Summary
Situハイブリダイゼーション(ISH)におけるマルチプレックスは、成体マウスの全迷頭神経節複合体における2つのGタンパク質共役受容体および1つの転写因子の転写を同時に可視化するために採用された。このプロトコルは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成するために使用することができる。
Abstract
本研究では、マウスの 遺伝子 組み換え(ISH)における多重化のプロトコルを説明し、特にGタンパク質共役受容体(GPCRs)の発現を検出することに重点を置いた。ホルマリン固定頸部-結節神経節は、RNAscope技術を用いて処理され、2つの代表的なGPDR(コレシストキニンおよびグレリン受容体)の発現を、ノードーズ(ペアドホメオボックス2b、Phox2b)または頸管失フェルニューロン(PRドメイン亜鉛フィンガータンパク質12、Prdm12)の1つのマーカー遺伝子と組み合わせて同時に検出した。標識された神経素は、前述の転写物の分布および発現パターンを決定するために共焦点顕微鏡を用いて画像化した。簡単に言えば、Phox2bのアッフェレントニューロンは、コレシストキニン受容体(Cck1r)を豊富に発現するが、グレリン受容体(Ghsr)を豊富に発現しないことが判明した。Prdm12の小さなサブセットの発泡性ニューロンは、Ghsrおよび/またはCck1rを発現することも発見された。この記事で説明されているアプローチは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成する際に科学者を助けるかもしれません。
Introduction
迷走性の細胞体は、頸部、ペトロサル、および無用量神経節1、2、3に含まれている。彼らの軸索は、頭蓋神経、胸部、および腹部の領域4、5、6、7に迷走神経のいくつかの枝を介して一緒に移動します。彼らの内臓の終わりから、迷走者は生理学的および有害な刺激の広い範囲に応答することができます8、9、10.しかし、バジクエンセンシングに関与するシグナル伝達分子や受容体の分布は、依然として十分に特徴付けされていません。これは、迷走性神経節が、その小さなサイズにもかかわらず、多数のGPCRs8、11、12、13を含む幅広い受容体スペクトルを発現するためである。さらに、迷走性の無フェレントニューロンは本質的に異種であり、明確な分子プロファイル14を表示する。問題を複雑にするために、頸部、ペトロサル、およびノードーズ神経節がマウスに取り付けられ、それによって単一の神経節塊を形成する。最後に、動物のサブセットにおいて、無用量神経節は交感神経節15に交感神経節に付着している。
過去に、研究者は、迷走性の神経細胞16、17、18の神経化学的構成を研究するために免疫体系化学に目を向けました。検証された抗体を用いた免疫組織化学は有用であるが、免疫組織化学の研究結果は慎重に解釈されなければならない。例えば、GPCRsに対する特定の抗体を同定するための数多くの努力は、19、20、21、22、23、24、25に失敗し、研究者はGPCBに対する抗体の大半が信頼できないと結論付けました。これらの問題を回避するために、定量PCR(qPCR)は、げっ歯類迷膜神経節系質量26、27、28、29における遺伝子発現を評価するために広く使用されている。しかし、qPCRを用いた遺伝子発現の検討は、空間情報の損失を犠牲にして生じる。特に、対象となる特定の遺伝子(例えば、無用量対頸部細胞)を発現する細胞の数や細胞タイプは予測できない。また、反復的な問題としては、隣接組織との汚染や迷走神経の可変長、上頸部、および解剖15中の頸管神経節の含めることも含まれる。上記の困難の結果として、論争は、迷走性の神経細胞におけるいくつかのGPCBの発現と分布を取り巻く。特に不可解な例の1つは、グレリン受容体(Ghsr)に関する。いくつかの研究は、バガルの無フェレントニューロン30、31、32でこの受容体の広範な発現を発見しているのに対し、他の研究は、Gsr mRNAが、11,14の無用量でほとんど検出できないことが判明した。したがって、迷走神経節系質量におけるGhsr mRNAの詳細なマッピングが保証される。
