de yugular-nodosa fijados con formalina se procesaron con la tecnología RNAscope para detectar simultáneamente la expresión de dos GPCR representativos (receptores de colecistoquinina y grelina) en combinación con un gen marcador de nodosa (homeobox 2b, Phox2b) o neuronas aferentes yugulares (proteína de dedo de zinc de dominio PR 12, Prdm12). Los ganglios marcados fueron fotografiados utilizando microscopía confocal para determinar la distribución y los patrones de expresión de las transcripciones antes mencionadas. Brevemente, se encontró que las neuronas aferentes Phox2b expresan abundantemente el receptor de colecistoquinina (Cck1r) pero no el receptor de grelina (Ghsr). También se encontró que un pequeño subconjunto de neuronas aferentes Prdm12 expresan Ghsr y / o Cck1r. Se discuten posibles advertencias técnicas en el diseño, procesamiento e interpretación de multiplex ISH. El enfoque descrito en este artículo puede ayudar a los científicos a generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.
Introduction
Los cuerpos celulares de los aferentes vagales están contenidos en los ganglios yugular, petrosal y nodosis1,2,3. Sus axones viajan juntos a través de varias ramas del nervio vago a los territorios craneocervicical, torácico y abdominal4,5,6,7. Desde sus terminaciones viscerales, las aferencias vagales pueden responder a una amplia gama de estímulos fisiológicos y nocivos8,9,10. Sin embargo, la distribución de las moléculas de señalización y los receptores involucrados en la detección vagagal sigue estando mal caracterizada. Esto se debe en parte a que los ganglios vagales, a pesar de su pequeño tamaño, expresan un amplio espectro de receptores, incluyendo un gran número de GPCR8,11,12,13. Además, las neuronas aferentes vagales son inherentemente heterogéneas y muestran perfiles moleculares distintos14. Para complicar el asunto, los ganglios yugular, petrosal y nodoso se unen en el ratón, formando así una sola masa ganglionar. Por último, en un subconjunto de animales, el ganglio de la nodosa está unido al ganglio cervical superior simpático15.
En el pasado, los investigadores han recurrido a la inmunohistoquímica para estudiar la composición neuroquímica de las neuronas aferentes vagales16,17,18. Si bien la inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos validados es útil, los resultados de los estudios inmunohistoquímicos deben interpretarse con precaución. Por ejemplo, numerosos esfuerzos para identificar anticuerpos específicos contra los GPCR han fallado19,20,21,22,23,24,25,lo que lleva a los investigadores a concluir que la mayoría de los anticuerpos contra los GPCR no son confiables. Para eludir estos problemas, la PCR cuantitativa (qPCR) se ha utilizado ampliamente para evaluar la expresión génica en la masa ganglionar vagal de roedores26,27,28,29. Sin embargo, el examen de la expresión génica utilizando qPCR ocurre a costa de una pérdida de información espacial. En particular, no se puede predecir cuántas células o qué tipo de célula expresan un gen particular de interés (por ejemplo, nodosa vs. células yugulares). Los problemas recurrentes también incluyen la contaminación con tejidos adyacentes y la inclusión de longitudes variables del nervio vago, los ganglios cervicales superiores y yugulares durante la disección15. Como resultado de las dificultades anteriores, la controversia rodea la expresión y distribución de varios GPCR en neuronas aferentes vagales. Un ejemplo particularmente desconcertante se relaciona con el receptor de grelina (Ghsr). Mientras que algunos estudios han encontrado una expresión generalizada de este receptor en las neuronas aferentes vagales30,31,32,otros han encontrado que el ARNm de Ghsr es casi indetectable en el ganglio de la nodosis11,14. Por lo tanto, se justifica un mapeo detallado del ARNm de Ghsr en la masa ganglionar vagal.
La hibridación in situ (ISH) también se ha utilizado para evaluar patrones de expresión génica en la masa ganglionar vagal7,11,12,33,34,35. Debido a que las técnicas basadas en ARN siguen siendo más confiables y específicas que las técnicas basadas en anticuerpos en la mayoría de las circunstancias36,37, los estudios de ISH han demostrado ser valiosos para una mejor comprensión de la codificación neuroquímica de las neuronas aferentes vagales. Sin embargo, las técnicas tradicionales de ISH en sí mismas no están exentas de advertencias. La ISH radiactiva es sensible pero genera fondo y sigue siendo engorrosa38. La ISH no radiactiva es menos complicada pero también menos sensible38. En contraste, el método RNAscope ISH recientemente desarrollado es altamente sensible y genera un fondo mínimo39. El estudio actual aplicó RNAscope fluorescente multiplex a la detección de GPCR en neuronas aferentes vagales del ratón. Nos centramos en mapear la distribución de Ghsr y comparamos su distribución con la del receptor de colecistoquinina (Cck1r), otro GPCR bien conocido por expresarse en el ganglio de la nodosis34. Por último, los dos factores de transcripción, homeobox 2b (Phox2b) y proteína 12 del dedo de zinc del dominio PR (Prdm12), se utilizaron como marcadores selectivos para las neuronas aferentes de nodosa y yugular, respectivamente14. Sin visualizar Phox2b o Prdm12, sería difícil identificar las aferencias yugulares frente a las nodosas con certeza. Las posibles trampas técnicas también se discuten a lo largo del artículo.
