Summary

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 検出

Published: September 20, 2021
doi:

Summary

Situハイブリダイゼーション(ISH)におけるマルチプレックスは、成体マウスの全迷頭神経節複合体における2つのGタンパク質共役受容体および1つの転写因子の転写を同時に可視化するために採用された。このプロトコルは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成するために使用することができる。

Abstract

本研究では、マウスの 遺伝子 組み換え(ISH)における多重化のプロトコルを説明し、特にGタンパク質共役受容体(GPCRs)の発現を検出することに重点を置いた。ホルマリン固定頸部-結節神経節は、RNAscope技術を用いて処理され、2つの代表的なGPDR(コレシストキニンおよびグレリン受容体)の発現を、ノードーズ(ペアドホメオボックス2b、Phox2b)または頸管失フェルニューロン(PRドメイン亜鉛フィンガータンパク質12、Prdm12)の1つのマーカー遺伝子と組み合わせて同時に検出した。標識された神経素は、前述の転写物の分布および発現パターンを決定するために共焦点顕微鏡を用いて画像化した。簡単に言えば、Phox2bのアッフェレントニューロンは、コレシストキニン受容体(Cck1r)を豊富に発現するが、グレリン受容体(Ghsr)を豊富に発現しないことが判明した。Prdm12の小さなサブセットの発泡性ニューロンは、Ghsrおよび/またはCck1rを発現することも発見された。この記事で説明されているアプローチは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成する際に科学者を助けるかもしれません。

Introduction

迷走性の細胞体は、頸部、ペトロサル、および無用量神経節1、2、3に含まれている。彼らの軸索は、頭蓋神経、胸部、および腹部の領域4、5、6、7に迷走神経のいくつかの枝を介して一緒に移動します。彼らの内臓の終わりから、迷走者は生理学的および有害な刺激の広い範囲に応答することができます8、9、10.しかし、バジクエンセンシングに関与するシグナル伝達分子や受容体の分布は、依然として十分に特徴付けされていません。これは、迷走性神経節が、その小さなサイズにもかかわらず、多数のGPCRs8、11、12、13を含む幅広い受容体スペクトル発現するためである。さらに、迷走性の無フェレントニューロンは本質的に異種であり、明確な分子プロファイル14を表示する。問題を複雑にするために、頸部、ペトロサル、およびノードーズ神経節がマウスに取り付けられ、それによって単一の神経節塊を形成する。最後に、動物のサブセットにおいて、無用量神経節は交感神経節15に交感神経節に付着している。

過去に、研究者は、迷走性の神経細胞16、17、18の神経化学的構成を研究するために免疫体系化学に目を向けました。検証された抗体を用いた免疫組織化学は有用であるが、免疫組織化学の研究結果は慎重に解釈されなければならない。例えば、GPCRsに対する特定の抗体を同定するための数多くの努力は、19、20、21、22、23、24、25に失敗し、研究者はGPCBに対する抗体の大半が信頼できないと結論付けました。これらの問題を回避するために、定量PCR(qPCR)は、げっ歯類迷膜神経節系質量26、27、28、29における遺伝子発現を評価するために広く使用されている。しかし、qPCRを用いた遺伝子発現の検討は、空間情報の損失を犠牲にして生じる。特に、対象となる特定の遺伝子(例えば、無用量対頸部細胞)を発現する細胞の数や細胞タイプは予測できない。また、反復的な問題としては、隣接組織との汚染や迷走神経の可変長、上頸部、および解剖15中の頸管神経節の含めることも含まれる。上記の困難の結果として、論争は、迷走性の神経細胞におけるいくつかのGPCBの発現と分布を取り巻く。特に不可解な例の1つは、グレリン受容体(Ghsr)に関する。いくつかの研究は、バガルの無フェレントニューロン30、31、32でこの受容体の広範な発現を発見しているのに対し、他の研究は、Gsr mRNA、11,14の無用量でほとんど検出できないことが判明した。したがって、迷走神経節系質量におけるGhsr mRNAの詳細なマッピングが保証される。