また、この中で、迷走神経節塊7、11、12、33、34、35の遺伝子発現パターンを評価するためにも使用されている。RNAベースの技術は、ほとんどの状況下で抗体ベースの技術よりも信頼性が高く、特異的なままであるため、36、37、ISH研究は、迷膜の発泡神経細胞の神経化学的コーディングのより良い理解のために価値があることが証明されています。それにもかかわらず、伝統的なISH技術自体は注意点がないわけではありません。放射性ISHは敏感であるが、背景を生成し、面倒な38のままです。非放射性のISHは複雑ではなく、感度が低い38です。対照的に、最近開発されたRNAscope ISH法は高感度で、最小限の背景39を生成します。現在の研究では、マウスの迷走性の神経細胞におけるGPCBの検出に多重蛍光RNAscopeを適用した。我々は、Ghsrの分布をマッピングすることに焦点を当て、その分布をコレシストキニン受容体(Cck1r)と比較し、無用量神経節34で発現することがよく知られている別のGPCRである。最後に、2つの転写因子は、ペアドライホメオボックス2b(Phox2b)およびPRドメインジンクフィンガータンパク質12(Prdm12)と、それぞれ14個の無用量および頸状の帯状神経細胞に対する選択マーカーとして使用した。Phox2bまたはPrdm12を視覚化しなければ、確実に頸部対無用量のアフェレントを特定することは困難です。潜在的な技術的な落とし穴についても、記事全体で説明されています。
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Protocol
注:この研究で使用されたマウスは、純粋なC57BL / 6Jバックグラウンドで野生型の雄でした。多重化のISHには合計4匹のマウスを用いた。すべてのマウスは、犠牲の時点で約8週齢であった。1つの雄マウス(およそ1歳)も老化に関連する内因性蛍光を示すために使用された。動物は、食料と水への アドリビタム アクセスを備えたバリア施設内の換気ケージに収容されました。UTサウスウェスタン医療センターの施設動物のケアと使用委員会は、以下に記載の手順を検討し、承認しました。試薬とツールの詳細については、 資料表を参照してください。
1. サンプルコレクション
- 犠牲の日に、マウスにクロラルハイドレート(500mg /kg、すなわち)の過剰摂取を投与する。深く麻酔化されたマウスを、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いた蠕動ポンプを使用して、室温で10%ホルマリンの50 mLを続ける心腔内に浸透させる。
注:これはホルマリンの吸入を防ぐためにヒュームフードで行われます。 - ノードース、ペトロサル、および頸管神経節が融合してマウス15に単一の神経節塊を形成し、解剖スコープと細かいスプリングハサミと鉗子の助けを借りて、両側(左右)から迷走神経節塊全体を慎重に収集する( 材料表を参照)。
- 大きなハサミでマウスの首を切るとき( 材料表を参照)、脳幹を押しつぶさないようにします。
- ラット40に先に説明した解剖アプローチに従って、後頭部骨を露出させるために、小さな鉗子(材料表)で気管に横向きのステルノヒロイドおよびオモヨイド筋を取り除く。頸動脈、迷走神経、舌下神経、および前門のマグナムが見えるまで、筋肉、脂肪組織、および結膜組織の全領域をクリアする。小さな春のはさみで全ての舌下神経を切る(材料表)。
- 口数マグナム15に近い半透明の塊として無用量ガングリオンを探してください。小さいはさみ(材料のテーブル)を使用して、慎重に後頭部の骨を破って、さらに頸神経節を露出させる。視覚的なランドマークとして、頸部の表面に黒いメラノサイトを探します。
- 迷走神経節系質量の間の神経付着を切断し、迷走神経の末端を優しく引っ張りながら、小さなスプリングハサミで脳幹に向かって頸神経節を切断することによって、神経節質量全体を抽出する(材料表)。
- 結合組織と、迷走神経と神経節系の塊にできるだけ固着する脂肪をできるだけ取り除きます。
- 一方のチューブから他方への移動中に1つの神経節を失うのは容易であるため、迷走神経の約0.5cmを保持して、サンプルの取り扱いと局在化を容易にします。
- 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに微細な鉗子の助けを借りて神経節を置き、ホルマリンで4°Cで24時間、さらに24時間30%スクロースでインキュベートします。
- アルミ箔の上に最適な切断温度(OCT)媒体の小さな滴(約4mm Ø)の内側に神経節を配置します。次に、ドライアイスのベッドの上にサンプルを凍結します。
- -20°Cのクライオスタットでサンプルを14 μmの厚さのセクションに切り、3シリーズ42 μm離れたところにガラス顕微鏡スライドに集めます。
メモ:スライドの端にセクションを近づけないようにします。試薬を保存するには、組織切片をできるだけしっかりと詰めておきますが、重ならないようにしてください。 - 少なくとも6ヶ月間、必要になるまで-80°Cの冷凍庫にサンプルを保管してください。
メモ:内因性蛍光のトラブルシューティングについては 、図1 を参照してください。
2. 前処理とイッシュ
- 実験の日の前に、食器や洗浄バッファーの瓶を含む、ISHに使用されるオートクレーブ実験室用ガラス製品。