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Protocol
NOTA: Los ratones utilizados en este estudio eran machos de tipo salvaje en un fondo puro de C57BL / 6J. Se utilizaron un total de 4 ratones para multiplex ISH. Todos los ratones tenían aproximadamente 8 semanas de edad en el momento del sacrificio. También se utilizó un ratón macho (aproximadamente de un año de edad) para demostrar la fluorescencia endógena asociada con el envejecimiento. Los animales fueron alojados en jaulas ventiladas dentro de una instalación de barrera con acceso ad libitum a alimentos y agua. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UT Southwestern Medical Center revisó y aprobó los procedimientos que se describen a continuación. Los detalles sobre reactivos y herramientas se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
1. Recogida de muestras
- El día del sacrificio, administrar una sobredosis de hidrato de cloral (500 mg/kg, i.p.) a los ratones. Perfundir los ratones profundamente anestesiados transcárdicamente utilizando una bomba peristáltica con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguida de 50 ml de formalina al 10% a temperatura ambiente.
NOTA: Esto se hace en una campana extractora de humos para evitar la inhalación de formalina. - Como los ganglios nodosos, petrosales y yugulares se fusionan para formar una sola masa ganglionar en elratón 15,recoja cuidadosamente toda la masa ganglionar vagal de cada lado (izquierda y derecha) con la ayuda de un endoscopio de disección y tijeras y fórceps de resorte fino (consulte la Tabla de materiales).
- Al decapitar al ratón con un par de tijeras grandes (consulte la Tabla de materiales),evite aplastar el tronco encefálico.
- Siguiendo un enfoque de disección descrito anteriormente en larata 40,retire los músculos esternohioideo y omohioideo lateral a la tráquea con pequeñas pinzas(Tabla de Materiales)para exponer el hueso occipital. Limpie toda la región del músculo, el tejido adiposo y el tejido conjuntivo hasta que la arteria carótida, el nervio vago, el nervio hipogloso y el foramen magnum sean visibles. Cortar todo el nervio hipogloso con pequeñas tijeras de resorte(Tabla de Materiales).
- Busque el ganglio de dosis como una masa translúcida cerca del foramen magnum15. Usando tijeras pequeñas(Tabla de Materiales),rompa cuidadosamente el hueso occipital para exponer aún más el ganglio yugular. Busque melanocitos negros en la superficie de la yugular como un hito visual.
- Corte las uniones nerviosas entre la masa ganglionar vagal y extraiga toda la masa ganglionar tirando suavemente del extremo periférico del nervio vago mientras corta simultáneamente el ganglio yugular hacia el tronco encefálico con pequeñas tijeras de resorte(Tabla de materiales).
- Elimine el tejido conjuntivo y la grasa que se adhieren al nervio vago y la masa ganglionar tanto como sea posible.
- Como es fácil perder un ganglio durante la transferencia de un tubo al otro, mantenga ~ 0,5 cm del nervio vago para facilitar el manejo y la localización de las muestras.
- Colocar los ganglios con la ayuda de fórceps finos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e incubar a 4 °C en foralina durante 24 h y con sacarosa al 30% durante otras 24 h.
- Coloque los ganglios dentro de una pequeña gota (~ 4 mm Ø) de temperatura óptima de corte (OCT) media en una pieza de papel de aluminio. A continuación, congele la muestra en un lecho de hielo seco.
- Cortar las muestras con un criostato a -20 °C en secciones de 14 μm de espesor y recoger en portaobjetos de microscopio de vidrio como 3 series a 42 μm de distancia.
NOTA: Evite colocar secciones cerca de los bordes de la diapositiva. Para ahorrar reactivos, mantenga las secciones de tejido lo más apretadas posible, pero sin superponerse. - Guarde las muestras en un congelador de -80 °C hasta que sea necesario para ISH durante al menos 6 meses.
NOTA: Consulte la Figura 1 para solucionar problemas de fluorescencia endógena.
2. Pretratamiento e ISH
- Antes del día de los experimentos, la cristalería de laboratorio en autoclave se utilizará para ISH, incluidos los platos de tinción y el lavado de frascos de tampón.
