L’ibridazione multiplex in situ (ISH) è stata impiegata per visualizzare simultaneamente i trascritti per due recettori accoppiati a proteine G e un fattore di trascrizione nell’intero complesso gangliare vagale del topo adulto. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per generare mappe accurate dei profili trascrizionali dei neuroni afferenti vagali.
Questo studio descrive un protocollo per l’ibridazione multiplex in situ (ISH) dei gangli giugulare-nodosi del topo, con particolare attenzione alla rilevazione dell’espressione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR). I gangli giugulare-nodosi fissati in formalina sono stati elaborati con la tecnologia RNAscope per rilevare contemporaneamente l’espressione di due GPCR rappresentativi (colecistochinina e recettori della grelina) in combinazione con un gene marcatore di nodosi (omeobox 2b accoppiato, Phox2b) o neuroni afferenti giugulari (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). I gangli etichettati sono stati ripresi utilizzando la microscopia confocale per determinare i modelli di distribuzione ed espressione dei suddetti trascritti. In breve, i neuroni afferenti Phox2b sono stati trovati per esprimere abbondantemente il recettore colecistochinina (Cck1r) ma non il recettore della grelina (Ghsr). È stato anche scoperto che un piccolo sottoinsieme di neuroni afferenti Prdm12 esprime Ghsr e / o Cck1r. Vengono discussi potenziali avvertimenti tecnici nella progettazione, nell’elaborazione e nell’interpretazione dell’ISH multiplex. L’approccio descritto in questo articolo può aiutare gli scienziati a generare mappe accurate dei profili trascrizionali dei neuroni afferenti vagali.
I corpi cellulari delle afferenze vagali sono contenuti nei gangli giugulari, petrosali e nodosi1,2,3. I loro assoni viaggiano insieme attraverso diversi rami del nervo vago ai territori craniocervicale, toracico e addominale4,5,6,7. Dalle loro terminazioni viscerali, le afferenze vagali possono rispondere a una vasta gamma di stimoli fisiologici e nocivi8,9,10. Tuttavia, la distribuzione delle molecole di segnalazione e dei recettori coinvolti nel rilevamento vagale rimane scarsamente caratterizzata. Ciò è in parte dovuto al fatto che i gangli vagali, nonostante le loro piccole dimensioni, esprimono un ampio spettro di recettori, tra cui un gran numero di GPCR8,11,12,13. Inoltre, i neuroni afferenti vagali sono intrinsecamente eterogenei e mostrano profili molecolari distinti14. A complicare la questione, i gangli giugulari, petrosali e nodosi sono attaccati al topo, formando così una singola massa gangliare. Infine, in un sottogruppo di animali, il ganglio nodoso è attaccato al ganglio cervicale superiore simpatico15.
In passato, i ricercatori si sono rivolti all’immunoistochimica per studiare la composizione neurochimica dei neuroni afferenti vagali16,17,18. Mentre l’immunoistochimica che utilizza anticorpi convalidati è utile, i risultati degli studi immunoistochimici devono essere interpretati con cautela. Ad esempio, numerosi sforzi per identificare anticorpi specifici contro i GPCR hanno fallito19,20,21,22,23,24,25,portando gli investigatori a concludere che la maggior parte degli anticorpi contro i GPCR sono inaffidabili. Per aggirare questi problemi, la PCR quantitativa (qPCR) è stata ampiamente utilizzata per valutare l’espressione genica nel roditore vagale di massa gangliare26,27,28,29. Tuttavia, l’esame dell’espressione genica utilizzando la qPCR avviene al costo di una perdita di informazioni spaziali. In particolare, non è possibile prevedere quante cellule o quali tipi di cellule esprimono un particolare gene di interesse (ad esempio, nodosi vs cellule giugulari). I problemi ricorrenti includono anche la contaminazione con i tessuti adiacenti e l’inclusione di lunghezze variabili del nervo vago, gangli cervicali e giugulari superiori durante la dissezione15. Come risultato delle difficoltà di cui sopra, la controversia circonda l’espressione e la distribuzione di diversi GPCR nei neuroni afferenti vagali. Un esempio particolarmente sconcertante riguarda il recettore della grelina (Ghsr). Mentre alcuni studi hanno trovato un’espressione diffusa di questo recettore nei neuroni afferenti vagali30,31,32,altri hanno trovato l’mRNA di Ghsr quasi non rilevabile nel ganglio nodoso11,14. È quindi necessaria una mappatura dettagliata dell’mRNA di Ghsr nella massa gangliare vagale.
L’ibridazione in situ (ISH) è stata utilizzata anche per valutare i modelli di espressione genica nella massa gangliare vagale7,11, 12,33,34,35. Poiché le tecniche basate sull’RNA rimangono più affidabili e specifiche rispetto alle tecniche basate sugli anticorpi nella maggior parte delle circostanze36,37,gli studi ISH si sono dimostrati preziosi per una migliore comprensione della codifica neurochimica dei neuroni afferenti vagali. Tuttavia, le stesse tecniche ISH tradizionali non sono prive di avvertimenti. L’ISH radioattivo è sensibile ma genera sfondo e rimane ingombrante38. L’ISH non radioattivo è meno complicato ma anche meno sensibile38. Al contrario, il metodo RNAscope ISH recentemente sviluppato è altamente sensibile e genera uno sfondo minimo39. L’attuale studio ha applicato l’RNAscopio fluorescente multiplex al rilevamento di GPCR nei neuroni afferenti vagali del topo. Ci siamo concentrati sulla mappatura della distribuzione di Ghsr e abbiamo confrontato la sua distribuzione con quella del recettore colecistochinina (Cck1r), un altro GPCR ben noto per essere espresso nel ganglio nodoso34. Infine, i due fattori di trascrizione, l’omeobox 2b accoppiato (Phox2b) e la proteina 12 del dito di zinco del dominio PR (Prdm12), sono stati utilizzati come marcatori selettivi per i neuroni afferenti nodosi e giugulari, rispettivamente14. Senza visualizzare Phox2b o Prdm12, sarebbe difficile identificare con certezza le afferenze giugulari vs nodosi. Potenziali insidie tecniche sono anche discusse in tutto l’articolo.
La tecnica di ISH è stata inventata alla fine del 196042. Tuttavia, non è fino alla metà degli anni 1980 che è stato applicato per il rilevamento di mRNA nel sistema nervoso centrale e periferico43,44. Considerando l’eterogeneità del sistema nervoso e i problemi ricorrenti con gli anticorpi, localizzare un particolare trascritto a livello cellulare rimane uno strumento inestimabile. Tuttavia, i metodi ISH tradizionali sono rimasti lab…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core finanziato dalla sovvenzione NIH #5P01DK119130-02. Gli autori desiderano riconoscere l’assistenza della UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (guidata dal Dr. Phelps) e del suo staff (Abhijit Bugde e Marcel Mettlen), supportati in parte dal NIH Grant #1S10OD021684-01, una risorsa condivisa dell’Harold C. Simmons Cancer Center, supportata in parte da una sovvenzione di supporto ncI Cancer Center, P30 CA142543.
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
-80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
HybEZ oven | hybridization oven | ||
Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
ImageJ-Fiji | NIH | ||
Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
User manual | ACD | 323100 USM | |
Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
ZEN Imaging Software | Zeiss |