注:RNaseフリーの条件下で作業することは重要ではありませんが、常に手袋を着用してください。汚染が疑われる場合には、RNase除染溶液ボトル(材料表)を手の届くところに保管してください。 - 初日は、特にISH専用のベンチでスライドを室温にします。1x PBSでスライドをすすぎ、ベーキングオーブン(材料表)で60°Cで30分間焼きます。
- 4%ホルマリンでスライドを4°Cで15分間後固定します。
- マルチプレックスキット(材料表)の試薬を室温にしてください。
- スライドを50%、70%、100%エタノールずつ脱水乾燥します。H2O2溶液をサンプルに10分間塗布し、二重蒸留水(ddH2O)ですすります。
- サンプルを5分間のターゲット検索試薬で処理し、ddH2Oでリンスを100%エタノール、エアドライで処理します。疎水性ペンを使用して、サンプルの周囲にバリアを作成します。
注:疎水性バリアを組織切片に近づけないでください。 - ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cでプロテアーゼを30分間塗布する(材料表)。
- その間、プローブを40°Cで予熱し、使用前に室温で冷却します。ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで2時間、目標プローブ(Cck1r-C3、Ghsr-C1、Phox2b-C2;またはCck1r-C3、Ghsr-C1、Prdm12-C2)の所望の組み合わせでスライドをインキュベートします。
- ジヒドロジピコリン酸還元法(DapB)標的C1プローブをハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで2時間用にインキュベートする。
- スライドを洗浄バッファーで洗い流し、室温でクエン酸 5x 生理食塩水ナトリウム (SSC) で一晩保管します。便宜上、実験を2日間に分割します。翌日、洗浄バッファーでスライドを洗い流し、以下にリストされている増幅試薬でインキュベートします( 資料表のユーザーマニュアルを参照)。
- AMP1(40°Cで30分)、AMP2(40°Cで30分)、AMP 3(40°Cで15分)を適用します。各ステップ間の洗浄バッファーで洗い流す。
- ジメチルスルホキシドで各オパール色素(材料表)を溶解し、必要になるまで4°Cで溶液を保存します。
- チャンネル1の場合は、HRP-C1(40°Cで15分)とオパール520(緑色、希釈1/1,500;40°Cで30分)でスライドをインキュベートします。各ステップ間の洗浄バッファーで洗い流す。
- チャンネル2の場合は、HRP-C2(40°Cで15分)とオパール570(黄色、希釈1/1,500;40°Cで30分間)でスライドをインキュベートします。各ステップ間の洗浄バッファーで洗い流す。
- チャンネル3の場合は、HRP-C3(40°Cで15分)とオパール690(遠い赤い色、希釈1/1,500;40°Cで30分間)でスライドをインキュベートします。各ステップ間の洗浄バッファーで洗い流す。
- スライドを洗い、4',6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)に30 sで公開します。
- すぐに各スライドに取り付け媒体を塗布し、組織セクションの上にカバースリップを置きます。
- 画像が撮れるまで、スライドホルダの組織を4°Cで水平に保ちます。
3. 顕微鏡・データ解析
メモ:多重のISHデータは、適切なフィルタを備えた幅広い機器で画像化できます。しかし、好ましいイメージング方法は、20xおよび63x(油)目標を有する共焦点顕微鏡である。その理由から議論を参照してください。最適な信号対雑音比の決定については 、図2 を参照してください。
- 488、561、および633 nmのレーザーラインを備えた共焦点顕微鏡を使用してください。次の取得パラメータを使用します( 表1を参照):Opal 690(HeNe 633 nm、検出範囲668-696 nm、パワー2.0、ゲイン724)。オパール570(DPSSレーザー561 nm、検出範囲579-627 nm、<パワー15.0、<ゲイン450);オパール520(アルゴンレーザー488 nm、検出範囲499-535 nm、<パワー6.0、<ゲイン830);DAPI(ダイオードレーザー405、検出範囲415-502nm、<電力12.0、<ゲイン532)。
- 画像の品質を向上させるためには、4のライン平均と少なくとも1024 x 1024のピクセルサイズで取得します。
注:上記のパラメータは例として提供されるだけであり、1つの器具、倍率(20xまたは63x)、発現レベル、および任意の特定の組織の蛍光の内因性レベルに応じて変更が推奨されます。 - 取得パラメータに満足したら、同じ設定を使用して画像を収集します。各チャネルに誤った色を設定して、視覚化を容易にします。