NOTA: Si bien trabajar en condiciones libres de RNasa no es crítico, use guantes en todo momento. Mantenga las botellas de solución de descontaminación RNasa(Tabla de Materiales)al alcance de la mano en caso de sospecha de contaminación. - El primer día, lleve los toboganes a temperatura ambiente en un banco dedicado específicamente a ISH. Enjuague los portaobjetos en 1x PBS y hornéelos durante 30 minutos a 60 °C en un horno de cocción(Tabla de materiales).
- Post-fijar las diapositivas en formalina al 4% durante 15 min a 4 °C.
- Llevar los reactivos del kit multiplex(Tabla de Materiales)a temperatura ambiente.
- Deshidratar los portaobjetos en 50%, 70% y 100% etanol durante 5 min cada uno. Aplique la solución H2O2 a las muestras durante 10 minutos y luego enjuague en agua de doble destilación (ddH2O).
- Tratar las muestras con el reactivo de recuperación objetivo durante 5 min, enjuagar en ddH2O seguido de etanol al 100% y secar al aire. Usando una pluma hidrofóbica, cree una barrera alrededor de las muestras.
NOTA: No aplique la barrera hidrofóbica demasiado cerca de las secciones de tejido. - Aplicar proteasa durante 30 min a 40 °C en un horno de hibridación (Tabla de Materiales).
- Mientras tanto, precalencie las sondas a 40 °C y enfríelas a temperatura ambiente antes de usarlas. Incubar los portaobjetos con la combinación deseada de sondas objetivo (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; o Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) durante 2 h a 40 °C en un horno de hibridación.
- Incubar el tejido de control negativo con la sonda C1 diana de la dihidrodipicolinato reductasa (DapB) durante 2 h a 40 °C en un horno de hibridación.
- Enjuague las diapositivas en tampón de lavado y guárdelas durante la noche en citrato de sodio salino (SSC) 5x a temperatura ambiente. Para mayor comodidad, divida el experimento en dos días. Al día siguiente, enjuague las diapositivas con tampón de lavado e incube con los reactivos de amplificación que se enumeran a continuación (consulte el manual del usuario en tabla de materiales).
- Aplique AMP1 (30 min a 40 °C), AMP2 (30 min a 40 °C) y AMP 3 (15 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.
- Disuelva cada colorante opal(Tabla de materiales)en dimetilsulfóxido y almacene las soluciones a 4 °C hasta que sea necesario.
- Para el canal 1, incubar los portaobjetos con HRP-C1 (15 min a 40 °C) y Opal 520 (color verde; dilución 1/1.500; 30 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.
- Para el canal 2, incubar los portaobjetos con HRP-C2 (15 min a 40 °C) y Opal 570 (color amarillo; dilución 1/1.500; durante 30 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.
- Para el canal 3, incubar los portaobjetos con HRP-C3 (15 min a 40 °C) y Opal 690 (color rojo lejano; dilución 1/1.500; durante 30 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.
- Lave las diapositivas y expóngalas a 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 30 s.
- Aplique inmediatamente el medio de montaje en cada diapositiva y coloque una cubierta sobre la sección de tejido.
- Mantenga los tejidos horizontales en un soporte deslizante a 4 °C hasta la toma de imágenes.
3. Microscopía y análisis de datos
NOTA: Los datos multiplex ISH se pueden obtener imágenes con una amplia gama de instrumentos con los filtros apropiados. Sin embargo, un método de imagen preferido es la microscopía confocal con objetivos de 20x y 63x (aceite); consulte la discusión para conocer las razones. Consulte la Figura 2 para determinar la relación señal-ruido óptima.
- Utilice un microscopio confocal equipado con líneas láser de 488, 561 y 633 nm. Utilice los siguientes parámetros de adquisición (consulte la Tabla 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, rango de detección 668-696 nm, potencia 2.0, ganancia 724); Opal 570 (láser DPSS 561 nm, rango de detección 579-627 nm,
- Para mejorar la calidad de las imágenes, adquiera con una línea promedio de 4 y un tamaño de píxel de al menos 1024 x 1024.
NOTA: Los parámetros anteriores solo se proporcionan como ejemplo, y se recomiendan modificaciones dependiendo de un instrumento, aumento (20x o 63x), niveles de expresión y niveles endógenos de fluorescencia para cualquier tejido dado.- Una vez satisfecho con los parámetros de adquisición, recopile imágenes utilizando la misma configuración. Atribuye colores falsos a cada canal para facilitar la visualización.