また、この中で、迷走神経節塊7、11、12、33、34、35の遺伝子発現パターンを評価するためにも使用されている。RNAベースの技術は、ほとんどの状況下で抗体ベースの技術よりも信頼性が高く、特異的なままであるため、36、37、ISH研究は、迷膜の発泡神経細胞の神経化学的コーディングのより良い理解のために価値があることが証明されています。それにもかかわらず、伝統的なISH技術自体は注意点がないわけではありません。放射性ISHは敏感であるが、背景を生成し、面倒な38のままです。非放射性のISHは複雑ではなく、感度が低い38です。対照的に、最近開発されたRNAscope ISH法は高感度で、最小限の背景39を生成します。現在の研究では、マウスの迷走性の神経細胞におけるGPCBの検出に多重蛍光RNAscopeを適用した。我々は、Ghsrの分布をマッピングすることに焦点を当て、その分布をコレシストキニン受容体(Cck1r)と比較し、無用量神経節34で発現することがよく知られている別のGPCRである。最後に、2つの転写因子は、ペアドライホメオボックス2b(Phox2b)およびPRドメインジンクフィンガータンパク質12(Prdm12)と、それぞれ14個の無用量および頸状の帯状神経細胞に対する選択マーカーとして使用した。Phox2bまたはPrdm12を視覚化しなければ、確実に頸部対無用量のアフェレントを特定することは困難です。潜在的な技術的な落とし穴についても、記事全体で説明されています。

Protocol

注:この研究で使用されたマウスは、純粋なC57BL / 6Jバックグラウンドで野生型の雄でした。多重化のISHには合計4匹のマウスを用いた。すべてのマウスは、犠牲の時点で約8週齢であった。1つの雄マウス(およそ1歳)も老化に関連する内因性蛍光を示すために使用された。動物は、食料と水への アドリビタム アクセスを備えたバリア施設内の換気ケージに収容されました。UTサウスウェス?…

Representative Results

RNAScopeは、年齢、性別、または遺伝的背景を持つ動物に適用できますが、若い成人(生後3ヶ月 <)と一緒に働くことをお勧めします。これは、蛍光性アーチファクト(例えば、リポフスチン)が古い動物41のニューロンにおける一般的な知見であるからである。古いマウスからのホルマリン固定神経節は、多くの場合、本物の染色と間違えられやすい驚くほど強烈な内因性蛍光を?…

Discussion

ISHの技術は1960年代後半42年に発明された。しかし、1980年代半ばになって初めて、中枢神経系および末梢神経系43,44におけるmRNAの検出に適用された。神経系の異質性と抗体の繰り返しの問題を考慮すると、細胞レベルで特定のトランスクリプトを局所化することは非常に貴重なツールのままです。それにもかかわらず、伝統的なISH?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIH助成金#5P01DK119130-02によって資金提供された神経解剖学/神学/脳注射コアによって支えられた。著者らは、NCIがんセンター支援グラントの一部が支援するハロルド・C・シモンズがんセンターの共有資源であるNIHグラント#1S10OD021684-01の支援を受けたUTサウスウェスタン・ライブ・セル・イメージング・ファシリティ(フェルプス博士が率いる)とそのスタッフ(アビジット・バグデとマルセル・メトレン)の支援を認めたいと考えています。 P30 CA142543.

Materials

10x PBS Fisher Scientific BP399-4
20x SSC Invitrogen AM9763
-80°C freezer PHCBI MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021 Adobe photo and design software
Baking oven Thermo Scientific Model:658
Confocal microscope Zeiss LSM880 Airyscan
Cover glass Brain Research Laboratories 2460-1.5D
Cryostat Leica CM 3050 S
Dumont #5 Forceps F.S.T. 11252-20
Ecomount Biocare Medical EM 897L mounting medium
HybEZ oven hybridization oven
Hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
ImageJ-Fiji NIH
Large scissors Henry Schein 100-7561
Micro centrifuge tubes VWR 20170-333
Minipump variable flow Fisher Scientific 13-876-1
Opal 520 Akoya biosciences FP1 1487001KT Fluorescent biomarker
Opal 570 Akoya biosciences FP1 1488001KT Fluorescent biomarker
Opal 690 Akoya biosciences FP1 1497001KT Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 ACD /Bio-Techne 323100 multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 ACD /Bio-Techne 313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB ACD /Bio-Techne 310043
RNAscope probe Mouse Ghsr ACD /Bio-Techne 426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 ACD /Bio-Techne 407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 ACD /Bio-Techne 524371-C2
RnaseZap Sigma R2020 Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors Millipore Sigma Z265977
Superfrost Plus slides Fisherbrand 1255015
Tissue Tek OCT medium Sakura 4583
User manual ACD 323100 USM
Vannas Spring Scissors Roboz RS 5620
ZEN Imaging Software Zeiss

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Cite This Article
Bob-Manuel, J., Gautron, L. Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (175), e62945, doi:10.3791/62945 (2021).

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