注: たとえば、赤 (Phox2b または Prdm12)、シアン (Cck1r)、黄色 (Ghsr)、およびグレー (DAPI) などです。 - DAPIで軽く染色された1つの核を有するRNAscope陽性プロファイルの輪郭を同定することにより、デジタル画像を用いて細胞計数を行う。各転写を表すRNAscope陽性プロファイルの割合を計算する[図3A-C]。
- 推定値の厳格さと精度を向上させるために、少なくとも4つの異なる動物から少なくとも2,000のニューロンプロファイルを数えます。左右の神経節から個別にカウントを実行します。
- カウントされたプロファイルの合計数を含む円グラフのデータを入力します。
- イメージングソフトウェアを使用して画像を取得し、20倍の画像をつなぎ合わせます。ImageJ-Fijiと別の写真とデザインソフトウェアを使用して、最終的なプレートを生成します。すべての画像に対して、コントラストと明度を均一に調整します。
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Representative Results
RNAScopeは、年齢、性別、または遺伝的背景を持つ動物に適用できますが、若い成人(生後3ヶ月 <)と一緒に働くことをお勧めします。これは、蛍光性アーチファクト(例えば、リポフスチン)が古い動物41のニューロンにおける一般的な知見であるからである。古いマウスからのホルマリン固定神経節は、多くの場合、本物の染色と間違えられやすい驚くほど強烈な内因性蛍光を含んでいます(図1A,B)。いずれの場合も、処理前に組織中の内在性蛍光のレベルを確認することをお勧めします。
図2A,Bに示すようにDapB陰性プローブでインキュベートされた陰性対照組織の切片を用いて、各レーザーと倍率の最適な取得パラメータと信号対雑音比を決定することが重要である。DapBは原核生物遺伝子であるため、RNAscopeシグナルは陰性対照組織から完全に存在しなくなるため、時折の破片および結晶を除いて、取得パラメータが適切である場合、負の対照組織からの画像では無視できる蛍光が見られる。しかし、あるレーザパワーとゲインを上回ると、不要な背景やランダム蛍光ドットが現れ始める(図2C)。レーザーパワーを最小限に抑えるもう1つの目的は、ピクセルの飽和と光の切り落としを避けることです。上記のパラメータを用いた場合、蛍光漂白の主要な問題は認められなかった。このような問題が発生する可能性がある場合は、レーザーパワーを可能な限り下げるだけでなく、蛍光標識された細胞用の実装媒体(材料表)で組織を覆うことをお勧めします(表1の推奨パラメータを参照)。
RNAscope技術を、マウスの迷走神経節塊の組織切片における3つの遺伝子の検出に適用した(図3および図4)。黄色とシアンのドットがそれぞれ赤い点で満たされた1つのプロファイルを重ねているのが見られたとき、Ghsrおよび/またはCck1rの1つのプロファイルは正であると考えられました(図3A-C)。図 3の例は、Phox2b と Cck1r の両方のトランスクリプトを含む多くのプロファイルを示しています (図 3D)。Phox2bは、無用量の無熱性ニューロンを同定するために使用された。ノドーズ神経節のニューロンに蓄積された豊富なPhox2b信号(図4A、B)。Cck1rシグナルは、Phox2b細胞の約52%で検出された(図4C)。Cck1rの発現レベルは、中程度(プロファイル当たり20ドット〜20ドット)から強烈な標識(細胞質充填)まで、細胞間で大きく変化した。対照的に、Ghsrのシグナルは、無用量ガングリオンでは極めてまばらであった(図4A、B)。Ghsr転写物についても、推定0.65%のPhox2b陽性細胞のみが陽性であった(図4C)。Ghsr発現細胞はCck1rを共発現することが多い。組織の視覚的な調査は、左右の神経節の間の明らかな違いを明らかにしなかった。ISHシグナルは、ニューロンを欠いた領域(例えば、エピニューリウムおよび線維路)から事実上存在しなかった。
Prdm12は、頸状のアファレントニューロンを同定するために使用された。予想通り、Prdm12発現は、頸神経節のニューロンおよび無用量神経節のrostral部分に浸潤するいくつかのニューロンにおいて高く富化した(図5A-C)。興味深いことに、Cck1rシグナルはPrdm12細胞のサブセットで検出された(図5B,C)。Prdm12陽性ニューロンの9%よりわずかに少ないもCck1rを発現した(図5D)。しかし、頸神経節には、一般的に無ドージガングリオンに見られる強く標識されたCck1r陽性細胞ではなく、中程度のレベルのCck1r(< 1細胞当たり20ドット)の細胞のみが含まれています。Ghsr陽性細胞は、無用量よりも頸部において有意に多く普及した(図5C)。Prdm12細胞の約3%もGhsr陽性であった(図5D)。興味深いことに、すべてのPrdm12の1%がGhsrとCck1rの両方を共同発現 <しました。イッシュ信号はニューロンを欠いている領域では見られなかった。