NOTA: Por ejemplo, rojo (Phox2b o Prdm12), cian (Cck1r), amarillo (Ghsr) y gris (DAPI).- Realice el conteo de células utilizando las imágenes digitales identificando el contorno de los perfiles positivos de RNAscope con un núcleo ligeramente teñido con DAPI. Calcular el porcentaje de perfiles RNAscope-positivos expresando cada transcripción [Figura 3A-C].
- Para mejorar el rigor y la precisión de las estimaciones, cuente al menos 2.000 perfiles neuronales de al menos 4 animales diferentes. Realice el conteo de los ganglios izquierdo y derecho por separado.
- Introduzca los datos en un gráfico circular con el número total de perfiles contados.
- Utilice un software de imágenes para adquirir imágenes y unir imágenes 20x. Utilice ImageJ-Fiji y otro software de fotografía y diseño para generar las placas finales. Aplique ajustes de contraste y ligereza de manera uniforme a todas las imágenes.
- Para mejorar la calidad de las imágenes, adquiera con una línea promedio de 4 y un tamaño de píxel de al menos 1024 x 1024.
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Representative Results
Si bien RNAScope se puede aplicar a animales de cualquier edad, sexo o antecedentes genéticos, es recomendable trabajar con adultos jóvenes (<3 meses de edad). Esto se debe a que los artefactos fluorescentes (por ejemplo, lipofuscina) son hallazgos comunes en las neuronas de animales mayores41. Los ganglios fijados con formalina de ratones más viejos a menudo contienen una fluorescencia endógena sorprendentemente intensa que puede confundirse fácilmente con una tinción genuina(Figura 1A,B). En cualquier caso, es recomendable verificar los niveles de fluorescencia endógena en el tejido antes del procesamiento.
Es importante determinar los parámetros óptimos de adquisición y la relación señal-ruido para cada láser y aumento utilizando secciones de un tejido de control negativo incubado con la sonda negativa DapB como se muestra en la Figura 2A,B. Debido a que DapB es un gen procariota, las señales de RNAscope deben estar completamente ausentes del tejido de control negativo. Aparte de los desechos y cristales ocasionales, se observa una fluorescencia insignificante en las imágenes de los tejidos de control negativos, siempre que se utilicen los parámetros de adquisición adecuados. Sin embargo, por encima de una cierta potencia y ganancia del láser, comienzan a aparecer fondos no deseados y puntos fluorescentes aleatorios(Figura 2C). Otro propósito de minimizar la potencia del láser es evitar la saturación de píxeles y el fotoblanqueo. No se observaron problemas importantes de blanqueamiento por fluorescencia cuando se trabajó con los parámetros anteriores. Si tal problema puede surgir, es aconsejable cubrir el tejido con un medio de montaje para células marcadas fluorescentemente(Tabla de Materiales)además de reducir la potencia del láser tanto como sea posible (consulte los parámetros recomendados en la Tabla 1).
Se aplicó la técnica RNAscope para la detección de 3 genes en secciones tisulares de la masa ganglionar vagal delratón (Figura 3 y Figura 4). Un perfil se consideró positivo para Ghsr y/o Cck1r cuando se vieron puntos amarillos y/o cian, respectivamente, superpuestos a un perfil lleno de puntos rojos(Figura 3A-C). El ejemplo dado en la Figura 3 muestra muchos perfiles que contienen transcripciones Phox2b y Cck1r(Figura 3D). Phox2b se utilizó para identificar neuronas aferentes de nodosis. Abundantes señales Phox2b acumuladas en las neuronas del ganglio de la nodosa (Figura 4A,B). Se detectaron señales Cck1r en aproximadamente el 52% de las células Phox2b(Figura 4C). Cabe destacar que los niveles de expresión para Cck1r variaron mucho entre las células, desde moderados (~ 20 puntos por perfil) hasta un marcado intenso (lleno de citoplasma). En contraste, las señales para Ghsr fueron extremadamente escasas en el ganglio de nodosis(Figura 4A,B). Solo se estima que el 0,65% de las células Phox2b positivas también fueron positivas para las transcripciones de Ghsr(Figura 4C). Las células que expresan Ghsr a menudo coexpresan Cck1r. Un estudio visual de los tejidos no reveló diferencias obvias entre los ganglios izquierdo y derecho. Las señales de ISH estaban prácticamente ausentes de áreas desprovistas de neuronas (por ejemplo, epineurio y tracto de fibra).