図1:内因性蛍光の問題のトラブルシューティング(A,B)1つの老化マウスの無用量/頸神経節における内因性蛍光(〜1歳)。デジタル画像は、若いマウスとの多重化のISHに使用されるものと同じ色と取得パラメータで示されたレーザー線を使用して共焦点顕微鏡で取得されました(後述参照)。重要なことに、固定組織は、−80°Cで保存され、DAPIに曝露される以外の方法で処理されなかった。Aに示すように、特に488nmレーザー(緑色)にさらされた場合、有意なレベルの望ましくない蛍光が神経細胞および非神経細胞で観察される。これは、組織学的分析前に内因性蛍光を評価することを保証する組織学における一般的な発見である。(B)高倍率では、蛍光は老化細胞に蓄積することが多く、本物の免疫反応性およびRNAScopeシグナルと間違えられやすいリポフスチン色素に似ている。スケールバー = 158 μm(A)および 15 μm(B)(B). 略語: DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール;NG = ノードーズガングリオン;ISH =イン・シチュハイブリダイゼーションこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 最適なシグナル対雑音比の決定( A, B) 原核生物遺伝子 DapBのRNAScope検出からなる陰性制御なお、若年成マウスの無用量神経節における内因性蛍光は最小限であり、DapBプローブによるインキュベーションはシグナルをもたらさなかったことに注意してください。取得パラメータは、多重化のISHに使用されるものと同一であった。これは、取得パラメータが慎重に選択された場合、RNAScope手順自体が重要なバックグラウンドを生み出さないことを示しています。(C)488 nmレーザーでパワーレーザーとゲインを増加させることで獲得した同じ組織のデジタル画像。いくつかのファジーグリーンの背景と時折ドットが特定のレーザーパワーとゲインの上に発生する方法に注意してください。したがって、陰性対照組織で得られる非特異的蛍光量に基づいて、各レーザの取得パラメータを慎重に選択することが重要である。スケールバー = 158 μm(A)および 15 μm (B, C)略語: DapB = ジヒドロジピコリン酸還元体;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール;NG = ノードーズガングリオン;ISH = イン・シチュハイブリダイ ゼーション この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 正のプロファイルの識別とカウント (A) Nodoseガングリオンのロストラル部分におけるPhox2b標識プロファイル(赤)の代表的なデジタル画像。この例では、合計18の細胞プロファイル(1~18のラベル)が同定されました。DAPI染色は、ニューロンの局在化に役立ち、通常は大きく丸い核を光DAPI染色で表示することに注意してください。対照的に、非神経細胞の核は明るく標識され、細長く、サイズが小さくなります。全体として、RNAScopeシグナルは、非神経細胞ではなくニューロンの分布と形状に準拠していました。(B)標識された2つのGhsr陽性ニューロン(黄色)が示されている(プロファイル19および20)。Ghsr信号はまばらで見えにくかった。したがって、黄色信号の明度と飽和度は、写真ソフトにおいて選択的かつ均一に増強された。(C) Cck1r ラベル付けプロファイル (シアン) の合計が識別されます (2、5、8、11、14、17、18、および 19 とラベル付け)。Cck1r信号の強度が細胞間でどのように大きく変化したかに注意してください。例えば、プロファイル11には数個の正のシグナルしか含み、プロファイル7はCck1r信号でほぼ満たされます。(D) すべてのチャネルの結合ビューにより、共局在パターンの識別が可能になります。多くのPhox2b陽性プロファイルはまた、同じ細胞プロファイル内の赤およびシアンRNAScopeドットによって証明されるように、Cck1r(例えば、プロファイル2、8、および14)を共発現した。対照的に、Phox2b陽性プロファイルは、Ghsr転写物(プロファイル19および20)を発現しなかった。しかし、1つのGhsr陽性細胞も低レベルのCck1r(プロファイル19)を発現した。白いアスタリスクで標識された2つの大きなDAPI染色核は、RNAScopeシグナルを欠いたPhox2b陰性の無色のニューロンの位置に対応すると考えられる。以下に示す代表的な結果では、少なくとも2,000の神経細胞プロファイルが4つの異なる動物から左右の神経節系の塊から数えられた。スケールバー= 24 μm略語: DAPI = 4',6-ジミディノ-2-フェニリンドール;Phox2b = ペアのようなホメオボックス 2b;Ghsr = グレリン受容体;Cck1r = コレシストキニン受容体. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:無用量無放射線性ニューロンにおける多重化ISHの代表的な結果Phox2b、Cck1r、およびGhsr. 画像の多重RNAscopeで標識された代表的な迷走神経節質量のデジタル画像は、共焦点顕微鏡の20x(A)および63x(B、C)の目的(Zeiss LSM880)で取得されました。A,20×いくつかの画像がZenソフトウェアを使用して一緒にステッチされ、混合されていないチャンネルとして提示されるか、またはマージされました。Phox2bシグナル(赤色)は、特に無用量神経節に位置する無フェレントニューロンに蓄積される。予想通り、Cck1rシグナル(シアン)は、無用量神経節の多くのニューロン(すべてではない)を強烈に標識した。低倍率では、低レベルのCck1rまたはGhsrシグナル(黄色)を有する細胞を発現する細胞は容易に観察できなかった。DAPI(グレー)は、組織を視覚化し、大きく軽く染色された核を持つ迷走性の刺激性ニューロンを同定するのに役立ちました。合成された画像の白いインセットは、以下に含まれるイメージの位置に対応します。(B)高倍率では、Phox2b陽性プロファイル(赤色)が明らかである。多くの細胞はまた、Cck1rを発現したが、様々なレベルで、中程度から非常に高い範囲である。プロファイル"1"は、Cck1rおよびGhsrに対する陰性のPhox2b細胞の一例であり、プロファイル"2"および"3"は、それぞれ高いおよび中等度のCck1rシグナルを有するPhox2b細胞である。Ghsr(黄色)に対する中程度のシグナルは、時折、鼻中神経節のロストラルで見られたが、プロファイル"4"で示されるように、Phox2bの陰性細胞ではほとんど常に見られた。興味深いことに、プロファイル"4"は、GhsrとCck1rの両方を表現しました。次の図に示すように、GhsrはPrdm12細胞でより豊富であった。(C) Ghsr (黄)、Cck1r(シアン)、またはその両方(灰色)を共同発現するPhox2b細胞(赤)の割合の推定値を要約した円グラフ。カウントされたプロファイルの総数は、チャートの横に示されます(n = 4異なる神経節、左右を組み合わせた)。違いは気づかなかったため、各側の結果はプールされました。スケールバー = 158 μm(A)および 15 μm(B)略語: DAPI = 4',6-ジミディノ-2-フェニリンドール;NG = ノードーズガングリオン;JG = 頸神経節;ISH = inPhox2b = ペアのようなホメオボックス 2b;Ghsr = グレリン受容体;Cck1r = コレシストキニン受容体.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:頸状の不フェレントニューロン多重化の代表結果多重RNAscope Prdm12、Cck1r、およびGhsr.画像で標識された代表的な迷頭神経節質量のデジタル画像は、共焦点顕微鏡(Zeiss LSM880)の20x(A)および63x(B、C)の目的で取得されました。A,20×いくつかの画像がZenソフトウェアを使用して一緒にステッチされ、混合されていないチャンネルとして提示されるか、またはマージされました。Prdm12転写物(赤)は、特に頸神経節に位置する無透過性ニューロンに蓄積され、無用量神経節のrostral部分に浸潤するニューロンはわずか数個である。Cck1rシグナル(シアン)は、無用量ガングリオンを強く標識した。低倍率では、低レベルのCck1rまたはGhsrシグナル(黄色)を有する細胞を発現する細胞は容易に見ることができなかった。DAPI(グレー)は、組織を視覚化し、大きく軽く染色された核を持つ迷走性の刺激性ニューロンを同定するのに役立ちました。マージされたイメージの 2 つの白いインセットは、以下に含まれるイメージの位置に対応します。(B, C)高倍率では、Prdm12陽性細胞プロファイル(赤色)を線分できます。Cck1rの中程度の信号もプロファイル"1"と"2"で検出されました。プロファイル"3"は、Cck1rまたはGhsrに対する陰性のPrdm12細胞を代表するものである。Cでは、Ghsr信号(黄色)は代表プロファイル"4"に見られますが、「5」には見られません。(D) Ghsr (黄)、Cck1r (シアン)、またはその両方(灰色)を共同発現するPrdm12細胞(赤)の割合の推定値を要約した円グラフ。