Prdm12 se utilizó para identificar neuronas aferentes yugulares. Como era de esperar, la expresión de Prdm12 fue altamente enriquecida en las neuronas del ganglio yugular y algunas neuronas que se infiltraron en la porción rostral del ganglio de la dosis(Figura 5A-C). Curiosamente, las señales Cck1r se detectaron en un subconjunto de células Prdm12(Figura 5B,C). Un poco menos del 9% de las neuronas Prdm12-positivas también expresaron Cck1r(Figura 5D). Sin embargo, el ganglio yugular solo contiene células con niveles moderados de Cck1r (<20 puntos por células) en lugar de las células Cck1r positivas fuertemente marcadas que se encuentran comúnmente en el ganglio de la nodosis. Las células Ghsr positivas fueron significativamente más prevalentes en la yugular que en la nodosis (Figura 5C). Aproximadamente el 3% de las células Prdm12 también fueron Ghsr-positivas(Figura 5D). Curiosamente, el 1% de todos los Prdm12 co-expresaron tanto Ghsr como Cck1r. Los niveles de expresión para Ghsr siempre fueron moderados (<20 puntos por célula). No se podían ver señales de ISH en áreas desprovistas de neuronas.
Figura 1:Solución de problemas de fluorescencia endógena. (A, B) Fluorescencia endógena en el ganglio de dosis/yugular de un ratón envejecido (~1 año de edad). Las imágenes digitales se adquirieron mediante microscopía confocal utilizando las líneas láser indicadas en colores y parámetros de adquisición idénticos a los utilizados para la ISH multiplex con ratones más jóvenes (ver más adelante). Es importante destacar que el tejido fijo no se procesó de ninguna otra manera que no fuera almacenarse a -80 ° C y exponerse a DAPI. Como se muestra en A,se observa un nivel significativo de fluorescencia no deseada en células neuronales y no neuronales, especialmente cuando se exponen al láser de 488 nm (verde). Este es un hallazgo común en histología, que justifica la evaluación de la fluorescencia endógena antes del análisis histológico. (B) Con un aumento más alto, la fluorescencia se asemeja a los pigmentos de lipofuscina que a menudo se acumulan en las células envejecidas y podrían confundirse fácilmente con señales genuinas de inmunorreactividad y / o RNAScope. Barras de escala = 158 μm (A) y 15 μm (B). (B). Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; NG = ganglio de nodosis; ISH = hibridación in situ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Determinación de la relación señal-ruido óptima. (A, B) Control negativo que consiste en la detección de RNAScope para el gen procariota DapB. Tenga en cuenta que la fluorescencia endógena en el ganglio de nodosis de un ratón adulto joven es mínima, y que la incubación con la sonda DapB no dio lugar a señales. Los parámetros de adquisición fueron idénticos a los utilizados para el ISH multiplex. Esto muestra que el procedimiento RNAScope en sí no produce ningún antecedente significativo si los parámetros de adquisición se eligen cuidadosamente. (C) Imágenes digitales del mismo tejido adquiridas al aumentar la potencia del láser y la ganancia con el láser de 488 nm. Observe cómo algunos fondos verdes borrosos y puntos ocasionales surgen por encima de una cierta potencia y ganancia del láser. Por lo tanto, es importante elegir cuidadosamente los parámetros de adquisición para cada láser en función de la cantidad de fluorescencia inespecífica obtenida en el tejido de control negativo. Barras de escala = 158 μm (A) y 15 μm (B, C). Abreviaturas: DapB = dihidrodipicolinato reductasa; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; NG = ganglio de nodosis; ISH = hibridación in situ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Identificación y conteo de perfiles positivos. (A) Imagen digital representativa de perfiles marcados con Phox2b (rojo) en la parte rostral del ganglio de la nodosis. En este ejemplo, se identificaron un total de 18 perfiles celulares (etiquetados como 1 a 18). Tenga en cuenta que la tinción DAPI ayuda aún más a localizar las neuronas, que generalmente mostraban un núcleo grande y redondo con tinción DAPI ligera. En contraste, los núcleos de las células no neuronales están brillantemente marcados, alargados y de menor tamaño. En general, las señales de RNAScope se ajustaron a la distribución y forma de las células neuronales en lugar de no neuronales. (B) Se muestran dos neuronas Ghsr positivas marcadas (amarillo) (perfiles 19 y 20). Las señales de Ghsr eran escasas y difíciles de ver. Por lo tanto, la ligereza y la saturación de las señales amarillas se mejoraron selectiva y uniformemente en el software fotográfico. (C) Se identifican un total de nueve perfiles marcados con Cck1r (cian) (etiquetados como 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 y 19). Observe cómo la intensidad de las señales Cck1r varió mucho entre las células. Por ejemplo, el perfil 11 solo contiene algunas señales positivas, mientras que el perfil 7 está casi lleno de señales Cck1r. (D) Una