カウントされたプロファイルの総数は、チャートの横に示されます(n = 4異なる神経節、左右を組み合わせた)。違いは気づかなかったため、各側の結果はプールされました。スケールバー = 158 μm(A)および 15 μm (B, C)略語: DAPI = 4',6-ジミディノ-2-フェニリンドール;NG = ノードーズガングリオン;JG = 頸神経節;ISH = inPrdm12 = PRドメインジンクフィンガータンパク質 12;Phox2b = ペアのようなホメオボックス 2b;Ghsr = グレリン受容体;Cck1r = コレシストキニン受容体.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| オパール | レーザーライン | 検出範囲 | 力 | 得 | ライン平均 | ピクセルサイズ |
| オパール 690 | ヘネ 633 nm | 668-696 nm | 2 | 724 | 4 | 1024 x 1024 |
| オパール 570 | DPSSレーザー 561 nm | 579-627 nm | 15 | 450 | 4 | 1024 x 1024 |
| オパール520 | アルゴンレーザー 488 nm | 499-535 nm | 6 | 830 | 4 | 1024 x 1024 |
| DAPI | ダイオードレーザー405 | 415-502 nm | 12 | 532 | 4 | 1024 x 1024 |
表1:取得パラメータ 略語: DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.
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Discussion
ISHの技術は1960年代後半42年に発明された。しかし、1980年代半ばになって初めて、中枢神経系および末梢神経系43,44におけるmRNAの検出に適用された。神経系の異質性と抗体の繰り返しの問題を考慮すると、細胞レベルで特定のトランスクリプトを局所化することは非常に貴重なツールのままです。それにもかかわらず、伝統的なISH法は、面倒で多様に敏感なままです。幸いなことに、この研究はRNAscopeと呼ばれる非常に敏感なISH手順を採用し、通常は背景を生成せず、低レベル45、46で発現するいくつかの転写物を検出することを可能にする。具体的には、多重蛍光RNAScopeを、GhsrおよびCck1r転写物の同時検出に適用した。転写因子としては、Phox2bおよびPrdm12が、それぞれ無用量および頸状の不透過性ニューロンを区別する選択的マーカーとしてさらに用いられた。Phox2bとPrdm12を視覚化しなければ、確実に頸部対無用量の無症量のニューロンを特定することは困難であろう。上記で説明したように、1 つの重要なステップには、一貫した適切な解剖技術が含まれます。また、内因性蛍光の検証も、RNAScopeシグナルと間違えられやすいため重要な要素です。さらに、陰性対照組織に基づく適切な取得パラメータの選択が強く推奨される。先に述べたように、共焦点顕微鏡は、低レベルおよび/またはまばらな細胞で発現する1)転写物が高倍率でしか目立てないかもしれないため、20xおよび63x(油)目標を有する好ましいイメージング法である。2)共焦点顕微鏡法は、単一の焦点面の収集を可能にし、これは、互いの上の2つの細胞が、発蛍光によって画像化されたときに誤って1つの細胞として現れる可能性があることを考慮して重要である。3) 共焦点顕微鏡はまたより選択的で、柔軟な獲得の変数を可能にする。上記の取得パラメータは一例としてのみ提供され、任意の特定の組織に対する1つの器具、倍率(20xまたは63x)、発現レベル、および内在性蛍光レベルに応じて変更が推奨されます。染色手順自体は、わずかな調整だけで推奨されるプロトコルのそれに非常に近いままでした。明らかに、ここで説明するプロトコルは、GPCRsだけでなく、任意のトランスクリプトの検出に適用することができます。ここで説明する手順は、GPCRs24に対して提起された抗体に関する繰り返しの問題を考慮すると特に有用である。
15で既に説明したように、マウスのノドーズガングリオンは、細胞ブリッジによって上頸神経節に付着することがあります。この細胞ブリッジを含めることは、例えば、非迷走マーカーが無用量神経節で検出される混乱を招く可能性がある。研究者は、解剖中に無用量神経節が上頸神経節に付着しているかどうかを体系的に検証したいと考えるかもしれません。さもなければ、神経節間の一貫性のない解離スキルは実験的な変動性を導入する。また、ペトロサルとノードーズの両方の無依存性ニューロンがPhox2b47を発現することに注意することも重要です。したがって、我々は無用量の無依存ニューロンと呼ばれるものは、ペトロサルとノードーズニューロンの両方を含んでいた。最後に、異なる研究を比較する場合、安楽死の異なる方法は、遺伝子発現48の変化を引き起こす可能性があることを覚えておいてください。
理論的には、検出に使用される蛍光体は、任意のチャネルに同じ意味で起因する可能性があります。しかし, オパール 690 緑色蛍光の低レベルを放出することが判明しました。.ほとんどの状況下では、高度に発現した転写物(例えばPrdm12)の場合、レーザー強度が高すぎる場合には望ましくない緑色蛍光が見られた。オパール 690 は、したがって、中等度/低い発現を持つ遺伝子に推奨されます。.高発現遺伝子のみを使用する場合は、オパール690をさらに希釈し(すなわち、1/3,000)、画像取得中に非特異的な緑色蛍光を捕捉しないことをお勧めします。RNAscopeシグナルは、同じ細胞プロファイル内でトランスクリプトが発現している場合でも、異なる色の別々のドットです。しかし、高度に発現したトランスクリプトの場合、個々のドットを見るのではなく、むしろ蛍光が細胞質を満たすことを見ることができるかもしれません。ドットが異なる色の蛍光を発する場合、他の例の中でも、不十分な取得パラメータおよび/または内在性顔料による非特異的蛍光の問題を考慮するかもしれません。最後に, オパール 570 と 620 は、その放出スペクトルが重複するため、同時に使用することはできません。.
目的の組織で発現することが知られている遺伝子に対してRNAscopeシグナルが観察されない場合、利用可能な陽性プローブ(すなわち、ペプチジル-プロリルシストランスイソメラーゼBハウスキーピング遺伝子)を実行することによって組織の完全性を検証することをお勧めします。DAPIカウンターステインは、組織の品質を決定するのにも有用である。細断されて見えるDAPI標識核は、過度の消化または不適切に固定された組織を示す可能性があります。
その結果、GhsrはPrdm12陽性頸管不フェレントニューロンの小さなサブセットで発現した。対照的に、1つの以前の研究11と一致して、Ghsr mRNAは、無用量無断の神経細胞から事実上存在しなかった。以前にqPCRおよびISHによって検出されたGhsr mRNAの低レベルは、頸部不フェレントニューロン30、31、32による可能性が高いと推測される。ある以前のカルシウムシグナル伝達研究は、培養された迷空性発泡ニューロンの3%がグレリン49に反応することを示した。Cck1rは、多くのPhox2b陽性のノドーズ・アフェレンスニューロンおよび、さらに驚くべきことに、Prdm12陽性頸管不フェレントニューロンのサブセットで発現した。要約すると、この論文は、頸部-線株神経節系質量における選択されたGPCBの細胞分布を評価するための既存のISH技術の適応に成功したことを示す。
結論として、多重化のISHは、成人マウスの全迷頭神経節複合体における2つのGPCR(Cck1rおよびGhsr)および1転写因子(Phox2bまたはPrdm12)の転写物を検出し、同時に可視化するために採用された。ここで説明するプロトコルは、RNA-シーケンス、qPCR、および従来のヒストロジーに対する補完的なツールです。しかし、このプロトコルは、同様のサイズの他の神経節に適用され得る。上で論じるように、取得パラメータ、動物の年齢、解剖の一貫性は、実験計画中に考慮すべき重要な要素である。したがって、高度に異種および小さな神経節における地形遺伝子発現パターンに関するユニークな情報を提供することができる。このプロトコルは、摂食状態の変化を含むがこれらに限定されない様々な生理学的および病態生理学的状態の文脈における頸部対無用量の発分神経の転写プロファイルの変化を決定するために使用することができる。また、霊長類および豚50,51を含む前臨床研究で一般的に使用される動物種における迷走性の抗フェレンスニューロンの神経化学的構成を比較するためにも使用することができる。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、NIH助成金#5P01DK119130-02によって資金提供された神経解剖学/神学/脳注射コアによって支えられた。著者らは、NCIがんセンター支援グラントの一部が支援するハロルド・C・シモンズがんセンターの共有資源であるNIHグラント#1S10OD021684-01の支援を受けたUTサウスウェスタン・ライブ・セル・イメージング・ファシリティ(フェルプス博士が率いる)とそのスタッフ(アビジット・バグデとマルセル・メトレン)の支援を認めたいと考えています。 P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
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