vista combinada de todos los canales permitió la identificación de patrones de colocalización. Muchos perfiles Phox2b positivos también coexpresaron Cck1r (por ejemplo, perfiles 2, 8 y 14), como lo demuestran los puntos RNAScope rojos y cian dentro del mismo perfil celular. Por el contrario, los perfiles Phox2b positivos no expresaron transcripciones de Ghsr (perfiles 19 y 20). Sin embargo, una célula Ghsr positiva también expresó niveles bajos de Cck1r (perfil 19). Los dos grandes núcleos teñidos con DAPI marcados con un asterisco blanco presumiblemente corresponden a la ubicación de neuronas aferentes Phox2b negativas desprovistas de señales RNAScope. En los resultados representativos que se describen a continuación, se contaron al menos 2.000 perfiles neuronales de masas ganglionares izquierda y derecha de 4 animales diferentes. Barras de escala = 24 μm. Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; Phox2b = homeobox pareado 2b; Ghsr = receptor de grelina; Cck1r = receptor de colecistoquinina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de la ISH multiplex en neuronas aferentes nodosas. Imágenes digitales de una masa ganglionar vagal representativa marcada con RNAscope multiplex para Phox2b, Cck1r y Ghsr. Las imágenes se adquirieron con los objetivos 20x (A) y 63x (B, C) de un microscopio confocal (Zeiss LSM880). En A,20× varias imágenes se unieron utilizando el software Zen y se presentaron como canales no mezclados o fusionados. Señales Phox2b (rojas) específicamente acumuladas en neuronas aferentes ubicadas en el ganglio de la nodosis. Como era de esperar, las señales Cck1r (cian) etiquetaron intensamente muchas, pero no todas, las neuronas en el ganglio de la nodosis. A bajo aumento, las células que expresan bajos niveles de Cck1r o cualquier célula con señales Ghsr (amarillo) no se pudieron observar fácilmente. DAPI (gris) ayudó a visualizar el tejido e identificar neuronas aferentes vagales con un núcleo grande y ligeramente teñido. El recuadro blanco en la imagen combinada corresponde a las ubicaciones de la imagen incluidas a continuación. (B) A gran aumento, los perfiles Phox2b positivos (rojo) son evidentes. Muchas células también expresaron Cck1r pero en niveles variables, que van de moderado a muy alto. El perfil "1" es un ejemplo de una célula Phox2b negativa para Cck1r y Ghsr. Los perfiles "2" y "3" son células Phox2b con señales Cck1r altas y moderadas, respectivamente. Ocasionalmente se observaron señales moderadas para Ghsr (amarillo) en el ganglio de nodosis rostral, pero casi siempre en células negativas para Phox2b, como se muestra con el perfil "4". Curiosamente, el perfil "4" expresó tanto Ghsr como Cck1r. Como se muestra en la siguiente figura, Ghsr fue más abundante en las células Prdm12. (C) Gráfico circular que resume las estimaciones del porcentaje de células Phox2b (rojo) que coexpresan Ghsr (amarillo), Cck1r (cian) o ambos (gris). El número total de perfiles contados se indica junto al gráfico (n=4 ganglios diferentes, izquierdo y derecho combinados). Los resultados de cada lado se agruparon porque no se notaron diferencias. Barras de escala = 158 μm (A) y 15 μm (B). Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; NG = ganglio de nodosis; JG = ganglio yugular; ISH = hibridación in situ; Phox2b = homeobox pareado 2b; Ghsr = receptor de grelina; Cck1r = receptor de colecistoquinina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos de las neuronas aferentes yugulares multiplex ISH. Imágenes digitales de una masa ganglionar vagal representativa marcada con múltiplex RNAscope Prdm12, Cck1r y Ghsr. Las imágenes se adquirieron con los objetivos 20x (A) y 63x (B, C) de un microscopio confocal (Zeiss LSM880). En A,20× varias imágenes se unieron utilizando el software Zen y se presentaron como canales no mezclados o fusionados. La transcripción de Prdm12 (roja) se acumuló específicamente en las neuronas aferentes ubicadas en el ganglio yugular y solo unas pocas neuronas que se infiltran en la parte rostral del ganglio de la nodosis. Las señales Cck1r (cian) etiquetaron intensamente el ganglio de la nodosa. A bajo aumento, las células que expresaban bajos niveles de Cck1r o cualquier célula con señales Ghsr (amarillas) no se podían ver fácilmente. DAPI (gris) ayudó a visualizar el tejido e identificar neuronas aferentes vagales con un núcleo grande y ligeramente teñido. Los dos recuadros blancos en la imagen combinada corresponden a las ubicaciones de las imágenes incluidas a continuación. (B, C) A gran aumento, se pueden delinear perfiles celulares Prdm12 positivos (rojo). También se detectaron señales moderadas para Cck1r en los perfiles "1" y "2". El perfil "3" es representativo de las células Prdm12 negativas para Cck1r o Ghsr. En C,las señales de Ghsr (amarillas) se ven en el perfil representativo "4" pero no en "5". (D) Gráfico circular que resume las estimaciones del porcentaje de celdas Prdm12 (rojo) que coexpresan Ghsr (amarillo), Cck1r (cian) o ambos (gris). El número total de perfiles contados se indica junto al gráfico (n=4 ganglios diferentes, izquierdo y derecho combinados). Los resultados de cada lado se agruparon porque no se notaron diferencias. Barras de escala = 158 μm (A) y 15 μm (B, C). Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; NG = ganglio de nodosis; JG = ganglio yugular; ISH = hibridación in situ; Prdm12 = proteína 12 del dedo de zinc del dominio PR; Phox2b = homeobox pareado 2b; Ghsr = receptor de grelina; Cck1r = receptor de colecistoquinina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ópalo | Línea láser | Rango de detección | poder | ganar | Promedio de línea | Tamaño de píxel |
| Ópalo 690 | HeNe 633 nm | 668-696 nm | 2 | 724 | 4 | 1024 x 1024 |
| Ópalo 570 | Láser DPSS 561 nm | 579-627 nm | 15 | 450 | 4 | 1024 x 1024 |
| Ópalo 520 | láser de argón 488 nm | 499-535 nm | 6 | 830 | 4 | 1024 x 1024 |
| DAPI | láser de diodo 405 | 415-502 nm | 12 | 532 | 4 | 1024 x 1024 |
Tabla 1: Parámetros de adquisición. Abreviatura: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol.
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Discussion
La técnica de ISH fue inventada a finales de la década de 196042. Sin embargo, no es hasta mediados de la década de 1980 que se aplicó para la detección de ARNm en los sistemas nerviosos central y periférico43,44. Teniendo en cuenta la heterogeneidad del sistema nervioso y los problemas recurrentes con los anticuerpos, la localización de una transcripción particular a nivel celular sigue siendo una herramienta invaluable. No obstante, los métodos tradicionales de ISH han permanecido laboriosos y variadamente sensibles. Afortunadamente, este estudio empleó un procedimiento de ISH altamente sensible llamado RNAscope, que generalmente no genera antecedentes y permite la detección de varias transcripciones expresadas en niveles bajos45,46. Específicamente, se aplicó RNAScope fluorescente multiplex para la detección simultánea de las transcripciones Ghsr y Cck1r. Los factores de transcripción, Phox2b y Prdm12, se utilizaron además como marcadores selectivos para diferenciar las neuronas aferentes de la dosis y la yugular, respectivamente. Sin visualizar Phox2b y Prdm12, sería difícil identificar las neuronas yugulares frente a las aferentes nodosas con certeza. Como se explicó anteriormente, un paso crítico incluye una técnica de disección consistente y adecuada. Además, la verificación de la fluorescencia endógena también es un factor importante, ya que podría confundirse fácilmente con señales de RNAScope. Además, se recomienda encarecidamente la elección de parámetros de adquisición adecuados basados en el tejido de control negativo. Como se mencionó anteriormente, la microscopía confocal es el método de imagen preferido con objetivos de 20x y 63x (aceite) porque 1) las transcripciones expresadas a niveles bajos y / o en células dispersas solo pueden notarse a un aumento alto. 2) La microscopía confocal permite la recolección de un solo plano focal, lo cual es importante teniendo en cuenta que dos células una encima de la otra pueden aparecer erróneamente como una sola célula cuando se obtienen imágenes por epifluorescencia. 3) La microscopía confocal también permite parámetros de adquisición más selectivos y flexibles. Los parámetros de adquisición anteriores solo se proporcionan como ejemplo, y se recomiendan modificaciones dependiendo de un instrumento, aumento (20x o 63x), niveles de expresión y niveles endógenos de fluorescencia para cualquier tejido dado. El procedimiento de tinción en sí se mantuvo muy cercano al del protocolo recomendado con solo ligeros ajustes. Obviamente, el protocolo descrito aquí puede aplicarse a la detección de cualquier transcripción, no solo DE GPCR. Sin embargo, el procedimiento descrito aquí es particularmente útil teniendo en cuenta los problemas recurrentes con los anticuerpos planteados contra los GPCR24.
Como se discutió anteriormente15,el ganglio de la nariz de ratón a veces está unido al ganglio cervical superior por un puente celular. La inclusión de este puente celular puede conducir a resultados confusos, por ejemplo, marcadores no vagales que se detectan en el ganglio de la nodosis. Es posible que el investigador desee verificar sistemáticamente si el ganglio de la dosis está unido al ganglio cervical superior durante la disección. De lo contrario, las habilidades de disección inconsistentes entre los ganglios introducirán variabilidad experimental. También es importante tener en cuenta que tanto las neuronas petrosales como las nodosas aferentes expresan Phox2b47. Por lo tanto, lo que llamamos neuronas aferentes de nodosis incluía neuronas petrosales y nodosas. Por último, al comparar diferentes estudios, se debe tener en cuenta que los diferentes métodos de eutanasia pueden causar cambios en la expresióngénica 48.
En teoría, los fluoróforos utilizados para la detección pueden atribuirse indistintamente a cualquier canal. Sin embargo, se encontró que Opal 690 emite un bajo nivel de fluorescencia verde. En la mayoría de las circunstancias, en el caso de transcripciones altamente expresadas (por ejemplo, Prdm12), se observó fluorescencia verde no deseada si la intensidad del láser era demasiado alta. Por lo tanto, Opal 690 se recomienda para genes con expresión moderada / baja. Si solo se trabaja con genes altamente expresados, se recomienda diluir Opal 690 aún más (es decir, 1/3,000) y no capturar fluorescencia verde inespecífica durante la adquisición de imágenes. Las señales de RNAscope son puntos separados de diferentes colores, incluso cuando las transcripciones se expresan dentro del mismo perfil celular. Sin embargo, para transcripciones altamente expresadas, es posible que no sea posible ver puntos individuales, sino más bien fluorescencia llenando el citoplasma. Cuando los puntos emiten fluorescencia de diferentes colores, se podría considerar un problema de fluorescencia inespecífica debido, entre otros ejemplos, a parámetros de adquisición inadecuados y/o pigmentos endógenos. Por último, Opal 570 y 620 no deben utilizarse simultáneamente porque sus espectros de emisión se superponen.
Si no se observan señales de RNAscope para un gen que se sabe que se expresa en el tejido de interés, se recomienda verificar la integridad del tejido ejecutando una sonda positiva disponible (es decir, el gen de limpieza de peptidil-prolil cis-trans isomerasa B). La contratinción DAPI también es útil para determinar la calidad del tejido. Los núcleos marcados con DAPI que aparecen triturados pueden indicar una digestión excesiva o tejido fijado incorrectamente.
Como resultado, Ghsr se expresó en un pequeño subconjunto de neuronas aferentes yugulares Prdm12 positivas. En contraste, y de acuerdo con un estudio previo11,el ARNm de Ghsr estaba prácticamente ausente de las neuronas aferentes de la nodosis. Se deduce que los bajos niveles de ARNm ghsr detectados previamente por qPCR e ISH probablemente se debieron a neuronas aferentes yugulares30,31,32. Un estudio previo de señalización de calcio mostró que el 3% de las neuronas aferentes vagales cultivadas responden a la grelina49,un número que es notablemente similar al porcentaje de neuronas aferentes yugulares que expresan Ghsr. Cck1r se expresó en muchas neuronas aferentes de nodosa Phox2b positivas y, lo que es más sorprendente, en un subconjunto de neuronas aferentes yugulares positivas para Prdm12. En resumen, este trabajo demuestra la adaptación exitosa de las técnicas ISH existentes para evaluar la distribución celular de GPCR seleccionados en la masa ganglionar de la nariz yugular en su totalidad.
En conclusión, se empleó ISH multiplex para detectar y visualizar simultáneamente las transcripciones de dos GPCR (Cck1r y Ghsr) y un factor de transcripción (Phox2b o Prdm12) en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. El protocolo descrito aquí puede ser una herramienta complementaria a la secuenciación de ARN, la qPCR y la histología tradicional. Sin embargo, este protocolo puede aplicarse a otros ganglios de tamaño similar. Como se discutió anteriormente, los parámetros de adquisición, la edad de los animales y la consistencia de la disección son factores importantes a considerar durante el diseño experimental. Por lo tanto, puede ofrecer información única sobre los patrones topográficos de expresión génica en un ganglio altamente heterogéneo y pequeño. Este protocolo podría usarse para determinar los cambios en los perfiles transcripcionales de las neuronas yugulares frente a las aferentes nodosas en el contexto de diversas condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, incluidos, entre otros, los cambios en el estado de alimentación. También se puede utilizar para comparar la composición neuroquímica de las neuronas aferentes vagales en especies animales comúnmente utilizadas en la investigación preclínica, incluidos primates y cerdos50,51.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financiado por la subvención de los NIH #5P01DK119130-02. Los autores desean agradecer la asistencia del UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (encabezado por el Dr. Phelps) y su personal (Abhijit Bugde y Marcel Mettlen), apoyado en parte por la Subvención nih #1S10OD021684-01, un recurso compartido del Centro Oncológico Harold C. Simmons, apoyado en parte por una subvención de apoyo del Centro Oncológico del NCI, P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
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